一種腦腫瘤干細(xì)胞分離方法

專利名稱：一種腦腫瘤干細(xì)胞分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于干細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種腦腫瘤干細(xì)胞分離方法。
背景技術(shù)：
腦腫瘤干細(xì)胞(Brain cancer stem cells，BCSCs)研究的首要問題就是如何從異質(zhì)性的腦腫瘤細(xì)胞群中分離出極少量的BCSCs，目前主要有以下幾種分離BCSCs的方法。1、利用BCSCs表面的人白細(xì)胞分化抗原133 (⑶13 標(biāo)記分子進(jìn)行篩選常用的篩選方法有熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACQ和磁性激活細(xì)胞分選術(shù)(MACS)。 其中FACS法是目前應(yīng)用較廣泛的分離方法，通過熒光標(biāo)記的CD133特異性抗體與細(xì)胞表面 CD133分子結(jié)合后，將能發(fā)出熒光的BCSCs分選出來。2、利用生物學(xué)特性進(jìn)行功能分選(SP細(xì)胞分選)用能結(jié)合DNA的熒光染料煙酸己可堿33342 (Hoechst 33342)處理細(xì)胞，利用腫瘤干細(xì)胞可將染料泵出細(xì)胞不發(fā)出熒光的性質(zhì)，經(jīng)過FACS分選，將不被染色或低染色的側(cè)群細(xì)胞(SP細(xì)胞)篩選出來。但是SP分選法中用到的熒光染料對BCSCs可能有一定的毒性作用，會(huì)使分離出的BCSCs的活性與功能發(fā)生改變，影響后續(xù)的培養(yǎng)研究。上述1、2這兩種分選方法均還存在如下不足過程繁瑣，時(shí)間冗長，費(fèi)用也比較昂貴，且都存在一定的主觀性，可因細(xì)胞的制備方法、設(shè)門(gating)等不同而有所差異，存在一定的誤差，最重要的是經(jīng)過長時(shí)間染色和分選后細(xì)胞的活力必然會(huì)受到影響，進(jìn)而影響下一步的培養(yǎng)或者生物學(xué)特性研究。3.利用BCSCs體外成神經(jīng)球生長的特性進(jìn)行分選腦腫瘤細(xì)胞在添加了生長因子的無血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中生長，其中的BCSCs 增殖而形成致密球狀，保持不分化狀態(tài)；而腦腫瘤非干細(xì)胞則貼壁生長，且在無血清條件下生長速度緩慢。有科學(xué)家將腦腫瘤手術(shù)標(biāo)本制成單細(xì)胞懸液后，用無血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM/F12培養(yǎng)基+B27添加劑+表皮生長因子(FGF) +表皮生長因子(FGF))進(jìn)行培養(yǎng)可形成腫瘤球，此腫瘤球細(xì)胞經(jīng)過免疫組化檢測顯示細(xì)胞表面高表達(dá)CD133和巢蛋白(nestin)分子(兩者均為正常神經(jīng)干細(xì)胞的表面標(biāo)記)，且腫瘤球中的部分細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)可致瘤，說明腦腫瘤球中存在一定比例的BCSCs。但是BCSCs在體外懸浮培養(yǎng)的過程中有可能分化成腦腫瘤非干細(xì)胞，且利用已有方法得到的BCSCs純化程度低 (20% 30% )，不能很好地滿足后期大量研究的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種腦腫瘤干細(xì)胞分離方法， 該方法既能抑制腦腫瘤干細(xì)胞的分化并促進(jìn)其增殖分裂，又能殺死腦腫瘤非干細(xì)胞亞群， 獲得大量高純度腦腫瘤干細(xì)胞。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案如下一種腦腫瘤干細(xì)胞分離方法，包括如下步驟
4
獲取原代腦腫瘤細(xì)胞；原代腦腫瘤細(xì)胞的消化傳代將所述腦腫瘤細(xì)胞接種至第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中，再加入蛋白酶體抑制劑MG-132進(jìn)行培養(yǎng)后，用第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行換液， 然后加入多烯紫杉醇和阿霉素進(jìn)行二次培養(yǎng)，獲得原代腦腫瘤球細(xì)胞；蛋白酶體抑制劑 MG-132在第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中的含量為10 25ymol/L ；原代腦腫瘤球細(xì)胞的收集傳代將所述原代腦腫瘤球細(xì)胞洗滌收集，再接種至第二無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)傳代，獲得所述的腦腫瘤干細(xì)胞；其中，所述第二無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中含有重組白血病抑制因子ESGR0。上述腦腫瘤干細(xì)胞分離方法先通過原代腦腫瘤細(xì)胞的消化傳代，有效的抑制了原代腦腫瘤細(xì)胞的分化，同時(shí)殺死腫瘤非干細(xì)胞亞群，再通過對原代腦腫瘤球細(xì)胞的收集傳代，進(jìn)一步抑制腦腫瘤細(xì)胞中腦腫瘤干細(xì)胞的自發(fā)分化，促進(jìn)BCSCs的增殖分裂，達(dá)到快速高效地獲得大量純化腦腫瘤干細(xì)胞的目的，經(jīng)測定得知，該腦腫瘤干細(xì)胞分離方法獲得的腦腫瘤干細(xì)胞純度高達(dá)到50% 60%。其中，在原代腦腫瘤細(xì)胞的消化傳代步驟中，蛋白酶體抑制劑MG-132能有效的干擾原代腦腫瘤細(xì)胞原有的增殖、分化和凋亡，使得原代腦腫瘤細(xì)胞停滯于細(xì)胞周期的&/M期，多烯紫杉醇與阿霉素能有效殺死原代腦腫瘤細(xì)胞中的腦腫瘤非干細(xì)胞亞群，該蛋白酶體抑制劑MG-132與多烯紫杉醇和阿霉素有效地實(shí)現(xiàn)了協(xié)同作用，有效達(dá)到抑制原代腦腫瘤細(xì)胞的分化，殺死腫瘤非干細(xì)胞亞群的目的；在原代腦腫瘤球細(xì)胞的收集傳代步驟中，重組白血病抑制因子ESGRO能有效抑制腦腫瘤干細(xì)胞的分化、 促進(jìn)其增殖的目的，實(shí)現(xiàn)對腦腫瘤干細(xì)胞在培養(yǎng)體系中的有效富集和純化。另外，該腦腫瘤干細(xì)胞分離方法顯著的節(jié)約了腦腫瘤干細(xì)胞分離所需的費(fèi)用和時(shí)間，降低了腦腫瘤干細(xì)胞的分離的成本。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例腦腫瘤干細(xì)胞組成結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例腦腫瘤干細(xì)胞分離方法工藝流程示意圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。研究顯示，腦腫瘤細(xì)胞是由極少量的腦腫瘤干細(xì)胞(BCSCs)和大量的腦腫瘤非干細(xì)胞組成，如圖1所示。要提高腦腫瘤細(xì)胞群中BCSCs的比例，必須首先殺死一部分腦腫瘤非干細(xì)胞?；谏鲜鏊悸罚景l(fā)明實(shí)施例提供了一種既能抑制腦腫瘤干細(xì)胞的分化并促進(jìn)其增殖分裂，又能殺死腦腫瘤非干細(xì)胞亞群，獲得大量高純度腦腫瘤干細(xì)胞的腦腫瘤干細(xì)胞分離方法。該腦腫瘤干細(xì)胞分離方法的工藝流程如圖2所示，包括如下步驟步驟Sl 獲取原代腦腫瘤細(xì)胞；步驟S2 原代腦腫瘤細(xì)胞的消化傳代-將所述腦腫瘤細(xì)胞接種至第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中，再加入蛋白酶體抑制劑MG-132(下文均簡稱MG-132)進(jìn)行培養(yǎng)后，用第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行換液，然后加入多烯紫杉醇和阿霉素進(jìn)行二次培養(yǎng)，獲得原代腦腫瘤球細(xì)胞；MG-132在第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中的含量為10 25 μ mol/L ；步驟S3 原代腦腫瘤球細(xì)胞的收集傳代-將所述原代腦腫瘤球細(xì)胞洗滌收集，再接種至第二無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)傳代，獲得所述的腦腫瘤干細(xì)胞；其中，所述第二無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中含有重組白血病抑制因子ESGRO(下文均簡稱ESGR0)。這樣，上述腦腫瘤干細(xì)胞分離方法先通過原代腦腫瘤細(xì)胞的消化傳代，有效的抑制原代腦腫瘤細(xì)胞的分化，同時(shí)殺死腫瘤非干細(xì)胞亞群，再通過對原代腦腫瘤球細(xì)胞的收集傳代，進(jìn)一步抑制腦腫瘤細(xì)胞中腦腫瘤干細(xì)胞的自發(fā)分化，促進(jìn)BCSCs的增殖分裂，達(dá)到快速高效地獲得大量純化腦腫瘤干細(xì)胞的目的，經(jīng)測定得知，該腦腫瘤干細(xì)胞分離方法獲得的腦腫瘤干細(xì)胞純度高達(dá)到50% 60%。其中，在原代腦腫瘤細(xì)胞的消化傳代步驟中， MG-132能有效的干擾原代腦腫瘤細(xì)胞原有的增殖、分化和凋亡，使得原代腦腫瘤細(xì)胞停滯于細(xì)胞周期的&/M期，多烯紫杉醇與阿霉素能有效殺死原代腦腫瘤細(xì)胞中的腦腫瘤非干細(xì)胞亞群，該MG-132與多烯紫杉醇和阿霉素有效地實(shí)現(xiàn)了協(xié)同作用，有效達(dá)到抑制原代腦腫瘤細(xì)胞的分化，殺死腫瘤非干細(xì)胞亞群的目的；在原代腦腫瘤球細(xì)胞的收集傳代步驟中， ESGRO能有效抑制腦腫瘤干細(xì)胞的分化、促進(jìn)其增殖的目的，實(shí)現(xiàn)對腦腫瘤干細(xì)胞在培養(yǎng)體系中的有效富集和純化。另外，該腦腫瘤干細(xì)胞分離方法顯著的節(jié)約了腦腫瘤干細(xì)胞分離所需的費(fèi)用和時(shí)間，降低了腦腫瘤干細(xì)胞的分離的成本。具體地，上述步驟Sl中，獲取原代腦腫瘤細(xì)胞方法優(yōu)選為直接采用已有的獲取腦腫瘤細(xì)胞株或者采用原代腦腫瘤細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法獲取。如采用原代腦腫瘤細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法獲取時(shí)，該原代腦腫瘤細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法優(yōu)選為取l-2cm3腦腫瘤組織，在無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中清洗，去血管，剪碎后置于膠原酶溶液中進(jìn)行處理后，反復(fù)吹打膠原酶處理后的溶液，并經(jīng)濾網(wǎng)過濾，制成腦腫瘤單細(xì)胞懸液，接著將該腦腫瘤單細(xì)胞懸液離心，獲得所述原代腦腫瘤單細(xì)胞，然后將該原代腦腫瘤單細(xì)胞接種至含血清腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。其中，為了最大限度的保證原代腦腫瘤細(xì)胞的活性，優(yōu)選將離體后的腫瘤組織在 4°C下保存，并30min內(nèi)進(jìn)行分離。膠原酶的濃度優(yōu)選為0. 5 1. 5mg/ml，更優(yōu)選為lmg/ml。 腦腫瘤組織在膠原酶溶液中進(jìn)行處理的溫度優(yōu)選為37°C，處理時(shí)間優(yōu)選為1小時(shí)。濾網(wǎng)優(yōu)選為200目的濾網(wǎng)，腦腫瘤單細(xì)胞懸液優(yōu)選在2000rpm的轉(zhuǎn)速下離心Smin。原代腦腫瘤單細(xì)胞的接種量優(yōu)選為2X IO5個(gè)細(xì)胞/ml，原代腦腫瘤單細(xì)胞的培養(yǎng)優(yōu)選在(X)2體積百分含量為4 6%，溫度為36 38°C的條件下保溫培養(yǎng)，更優(yōu)選在(X)2體積百分含量為5%，溫度為37°C的條件下保溫培養(yǎng)1-3天。具體地，上述步驟S2 中，加入的 MG_132(EMD Millipore, Cat. No 474790)是一種有效、可逆的細(xì)胞滲透蛋白酶抑制劑(Ki = 4nM)，能快速進(jìn)入細(xì)胞，其活性和特異性強(qiáng)， 通過抑制細(xì)胞內(nèi)泛素-蛋白酶體的活性，阻斷泛素-蛋白酶體通路，影響細(xì)胞周期蛋白、 信號(hào)分子和細(xì)胞因子的表達(dá)，從而干擾細(xì)胞的增殖、分化和凋亡過程，特別是對惡性增殖的腫瘤細(xì)胞的敏感性更加明顯。發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，MG-132能使惡性增殖的腦腫瘤細(xì)胞停滯于細(xì)胞周期的&/M期，并對腦腫瘤細(xì)胞有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，且具有一定的劑量依賴性和時(shí)間依賴性，在一定濃度下，它可以選擇性抑制腦腫瘤細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶體 (Proteasome)，導(dǎo)致腦腫瘤細(xì)胞停留在有絲分裂的間期。因此，為了能更有效的干擾原代腦腫瘤細(xì)胞原有的增殖、分化和凋亡，使得原代腦腫瘤細(xì)胞停滯于細(xì)胞周期的&/M期，在第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中的含量優(yōu)選為20 μ mol/L。該優(yōu)選濃度，能進(jìn)一步干擾原代腦腫瘤細(xì)胞原有的增殖、分化的效果。在上述步驟S2中，經(jīng)MG-132干擾原代腦腫瘤細(xì)胞原有的增殖、分化，并將原代腦腫瘤細(xì)胞調(diào)整至細(xì)胞周期的&/M期后，采用第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行對該原代腦腫瘤細(xì)胞進(jìn)行洗脫，換液，以達(dá)到降低或除去MG-132的濃度，實(shí)現(xiàn)消除MG-132對原代腦腫瘤細(xì)胞的干擾，腦腫瘤細(xì)胞可以由有絲分裂間期同步進(jìn)入到有絲分裂后期，從而使得腦腫瘤細(xì)胞對細(xì)胞周期特定化療藥物敏感。此時(shí)，再向第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基加入多烯紫杉醇和阿霉素，多烯紫杉醇是特異性針對M期的周期依賴性化療藥物，阿霉素是特異性針對( 期的周期依賴性化療藥物，兩者能有效的殺死原代腦腫瘤細(xì)胞中的腦腫瘤非干細(xì)胞亞群，其中，該多烯紫杉醇在第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中的含量優(yōu)選為5 15 μ mol/L,更優(yōu)選為 10 μ mol/L,阿霉素在第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中的含量優(yōu)選為0. 5 2 μ mol/L,更優(yōu)選為 1 μ mol/L。該優(yōu)選濃度的多烯紫杉醇和阿霉素能更有效的殺死原代腦腫瘤細(xì)胞中的腦腫瘤非干細(xì)胞亞群，達(dá)到初步純化BCSCs的目的。發(fā)明人進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MG-132、多烯紫杉醇和阿霉素對GO期的BCSCs作用不大，且由于BCSCs細(xì)胞膜上高表達(dá)耐藥泵，可將MG-132、多烯紫杉醇和阿霉素藥物排出細(xì)胞外，使得BCSCs免受傷害。因此，采用MG-132與多烯紫杉醇和阿霉素周期依賴性化療藥物聯(lián)用其到了協(xié)同作用，有效達(dá)到了的殺死腦腫瘤非干細(xì)胞亞群，純化BCSCs的目的。
在上述步驟S2中，該第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)選包含如下配方組份 DMEM/F12 培養(yǎng)基93 ~ 98.5 ν/ν %
Β27 添力口劑1 ~ 5 ν/ν %
胰島素(insulin)2 ~ 6U/L
人重組表皮生長因子(hrEGF)10 ~ 30ng/ml
人重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子(hrbFGF) 5 ~ 15ng/ml
抗生素 P/S/G0.5 ~ 2 ν/ν %
在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，上述第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基包含如下配方組份
DMEM/F12 培養(yǎng)基97 ν/ν %
氏7添加劑2ν/ν%
胰島素(insulin)4 U/L
人重組表皮生長因子(hrEGF)20 ng/ml
人重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子(hrbFGF)10 ng/ml
抗生素 P/S/G1 ν/ν %。
該優(yōu)選配方的第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基有利于BCSCs增殖，形成原代腦腫瘤球細(xì)胞。在上述步驟S2中，腦腫瘤細(xì)胞的接種密度優(yōu)選為IX IO5 3X IO5個(gè)細(xì)胞/ml，進(jìn)一步優(yōu)選為2 X IO5個(gè)細(xì)胞/ml ；加入MG-132進(jìn)行培養(yǎng)和加入多烯紫杉醇和阿霉素進(jìn)行二次培養(yǎng)均優(yōu)選是在(X)2體積百分含量為4 6%，溫度為36 38°C的條件下保溫培養(yǎng)6 10 小時(shí)，進(jìn)一步優(yōu)選在(X)2體積百分含量為5%，溫度為37°C的條件下保溫培養(yǎng)8小時(shí)。該優(yōu)選的培養(yǎng)條件，有利于BCSCs的增殖，形成致密球狀即原代腦腫瘤球細(xì)胞。進(jìn)一步地，在上述步驟S2中，如果上述步驟Sl中的原代腦腫瘤細(xì)胞是采用原代腦腫瘤細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法獲取是，經(jīng)含血清腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)后，如經(jīng)l-3d培養(yǎng)后，原代腦腫瘤細(xì)胞會(huì)貼培養(yǎng)瓶壁生長為致密單層，此時(shí)，在將原代腦腫瘤細(xì)胞接種至第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)前，應(yīng)對原代腦腫瘤細(xì)胞進(jìn)行前期預(yù)處理，具體包含的步驟優(yōu)選為先吸棄含血清腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基，加入IOml杜氏磷酸緩沖液(DPBS)洗滌，再加入2ml 胰蛋白酶，并使胰蛋白酶均勻布滿瓶壁，待瓶壁的貼壁細(xì)胞漂浮起來后，迅速加入約IOml 消化終止液，并用移液管將細(xì)胞從瓶壁上完全吹打下來，得到細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中離心，吸棄上清。其中，消化終止液包含體積百分比的93 97%的DPBS和3 7 %的胎牛血清(FBQ，該消化終止液進(jìn)一步優(yōu)選包含體積百分比的95 %的DPBS和5 %的胎牛血清(FBS)。具體地，上述步驟S3中，原代腦腫瘤球細(xì)胞洗滌收集的方法優(yōu)選為用DPBS洗滌后，用第二無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基將原代腦腫瘤球細(xì)胞吹打重懸。用DPBS洗滌的目的是以除去培養(yǎng)體系中的多烯紫杉醇和阿霉素化療藥物。這是因?yàn)椋l(fā)明人在研究中同時(shí)發(fā)現(xiàn)， BCSCs具有很強(qiáng)的自我更新和多向分化能力，在體外分離培養(yǎng)的過程中，部分BCSCs會(huì)分化成腦腫瘤非干細(xì)胞，因此要提高BCSCs在腦腫瘤細(xì)胞中的比例，除了殺滅其中大量的腦腫瘤非干細(xì)胞外，如何維持BCSCs的多潛能特性、抑制其分化也是一個(gè)關(guān)鍵問題。因此，發(fā)明人在本步驟中采用添加ESGRO來解決該問題。ESGRO是經(jīng)過優(yōu)化的重組白血病抑制因子，比普通白血病抑制因子的抑制作用更強(qiáng)，當(dāng)用于腦腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，能高效抑制腦腫瘤細(xì)胞中BCSCs的自發(fā)分化，且能促進(jìn)BCSCs的增殖分裂。但是發(fā)明人在研究中還發(fā)現(xiàn)，ESGRO的促增殖作用與上述多烯紫杉醇和阿霉素化療藥物對增殖細(xì)胞的殺傷作用會(huì)產(chǎn)生抵觸，若同時(shí)存在于培養(yǎng)體系中，化療藥物可能會(huì)殺死一部分處于增殖分裂的BCSCs。為了解決此問題，發(fā)明人采用化療藥物與ESGRO分步驟使用，在培養(yǎng)前期通過添加化療藥物“MG132+多烯紫杉醇+阿霉素”選擇性殺滅腦腫瘤細(xì)胞群中的非干細(xì)胞，培養(yǎng)后期通過在第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加ESGRO即第二無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基來抑制BCSCs的分化、促進(jìn)增殖， 這兩方面共同保證了 BCSCs在培養(yǎng)體系中的有效富集和純化。因此，在上述步驟S3中，第二無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)選含如下配方組份
DMEM/F12 培養(yǎng)基93 ~ 98.5 ν/ν %B271 力口齊 1J 胰島素
人重組表皮生長因子
人重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子5 ~ 15ng/ml
抗生素P/S/G
在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施例中，上述第二無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基包含如下配方組份
DMEM/F12 培養(yǎng)基97 ν/ν %
氏7添加劑2ν/ν%
胰島素(insulin)4 U/L
人重組表皮生長因子(hrEGF)20 ng/ml
人重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子(hrbFGF) 10 ng/ml 抗生素 P/S/G1 ν/ν %
ESGRO1000 U/ml。該優(yōu)選配方的第二無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基能有效的促進(jìn)BCSCs增殖的同時(shí)，有效的抑制BCSCs分化成腦腫瘤非干細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)BCSCs即原代腦腫瘤球細(xì)胞的收集傳代。在上述步驟S3中，原代腦腫瘤球細(xì)胞的接種密度優(yōu)選為IX IO5 3X IO5個(gè)細(xì)胞 /ml，進(jìn)一步優(yōu)選為2X IO5個(gè)細(xì)胞/ml，并優(yōu)選以1 2或1 3的比例進(jìn)行傳代3 5代； 原代腦腫瘤球細(xì)胞的培養(yǎng)傳代優(yōu)選是在(X)2體積百分含量為4 6%，溫度為36 38°C的條件下保溫培養(yǎng)6 10小時(shí)，進(jìn)一步優(yōu)選在(X)2體積百分含量為5%，溫度為37°C、濕度為 100%的條件下保溫培養(yǎng)8小時(shí)。在培養(yǎng)過程，為了保證第二無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)恒定，優(yōu)選每隔3天添加新鮮的hrEGF和hrbFGF。該優(yōu)選的培養(yǎng)條件，更有利于抑制BCSCs的分化，使得BCSCs快速增殖，實(shí)現(xiàn)對腦腫瘤干細(xì)胞在培養(yǎng)體系中的有效富集和純化。進(jìn)一步優(yōu)選地，上述腦腫瘤干細(xì)胞分離方法還包括對BCSCs含量的測定，測定方法優(yōu)選包含如下步驟(1)將上述步驟S3中收集的腦腫瘤球細(xì)胞重懸計(jì)數(shù)后轉(zhuǎn)IO6個(gè)細(xì)胞到5ml離心管中，用預(yù)冷的含有體積百分含量2%熱滅活小牛血清的HBSS溶液(HBSS/2%HICQ洗兩次(1000rpm，5min)，再用100 μ 1 HBSS/2% HICS重懸。加入5μ 1免疫球蛋白溶液(lmg/ ml)，冰上孵育IOmin后，用HBSS/^2% HICS洗兩次，再用100 μ 1 HBSS/2% HICS重懸細(xì)胞。 以1μ 1/106個(gè)細(xì)胞的濃度加入熒光標(biāo)記的抗體PE-⑶133，冰上孵育20min后，用HBSS/^W HICS洗兩次，再用0. 5ml含有7氨基放線菌素(7AAD)的HBSS/2% HICS重懸細(xì)胞(7AAD在體系中的終濃度為lyg/ml)。(2)流式細(xì)胞儀檢測使用流式細(xì)胞儀如BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀在488nm波
9長的光源激發(fā)待測細(xì)胞，檢測出其中抗原分子⑶133陽性的(⑶133+)BCSCs的百分比。按照上述方法測定，本發(fā)明腦腫瘤干細(xì)胞分離方法分離的腦腫瘤干細(xì)胞純度高達(dá) 50% -60%。本發(fā)明中，上述“ ν/ν % ”均表示體積百分含量?，F(xiàn)以具體的腦腫瘤干細(xì)胞分離方法為例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例1腦腫瘤干細(xì)胞分離方法，即采用“MG-132+多烯紫杉醇+阿霉素+ESGRO實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?包括如下步驟Sll.試劑及溶液的配制(1)試劑細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑DPBS、胰蛋白酶(Gibco公司)、膠原酶、胎牛血清(FBS)、DMEM 培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、B-27添加劑(無血清和維生素A)、胰島素 (insulin)、人重組表皮生長因子(human recombinant epidermal growth Factor,hrEGF, Sigma公司)、人重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子(human recombinant basic fibroblast growth factor, hrbFGF, Sigma 公司)、ESGRO(Chemicon 公司)、MG_132(EMD Millipore, Cat. No 474790)、多烯紫杉醇、阿霉素、抗生素P/S/G(青霉素/鏈霉素/慶大霉素)。溶液配制MG-132用二甲基亞砜(DMSO)溶解，配成80 μ mol/L的溶液待用，_20°C 避光保存，使用前稀釋至終濃度；多烯紫杉醇和阿霉素溶于生理鹽水，-20°C保存。流式細(xì)胞檢測所需試劑PE_CD133抗體(Miltenyi公司)、HBSS緩沖液、小牛血清、免疫球蛋白、7AAD。(2)培養(yǎng)基的配制含血清腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)組份DMEM 培養(yǎng)基 89v/v%FBS10v/v%抗生素P/S/G lv/v%。第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)組份
DMEM/F12 培養(yǎng)基 97 ν/ν % B272 ν/ν %
insulin4 U/L
hrEGF20 ng/ml
hrbFGF10 ng/ml
抗生素 P/S/G1 v/v %。第二無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)組份DMEM/F12 培養(yǎng)基 97 ν/ν %
hrbFGF
hrEGF
B27
insulin
抗生素P/S/G
2 ν/ν % 4U/L 20 ng/ml 10 ng/ml
1 ν/ν %
ESGRO
lOOOU/ml。(3)消化終止液的配制DPBS (95v/v% ) +FBS (5v/v% )S12 :腦腫瘤干細(xì)胞分離方法的具體步驟S121 原代腦腫瘤細(xì)胞的分離培養(yǎng)①取手術(shù)切除的新鮮腦腫瘤組織2cm3，在無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中清洗、去血管，用消毒的手術(shù)剪刀盡快剪碎后置于50ml離心管中；②加入一定量的lmg/ml的膠原酶溶液，37°C水浴Ih后，用移液管反復(fù)吹打，將細(xì)胞懸液經(jīng)200目濾網(wǎng)制成單細(xì)胞懸液；③2000rpm，8min離心后細(xì)胞用含血清腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基吹打重懸，接種到175cm2 培養(yǎng)瓶，密度約為2 X IO5個(gè)細(xì)胞/ml，置于37°C，5v/v%的(X)2環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)；S122.原代腦腫瘤細(xì)胞的消化傳代①按上述步驟S121的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)3d，待細(xì)胞貼壁生長為致密單層后，吸棄培養(yǎng)液，加入IOmlDPBS洗滌兩次后，加入2ml胰蛋白酶，使其均勻鋪滿瓶壁，待瓶壁的貼壁細(xì)胞漂浮起來，迅速加入約IOml消化終止液，搖晃均勻，并用移液管將細(xì)胞從瓶壁上完全吹打下來；②吹打完全后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入50ml離心管中，IOOOrpm離心8min，吸棄上清，用第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基吹打重懸細(xì)胞；③細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種到175cm2培養(yǎng)瓶中，密度約為2X IO5個(gè)細(xì)胞/ml，另外加入 MG-132(終濃度20μπιΟ1/υ至培養(yǎng)瓶中。置于37°C，5v/v% CO2環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)他后，用PBS清洗3次，并進(jìn)行換液后，加入多烯紫杉醇(ΙΟμπιοΙ/L)和阿霉素(Ιμπιο /L)繼續(xù)培養(yǎng)。以上步驟重復(fù)2次；S123.腦腫瘤球的收集傳代按上述步驟S122的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)①按上述步驟S122的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)7d后，出現(xiàn)懸浮細(xì)胞球，收集原代腫瘤球細(xì)胞，用DPBS洗滌兩次后，用第二無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基將細(xì)胞吹打重懸，按2 X IO5個(gè)細(xì)胞/ml的密度以1 2的比例進(jìn)行傳代，在傳代培養(yǎng)過程中，每隔3天添加新鮮的hrEGF和 hrbFGF，培養(yǎng)條件為 37°C，5v/v% CO2，濕度 100% ；②使用第二無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基連續(xù)傳4代后，收集腦腫瘤球細(xì)胞，即可淘汰絕大部分腦腫瘤非干細(xì)胞，得到大量純度較高且保持活力的BCSCs ；S13.腦腫瘤球細(xì)胞中CD133+BCSCs的含量測定①流式細(xì)胞檢測前的細(xì)胞染色將上述步驟S123中收集的腦腫瘤球細(xì)胞重懸計(jì)數(shù)后轉(zhuǎn)IO6個(gè)細(xì)胞到5ml離心管中，用預(yù)冷的含有2V/V%熱滅活小牛血清的HBSS溶液 (HBSS/2 % HICS)洗兩次(lOOOrpm, 5min)，再用 100 μ 1HBSS/2 % HICS 重懸，加入 5 μ 1 免疫球蛋白溶液(lmg/ml)，冰上孵育IOmin后，用HBSS/2% HICS洗兩次，再用100 μ 1 HBSS/2% HICS重懸細(xì)胞，以1 μ 1/106個(gè)細(xì)胞的濃度加入熒光標(biāo)記的抗體PE-⑶133，冰上孵育20min 后，用HBSS/2% HICS洗兩次，再用0. 5ml含有7AAD的HBSS/2% HICS重懸細(xì)胞(7AAD在體系中的終濃度為lyg/ml)；②流式細(xì)胞儀檢測使用流式細(xì)胞儀BD FACSCalibur在488nm波長的光源激發(fā)待測細(xì)胞，檢測出其中⑶133+BCSCs的百分比；本實(shí)施例1的腦腫瘤干細(xì)胞分離方法共選取5個(gè)樣本進(jìn)行分離，并均經(jīng)上述步驟S13測量，本實(shí)施例1腦腫瘤干細(xì)胞分離方法所獲得的腦腫瘤干細(xì)胞純度平均高達(dá) 57. 82%，具體參見下述表1中數(shù)值。對比實(shí)例1腦腫瘤干細(xì)胞分離方法，該分離方法采用“MG-132+ESGR0實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?，包括如下步驟S31.試劑及溶液的配制參照實(shí)施例1中步驟Sll ；S32.腦腫瘤干細(xì)胞分離方法的具體步驟S321.原代腦腫瘤細(xì)胞的分離培養(yǎng)參照實(shí)施例1中步驟S121 ；S322.原代腦腫瘤細(xì)胞的消化傳代①按上述步驟S321的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)3d，待細(xì)胞貼壁生長為致密單層后，吸棄培養(yǎng)液，加入IOmlDPBS洗滌兩次后，加入2ml胰蛋白酶，使其均勻鋪滿瓶壁，待瓶壁的貼壁細(xì)胞漂浮起來，迅速加入約IOml消化終止液，搖晃均勻，并用移液管將細(xì)胞從瓶壁上完全吹打下來；②吹打完全后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入50ml離心管中，IOOOrpm離心8min，吸棄上清，用第
一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基吹打重懸細(xì)胞；③細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種到175cm2培養(yǎng)瓶中，密度約為2X IO5個(gè)細(xì)胞/ml，另外加入 MG-132(終濃度20μπιΟ1/υ至培養(yǎng)瓶中。置于37°C，5v/v% CO2環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。S323.腦腫瘤球的收集傳代①按上述步驟S322的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)7d后，出現(xiàn)懸浮細(xì)胞球，收集原代腫瘤球細(xì)胞，用DPBS洗滌兩次后，用第二無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基將細(xì)胞吹打重懸，按2 X IO5個(gè)細(xì)胞/ml的密度以1 2的比例進(jìn)行傳代，在傳代培養(yǎng)過程中，每隔3天添加新鮮的hrEGF和 hrbFGF，培養(yǎng)條件為 37°C，5v/v% CO2，濕度 100% ；②使用第二無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基連續(xù)傳4代后，收集腦腫瘤球細(xì)胞。即可淘汰絕大部分腦腫瘤非干細(xì)胞，得到大量純度較高且保持活力的BCSCs。S33.腦腫瘤球細(xì)胞中⑶133+BCSCs的含量測定參照實(shí)施例1中步驟S13 ；本對比實(shí)施例1的腦腫瘤干細(xì)胞分離方法共選取5個(gè)樣本進(jìn)行分離，并均經(jīng)上述步驟S13測量，本對比實(shí)施例1腦腫瘤干細(xì)胞分離方法所獲得的腦腫瘤干細(xì)胞純度參見下述表1中數(shù)值。對比實(shí)例2腦腫瘤干細(xì)胞分離方法，該分離方法采用“ESGR0實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?，包括如下步驟
S41.試劑及溶液的配制參照實(shí)施例1中步驟Sll ；S42.腦腫瘤干細(xì)胞分離方法的具體步驟S421.原代腦腫瘤細(xì)胞的分離培養(yǎng)參照實(shí)施例1中步驟S121 ；S422.原代腦腫瘤細(xì)胞的消化傳代①按上述步驟S421的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)3d，待細(xì)胞貼壁生長為致密單層后，吸棄培養(yǎng)液，加入IOmlDPBS洗滌兩次后，加入2ml胰蛋白酶，使其均勻鋪滿瓶壁，待瓶壁的貼壁細(xì)胞漂浮起來，迅速加入約IOml消化終止液，搖晃均勻，并用移液管將細(xì)胞從瓶壁上完全吹打下來；②吹打完全后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入50ml離心管中，IOOOrpm離心8min，吸棄上清，用第
一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基吹打重懸細(xì)胞；③細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種到175cm2培養(yǎng)瓶中，密度約為2X IO5個(gè)細(xì)胞/ml，置于37°C， 5V/V%C02環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)；S423.腦腫瘤球的收集傳代①按上述步驟S422的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)7d后，出現(xiàn)懸浮細(xì)胞球，收集原代腫瘤球細(xì)胞，用DPBS洗滌兩次后，用第二無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基將細(xì)胞吹打重懸，按2 X IO5個(gè)細(xì)胞/ml的密度以1 2的比例進(jìn)行傳代，在傳代培養(yǎng)過程中，每隔3天添加新鮮的hrEGF和 hrbFGF，培養(yǎng)條件為 37°C，5v/v% CO2，濕度 100% ；②使用第二無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基連續(xù)傳4代后，收集腦腫瘤球細(xì)胞。即可淘汰絕大部分腦腫瘤非干細(xì)胞，得到大量純度較高且保持活力的BCSCs ；S43 腦腫瘤球細(xì)胞中⑶133+BCSCs的含量測定參照實(shí)施例1中步驟S13。本對比實(shí)施例2的腦腫瘤干細(xì)胞分離方法共選取5個(gè)樣本進(jìn)行分離，并均經(jīng)上述步驟S13測量，本對比實(shí)施例2腦腫瘤干細(xì)胞分離方法所獲得的腦腫瘤干細(xì)胞純度參見下述表1中數(shù)值?？瞻讓φ諏?shí)例3腦腫瘤干細(xì)胞分離方法，該分離方法采用“ESGR0實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?，包括如下步驟S41.試劑及溶液的配制參照實(shí)施例1中步驟Sll ；S52.腦腫瘤干細(xì)胞分離方法的具體步驟S521.原代腦腫瘤細(xì)胞的分離培養(yǎng)參照實(shí)施例1中步驟S121 ；S522.原代腦腫瘤細(xì)胞的消化傳代參照對比實(shí)例2中步驟S422 ；S523.腦腫瘤球的收集傳代①按上述步驟S522的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)7d后，出現(xiàn)懸浮細(xì)胞球，收集原代腫瘤球細(xì)胞，用DPBS洗滌兩次后，用第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基將細(xì)胞吹打重懸，按2 X IO5個(gè)細(xì)胞/ml的密度以1 2的比例進(jìn)行傳代，在傳代培養(yǎng)過程中，每隔3天添加新鮮的hrEGF和 hrbFGF，培養(yǎng)條件為 37°C，5v/v% CO2，濕度 100% ；②使用第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基連續(xù)傳4代后，收集腦腫瘤球細(xì)胞。S53 腦腫瘤球細(xì)胞中⑶133+BCSCs的含量測定參照實(shí)施例1中步驟S13 ；本空白對照實(shí)例3的腦腫瘤干細(xì)胞分離方法共選取5個(gè)樣本進(jìn)行分離，并均經(jīng)上述步驟S13測量，本空白對照實(shí)例3的腦腫瘤干細(xì)胞分離方法所獲得的腦腫瘤干細(xì)胞純度參見下述表1中數(shù)值。
表權(quán)利要求
1.一種腦腫瘤干細(xì)胞分離方法，包括如下步驟獲取原代腦腫瘤細(xì)胞；原代腦腫瘤細(xì)胞的消化傳代將所述腦腫瘤細(xì)胞接種至第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中， 再加入蛋白酶體抑制劑MG-132進(jìn)行培養(yǎng)后，用第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行換液，然后加入多烯紫杉醇和阿霉素進(jìn)行二次培養(yǎng)，獲得原代腦腫瘤球細(xì)胞；蛋白酶體抑制劑MG-132在第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中的含量為10 25ymol/L ；原代腦腫瘤球細(xì)胞的收集傳代將所述原代腦腫瘤球細(xì)胞洗滌收集，再接種至第二無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)傳代，獲得所述的腦腫瘤干細(xì)胞；其中，所述第二無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中含有重組白血病抑制因子ESGR0。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腦腫瘤干細(xì)胞分離方法，其特征在于在所述原代腦腫瘤細(xì)胞的消化傳代的步驟中，加入所述多烯紫杉醇在第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中的含量為5 15 μ mol/L,阿霉素在第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中的含量為0. 5 2 μ mol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腦腫瘤干細(xì)胞分離方法，其特征在于所述第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基包含如下配方組份DMEM/F12 培養(yǎng)基93 ~ 98.5 ν/ν %Β27 添力口劑1 ~ 5 ν/ν %胰島素2~6U/L人重組表皮生長因子10~30ng/ml人重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子5 ~ 15 ng/ml抗生素 P/S/G0.5 ~ 2 ν/ν %
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一所述的腦腫瘤干細(xì)胞分離方法，其特征在于在所述原代腦腫瘤細(xì)胞的消化傳代的步驟中，所述腦腫瘤細(xì)胞的接種密度為1X IO5 3Χ IO5個(gè)細(xì)胞/ ml ；所述加入蛋白酶體抑制劑MG-132進(jìn)行培養(yǎng)和加入多烯紫杉醇和阿霉素進(jìn)行二次培養(yǎng)是在(X)2體積百分含量為4 6%，溫度為36 38°C的條件下保溫培養(yǎng)6 10小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腦腫瘤干細(xì)胞分離方法，其特征在于所述重組白血病抑制因子ESGRO在第二無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中的含量為800 1200U/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的腦腫瘤干細(xì)胞分離方法，其特征在于所述第二無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基還包含如下配方組份DMEM/F12 培養(yǎng)基93 ~ 98.5 v/v %B27 添加劑l~5v/v%胰島素2~6U/L人重組表皮生長因子10~30ng/ml人重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子5 ~ 15ng/ml抗生素 P/S/G0.5 ~ 2 v/v %。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腦腫瘤干細(xì)胞分離方法，其特征在于在所述原代腦腫瘤球 細(xì)胞的收集傳代的步驟中，所述原代腦腫瘤球細(xì)胞的接種密度為1 X IO5 3X IO5個(gè)細(xì)胞/ ml ；所述培養(yǎng)傳代是在(X)2體積百分含量為4 6%，溫度為36 38°C的條件下保溫培養(yǎng) 6 10小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腦腫瘤干細(xì)胞分離方法，其特征在于獲取原代腦腫瘤細(xì)胞 的方法為取Icm3 2cm3腦腫瘤組織，在無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中清洗，去血管，剪碎 后置于膠原酶溶液中，在36 38°C處理0. 5 15小時(shí)后，反復(fù)吹打膠原酶處理后的溶液， 并經(jīng)濾網(wǎng)過濾，制成單細(xì)胞懸液，然后將所述單細(xì)胞懸液離心，獲得所述原代腦腫瘤單細(xì) 胞，然后將所述原代腦腫瘤單細(xì)胞接種至含血清腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的腦腫瘤干細(xì)胞分離方法，其特征在于含血清腫瘤細(xì)胞培養(yǎng) 基包含如下體積百分比的配方組份DMEM培養(yǎng)基83 94. 5 %胎牛血清 5 15%抗生素P/S/G 0. 5 2%。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腦腫瘤干細(xì)胞分離方法，其特征在于在原代腦腫瘤球細(xì)胞 的收集傳代步驟之后，還包含測定抗原分子CD133陽性的腦腫瘤干細(xì)胞含量的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種腦腫瘤干細(xì)胞分離方法，包括的步驟有獲取原代腦腫瘤細(xì)胞；原代腦腫瘤細(xì)胞的消化傳代將所述腦腫瘤細(xì)胞接種至第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中，再加入MG-132進(jìn)行培養(yǎng)后，用第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行換液，然后加入多烯紫杉醇和阿霉素進(jìn)行二次培養(yǎng)，獲得原代腦腫瘤球細(xì)胞；MG-132在第一無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中的含量為10～25μmol/L；原代腦腫瘤球細(xì)胞的收集傳代將所述原代腦腫瘤球細(xì)胞洗滌收集，再接種至第二無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)傳代，獲得所述的腦腫瘤干細(xì)胞；其中，所述第二無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中含有ESGRO。該方法能抑制腦腫瘤干細(xì)胞的分化并促進(jìn)其增殖分裂，獲得大量高純度腦腫瘤干細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/095GK102286430SQ20111026921
公開日2011年12月21日 申請日期2011年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月13日
發(fā)明者劉韜 申請人:劉韜, 深圳市博泰生物醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司