專(zhuān)利名稱：一種誘導(dǎo)煙草疫霉產(chǎn)生致病性分泌蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種誘導(dǎo)煙草疫霉產(chǎn)生致病性分泌蛋白的方法。
背景技術(shù)：
傲Phytophthora parasiticavar. nicotiana引起的煙草黑脛病是煙草生產(chǎn)上毀滅性病害之一，世界各地的煙草種植區(qū)均有發(fā)生，每年可造成數(shù)百億美元的損失，因此受到世界各國(guó)煙草育種學(xué)家、植物病理學(xué)家、遺傳學(xué)家的廣泛關(guān)注。煙草疫霉同時(shí)還是遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的良好實(shí)驗(yàn)材料，該病害系統(tǒng)是真菌-植物互作研究的模式系統(tǒng)，近年來(lái)的研究獲得了許多與該病原菌侵染相關(guān)的形態(tài)分化和致病因子的遺傳資源與信息，為煙草疫霉菌基因組學(xué)研究打下了良好基礎(chǔ)。通過(guò)致病相關(guān)基因的功能研究，可深入了解煙草疫霉菌的致病機(jī)制、并以此為途徑尋找煙草中與該病原菌致病基因相對(duì)應(yīng)的抗性基因，研究寄主-病原物互作機(jī)制和抗病機(jī)制，預(yù)測(cè)該病菌群體中致病基因分布、多樣性栽培條件下致病基因的表達(dá)和變化、誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)的功能域與致病功能域的關(guān)系，預(yù)測(cè)煙草中相應(yīng)抗病基因的抗性持久性。通過(guò)鑒定致病基因控制的致病相關(guān)因子，可以尋找殺菌劑的作用靶點(diǎn)，最終為有效控制煙草黑脛病提出新的策略。但是多年研究結(jié)果表明，目前還沒(méi)有能夠誘導(dǎo)煙草疫霉菌產(chǎn)生致病性分泌蛋白的方法，從而無(wú)法確定其致病相關(guān)因子，限制了對(duì)其致病機(jī)理的深入研究。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服煙草疫霉菌在固體培養(yǎng)條件下無(wú)法產(chǎn)生分泌蛋白的不足，提供一種能夠誘導(dǎo)煙草疫霉病菌產(chǎn)生致病性分泌蛋白的方法。本發(fā)明的誘導(dǎo)煙草疫霉菌產(chǎn)生致病性分泌蛋白的方法是按以下步驟進(jìn)行
(1)將煙草黑脛病樣用自來(lái)水沖洗干凈病株莖稈表面，待風(fēng)干后從病健交界處取 0. 4cmX0. 4cm髓部組織塊置于燕麥培養(yǎng)基，置于黑暗條件下培養(yǎng)3 4天，再接種到燕麥培養(yǎng)基上，置于黑暗條件下培養(yǎng)3 4天；形成較大的菌落；
(2)形成較大的菌落后，將菌絲塊轉(zhuǎn)接到300mL分泌蛋白液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基；分泌蛋白液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基由以下部分組成酵母浸膏0.5 -lmg/L、葡萄糖25-30g /L、NaH2PCM 0. 5 -0. 75g/L、MgS04 ·7Η20 0. 25 — 0. 4g/L、天門(mén)冬酰胺 1· 5 — 2g/L、VBl 1· 5 — 2mg/L、H20 1L, 于，120rpm振蕩培養(yǎng)2周；
(3)用雙層滅菌濾紙濾去菌絲體，濾液經(jīng)5000rpm離心20min，上清液加入100%飽和硫酸銨溶液，于10000 rpm離心30min，沉淀經(jīng)IKD (透析帶截流范圍)透析帶處理，凍干后獲得煙草疫霉致病性分泌蛋白提取物，-20°C保存；
(4)將得到的蛋白提取物用ΙΟΟμΙ除離子水溶解后，在成株期煙草葉片上進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證所提取蛋白的特性。本發(fā)明的有益效果是解決了煙草疫霉菌在人工培養(yǎng)條件下不產(chǎn)生致病性分泌蛋白的問(wèn)題，通過(guò)對(duì)液體培養(yǎng)基配方調(diào)整，加入少量無(wú)機(jī)鹽及氨基酸，從而誘導(dǎo)煙草疫霉菌大量產(chǎn)生致病性分泌蛋白。通過(guò)對(duì)這些分泌蛋白的分離和提純，可以深入研究煙草疫霉與寄主之間在蛋白質(zhì)水平上的相互作用，最終揭示二者在基因水平上的相互識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)等機(jī)理，對(duì)于煙草黑脛病致病機(jī)理的研究具有重要意義。
具體實(shí)施例方式將分離得到的煙草疫霉菌在燕麥固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)入致病性分泌蛋白液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最后提取煙草疫霉菌致病性分泌蛋白，蛋白提取物在煙草葉片上接種，調(diào)查壞死斑。實(shí)施例1
將煙草黑脛病樣帶回實(shí)驗(yàn)室，用自來(lái)水沖洗干凈病株莖稈表面。待風(fēng)干后從病健交界處取0. 4cmX0. 4cm髓部組織塊置于燕麥培養(yǎng)基，置于黑暗條件下培養(yǎng)3 4天。燕麥培養(yǎng)基由以下部分組成燕麥片30g，瓊脂20g，蒸餾水IOOOml ；將分離獲得的煙草疫霉病菌弱致病性菌株Yl接種到由燕麥片30g，瓊脂20g，蒸餾水IOOOml組成的普通固體培養(yǎng)基上，置于黑暗條件下培養(yǎng)3 4天；形成較大的菌落后，將菌絲塊轉(zhuǎn)接到300mL致病性分泌蛋白液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基由以下部分組成酵母浸膏0.5 mg/L、葡萄糖25g /L、NaH2P04 0. 5g/L、MgS04 · 7H20 0. 25g/L、天門(mén)冬酰胺 1. 5g/L、VBl 1. 5mg/L、H2O 1L,于 28°C，120rpm振蕩培養(yǎng)2周；用雙層滅菌濾紙濾去菌絲體，濾液經(jīng)5000rpm離心20min，上清液加入100%飽和硫酸銨溶液，10000 rpm離心30min，沉淀經(jīng)IKD透析帶處理，凍干后獲得煙草疫霉分泌蛋白提取物，-20°C保存。實(shí)施例2
將分離獲得的煙草疫霉病菌強(qiáng)致病性菌株Y2、Y3接種到由燕麥片30g，瓊脂20g，蒸餾水IOOOml組成的普通固體培養(yǎng)基上，置于黑暗條件下培養(yǎng)3 4天；形成較大的菌落后，將菌絲塊轉(zhuǎn)接到300mL由致病性分泌蛋白液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基由以下部分組成酵母浸膏 1 mg/L、葡萄糖 30g /L、NaH2PCM 0. 75g/L、MgS04 · 7H20 0. 4g/L、天門(mén)冬酰胺 2g/L、VBl 2mg/L,H20 1L，于，120rpm振蕩培養(yǎng)2周；用雙層滅菌濾紙濾去菌絲體，濾液經(jīng)5000rpm離心20min，上清液加入100%飽和硫酸銨溶液，10000 rpm離心30min，沉淀經(jīng) IKD透析帶處理，凍干后獲得煙草疫霉分泌蛋白提取物，-20°C保存。將上述實(shí)施例1、實(shí)施例2所提取、保存的分泌蛋白接種到煙草品種1(3 上，接種 7天后調(diào)查壞死斑大小，結(jié)果表明壞死病斑由內(nèi)至外，依次形成灰白斑、水漬圈和褐斑圈的感病癥狀，而且菌株致病性越強(qiáng)，誘導(dǎo)蛋白致病性也越強(qiáng)。壞死斑大小見(jiàn)下表
權(quán)利要求
1. 一種誘導(dǎo)煙草疫霉產(chǎn)生致病性分泌蛋白的方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行(1)將煙草黑脛病樣用自來(lái)水沖洗干凈病株莖稈表面，待風(fēng)干后從病健交界處取 0. 4cmX0. 4cm髓部組織塊置于燕麥培養(yǎng)基，置于黑暗條件下培養(yǎng)3 4天，獲得的煙草疫霉病菌致病性菌株，再接種到燕麥培養(yǎng)基上，置于黑暗條件下培養(yǎng)3 4天；形成較大的菌落；(2)形成較大的菌落后，將菌絲塊轉(zhuǎn)接到300mL分泌蛋白液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基；分泌蛋白液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基由以下部分組成酵母浸膏0. 5 -lmg/L、葡萄糖25-30g /L、NaH2PCM 0. 5 一 0. 75g/L、MgS04 ·7Η20 0. 25 — 0. 4g/L、天門(mén)冬酰胺 1. 5 — 2g/L、VBl 1· 5 — 2mg/L、H20 1L, 于，120rpm振蕩培養(yǎng)2周；(3)用雙層滅菌濾紙濾去菌絲體，濾液經(jīng)5000rpm離心20min，上清液加入100%飽和硫酸銨溶液，于10000 rpm離心30min，沉淀經(jīng)透析帶IKD處理，凍干后獲得煙草疫霉致病性分泌蛋白提取物，-20°C保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)煙草疫霉產(chǎn)生致病性分泌蛋白的方法。其方法是將煙草黑脛病樣帶回實(shí)驗(yàn)室，用自來(lái)水沖洗干凈病株莖稈表面。待風(fēng)干后從病健交界處取0.4cm×0.4cm髓部組織塊置于燕麥培養(yǎng)基，置于28℃黑暗條件下培養(yǎng)3～4天，形成較大的菌落后，將菌絲塊轉(zhuǎn)接到300mL分泌蛋白液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于28℃，120rpm振蕩培養(yǎng)2周，用雙層滅菌濾紙濾去菌絲體，濾液經(jīng)5000rpm離心10min，上清液加入硫酸銨，10000rpm離心20min，沉淀經(jīng)透析處理，凍干后獲得煙草疫霉的分泌蛋白，-20℃保存。此方法可以誘導(dǎo)煙草疫霉菌大量產(chǎn)生致病性分泌蛋白，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外煙草疫霉致病機(jī)理研究中不能獲得分泌蛋白的空白，具有重大意義。
文檔編號(hào)C12P21/00GK102321711SQ20111025506
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月31日
發(fā)明者周曉罡, 常壽榮, 徐潔, 王紹坤, 羅華元 申請(qǐng)人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所, 紅云紅河煙草(集團(tuán))有限責(zé)任公司