專利名稱：提高小球藻中總油脂、亞油酸或α-亞麻酸的含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物編碼基因在小球藻中的應(yīng)用。具體地，涉及將一個(gè)來(lái)源于擬南芥 (Arabidopsis thaliana)的具有完整閱讀框架的基因AtLECl構(gòu)建成小球藻表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入小球藻，使小球藻的亞油酸(LA)和α-亞麻酸(ALA)含量，及總油脂含量顯著提高。
背景技術(shù)：
微藻的光合作用效率高，生長(zhǎng)周期短，單位面積年產(chǎn)量是糧食的幾十倍乃至上百倍，而且微藻脂類含量在10% 70%，這是陸地植物遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到的。它具有產(chǎn)能大、無(wú)污染、可再生、易培養(yǎng)、含有較多的脂類物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)。它生長(zhǎng)和繁殖在水域中，不會(huì)引起與農(nóng)業(yè)、牧業(yè)用地競(jìng)爭(zhēng)的矛盾。由于以上多方面的優(yōu)勢(shì)，微藻被認(rèn)為是當(dāng)今最有開(kāi)發(fā)前途的能源之一 [1]。本發(fā)明使用的小球藻是一種單細(xì)胞真核藻類，繁殖速度快，以無(wú)性生殖方式進(jìn)行繁殖，可以進(jìn)行光自養(yǎng)培養(yǎng)和無(wú)光照的異養(yǎng)培養(yǎng)，可規(guī)模化生產(chǎn)，本實(shí)驗(yàn)室有成熟的培養(yǎng)、篩選和轉(zhuǎn)化技術(shù)β]?；蚬こ碳夹g(shù)已被廣泛應(yīng)用于作物改良，并取得了許多顯著的成效，而通過(guò)基因工程技術(shù)提高真核藻類總的油脂含量的研究很少有報(bào)道 ]。Jarvis等曾將硅藻 C. cryptica ^ acclcryptica 禾口 Navicula saprophila/K 平上均檢測(cè)到該基因的過(guò)量表達(dá)，但兩種轉(zhuǎn)基因硅藻的油含量并沒(méi)有顯著增加，這是首次嘗試?yán)没蚬こ碳夹g(shù)提高硅藻含油量的研究，然而未達(dá)到理想結(jié)果M。目前提高藻類油脂含量的最有成效的手段，是通過(guò)調(diào)控培養(yǎng)過(guò)程、培養(yǎng)條件、營(yíng)養(yǎng)成分等手段提高藻類的油含量[5_6]。然而在這些手段中都不可避免的產(chǎn)生一個(gè)問(wèn)題，那就是提高含油量要以生物量的降低為代價(jià)，當(dāng)生物量增加時(shí)，油脂的含量就會(huì)比較低[7<。而基因工程技術(shù)有望解決這個(gè)問(wèn)題。目前尚未檢索到利用基因工程手段提高藻類油脂含量并且總生物量不減少的成功報(bào)道。轉(zhuǎn)錄調(diào)控是許多生物學(xué)調(diào)控的關(guān)鍵步驟，轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控特定代謝途徑中的一系列相關(guān)基因的表達(dá)，使得該代謝途徑從整體水平上發(fā)生改變。LECl(Leafy Cotyledon 1) 是轉(zhuǎn)錄激活因子HAP3(CCAAT-BoX結(jié)合因子)基因家族的一個(gè)成員，在胚胎發(fā)育早期LECl 維持胚柄細(xì)胞的特性以及子葉的特性，而在胚胎發(fā)育的后期LECl基因的表達(dá)與儲(chǔ)藏物質(zhì)的積累、胚抗脫水性的獲得等種子成熟過(guò)程相關(guān)M。Loton等在擬南芥中過(guò)量表達(dá)LECl的幼苗體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了油體蛋白和貯藏蛋白等種子特異RNA的積累，但是過(guò)表達(dá)的種子發(fā)芽率很低，植株生長(zhǎng)很弱，最終不育或者死亡_。Mu等的研究表明，發(fā)育早期誘導(dǎo)過(guò)量表達(dá)擬南芥LECl基因可影響ABI3、FUS3和WRINKLED1等轉(zhuǎn)錄因子，提高脂肪酸合成相關(guān)基因表達(dá)的整體水平，葉片中的油脂含量得到顯著提高[11]。Shen等將玉米ZwLECl基因置于胚特異性的弱啟動(dòng)子EPAl之下，獲得高含油量的轉(zhuǎn)基因玉米，但是植株葉片減小到野生型的一半左右；將玉米ZwLECl基因置于胚特異性的強(qiáng)啟動(dòng)子OLE之下，種子萌發(fā)和葉片生長(zhǎng)發(fā)生了非常嚴(yán)重的缺陷[12]。Tan等將油菜來(lái)源的&1LEC1基因置于種子特異性的啟動(dòng)子napinA之下在芥菜中表達(dá)，結(jié)果轉(zhuǎn)基因植株在發(fā)芽后出現(xiàn)嚴(yán)重異常，全部死亡或者不育；因此對(duì)啟動(dòng)子napinA進(jìn)行了一系列的改造，當(dāng)啟動(dòng)強(qiáng)度只有原來(lái)的18%時(shí)，植株生長(zhǎng)繁殖正常并且油含量得到顯著提高[13]。在高等植物中，最重要的事件是種子發(fā)育并成熟以及再次萌發(fā)，LECl 基因在強(qiáng)啟動(dòng)子下啟動(dòng)表達(dá)的后果都是致死的。小球藻是低等真核植物，不需要形成種子并且是無(wú)性繁殖，不存在LECl基因在強(qiáng)啟動(dòng)子下過(guò)表達(dá)造成致死的因素。目前尚未檢索到利用擬南芥編碼的LECl基因轉(zhuǎn)化藻類并提高油脂含量的研究。多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)是指含有兩個(gè)或兩個(gè)以上雙鍵且碳鏈長(zhǎng)為18 22個(gè)碳原子的直鏈脂肪酸，主要包括亞油酸(Linoleic Acid, LA, 18:2Δ9’12)、Y-亞麻酸(Y-Linolenic Acid，GLA，18:3 Δ6’9’12)、花生四烯酸(Arachidonic Acid,八八，20:4厶5’8’11’14)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid, EPA, 205 Δ 5'8'lia4' 17)、二十二碳六烯酸(Decosahexaenoic Acid, DHA, 20 5 Δ 4'7'10'13'16'19)等。其中，亞油酸及亞麻酸被公認(rèn)為人體必需脂肪酸(Essential fatty acids，EFA)，可進(jìn)一步衍化成具有不同功能的高度不飽和脂肪酸，如AA、EPA、0撤等[14]。藻類含有豐富的多不飽和脂肪酸，主要包括亞油酸(Linoleic acid, LA，18 2 Δ 9'12)、Y -亞麻酸(y-Llinolenic Acid, GLA, 18:3 Δ6'9'12)等。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)AtLECl使小球藻的亞油酸(LA)和α -亞麻酸(ALA)含量， 及總油脂含量顯著提高。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供基因AtLECl用于提高小球藻中總油脂、亞油酸或α-亞麻酸的含量的應(yīng)用。脂肪酸的檢測(cè)主要采用GC-MS (氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù))來(lái)完成。其原理是通過(guò)GC(氣相色譜)將不同的脂肪酸組分分離，然后通過(guò)MS(質(zhì)譜)檢測(cè)器分別對(duì)每種組分進(jìn)行質(zhì)譜定性分析，從而確定每一種組分的成分及含量的比較成熟的聯(lián)用分析技術(shù)。索氏抽提法(Soxhlet extractor method)是公認(rèn)測(cè)定油脂含量的經(jīng)典方法，目前被國(guó)內(nèi)外普遍采用。利用溶劑回流及虹吸原理，使固體物質(zhì)連續(xù)不斷地被純?nèi)軇┹腿?，最后萃取出的物質(zhì)富集在燒瓶中。具體地，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及AtLECl基因在提高小球藻中總油脂、亞油酸或 α-亞麻酸的含量的應(yīng)用。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種提高小球藻中總油脂、亞油酸或α-亞麻酸的含量的方法，其特征在于將AtLECl基因轉(zhuǎn)化到小球藻中。在本發(fā)明的應(yīng)用及方法的一個(gè)具體實(shí)施方案中，AtLECl基因是擬南芥來(lái)源的。更優(yōu)選地，AtLECl基因的序列為SEQ ID NO=I所示的序列，其編碼的蛋白序列為SEQ ID NO 2所示的序列。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述AtLECl基因包含在植物表達(dá)載體中。所述表達(dá)載體可以是引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的任一種表達(dá)載體。優(yōu)選地，所述表達(dá)載體可以是植物表達(dá)載體 pBmi9、pBI121、pBI221，pCambia 1300，pGreen。優(yōu)選地為 pGreenO(^9。本發(fā)明的載體也可含有適當(dāng)?shù)膯?dòng)子。在本發(fā)明中可使用任何一種強(qiáng)啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子包括但不限于花椰菜花葉病毒(CaMV 35S) WbiqutiruActin啟動(dòng)子。它可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。本發(fā)明的表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒，植物病毒載體，直接的DNA轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等方式導(dǎo)入植物細(xì)胞。在又一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述小球藻選自橢圓小球藻(Chlorella ellipsoidea)，普通小球藻(Chlorella vulgaris)和蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)。附件說(shuō)明圖 1 含 AtLECl 基因的載體 p^-AtLECl。圖2含nos終止子的載體圖構(gòu)建過(guò)程。圖3空載(UN CK)植物表達(dá)載體圖構(gòu)建過(guò)程。圖4基因AtLECl的植物表達(dá)載體圖構(gòu)建過(guò)程。圖5轉(zhuǎn)基因藻株的PCR檢測(cè)。M =Marker, 1-3 陽(yáng)性藻株，CK 陰性對(duì)照。圖6轉(zhuǎn)基因藻株的RT-PCR檢測(cè)。M =Marker, 1-4 陽(yáng)性藻株，CK 陰性對(duì)照。圖7轉(zhuǎn)基因藻株的Southern檢測(cè)。第四泳道為對(duì)照，其它均為陽(yáng)性藻株。1: LECl-I (EcoR 1),2 =LECl-I (Xba I)，3 :LEC1_3 (Xho I)，4:UN CK (Xho I)，5 :LEC1_3 (EcoR I) ,6 :LECl-8(Xba I)，7 :LEC1_8(Xho I)，8 :LEC1_9(EcoR I)，9 :LEC1_9(Xba I)。圖8轉(zhuǎn)基因藻株和對(duì)照生長(zhǎng)曲線。圖9純化多代的轉(zhuǎn)基因藻株脂肪酸GC-MS測(cè)定結(jié)果比較。SEQ ID NO 1. AtLECl 核苷酸序列。SEQ ID NO 2. AtLECl 氨基酸序列。SEQ ID NO :3. nos終止子片段克隆所用正向引物。SEQ ID NO :4. nos終止子片段克隆所用反向引物。SEQ ID NO :5. ubi啟動(dòng)子片段的克隆所用正向引物。SEQ ID NO :6. ubi啟動(dòng)子片段的克隆所用反向引物。SEQ ID NO :7.從pEB-AtLECl載體中擴(kuò)增基因AtLECl的正向引物。SEQ ID NO :8.從pEB-AtLECl載體中擴(kuò)增基因AtLECl的反向引物。SEQ ID NO :9.從基因AtLECl內(nèi)部擴(kuò)增的正向引物。SEQ ID NO :10.從基因AtLECl內(nèi)部擴(kuò)增的反向引物。
具體實(shí)施例方式下面參考實(shí)施例和附圖詳細(xì)描述本發(fā)明。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解的是， 下述實(shí)施例是舉例說(shuō)明的目的，其不應(yīng)以任何方式解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍由后附的權(quán)利要求所限定。實(shí)施例1. AtLECl基因小球藻載體的構(gòu)建1.按照公開(kāi)的序列(NCBI Reference Sequence :NM 102046. 4)合成基因 AtLECl， 并連入T載體(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，構(gòu)成含有基因AtLECl的載體 pEB-AtLECl，測(cè)序驗(yàn)證基因AtLECl序列為SEQ IDNO 1，所表達(dá)的蛋白序列為SEQ ID NO :2， 該質(zhì)粒載體圖見(jiàn)
圖1。2.以 pGreenO(^9 (購(gòu)自 the John Innes Centre)為基礎(chǔ)載體，構(gòu)建含 Ubiquitin 啟動(dòng)子和nos終止子的對(duì)照載體pG^-UN-CK。用高保真酶Pfu(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)從載體pGreenOO^上擴(kuò)增nos終止子，用引物SEQ ID N0:3(正向引物)和SEQ ID N0:4(反向引物)。PCR反應(yīng)體系如下
權(quán)利要求
1.LAtLECl基因在提高小球藻中總油脂、亞油酸或α-亞麻酸的含量的應(yīng)用。
2.提高小球藻中總油脂、亞油酸或α-亞麻酸的含量的方法，其特征在于將AtLECl基因轉(zhuǎn)化到小球藻中。
3.權(quán)利要求1的應(yīng)用或權(quán)利要求2的方法，其中所述AtLECl基因來(lái)自擬南芥 (Arabidopsis thaliana)。
4.權(quán)利要求1的應(yīng)用或權(quán)利要求2的方法，其中所述AtLECl基因的序列為SEQID NO 1所示的序列，其編碼的蛋白序列為SEQ ID NO 2所示的序列。
5.權(quán)利要求1的應(yīng)用或權(quán)利要求2的方法，其中所述AtLECl基因包含在植物表達(dá)載體中。
6.權(quán)利要求5的應(yīng)用或方法，其中所述表達(dá)載體選自植物表達(dá)載體pBIN19、pBI121、 pBI221, pCambia 1300，pGreen，優(yōu)選地為 pGreen0029。
7.權(quán)利要求6的應(yīng)用或方法，其中所述載體包含啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子選自花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子CaMV 35S、Ubiqutin啟動(dòng)子、或Actin啟動(dòng)子。
8.權(quán)利要求1的應(yīng)用或權(quán)利要求2的方法，其中所述小球藻選自橢圓小球藻(Chlorella ellipsoidea),普通小球藻(Chlorella vulgaris)或蛋白核小球藻 (Chlorella pyrenoidosa)。
全文摘要
本發(fā)明提供了AtLEC1基因在提高小球藻油脂含量中的應(yīng)用。該基因來(lái)源于擬南芥(Arabidopsis thaliana)，是CCAAT-Box結(jié)合因子HAP3家族的一個(gè)成員。AtLEC1基因轉(zhuǎn)化小球藻可以提高亞油酸(LA)和α-亞麻酸(ALA)含量，同時(shí)提高藻株的總油脂含量。本發(fā)明可應(yīng)用于采用基因工程技術(shù)以藻類表達(dá)體系生產(chǎn)多不飽和脂肪酸和生物柴油。
文檔編號(hào)C12R1/89GK102277378SQ20111023664
公開(kāi)日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月17日
發(fā)明者宋麗英, 尹維波, 左建儒, 張建輝, 白麗莉, 胡贊民, 陳宇紅 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所