專利名稱：以MyD88TIR二聚化為靶點(diǎn)的抗炎抑制劑篩選模型及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以MyD88 TIR 二聚化為靶點(diǎn)的抗炎抑制劑篩選模型及應(yīng)用，以實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞原位的、基于熒光信號(hào)變化的MyD88 二聚化抑制物的高通量篩選。
背景技術(shù)：
IL-IR類受體和Toll-like受體(TLRs)共屬于同一超家族，IL-1R亞家族包括 IL-I β和IL-18的受體及其它成員，介導(dǎo)急性和慢性炎癥反應(yīng)。Toll-like受體亞家族有 10個(gè)成員，識(shí)別病源微生物或其代謝產(chǎn)物(如內(nèi)毒素LPS)，介導(dǎo)天然免疫。當(dāng)IL-IR類受體和 Toll-like 受體與配體結(jié)合后，其胞內(nèi)的 TIR(Toll/IL-lreceptor homologous region) 結(jié)構(gòu)域發(fā)生構(gòu)象改變，招募存在于胞漿內(nèi)的也含有TIR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白分子，這一過(guò)程對(duì)信號(hào)向胞內(nèi)的傳遞至關(guān)重要。0，Neill LA :The interleukin-lreceptor/Toll-like receptor superfamily 10 years of progress. Immunol Rev 2008, 226 10-18.接頭蛋白分子主要包括 MyD88 (myeloid differentiation primary response protein 88) > Mal (MyD88-adaptor-like), ik ^ TIRAP> TRIF (TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β )、TRAM(trif-related adaptor molecule)、SARM(sterile α andHEAT-Armadillo motifs)[2.0' Neill LA, Bowie AG :The family of five TIR-domain—containing adaptors in Toll—like receptor signal1ing. Nat Rev Immunol 2007,7(5) :353_364.3. Watters TM,Kenny EF,0' Neill LA !Structure,function and regulation of the Toll/IL-lreceptor adaptor proteins. Immunol Cell Biol 2007,85(6) :411_419·], 不同的接頭蛋白決定了不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑-MyD88依賴信號(hào)途徑和MyD88非依賴途徑。接頭蛋白分子家族中第一個(gè)被鑒定的是MyD88，最初發(fā)現(xiàn)為骨髓分化時(shí)表達(dá)的蛋白[4. Lord ΚΑ, Hoffman-Liebermann B, Li ebermann DA :Nucleotide sequence and expression of a cDNA encoding MyD88, a novel myeloid differentiation primary response gene induced by IL6. Oncogene 1990,5(7) :1095_1097.]，故而得名。對(duì) MyD88 依賴的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制目前為止研究的最為成熟，在胞外信號(hào)配體刺激下，MyD88可通過(guò)自身 C末端的TIR結(jié)構(gòu)域相互作用發(fā)生二聚化，并且MyD88的TIR結(jié)構(gòu)域和受體復(fù)合物的TIR結(jié)構(gòu)域也發(fā)生同源性蛋白-蛋白相互作用。MyD88分子N末端的死亡結(jié)構(gòu)域(Dead Domain, DD結(jié)構(gòu)域)再與IRAK家族DD結(jié)構(gòu)域發(fā)生同源性相互作用，形成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物，向下傳遞活化信號(hào)，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子AP-I和NF-k B的活性，誘導(dǎo)致炎細(xì)胞因子，如IL-1、IL_6、IL-8、 IL-12和TNF- α等基因的表達(dá)。接頭蛋白MyD88是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵蛋白，其TIR結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的MyD88的二聚化是其被招募到受體的胞漿尾部的前提條件[5. Takeda K5Akira S TLR signaling pathways. Semin Immuno 12004，16 (1) :3_9· ]。MyD88 作為一種重要的接頭蛋白，一方面?zhèn)鬟f了 TLRs介導(dǎo)的先天免疫信號(hào)，另一方面也參與了 IL-18受體介導(dǎo)的非感染性炎癥信號(hào)的傳遞。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis, RA) [6. Leung BP, Culshaw S,Gracie JA,Hunter D, Canetti CA, Campbell C,Cunha F,Liew FY, McInnes IB :A rolefor IL-18 in neutrophil activation. JImmunol 2001,167(5) :2879_2886·]、系統(tǒng)性紅斑狼疫(Systmetic Lupus) [7. Favilli F，Anzilotti C，Martinelli L，Quattroni P，De Martino S，Pratesi F，Neumann D，Beermann S，Novick D，Dinarello CA et al :IL_18 activity in systemic lupus erythematosus. Ann N Y Acad Sci2009，1173 :301_309· ]、I 型糖尿病(Type I Diabetes) [8. Rothe H，Jenkins NAiCopeland NGiKolb H :Active stage of autoimmune diabetes is associated with the expression of a novel cytokine, IGIF，which is located near Idd2. J Clin Invest 1997,99(3) :469_474·]及動(dòng)脈粥狀硬化(Atherosclerosis)[9. Kleemann R，Zadelaar S，Kooistra T :Cytokines and atherosclerosis :a comprehensive review of studies in mice. Cardiovasc Res 2008， 79(3) :360-376.]等慢性炎癥和自身免疫性疾病的炎性放大過(guò)程都與MyD88依賴的信號(hào)通路相關(guān)。目前很多研究根據(jù)MyDSSTIR結(jié)構(gòu)域氨基酸序列設(shè)計(jì)合成的TIR結(jié)構(gòu)類似物導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，這些結(jié)構(gòu)類似物競(jìng)爭(zhēng)性地占據(jù)了 MyDSSTIR 二聚化的位點(diǎn)，從而抑制了 MyD88依賴的IL-I β和IL-18的促炎效應(yīng)[11. Davis CN, Mann E, Behrens MM, Gaidarova S, Rebek Μ, Rebek J, Jr., Bartfai T :MyD88-dependent arid—independent signaling by IL-I in neurons probed by bifunctional Toll/IL-1 receptor domain/BB-loop mimetics. Proc Natl Acad Sci USA 2006,103(8) :2953_2958. 12. Loiarro M, Sette C, Gallo G, Ciacci A, Fanto N, Mastroianni D, Carminati P, Ruggiero V:Peptide-mediated interference of TIR domain dimerization in MyD88 inhibits interleukin-l-dependent activation of NF-{kappa}B. J Biol Chem 2005,280(16) 15809-15814.13. Loiarro M, Capolunghi F, Fanto N, Gallo G, Campo S, Arseni B, Carsetti R, Carminati P, De Santis R, Ruggiero V et al :Pivotal Advance inhibition of MyD88 dimerization and recruitment of IRAKI and IRAK4by a novel peptidomimetic compound. J Leukoc Biol 2007,82 (4) :801-810.]。有些這樣的工作就其所研究的有效抑制MyD88 二聚化的具體化合物進(jìn)行了專利申報(bào)。FRET技術(shù)是一種檢測(cè)生物大分子間是否存在直接相互作用的實(shí)驗(yàn)手段[10. Mahajan NP, Linder K, Berry G, Gordon Gff, Heim R, Herman B :Bcl-2and Bax interactions in mitochondria probed with green fluorescent protein and fluorescence resonance energy transfer. Nat Biotechnoll998,16(6) :547_552·],近年來(lái)，F(xiàn)RET技術(shù)常常被用來(lái)設(shè)計(jì)精巧的藥物篩選模型，例如，熒光蛋白供體-受體對(duì)(如 CFP-YFP)可被構(gòu)建成融合蛋白質(zhì)粒，中間由一段短肽(caspse酶的作用位點(diǎn)L/DEVD)連接， 這種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)后，caspase酶如果活化，CFP和YFP分離，F(xiàn)RET不能實(shí)現(xiàn)， caspase酶活性如被抑制，F(xiàn)RET可以實(shí)現(xiàn)，從而可以進(jìn)行caspase抑制劑的篩選[14. Xu X, Gerard AL, Huang BC, Anderson DC, Payan DG, Luo Y -Detection of programmed cell death using fluorescence energy transfer. Nucleic Acids Res 1998，26(8) :2034-2035.15. He L,ffu X, Meylan F, Olson DP, Simone J, Hewgill D, Siegel R, Lipsky PE:Monitoring caspase activity in living cells using fluorescent proteins and flow cytometry. Am J Pathol 2004,164(6) : 1901—1913. 16. Jones J, Heim R，Hare E，Stack J, Pollok BA :Development and application of a GFP-FRET intracellular caspase assay for drug screening. J Biomol Screen 2000,5(5) :307_318.]。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Re Energy Transfer, FRET)技術(shù)，提供一種以MyD88TIR 二聚化為靶點(diǎn)的抗炎抑制劑篩選模型；因?yàn)镸yD88被招募到膜受體胞漿尾部是IL-18受體等活化后信號(hào)傳遞通路的第一個(gè)信號(hào)事件，阻斷這一環(huán)節(jié)就抑制了信號(hào)在胞內(nèi)的繼續(xù)發(fā)散和向下傳遞，又因?yàn)镸yDSSTIR的二聚化是MyD88 與膜受體結(jié)合的前提，所以，MyDSSTIR 二聚化的抑制可考慮作為上述慢性非感染性炎癥和自身免疫性疾病治療一個(gè)有效靶點(diǎn)；模型的建立將利于MyD88信號(hào)通路參與的慢性炎癥、自身免疫性疾病的藥物篩選，也會(huì)為MyD88信號(hào)傳遞相關(guān)的基礎(chǔ)研究提供便利的科研工具；我們向細(xì)胞內(nèi)同時(shí)轉(zhuǎn)染兩個(gè)質(zhì)粒熒光蛋白供體為GFP-MyD88TIR，熒光蛋白受體為 RFP-MyD88TIR,建立兩種熒光蛋白雙陽(yáng)性穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，即可獲得以MyD88TIR 二聚化為靶點(diǎn)的抗炎抑制劑篩選模型，要篩查的抑制劑作用靶點(diǎn)是MyD88分子的二聚化。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，利用所構(gòu)建的以MyDSSTIR 二聚化為靶點(diǎn)的抗炎抑制劑篩選模型，進(jìn)行活細(xì)胞原位熒光信號(hào)分析，可以快速得到有效抑制MyDSSTIR 二聚化，進(jìn)而影響MyD88依賴的信號(hào)通路以及最終的生物學(xué)效應(yīng)的化合物；即針對(duì)MyD88 二聚化過(guò)程的阻斷，建立一種基于細(xì)胞培養(yǎng)的、高通量的篩選模型，利用這一模型可以對(duì)商品化的小分子庫(kù)或自行制備的天然產(chǎn)物組分進(jìn)行廣泛的篩選，篩查出未知的阻斷MyD88 二聚化的抑制物。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的以MyD88 TIR 二聚化為靶點(diǎn)的抗炎抑制劑篩選模型，是依賴于一種被稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Re Energy Transfer, FRET) 的分子細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，建立活細(xì)胞原位的、基于熒光信號(hào)變化的MyD88 TIR 二聚化阻斷的檢測(cè)模型；其特征在于可以外源轉(zhuǎn)染一對(duì)目的蛋白基因，二者分別與一熒光供體和熒光受體蛋白基因GFP/RFP(或CFP/YFP)融合。這樣，兩種生物大分子的距離足夠近，即小于lOnm，為兩種分子直接相互作用的距離時(shí)，在熒光供體的激發(fā)光照射下可以產(chǎn)生熒光受體的發(fā)射光信號(hào)；其具體步驟如下首先構(gòu)建綠色熒光蛋白與MyD88 TIR的融合蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒(以下簡(jiǎn)稱GFP-MyD88 TIR)和紅色熒光蛋白與MyD88 TIR的融合蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒(以下簡(jiǎn)稱RFP-MyD88 TIR)；再將二者共同轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞即HeLa，建立兩種熒光蛋白雙陽(yáng)性穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。如果培養(yǎng)條件中不存在小分子抑制物，MyD88 TIR發(fā)生二聚化，488nm激發(fā)光(藍(lán)光)照射下GFP_MyD88 TIR發(fā)出的綠色熒光會(huì)有一部分作為 RFP-MyD88 TIR的激發(fā)光被吸收，進(jìn)而發(fā)出紅色熒光，綠熒光減弱，即FRET發(fā)生；而如果培養(yǎng)條件中有小分子抑制物存在的話，MyDSSTIR無(wú)法發(fā)生二聚化，488nm激發(fā)光(藍(lán)光)照射下GFP-MyD88 TIR發(fā)出的綠色熒光不會(huì)轉(zhuǎn)移給RFP_MyD88 TIR,無(wú)紅色熒光發(fā)出，細(xì)胞產(chǎn)生正常的綠色熒光。原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌并純化獲得重組蛋白，進(jìn)行體外蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的驗(yàn)證分析當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞中FRET現(xiàn)象被某種添加的化合物阻斷了，尚不能得出是這種
5化合物直接阻斷了 MyDSSTIR的二聚化結(jié)論，因?yàn)檫@種化合物可能引發(fā)了某種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)，間接地影響了 MyD88TIR的二聚化；因此利用一個(gè)His_MyD88 TIR和GST_MyD88 TIR重組蛋白體外相互作用分析加以驗(yàn)證在非變性緩沖液中，可以加入上述熒光篩選模型認(rèn)為有效阻斷MyD88 二聚化的化合物，如果化合物能直接阻斷MyD88TIR的二聚化，則His_MyD88 TIR體外條件下不能正常結(jié)合GST-MyD88 TIR,進(jìn)行His_MyD88 TIR的Pull-down產(chǎn)物的 western blot分析，不能檢測(cè)到GST抗體識(shí)別的信號(hào)；如果化合物不能直接阻斷MyD88 二聚化，His-MyD88 TIR體外條件下能夠正常結(jié)合GST_MyD88 TIR，進(jìn)行His_MyD88TIR的 Pull-down產(chǎn)物的western blot分析，則可以檢測(cè)到GST抗體識(shí)別的信號(hào)；經(jīng)此驗(yàn)證模型， 確切的MyDSSTIR 二聚化抑制劑就可得以判定。實(shí)驗(yàn)材料與方法(1)試劑與抗體細(xì)胞轉(zhuǎn)染用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購(gòu)于Invitrogen公司。GST多克隆抗體、 MyD88多克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz公司。谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B珠子(GST-S印harose 4B)購(gòu)于Amersham公司。Ni-NTA珠子購(gòu)于Qiagen公司。辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗購(gòu)于 Sigma公司。其他分析純化學(xué)試劑來(lái)自于北京化工廠、生化試劑來(lái)自于Amresco公司或BBI 公司。(2)細(xì)胞培養(yǎng)HeLa細(xì)胞購(gòu)于上海細(xì)胞研究所，培養(yǎng)于含10%小牛血清的IMDM培養(yǎng)基(Gibco公司)中，并添加10%的雙抗(即，青霉素100U/ml、100ug/ml鏈霉素)。培養(yǎng)箱內(nèi)空氣保證濕度和5%的CO2含量。(3)質(zhì)粒構(gòu)建MyDSSTIR結(jié)構(gòu)域片斷通過(guò)以人源cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度 bp。引物設(shè)計(jì)參照核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)信息(NCBI登錄號(hào)NM_002468)。將外源片斷利用限制酶位點(diǎn)Hind III和BamH I插入pEGFP-Cl載體(購(gòu)于美國(guó)BDBioscience公司)，構(gòu)建綠色熒光蛋白GFP-MyD88TIR融合蛋白表達(dá)重組子；將外源片斷利用限制酶位點(diǎn)Hind III和BamH I插入pVisionRFP-C載體(購(gòu)于美國(guó)BioVision公司)，構(gòu)建紅色熒光蛋白R(shí)FP_MyD88TIR 融合蛋白表達(dá)重組子。將外源片斷利用限制酶位點(diǎn)BamH I和EcoR I插入到pEGX_6p-l原核表達(dá)載體(購(gòu)于美國(guó)GE Healthcare公司)以及利用限制酶位點(diǎn)BamH I和Xho I插入到 pET-28a原核表達(dá)載體(購(gòu)于德國(guó)Merck公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，可獲得GST_MyD88TIR 融合重組蛋白和His-MyD88 TIR融合重組蛋白。質(zhì)粒構(gòu)建及大腸桿菌轉(zhuǎn)化等方法按常規(guī)分子克隆技術(shù)進(jìn)行。(4)GFP及其融合蛋白質(zhì)粒、RFP及其融合蛋白質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及熒光顯微術(shù)接種5X IO4個(gè)細(xì)胞于48孔培養(yǎng)板的每孔，無(wú)抗生素培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染利用Invitroge公司的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000，按說(shuō)明書操作進(jìn)行。每種質(zhì)粒的用量為0. 5μ g。轉(zhuǎn)染4-6小時(shí)后更換含抗生素和10%血清的IMDM培養(yǎng)基。次日，在倒置熒光顯微鏡(Nikon TE 2000U)的488nm及510nm激發(fā)光下觀察各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光情況。(5)重組蛋白的表達(dá)純化原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，接種于IOOmL含卡鈉霉素的LB培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)3小時(shí)。加入200 μ 1 0. 5Mol IPTG繼續(xù)培養(yǎng)2-3小時(shí)，誘導(dǎo)表達(dá)。
His-MyD88 TIR的純化離心收集菌體后800 μ 1緩沖液A (IOmMol Tris-HCl (pH8. 0),500mMol NaCl，10% 甘油，0· 1% Tween-20, IOmMol 咪唑，0· 1% β -巰基乙醇，10 μ Mol ZnSO4與ImMol PMSF現(xiàn)用現(xiàn)加)重懸，超聲10秒，間歇10秒，共3分鐘，功率300W。加入終濃度為的Triton-XlOO混勻，13000rpm, 10min，4°C離心。轉(zhuǎn)移上清到新的EP管中，加入Ni-NTA珠子，4°C搖2-3小時(shí)。離心純化His重組蛋白。緩沖液A洗珠子 3-5 次，再用緩沖液 E(20mMol HEPES_K0HpH(7. 5)，20 % 甘油，IOOmMol NaCl, IOmMol 咪唑，ImMol EDTA, ImMol DTT, 10 μ Mol ZnSO4 與 ImMol PMSF 現(xiàn)用現(xiàn)加)洗珠子 3 次。純化的結(jié)合于Ni-NTA珠上的His重組蛋白可用于Pull-down實(shí)驗(yàn)。GST-MyD88 TIR 的純化誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體通過(guò)離心獲得，加入800 μ 1細(xì)菌裂解液(20mMHEPES(pH7. 5)， 120mM NaCl，10%甘油，2mM EDTA, ImM PMSF)，重懸，超聲10秒，間歇10秒，超聲6次，功率 300W。加入終濃度為0. 5%的NP-40混勻，13000rpm，10min，4°C離心。轉(zhuǎn)移上清到新的EP 管中，加入50%谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B珠子在4°C搖床上搖動(dòng)1-2小時(shí)。離心純化GST重組蛋白。先用含有0. 5% NP-40的裂解液洗滌珠子3次，再用不含0. 5% NP-40的裂解液洗滌珠子3次。純化的結(jié)合于谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠上的GST重組蛋白可用于Pull-down實(shí)驗(yàn)。(6)重組蛋白體外相互作用分析首先，將GST融合蛋白從瓊脂糖珠上洗脫。取0. 1 μ g GST-MyD88-TIR離心吸去上清，加入等體積的谷氨酰胺洗脫緩沖液(IOmMol還原型谷胱甘肽，50mMol Tris-HCl (ρΗ8· 0))，冰上漩渦振蕩30分鐘，離心后吸上清至500 μ 1 GBT buffer,再加入 1 μ g封閉后的His融合蛋白Ni-NTA珠，4°C搖床上搖動(dòng)2_3個(gè)小時(shí)。GBT緩沖液洗2次，緩沖液A洗一次，緩沖液E洗一次，每次于冰上搖動(dòng)約5分鐘。離心后加入20 μ 1上樣緩沖液， 沸水煮5min，免疫印記檢測(cè)GST融合蛋白。本發(fā)明的積極效果是當(dāng)抑制物存在，MyDSSTIR 二聚化不能實(shí)現(xiàn)時(shí)，F(xiàn)RET效率受到嚴(yán)重影響，提示了依賴雙陽(yáng)性表達(dá)GFP-MyD88-TIR和RFP-MyD88-TIR的細(xì)胞株，檢測(cè)不同化合物對(duì)于熒光FRET效率的影響，可以建立MyD88 TIR 二聚化抑制藥物的篩選模型。此外， 我們構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒，利用純化的His-MyD88 TIR與GST_MyD88 TIR體外結(jié)合分析，可以進(jìn)一步確定抑制物是否直接阻斷了 MyD88 TIR的相互作用。結(jié)合真核細(xì)胞的熒光FRET 阻斷結(jié)果和原核表達(dá)的重組蛋白相互作用分析，可確定MyD88 TIR 二聚化的抑制物。根據(jù)以上所述技術(shù)方法，本發(fā)明的技術(shù)方案可以實(shí)現(xiàn)，結(jié)合高通量篩選儀，可以建立一種基于細(xì)胞培養(yǎng)的、活細(xì)胞原位熒光信號(hào)變化的、高通量的篩選模型，利用這一模型可以對(duì)商品化的小分子庫(kù)或自行制備的天然產(chǎn)物組分進(jìn)行廣泛的篩選，篩查出未知的阻斷MyD88 TIR 二聚化的抑制物。
圖IHeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒組合，MyD88 TIR 二聚化可引起GFP_MyD88 TIR和 RFP-MyD88 TIR熒光共振能力轉(zhuǎn)移圖2示意MyD88 TIR 二聚化實(shí)現(xiàn)時(shí)能夠介導(dǎo)綠色熒光蛋白(GFP)發(fā)射的熒光能夠?qū)⒛芰哭D(zhuǎn)移給紅色熒光蛋白(RFP)。
圖3示意MyD88 TIR 二聚化受抑制時(shí)GFP發(fā)射的熒光無(wú)法實(shí)現(xiàn)能量向RFP進(jìn)行的轉(zhuǎn)移圖4非變性緩沖液中，MyD88 TIR可以介導(dǎo)GST_MyD88 TIR和His_MyD88 TIR在體外的結(jié)合，GST的免疫印記(western blot)信號(hào)陽(yáng)性圖5示意體外緩沖液中有抑制物存在時(shí)，固定于珠子上的His-MyD88 TIR無(wú)法將 GST-MyD88 TIR結(jié)合下來(lái)，Western blot將檢測(cè)不到GST信號(hào)圖6示意體外緩沖液中不存在抑制性成分時(shí)，固定于珠子上的His-MyD88 TIR可以將GST-MyD88 TIR結(jié)合下來(lái)，Western blot將檢測(cè)到GST信號(hào)
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述實(shí)施例1 轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的GFP_MyD88 TIR和RFP_MyD88 TIR可以發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移我們按圖1中所示的組合，將構(gòu)建好的GFP-MyD88 TIR, RFP_MyD88 TIR, GFP, RFP 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中。在488nm激發(fā)光下，共轉(zhuǎn)染GFP-MyD88 TIR和RFP_MyD88TIR融合蛋白的細(xì)胞(左側(cè)照片)發(fā)出昏暗的綠色熒光，甚至有些細(xì)胞還發(fā)出橘黃色的光。證明了 GFP發(fā)出的綠色熒光應(yīng)為MyDSSTIR的二聚化將能量傳遞給RFP，實(shí)現(xiàn)了 FRET。而對(duì)照組共轉(zhuǎn)染GFP-MyD88 TIR融合蛋白和空載RFP的質(zhì)粒(中間照片)，或反之，共轉(zhuǎn)染空載GFP和 RFP-MyD88 TIR融合蛋白的質(zhì)粒(右側(cè)照片)，488nm激發(fā)光下觀察，細(xì)胞顯示明亮的綠色熒光。說(shuō)明共轉(zhuǎn)染GFP-MyD88 TIR和RFP或共轉(zhuǎn)染GFP和RFP_MyD88 TIR的細(xì)胞因?yàn)闊o(wú)法形成MyD88 TIR的二聚化，熒光共振能量轉(zhuǎn)移無(wú)法發(fā)生，證明了一旦MyD88 TIR的二聚化受影響，488nm激發(fā)光下GFP發(fā)射的綠色熒光無(wú)法將能量轉(zhuǎn)移給RFP。(分別轉(zhuǎn)染GFP_MyD88 TIR和RFP或者是GFP和RFP_MyD88 TIR的細(xì)胞在488nm激發(fā)光下發(fā)出正常的明亮綠色熒光，證明了 GFP和GFP-MyD88 TIR綠色熒光的有效性；所有轉(zhuǎn)染RFP或者RFP_MyD88 TIR的細(xì)胞在510nm激發(fā)光下能過(guò)發(fā)出正常的紅色熒光，進(jìn)一步證明了 RFP或者RFP_MyD88 TIR 紅色熒光的有效性。)我們完成的圖1所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，可以利用FRET技術(shù)建立一個(gè)活細(xì)胞培養(yǎng)的、基于熒光信號(hào)變化的篩選模型將GFP-MyD88 TIR和RFP_MyD88 TIR共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如HeLa)，建立穩(wěn)定雙表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞株。如圖2和圖3所示，如果細(xì)胞中不存在MyD88 TIR 二聚化抑制物時(shí)，F(xiàn)RET能夠發(fā)生，而當(dāng)抑制物存在時(shí)，F(xiàn)RET受到影響。實(shí)施例2 :His-MyD88 TIR重組蛋白可以與GST-MD88 TIR重組蛋白體外相互作用上述實(shí)施例1所述活細(xì)胞原位熒光模型尚存在一個(gè)問(wèn)題當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞中FRET現(xiàn)象被某種添加的化合物阻斷了，我們尚不能得出結(jié)論，是這種化合物直接阻斷了MyD88 TIR的二聚化，還是這種化合物引發(fā)了某種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)，間接地影響了 MyD88 TIR的二聚化。 針對(duì)這一問(wèn)題，我們可以利用一個(gè)His-MyD88 TIR和GST_MyD88 TIR重組蛋白體外相互作用分析加以驗(yàn)證。為此，我們又構(gòu)建了原核表達(dá)融合蛋白GST_MyD88 TIR和His_MyD88 TIR的質(zhì)粒， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌后誘導(dǎo)蛋白表達(dá)(重組融合蛋白可以被MyD88抗體免疫印記特異識(shí)別，證明 MyD88 TIR的正確表達(dá))。如圖4所示，經(jīng)純化的結(jié)合與Ni-TNA珠上的His_MyD88 TIR重
8組蛋白與純化的洗脫后的GST-MyD88 TIR重組蛋白或GST重組蛋白進(jìn)行孵育，Ni-NTA瓊脂糖珠結(jié)合下來(lái)的蛋白進(jìn)行蛋白電泳和抗GST免疫印記分析，結(jié)果顯示，GST-MyD88 TIR可以被Ni-NTA瓊脂糖珠結(jié)合下來(lái)(左側(cè)泳道)，GST蛋白(右側(cè)泳道)卻不能，說(shuō)明了是MyD88 TIR 二聚化介導(dǎo)了 GST-MyD88 TIR和His_MyD88 TIR融合蛋白的體外結(jié)合我們完成的圖4所示的實(shí)驗(yàn)提示了，利用重組蛋白，進(jìn)行體外蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的驗(yàn)證分析具有可行性在非變性緩沖液中，可以加入上述熒光篩選模型認(rèn)為有效阻斷MyD88 二聚化的化合物。圖5示意體外非變性條件下，如果有抑制物存在時(shí)，His-MyDSS TIR無(wú)法憑借MyD88 TIR的二聚化將GST_MyD88 TIR結(jié)合下來(lái)，結(jié)合物(Pull-down產(chǎn)物)做 western blot分析檢測(cè)不到GST的免疫印記信號(hào)；圖6則示意無(wú)抑制物存在時(shí)，His_MyD88 TIR可以憑借MyD88 TIR的二聚化將GST_MyD88 TIR結(jié)合下來(lái)，結(jié)合物(Pull-down產(chǎn)物) 做western blot分析可以檢測(cè)到GST的免疫印記信號(hào)。以上兩實(shí)施例說(shuō)明，經(jīng)活細(xì)胞熒光篩選模型篩選，再經(jīng)體外重組蛋白驗(yàn)證模型驗(yàn)證，確切的MyD88 TIR 二聚化抑制劑就可以被確定下來(lái)。實(shí)驗(yàn)材料與方法(1)試劑與抗體細(xì)胞轉(zhuǎn)染用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購(gòu)于Invitrogen公司。GST多克隆抗體、 MyD88多克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz公司。谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B珠子(GST-S印harose 4B)購(gòu)于Amersham公司。Ni-NTA珠子購(gòu)于Qiagen公司。辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗購(gòu)于 Sigma公司。其他分析純化學(xué)試劑來(lái)自于北京化工廠、生化試劑來(lái)自于Amresco公司或BBI 公司。(2)細(xì)胞培養(yǎng)HeLa細(xì)胞購(gòu)于上海細(xì)胞研究所，培養(yǎng)于含10%小牛血清的IMDM培養(yǎng)基(Gibco公司)中，并添加10%的雙抗(即，青霉素100U/ml、100ug/ml鏈霉素)。培養(yǎng)箱內(nèi)空氣保證濕度和5%的CO2含量。(3)質(zhì)粒構(gòu)建MyD88 TIR結(jié)構(gòu)域片斷通過(guò)以人源cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度 bp。引物設(shè)計(jì)參照核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)信息(NCBI登錄號(hào)NM_002468)。將外源片斷利用限制酶位點(diǎn)Hind III和BamH I插入pEGFP-Cl載體(購(gòu)于美國(guó)BDBioscience公司)， 構(gòu)建綠色熒光蛋白GFP-MyDSSTIR融合蛋白表達(dá)重組子；將外源片斷利用限制酶位點(diǎn)Hind III和BamH I插入pVisionRFP-C載體(購(gòu)于美國(guó)BioVision公司)，構(gòu)建紅色熒光蛋白 RFP-MyD88TIR融合蛋白表達(dá)重組子。將外源片斷利用限制酶位點(diǎn)BamH I和EcoR I插入到 pEGX-6p-l原核表達(dá)載體(購(gòu)于美國(guó)GE Healthcare公司)以及利用限制酶位點(diǎn)BamH I和 Xho I插入到pET-28a原核表達(dá)載體(購(gòu)于德國(guó)Merck公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，可獲得 GST-MyD88 TIR融合重組蛋白和His_MyD88 TIR融合重組蛋白。質(zhì)粒構(gòu)建及大腸桿菌轉(zhuǎn)化等方法按常規(guī)分子克隆技術(shù)進(jìn)行。(4)GFP及其融合蛋白質(zhì)粒、RFP及其融合蛋白質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及熒光顯微術(shù)接種5X IO4個(gè)細(xì)胞于48孔培養(yǎng)板的每孔，無(wú)抗生素培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染利用Invitroge公司的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000，按說(shuō)明書操作進(jìn)行。每種質(zhì)粒的用量為0. 5μ g。轉(zhuǎn)染4-6小時(shí)后更換含抗生素和10%血清的IMDM培養(yǎng)基。次日，在倒置熒光顯微鏡(Nikon TE 2000U)的488nm及510nm激發(fā)光下觀察各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光情況。(5)重組蛋白的表達(dá)純化原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，接種于IOOmL含卡鈉霉素的LB培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)3小時(shí)。加入200 μ 1 0. 5Mol IPTG繼續(xù)培養(yǎng)2-3小時(shí)，誘導(dǎo)表達(dá)。His-MyD88 TIR的純化離心收集菌體后800 μ 1緩沖液A (IOmMol Tris-HCl (pH8. 0),500mMol NaCl，10% 甘油，0· 1% Tween-20, IOmMol 咪唑，0· 1% β -巰基乙醇，10 μ Mol ZnSO4與ImMol PMSF現(xiàn)用現(xiàn)加)重懸，超聲10秒，間歇10秒，共3分鐘，功率300W。加入終濃度為的Triton-XlOO混勻，13000rpm, 10min，4°C離心。轉(zhuǎn)移上清到新的EP管中，加入Ni-NTA珠子，4°C搖2-3小時(shí)。離心純化His重組蛋白。緩沖液A洗珠子 3-5 次，再用緩沖液 E(20mMol HEPES_K0HpH(7. 5)，20 % 甘油，IOOmMol NaCl, IOmMol 咪唑，ImMol EDTA, ImMol DTT, 10 μ Mol ZnSO4 與 ImMol PMSF 現(xiàn)用現(xiàn)加)洗珠子 3 次。純化的結(jié)合于Ni-NTA珠上的His重組蛋白可用于Pull-down實(shí)驗(yàn)。GST-MyD88 TIR 的純化誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體通過(guò)離心獲得，加入800 μ 1細(xì)菌裂解液(20mMHEPES(pH7. 5)， 120mM NaCl，10%甘油，2mM EDTA, ImM PMSF)，重懸，超聲10秒，間歇10秒，超聲6次，功率 300W。加入終濃度為0. 5%的NP-40混勻，13000rpm，10min，4°C離心。轉(zhuǎn)移上清到新的EP 管中，加入50%谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B珠子在4°C搖床上搖動(dòng)1-2小時(shí)。離心純化GST重組蛋白。先用含有0. 5% NP-40的裂解液洗滌珠子3次，再用不含0. 5% NP-40的裂解液洗滌珠子3次。純化的結(jié)合于谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠上的GST重組蛋白可用于Pull-down實(shí)驗(yàn)。(6)重組蛋白體外相互作用分析首先，將GST融合蛋白從瓊脂糖珠上洗脫。取0. 1 μ g GST-MyD88-TIR離心吸去上清，加入等體積的谷氨酰胺洗脫緩沖液(IOmMol還原型谷胱甘肽，50mMTriS-HCl(pH8. 0))， 冰上漩渦振蕩30分鐘，離心后吸上清至500 μ 1 GBT buffer,再加入1 μ g封閉后的His融合蛋白Ni-NTA珠，4°C搖床上搖動(dòng)2-3個(gè)小時(shí)。GBT緩沖液洗2次，緩沖液A洗一次，緩沖液 E洗一次，每次于冰上搖動(dòng)約5分鐘。離心后加入20 μ 1上樣緩沖液，沸水煮5min，免疫印記檢測(cè)GST融合蛋白。依據(jù)上述妨術(shù)原理IU及實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，IHriau各It型的建立禾π#用方法i羊細(xì)描述如下(1)構(gòu)建綠色熒光蛋白與MyD88TIR的融合蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒(GFP_MyD88 TIR) 和紅色熒光蛋白與MyD88TIR的融合蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒(RFP_MyD88 TIR)，共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，建立和篩選表達(dá)強(qiáng)度適當(dāng)?shù)?、雙陽(yáng)性穩(wěn)定表達(dá)GFP-MyD88 TIR和RFP_MyD88 TIR(或 CFP-MyD88 TIR 和 YFP_MyD88 TIR)細(xì)胞株。(2)獲得上述細(xì)胞株后，將商品化購(gòu)得的小分子庫(kù)或自行制備的天然產(chǎn)物不同成分等被篩物加入到培養(yǎng)基中，結(jié)合高通量篩選設(shè)備和相應(yīng)的計(jì)算機(jī)函數(shù)運(yùn)算，可以實(shí)現(xiàn)高通量的、活細(xì)胞原位的MyD88 二聚化抑制劑的篩選。(3)在上述篩選過(guò)程中，對(duì)熒光FRET有影響的化合物進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)施例2所描述的體外重組蛋白質(zhì)(His-MyD88 TIR和GST_MyD88 TIR)相互作用驗(yàn)證，確認(rèn)對(duì)MyD88 TIR 二聚化抑制的有效性及特異性。
權(quán)利要求
1.以MyDSSTIR二聚化為靶點(diǎn)的抗炎抑制劑篩選模型，其特征在于可以將MyD88分子的TIR結(jié)構(gòu)域(以下稱MyD88 TIR)分別與一熒光供體和熒光受體蛋白基因GFP/RFP (或 CFP/YFP)構(gòu)建融合蛋白質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，建立雙陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞株。如兩種生物大分子(熒光供體分子和熒光受體分子)的距離足夠近，即小于lOnm，為兩蛋白分子直接相互作用的距離，在熒光供體的激發(fā)光照射下可以產(chǎn)生熒光受體的發(fā)射光信號(hào)，即發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)；如果熒光供體分子和熒光受體分子的結(jié)合受到阻礙，則FRET受到影響。其具體步驟如下首先構(gòu)建綠色熒光蛋白與MyDSSTIR的融合蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒(以下簡(jiǎn)稱GFP-MyD88 TIR)和紅色熒光蛋白與MyD88 TIR的融合蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒(以下簡(jiǎn)稱RFP-MyD88 TIR)；再將二者共同轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如HeLa)，并建立雙陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞株。如果培養(yǎng)條件中不存在小分子抑制物，MyD88 TIR發(fā)生二聚化，488nm激發(fā)光(藍(lán)光) 照射下GFP-MyD88 TIR發(fā)出的綠色熒光會(huì)有一部分作為RFP_MyD88 TIR的激發(fā)光被吸收， 進(jìn)而發(fā)出紅色熒光，綠熒光減弱，即FRET發(fā)生；而如果培養(yǎng)條件中有小分子抑制物存在的話，MyD88 TIR無(wú)法發(fā)生二聚化，488nm激發(fā)光(藍(lán)光)照射下GFP_MyD88 TIR發(fā)出的綠色熒光不會(huì)轉(zhuǎn)移給RFP-MyD88 TIR，無(wú)紅色熒光發(fā)出，產(chǎn)生正常的綠色熒光。細(xì)胞培養(yǎng)和藥物篩選可結(jié)合高通量篩選儀及熒光值的相關(guān)函數(shù)運(yùn)算；對(duì)于上述基于熒光信號(hào)變化的篩選模型認(rèn)定陽(yáng)性(即，對(duì)FRET有影響)的化合物， 還需利用原核表達(dá)并純化的重組蛋白，進(jìn)行體外蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的驗(yàn)證分析當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞中FRET現(xiàn)象被某種添加的化合物阻斷了，尚不能得出是這種化合物直接阻斷了 MyD88 TIR的二聚化結(jié)論，還是這種化合物引發(fā)了某種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)，間接地影響了 MyD88 TIR的二聚化；因此利用一個(gè)His_MyD88TIR和GST_MyD88 TIR重組蛋白體外相互作用分析加以驗(yàn)證；具體步驟如下在非變性緩沖液中，可以加入上述熒光篩選模型認(rèn)為有效阻斷MyD88 TIR 二聚化的化合物，如果化合物能直接阻斷MyD88 TIR的二聚化，則His_MyD88 TIR體外條件下不能正常結(jié)合GST-MyD88 TIR，進(jìn)行His_MyD88 TIR結(jié)合物(Pull-down產(chǎn)物)的 western blot分析，不能檢測(cè)到GST抗體識(shí)別的信號(hào)；如果化合物不能直接阻斷MyD88 TIR 二聚化，His-MyD88 TIR體外條件下能夠正常結(jié)合GST_MyD88 TIR，進(jìn)行His_MyD88 TIR結(jié)合物(Pull-down產(chǎn)物)的western blot分析，則可以檢測(cè)到GST抗體識(shí)別的信號(hào)；經(jīng)此驗(yàn)證模型，確切的MyD88 TIR 二聚化抑制劑就可得以判定。
2.&MyD88 TIR 二聚化為靶點(diǎn)的抗炎抑制劑篩選模型用于對(duì)商品化的小分子庫(kù)、自行制備的天然產(chǎn)物組分或各種化學(xué)合成物、修飾物進(jìn)行廣泛的篩選，從中獲得有效的MyD88 二聚化的抑制性化合物，參與對(duì)MyD88信號(hào)通路依賴的慢性炎癥、自身免疫性疾病的藥物蹄選。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以MyD88TIR二聚化為靶點(diǎn)的抗炎抑制劑篩選模型及應(yīng)用，其特征在于將MyD88TIR分別與一熒光供體和熒光受體蛋白基因GFP/RFP構(gòu)建融合蛋白質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，建立雙陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞株?？梢詸z測(cè)到FRET現(xiàn)象；當(dāng)培養(yǎng)基中存在MyD88TIR二聚化抑制物時(shí)，提示了依賴雙陽(yáng)性表達(dá)GFP-MyD88-TIR和RFP-MyD88-TIR的細(xì)胞株，經(jīng)體外結(jié)合分析，可以進(jìn)一步確定抑制物是否直接阻斷了TIR的相互作用。結(jié)合真核細(xì)胞的熒光FRET阻斷結(jié)果和原核表達(dá)的重組蛋白相互作用分析，可確定MyD88TIR二聚化的抑制物。利用該模型可以對(duì)商品化的小分子庫(kù)、自行制備的天然產(chǎn)物組分或各種化學(xué)合成物、修飾物進(jìn)行廣泛的篩選，從中獲得有效的MyD88二聚化的抑制性化合物，參與對(duì)MyD88信號(hào)通路依賴的慢性炎癥、自身免疫性疾病的藥物篩選。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102321586SQ20111023631
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月17日
發(fā)明者巴雪青, 曾憲錄 申請(qǐng)人:東北師范大學(xué)