專利名稱：一種油菜千粒重性狀主效基因位點及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種甘藍型油菜千粒重性狀主效基因位點的分子標(biāo)記，同時還涉及該分子標(biāo)記在油菜高產(chǎn)育種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
油菜是最重要的油料和能源作物之一，其脂肪酸碳鏈長度和結(jié)構(gòu)接近化石柴油， 是一種適宜于生產(chǎn)生物柴油的植物油。在當(dāng)前和今后相當(dāng)長的時間內(nèi)，全世界都將面臨食用植物油和化石能源短缺的嚴峻局面，因此大幅度增加菜籽油供應(yīng)總量，是保障全球食物和能源安全的重大需求。在城市化規(guī)模持續(xù)擴大耕地面積進一步縮小的形式下，持續(xù)提高單位面積產(chǎn)油量(=單產(chǎn)X含油量)是唯一出路。近年來，高含油量品種選育已取得了重大突破，某些代表性品種(如中雙11號等)的含油量已接近甚至超過50%，這已越來越接近油菜種質(zhì)資源的最高含油量，這預(yù)示著高含油量育種即將遭遇瓶頸。與此相反，油菜單產(chǎn)提高的潛力還很大，這具體表現(xiàn)在各國參試油菜品種產(chǎn)量構(gòu)成因子的平均值跟油菜種質(zhì)資源的最高水平相比還有相當(dāng)差距。例如，我國2000-2009年冬油菜四大區(qū)參試油菜品種平均千粒重在4克以下(俞琦英等，2010)，而油菜種質(zhì)資源中的最高千粒重超過了 8克。并且，參試油菜品種千粒重和單株產(chǎn)量的相關(guān)性很高，達0. 5303。雖然油菜單株產(chǎn)量的三個構(gòu)成因子之間表現(xiàn)不同程度的負相關(guān)，但其相關(guān)系數(shù)往往不大(Shi et al. 2009)，這表明可以通過提高單個產(chǎn)量構(gòu)成因子(如千粒重)來增加產(chǎn)量(^iang et al. 2007)。雖然傳統(tǒng)育種方法曾經(jīng)為生產(chǎn)提供了許多優(yōu)良油菜品種，但由于育種周期長、選擇效率低，已經(jīng)無法完全滿足當(dāng)前油菜生產(chǎn)的需要。隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的發(fā)展， 育種家們對性狀的選擇正在逐漸實現(xiàn)由表型選擇向基因型選擇的過渡。分子標(biāo)記輔助育種是將分子遺傳學(xué)與傳統(tǒng)的表型選擇有效結(jié)合的一種新的育種手段，其基本原理是在油菜育種過程中直接利用與目標(biāo)性狀基因緊密連鎖和共分離的分子標(biāo)記對選擇個體進行目標(biāo)區(qū)域以及全基因組篩選，以達到提高目標(biāo)性狀選擇效率、縮短育種年限的目的。分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)的關(guān)鍵是鑒定與重要農(nóng)藝性狀緊密連鎖的DNA分子標(biāo)記。近年來，美國等發(fā)達國家都投入巨資開展這方面的研究工作。伴隨著水稻、玉米、小麥等重要作物農(nóng)藝性狀分子標(biāo)記的開發(fā)，利用篩選到的分子標(biāo)記進行輔助選擇育種已漸趨成熟，目標(biāo)性狀也從簡單的單基因質(zhì)量性狀擴展到復(fù)雜的多基因數(shù)量性狀。隨著基因組學(xué)和測序技術(shù)的高速發(fā)展， 油菜分子標(biāo)記研究日漸受到關(guān)注，研究的領(lǐng)域涉及種質(zhì)遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構(gòu)建、 基因標(biāo)記和定位、品種純度鑒定、配合力預(yù)測、標(biāo)記輔助選擇等多方面，并取得了重要進展。 但與發(fā)達國家相比，我國油菜分子育種研究還有較大差距，主要體現(xiàn)在不能有效地發(fā)掘和利用種質(zhì)資源中的有利基因，缺乏有自主知識產(chǎn)權(quán)及育種價值的基因和標(biāo)記等。目前常用的分子標(biāo)記技術(shù)大致可分為兩種一種是基于分子雜交技術(shù)，另一種則以PCR技術(shù)為核心。Grodzicker等(1974)創(chuàng)立了限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)標(biāo)記技術(shù)。Botstein 等(1980)首先提出用限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，簡稱RFLP)作為遺傳標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜的設(shè)想，從而開創(chuàng)了利用分子標(biāo)記作為遺傳標(biāo)記的新時代。隨后幾十種基于分子雜交(如RFLP和微陣列技術(shù)等)或PCR(如RAPD，SSR, AFLP, SRAP等)的DNA分子標(biāo)記技術(shù)陸續(xù)建立，并廣泛應(yīng)用于植物科學(xué)的研究中。大多數(shù)重要的農(nóng)藝性狀(如產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性等)均表現(xiàn)數(shù)量性狀的遺傳特點，表型連續(xù)分布且易受環(huán)境條件的影響，因此基于表型選擇的常規(guī)育種方法對復(fù)雜數(shù)量性狀的選擇效果不好，致使育種效率低下，育種周期延長。由于分子標(biāo)記技術(shù)和數(shù)量遺傳學(xué)的發(fā)展和結(jié)合，人們已可將復(fù)雜的數(shù)量性狀分解為單個的數(shù)量性狀基因位點(quantitative trait loci，QTL)，然后像研究質(zhì)量性狀一樣對控制數(shù)量性狀的多個基因進行研究。QTL定位就是在遺傳分離群體的基礎(chǔ)上，借助分子標(biāo)記和遺傳圖譜，利用QTL作圖軟件對分離群體的數(shù)量性狀表型數(shù)據(jù)進行分析，從而確定數(shù)量性狀基因在染色體上的位置和效應(yīng)。目前對油菜千粒重的QTL定位研究也有一些報道，但通常檢測出的QTL效應(yīng)值較小且重復(fù)性不好，較難在油菜育種中應(yīng)用。本研究通過QTL定位，旨在篩選到對油菜千粒重具有正向效應(yīng)的QTL，用于油菜產(chǎn)量性狀的標(biāo)記輔助選擇。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是在于提供了一種油菜千粒重性狀的主效基因位點。該主效基因位點的效應(yīng)值和貢獻率都超過已往的報導(dǎo)，對油菜千粒重的調(diào)控起著關(guān)鍵作用，可用作圖位克隆和分子標(biāo)記輔助選擇。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種油菜千粒重性狀主效基因位點緊密連鎖的分子標(biāo)記。該標(biāo)記離主效基因位點的遺傳距離很近(< 2cM)且是基于PCR技術(shù)的共顯性SSR標(biāo)記，因而可靠且使用方便，這給今后中雙11號衍生品系的選育提供了極大的便利。本發(fā)明的再一個目的是在于提供了一種油菜千粒重性狀主效基因位點緊密連鎖的分子標(biāo)記在油菜高產(chǎn)育種中的應(yīng)用。申請人利用該標(biāo)記對育種群體F3代進行了輔助選擇，結(jié)果表明攜帶有利標(biāo)記的單株80%以上其千粒重超過群體均值，這表明該標(biāo)記用于輔助選擇是切實有效的。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種油菜千粒重性狀主效基因位點的分離方法，它包括如下步驟 (1)利用油菜測序品種中雙11號和73290雜交，雜種Fl代自交產(chǎn)生F2和F2 3代分離群體。本發(fā)明用到的研究材料由中國農(nóng)科院油料所油菜生物技術(shù)育種課題組提供。(2)采用CTAB法(Doyle et al. 1987)提取親本中雙11和73290及F2分離群體的葉片總DNA，過程中所用到的試劑包括提取液(1. 4M NaCl, IOOmM Tris,pH 8. 0,20mM EDTA, PH 8.0,2% CTAB)、氯仿、異戊醇和無水乙醇；(3)合成油菜公開(http //www. ukcrop. net/Brassica DB)和自主開發(fā)的簡單序列重復(fù)(simple sequence repeat, SSR)禾口單核昔酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)引物，并對親本DNA進行PCR擴增，產(chǎn)物在變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，染色和顯影后對條帶的大小進行判別，篩選多態(tài)性引物。過程中所用到的主要軟件包括 MISA(http//PRrc. ipk-Ratersleben. de/misa/)，BffA(http//bio~bwa. sourceforRe. net/)，SAMtools(http://samtools. sourceforge. net/)和 primer3(http://www. genome, wi. mit. edu/cgi-bin/primer/primer3-www. cgi)等，都是免費公幵的；主要試齊Ll包括 Taq酶、dNTP、丙烯酰胺、尿素、冰醋酸、硝酸銀和碳酸鈉。(4)利用多態(tài)性引物對F2分離群體進行分子標(biāo)記分析，獲得基因型數(shù)據(jù)。過程中用到的試劑(Taq酶、dNTP、丙烯酰胺、尿素、冰醋酸、硝酸銀和碳酸鈉)如上所述；(5)把F2分離群體的基因型數(shù)據(jù)輸入Joinmap3. 0軟件(http://www. kyazma. nl/ index, php/mc. JoinMap)，進行遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建；(6)F2群體的基因型數(shù)據(jù)(僅限于定位到遺傳圖譜上的標(biāo)記)以及F2和F2:3 群體的千粒重性狀數(shù)據(jù)輸入 WinQTLcart2. 5 軟件(http//statgen. ncsu. edu/qtlcart/ WQTLCart.htm)進行數(shù)量性狀位點(quantitative trait loci，QTL)定位，總共檢測到了 8 個控制千粒重的QTL。其中，位于A9連鎖群(對應(yīng)白菜第9染色體)上的QTL在兩個群體中能重復(fù)檢測到，而且效應(yīng)值和貢獻率最大。利用上述技術(shù)措施，申請人最終獲得了油菜千粒重性狀的主效基因位點qTSW. A9,該主效基因位點位于油菜A9染色體，與申請人自主開發(fā)的SSR標(biāo)記BrSF7-181a 緊密連鎖，其引物序列為 BrSF7-181-F :TCGCGAGGAATAGAACGAAT ;BrSF7-181-R GGAACCTTCTCGATGGTTTTT。利用WinQTLCart2. 5軟件分析測得其對油菜千粒重的平均貢獻率為33. 5 %，加性效應(yīng)為0. 31，顯性效應(yīng)為0.沈，近似顯性遺傳。本研究中所用的親本材料為中雙11號和73四0，均由中國農(nóng)科院油料所生物技術(shù)育種課題組技術(shù)人員在王漢中研究員帶領(lǐng)下育成。中雙11號是由中雙9號與高油、長角和大粒品系2F10和沈102經(jīng)復(fù)合雜交、小孢子培養(yǎng)和加倍選育而來；73290由93275(中油雜 4號恢復(fù)系)作母本和中雙2號選株雜交的雜種Fl代進行小孢子培養(yǎng)與套袋自交選育而成 (所有權(quán)歸本課題組所有)。一種油菜千粒重性狀主效基因位點緊密連鎖的分子標(biāo)記在油菜高產(chǎn)育種中的應(yīng)用，其步驟是(1)田間種植中選F2代單株自交所產(chǎn)生的F3種子，在定苗前取樣，用CTAB法抽提葉片總DNA，過程中所用到的試劑(提取液、氯仿、異戊醇和無水乙醇)如上所述；(2)利用qTSW. A9位點的分子標(biāo)記BrSF7_181a對兩親本的F3代進行基因型鑒定， 并在收獲后進行千粒重的考種。結(jié)果表明，通過分子標(biāo)記輔助選擇得到的植株千粒重超過 F2:3家系均值克)的占87.5%，在保留下來的植株中再篩選果多和粒多的單株。通過鑒定上述千粒重主效基因位點來預(yù)測油菜千粒重，可提高油菜高產(chǎn)育種的選擇效率，從而加快育種進程。本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明首次定位了油菜大粒品種中雙11號中控制千粒重的主效基因位點，可解釋33. 5%的表型方差。在常規(guī)育種方法中，千粒重性狀表型鑒定要等到成熟期考種，費時費力且選擇效率低下(千粒重表型受環(huán)境影響較大)。通過檢測千粒重性狀主效基因位點，可以在苗期進行淘汰，不僅節(jié)約生產(chǎn)成本而且大大提高選擇效率。本發(fā)明中千粒重主效基因位點位置明確，主效基因位點的檢測方法方便快速，不受環(huán)境影響。通過檢測與千粒重性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，即可預(yù)測千粒重的多少，進而準(zhǔn)確快速篩選大粒單株。
圖1為一種中雙11X73290組合F2和F23群體在武漢種植時的千粒重分布圖。
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結(jié)果表明千粒重表型呈正態(tài)分布，且變異范圍很寬，證明千粒重屬于數(shù)量性狀。圖2為一種油菜A9連鎖群示意圖。右半部分指示該連鎖群上的標(biāo)記名稱，左半部分指示每個標(biāo)記對應(yīng)的遺傳圖據(jù)。圖3為一種位于A9連鎖群上的千粒重主效基因位點LOD曲線示意圖。圖中橫坐標(biāo)代表連鎖群，縱坐標(biāo)代表LOD值。圖4為一種利用分子標(biāo)記BrSF7_181a對F3單株進行基因型分析和篩選示意圖。圖中1-46為F3單株編號，最后兩個Pl和P2分別代表親本中雙11和73四0。
具體實施例方式實施例1 油菜千粒重分離群體的構(gòu)建及性狀測定本實施例中使用油菜測序品種中雙11和另一個遺傳差異大的油菜品種73290雜交構(gòu)建F2和F2:3分離群體。兩親本和兩群體的千粒重表型在成熟期收獲后經(jīng)考種鑒定。 千粒重考種數(shù)據(jù)表明兩群體千粒重均呈正態(tài)分布，證明千粒重性狀的數(shù)量遺傳特征；兩群體的千粒重均呈超親分離，表明大粒基因在雙親中都有分布(圖1)。實施例2 葉片總DNA的提取利用CTAB法提取葉片總DNA，具體步驟如下(1)取0. 1克新鮮葉片放入研磨，加700微升提取液研磨，隨即轉(zhuǎn)入1. 5毫升離心管中置于65°C恒溫水浴60分鐘，其間混合2-3次；(2)加等體積的苯酚氯仿異戊醇05 24 1, V/V/V)，輕輕顛倒使其充分混勻，在12000rpm離心10分鐘，輕輕吸取上清液轉(zhuǎn)入另一 1. 5毫升離心管；加等體積的氯仿異戊醇04 1，V/V)重新抽提一次；(3)加入1毫升_20°C預(yù)冷無水乙醇，置于_20°C冷凍不超過30分鐘讓DNA析出； 12000rpm離心10分鐘讓DNA沉淀，倒掉離心管中乙醇溶液；用75% (V/V)乙醇清洗2_3次， 倒掉浸泡液，打開離心管蓋置于通風(fēng)櫥內(nèi)吹干；(4)加入 TEdOmM Tris, pH 8. 0 ； ImM EDTA，pH 8. 0)溶解 DNA ；用紫外分光光度計測定DNA的濃度，于_20°C冰箱中保存?zhèn)溆?；實施? 引物的開發(fā)和合成申請人:利用的SSR引物包括兩類一類是已發(fā)表文章和蕓苔屬數(shù)據(jù)庫中公開的引物序歹0 (http://www. brassica. info/resource/markers/ssr-exchange. php)；另一類是申請人根據(jù)白菜和甘藍scaffold序列(自行測序所得)開發(fā)的，分別命名為BrSF和BoSF 系列，具體的開發(fā)方法是先利用MISA軟件(http://pgrc. ipk-gatersleben. de/misa)在每個 scaffold 搜索 SSR,然后用 Primer3. 0 軟件(http://www. genome, wi. mit. edu/cgi-bin/ primer/primer3-www. cgi)設(shè)計SSR引物。自主開發(fā)的SNP引物則是通過比對73四0的重測序序列和中雙11的參考基因組序列而來，首先，利用BWA軟件(http://bio-bwa. sourceforge.net/)把73四0的重測序序列定位到中雙11的全基因組參考序列上，然后利用 samtools 軟件(http://samtools.sourceforge.net/)查找 SNP。SNP 檢測采用的是SNAP (single nucleotide amplified polymorphism)方法，即在引物設(shè)計時在 SNP 位點處 引入ー個錯配，在一個親本中導(dǎo)致PCR擴增的失敗。申請人已經(jīng)通過生物公司合成了公共 和新開發(fā)的SSR引物各6652對，SNP引物517對。實施例4 引物多態(tài)性的篩選，其流程如下(1)從親本中各隨機選擇10株DNA等量混合，作為篩選引物的模板。(2)利用溶解后的引物對親本DNA進行PCR擴增，反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種油菜千粒重性狀主效基因位點，其特征在于所述的主效基因位點為^zT1U禮
2.一種油菜千粒重性狀主效基因位點緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于所述的SSR 分子標(biāo)記 BrSF7-181a 緊密連鎖，其引物為 BrSF7 — 181F :TCGCGAGGAATAGAACGAAT，BrSF7 — 18IR GGAACCTTCTCGATGGTTTTT
3.權(quán)利要求2所述的一種油菜千粒重性狀主效基因位點緊密連鎖的分子標(biāo)記在油菜育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種油菜種子重量性狀主效基因位點及應(yīng)用，步驟包括1)利用油菜測序品種雜交，雜種F1自交構(gòu)建分離群體；2)利用公共和已開發(fā)的SSR和SNP引物對親本DNA進行多態(tài)性篩選，通過對F2代分離群體進行分子標(biāo)記基因型分析構(gòu)建遺傳連鎖圖譜；3)通過對F2和F2:3分離群體進行田間實驗和考種獲得種子重量的表型數(shù)據(jù)；4)結(jié)合分離群體的基因型和表型數(shù)據(jù)，進行QTL檢測。獲得了A9連鎖群上控制油菜千粒重的主效基因位點qTSW.A9和分子標(biāo)記BrSF7-181a。通過該標(biāo)記對兩親本衍生的F3代進行基因型分析，保留攜帶有利標(biāo)記的單株，考種結(jié)果表明千粒重高于F2:3家系均值的F3單株比例高達89.5%，因此利用該標(biāo)記進行輔助選擇可大大提高高產(chǎn)育種的選擇效率。
文檔編號C12N15/11GK102286492SQ201110236050
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月17日
發(fā)明者劉貴華, 華瑋, 師家勤, 王新發(fā), 王漢中, 黃順謀 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所