一種多段dna并行組裝的方法

專利名稱：一種多段dna并行組裝的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是遺傳工程領(lǐng)域基因重組技術(shù)，具體地說是一種多段DNA并行組裝的方法。
背景技術(shù)：
目前人類所接觸到的生命形式，都需要完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮生物體的全部特征。在細(xì)胞當(dāng)中，DNA是主要的遺傳物質(zhì)，DNA轉(zhuǎn)錄形成RNA，RNA翻譯得到蛋白質(zhì)，RNA和蛋白質(zhì)在生物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)生物學(xué)功能。因此對(duì)生物的改造最本質(zhì)對(duì)DNA的改造。對(duì)DNA的改造能力決定了人類改造甚至創(chuàng)造生物的能力。2005年以后，合成生物學(xué)相關(guān)技術(shù)需要發(fā)展出合適的大規(guī)?；蚪M裝技術(shù)以適應(yīng)基因工程、代謝工程的發(fā)展和需要?！爸亟MDNA技術(shù)” (recombinant DNA technology)發(fā)明于1973年，至今仍然普遍使用。但是由于對(duì)限制性內(nèi)切酶的依賴，導(dǎo)致該技術(shù)具有以下缺陷
1、常用限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列一般為4-8堿基對(duì)，通常為6堿基對(duì)，平均每4096bp長度的天然DNA當(dāng)中就含有一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。長片段的DNA往往含有多種限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)而難于操作。2、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)需要體外操作，而長片段DNA難于進(jìn)行體外操作。3、當(dāng)需要回避限制性內(nèi)酶切位點(diǎn)時(shí)，很難并行化操作。為了克服“重組DNA技術(shù)”的缺點(diǎn)解決多段DNA組裝問題，近年來有以下方法被提出
一、基于內(nèi)切酶的方法 a) BioBrick 系統(tǒng)
MIT的IGEM組織提倡通過人工合成基因來規(guī)避天然DNA當(dāng)中的原本具有的某些限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，從而利用同尾酶進(jìn)行并行化組裝。BioBrick協(xié)議規(guī)定一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的BioBrick的 DNA當(dāng)中依次具有如下結(jié)構(gòu)=EcoRI位點(diǎn)、XbaI位點(diǎn)、DNA片段、SpeI位點(diǎn)、PstI位點(diǎn)。其中合成的DNA片段當(dāng)中不含有EcoRI、XbaI, SpeKPstI位點(diǎn)。XbaI和SpeI是酶切后具有相同粘性末端的同尾酶，但它們?cè)谶B接之后得到非回文序列，酶切位點(diǎn)消失，從而使組裝的產(chǎn)物仍然具有EcoRI位點(diǎn)、XbaI位點(diǎn)、DNA片段、SpeI位點(diǎn)、PstI位點(diǎn)的順次結(jié)構(gòu)，可用于進(jìn)一步組裝。此方法的缺點(diǎn)1、合成DNA的成本比較高。2、不能避免大片段DNA難于進(jìn)行體外操作的問題。b)基于產(chǎn)生不特定粘末端的限制性內(nèi)切酶的多段DNA連接法。少數(shù)限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列中含有不特定序列，例如SfiI的識(shí)別位點(diǎn)為 GGCCNNNN~NGGCC，其中N可以為ATGC任意堿基對(duì)。該酶切割產(chǎn)生三個(gè)堿基NNN的任意粘末端。利用不同粘末端的匹配可以同時(shí)連接多段DNA。此方法的缺點(diǎn)1、不能回避天然序列中含有該類型酶切位點(diǎn)的問題。2、一次性連接組裝的片段數(shù)一般不宜超過10段，否則連接效率很低。3、對(duì)于大片段難于進(jìn)行體外操作。
二、重組組裝技術(shù)
a)基于枯草芽孢桿菌同源重組的篩選標(biāo)記交換法。該方法利用到枯草芽孢桿菌當(dāng)中一種同源重組。每個(gè)待組裝片段需要預(yù)留同源臂，并連接到domino載體當(dāng)中。Domino載體具有兩種不同抗生素的形式。在重組過程中將載體需要在體外先切割成線性并連接成多段重復(fù)的線形結(jié)構(gòu)。當(dāng)基因組當(dāng)中含有一種抗性的載體時(shí)，則下一個(gè)組裝片段將被置于含有另外一種抗性的載體；該載體攜帶組裝片段與基因組發(fā)生重組，替換基因組中原有載體和抗性，從而實(shí)現(xiàn)逐次組裝片段。組裝起來的片段可以再次通過同源重組從枯草芽孢桿菌當(dāng)中取出，并用于下一次重組。此方法的缺點(diǎn)1、由于完全利用同源重組，當(dāng)重待組裝片段當(dāng)中有重復(fù)序列時(shí)會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤重組。2、此方法重組效率并不高，很少有人實(shí)際采用。b)位點(diǎn)特異性重組組裝法
美國專利“重組法組裝大片段 DNA" (Recombination assembly of large DNA fragments, US7267984)當(dāng)中描述一個(gè)環(huán)形基因組和環(huán)形質(zhì)粒的系統(tǒng)。其基因組當(dāng)中包括3 個(gè)位點(diǎn)，分別用于重組插入、切出載體、回收載體。此方法的缺點(diǎn)1、是一個(gè)順序組裝系統(tǒng)， 不能并行化。三、體外重組法 a)體外重組方法
該方法的原理是體外重組通過不完全PCR或者T4 DNA聚合酶或者λ外切酶分解等方法在獲得末端單鏈伸出的DNA，然后利用堿基配對(duì)原理使伸出的單鏈DNA根據(jù)配對(duì)結(jié)合。 首先通過PCR引物或者基因合成的設(shè)計(jì)，使待組裝的PCR片段末端帶有特定的重組片段，一般為30bp ；然后用T4 DNA聚合酶處理這些PCR片段，獲得末端具備單鏈末端伸出的產(chǎn)物， 然后將這些DNA利用體外重組方法組裝起來。此方法的缺點(diǎn)1、由于涉及到PCR過程，容易引入突變。2、并不適用于組裝長片段。b)改進(jìn)的體外重組法
改進(jìn)的體外重組方法在原理上和SLIC —致。此方法較SLIC方法有如下改進(jìn)1、增加了重組片段的長度，通常使用80堿基的同源末端進(jìn)行重組，少數(shù)情況下會(huì)使用長達(dá)200-250 堿基的同源末端；2、在反應(yīng)體系當(dāng)中增加了 DNA聚合酶和連接酶，使單鏈互補(bǔ)重組后的產(chǎn)物能夠補(bǔ)平并連接為雙鏈完整DNA。3、需要時(shí)，在反應(yīng)體系當(dāng)中可引入了 T5 exo外切酶以切掉單鏈DNA末端一段非匹配單鏈DNA。此方法的缺點(diǎn)1、由于重組所需長度的增加，對(duì)于天然片段而言，一次PCR難于獲得80堿基以上的重組片段，所以該方法主要用于全化學(xué)合成基因組。而全化學(xué)合成基因組成本過高，導(dǎo)致應(yīng)用范圍有很大限制。2、組裝過程中需要用較高拷貝數(shù)的載體做中間克隆，在E. coli當(dāng)中不宜組裝超過50Kbp的片段。相關(guān)技術(shù)
Invitrogen的美國專利US5888732保護(hù)了如下內(nèi)容若一個(gè)質(zhì)粒可拆分成為兩部分， 其中一部分的兩端是兩個(gè)不互相重組的Attachment重組位點(diǎn)，則此質(zhì)粒及其重組反應(yīng)屬于US5888732的保護(hù)范圍。lambda red重組和切出大腸桿菌Lambda Red噬菌體中發(fā)現(xiàn)的另外一類重組反應(yīng)由Lambda Red Alpha, Beta, Exo和大腸桿菌的RecA酶催化。該反應(yīng)可以催化PCR或者酶切產(chǎn)生的平末端或者粘末端的線性DNA與基因組或者質(zhì)粒重組。當(dāng)在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)利用歸位內(nèi)切酶切開染色體時(shí)，Lambda Red重組可以誘導(dǎo)切出DNA片段。Lambda Red重組被WO 1999029837等專利保護(hù)。線形質(zhì)粒m5噬菌體及類似的噬菌體能夠以線形存在于宿主細(xì)菌當(dāng)中。其兩端是封閉的發(fā)卡形端粒。基于N15噬菌體的質(zhì)粒發(fā)表很早，按照一般專利法的規(guī)定，該線形噬菌體和質(zhì)粒本身已經(jīng)不能受專利保護(hù)。目前在申請(qǐng)中的美國專利US20090263873，申請(qǐng)保護(hù)基于該質(zhì)粒的克隆載體。本發(fā)明中的線形單元載體和回收載體利用到了線形質(zhì)粒。線性基因組大部分原核微生物都具有環(huán)形的染色體，少數(shù)天然具有線形染色體。 比如根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的染色體中有一條為線形。將附5噬菌體的端粒酶識(shí)別位點(diǎn)整合到大腸桿菌染色體的合適位置，并表達(dá)端粒酶，可以使大腸桿菌的染色體線形化。此結(jié)果已經(jīng)公開，無專利保護(hù)此內(nèi)容。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有DNA組裝技術(shù)所存在的缺陷，本發(fā)明提出了一種多段DNA并行組裝的方法。該方法通過利用單元載體置入宿主進(jìn)行基因?qū)?，然后再回收載體，解決多段DNA 組裝的技術(shù)問題。本發(fā)明解決技術(shù)方案所采用的方案是
對(duì)待組裝片段進(jìn)行克隆，得到符合“廣義單元載體”結(jié)構(gòu)的單元載體； 根據(jù)單元載體的“組裝職能”選出一系列含有不同待組裝片段的廣義單元載體，形成 “可組裝隊(duì)列”；
對(duì)“可組裝隊(duì)列“進(jìn)行“隊(duì)列并行組裝”； 具體步驟
(1)首先，根據(jù)組裝實(shí)施者的需要，將“待組裝片段”克隆到“空單元載體”當(dāng)中形成“單元載體”；取含有待組裝片段的“單元載體”和其他“廣義單元載體”構(gòu)成至少一種“初始可組裝隊(duì)列”；然后，對(duì)“初始可組裝隊(duì)列”進(jìn)行“隊(duì)列并行組裝”，直到形成的“可組裝隊(duì)列”中單元載體數(shù)量等于1 ；最后隊(duì)列中所得的1個(gè)載體，包含按照組裝實(shí)施者需要設(shè)計(jì)順序排列的所有待組裝片段的組裝產(chǎn)物；
并且，
(2)組裝若在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生，則所需的重組酶由“輔助質(zhì)?！北磉_(dá)；組裝若在細(xì)胞外發(fā)生， 則所需的重組酶以蛋白形式直接加入；
并且，
(3)當(dāng)“隊(duì)列并行組裝”需要時(shí)，組裝過程中有“輔助質(zhì)?！薄ⅰ敖M裝宿主”、“回收載體”的輔助；
所述“廣義單元載體”包括“單元載體”和“組裝宿主”；
所述“單元載體”的結(jié)構(gòu)特征如下“單元載體”結(jié)構(gòu)具有以下2種可能性
(1)一種是含有單重構(gòu)位點(diǎn)“單元載體”，按序列順序依次包括左臂、左反應(yīng)端、待組裝片段、右反應(yīng)端、右臂、拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)、接左臂；
或者，
(2)另一種是含有雙重構(gòu)位點(diǎn)單元載體，按序列順序依次包括固定臂、回收重構(gòu)位點(diǎn)、左臂、左反應(yīng)端、待組裝片段、右反應(yīng)端、右臂、拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)、接前述固定臂；所述“待組裝片段”連接到“空單元載體”當(dāng)中形成含有“待組裝片段”的“單元載體”；
所述“組裝宿主”是“待組裝片段”長度為0的“單元載體”，具有如下結(jié)構(gòu)特征固定臂、回收重構(gòu)位點(diǎn)、左臂、左反應(yīng)端和右反應(yīng)端有至少其一、右臂、拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)、接前述固定臂；
所述“廣義單元載體”具有如下特征
(1)“廣義單元載體”的“組裝職能”類型的差別在于左反應(yīng)端、右反應(yīng)端、拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)、回收重構(gòu)位點(diǎn)的差別；
并且，
(2)“廣義單元載體”有至少1種類型的“組裝職能”；
并且，
(3)不同種類型“組裝職能”的“廣義單元載體”的反應(yīng)端和重構(gòu)位點(diǎn)的選擇要滿足任何一種“組裝職能”的“廣義單元載體”，并且至少存在一種“組裝職能”的“廣義單元載體” 與其“互相匹配”；
并且，
(4)“廣義單元載體”的“組裝職能”的所有種類要滿足對(duì)于任意數(shù)量待組裝片段，至少存在一種“可組裝隊(duì)列”；
所述“回收載體”的結(jié)構(gòu)特征如下
(1)“回收載體”具有回收重構(gòu)位點(diǎn)、左反應(yīng)端、右反應(yīng)端、拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)、接前述固定臂4個(gè)重組位點(diǎn)當(dāng)中至少其中2個(gè)；
并且，
(2)“回收載體”與“匹配”的“廣義單元載體”進(jìn)行“載體置換”的目的產(chǎn)物仍然為“廣義單元載體”；
所述“待組裝片段”，是組裝實(shí)施者需要組裝的片段；“待組裝片段”的DNA序列，允許是任意不參與反應(yīng)端、拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)、回收重構(gòu)位點(diǎn)的重組的，并且不參與復(fù)制子和篩選標(biāo)記的篩選的DNA序列；
所述待組裝片段的“左反應(yīng)端”和“右反應(yīng)端”是具有發(fā)生重組能力的DNA序列；并且， 在“組裝反應(yīng)”中，同一個(gè)單元載體內(nèi)的左反應(yīng)端和右反應(yīng)端不具有互相重組能力；并且，在 “組裝反應(yīng)”中，來自不同“組裝職能”的“廣義單元載體”的左反應(yīng)端和右反應(yīng)端重組后消失或者變?yōu)樵谠撝亟M酶下沒有重組活性的DNA序列；并且，“左反應(yīng)端”和“右反應(yīng)端”來自于空單元載體、或者來自于待組裝片段；
所述“拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)”是序列特異性重組位點(diǎn)，或者是端粒酶位點(diǎn)，或者是相互斷開的 2個(gè)端粒，并且在同一 “組裝反應(yīng)”中具有發(fā)生重組能力，并且在同一 “組裝反應(yīng)”中不具有與同一載體內(nèi)的反應(yīng)端或回收重構(gòu)位點(diǎn)重組的能力；并且，當(dāng)拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)是相互斷開的 2個(gè)端粒時(shí)，含有拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)的載體DNA分子在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上為線形；
所述“回收重構(gòu)位點(diǎn)”是在“組裝反應(yīng)”中具有發(fā)生重組能力的DNA序列，并且在同一 “組裝反應(yīng)”中不具有與同一載體內(nèi)的任何反應(yīng)端重組的能力，并且同一“組裝反應(yīng)”中不具有與同一載體內(nèi)的拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)重組的能力；
所述“固定臂”、“左臂”、“右臂”，是任意在“組裝反應(yīng)”中不具有與反應(yīng)端、拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)、回收重構(gòu)位點(diǎn)重組能力的DNA序列，其中包括至少一個(gè)復(fù)制子和至少一個(gè)篩選標(biāo)記；所述“置換臂”，是任意不參與反應(yīng)端、拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)、回收重構(gòu)位點(diǎn)的重組的DNA序
列；
所述“回收載體”與“廣義單元載體”的“位點(diǎn)匹配”具有如下3點(diǎn)特征
(1)“回收載體”包含的重組位點(diǎn)中與“廣義單元載體”的回收重構(gòu)位點(diǎn)、左反應(yīng)端、右反應(yīng)端、拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)重組位點(diǎn)當(dāng)中至少2個(gè)具有發(fā)生重組的能力；
并且，
(2)“回收載體”與“廣義單元載體”發(fā)生“載體置換”之后的目的產(chǎn)物符合“廣義單元載體”的結(jié)構(gòu)特征，并且具有區(qū)別于反應(yīng)前的篩選特征；
所述“回收載體”與“廣義單元載體”的“載體置換”定義包括如下2個(gè)反應(yīng)的
(1) “回收載體”與“廣義單元載體”回收重構(gòu)位點(diǎn)、左反應(yīng)端、右反應(yīng)端、拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn) 4個(gè)重組位點(diǎn)當(dāng)中至少具有其中2個(gè)發(fā)生重組；
所述“載體置換”的目的產(chǎn)物是“載體置換”反應(yīng)后，得到反應(yīng)物當(dāng)中“廣義單元載體” 的“待組裝片段”的、并且符合“廣義單元載體”特征的載體；
所述“廣義單元載體”的“互相匹配”定義為同時(shí)滿足以下三個(gè)條件
(1)滿足反應(yīng)端匹配2個(gè)單元載體，或者至多其中2個(gè)單元載體經(jīng)過“載體置換”之后， 其中一個(gè)單元載體的右反應(yīng)端具有與另一個(gè)單元載體的左反應(yīng)端重組的能力，或者其中一個(gè)單元載體的左反應(yīng)端具有與另一個(gè)單元載體的右反應(yīng)端重組的能力；上述兩種情況在同一種酶催化下不同時(shí)發(fā)生；該重組定義為“反應(yīng)端匹配重組”；
并且，
(2)滿足重構(gòu)位點(diǎn)匹配2個(gè)單元載體本身，或者至多其中兩者單元載體經(jīng)過“載體置換”之后，在同一種酶催化下，其中一個(gè)單元載體與另一個(gè)單元載體的拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)具有重組能力，或者其中一個(gè)單元載體與另一個(gè)單元載體的拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)同時(shí)為斷開的端粒形式，或者其中一個(gè)單元載體與另一個(gè)單元載體的回收重構(gòu)位點(diǎn)具有重組能力；上述三種情況在同一種酶催化下不同時(shí)發(fā)生；該重組定義為“重構(gòu)位點(diǎn)匹配重組”；
并且，
(3)滿足篩選特征匹配互相匹配的2個(gè)單元載體本身，或者至多其中兩者單元載體經(jīng)過“載體置換”之后，單元載體之間進(jìn)行組裝的每一步重組產(chǎn)物，都有區(qū)別于過反應(yīng)前體的篩選特征變化；
所述“匹配單元載體對(duì)”定義為滿足“互相匹配”關(guān)系的2個(gè)“廣義單元載體”；
所述“組裝反應(yīng)”是“互相匹配”的2個(gè)“廣義單元載體”之間發(fā)生的重組反應(yīng)，其特征如下
(1)在“互相匹配”需要的情況下先與“回收載體”進(jìn)行所需的“載體置換”，然后發(fā)生 “反應(yīng)端匹配重組”和“重構(gòu)位點(diǎn)匹配重組” 2個(gè)重組；
并且，
(2)“組裝反應(yīng)”產(chǎn)物是重組反應(yīng)產(chǎn)物當(dāng)中含有其2個(gè)“廣義單元載體”前體中所包含的所有待組裝片段的載體；
根據(jù)所述單元載體的結(jié)構(gòu)，“組裝反應(yīng)”的產(chǎn)物，滿足單元載體的定義，仍稱為“單元載體”，具有繼續(xù)與匹配的“廣義單元載體”發(fā)生組裝反應(yīng)的能力；
所述“可組裝隊(duì)列”是由“廣義單元載體”構(gòu)成的隊(duì)列；并且滿足當(dāng)隊(duì)列中“廣義單元載體”數(shù)量為2N或者2N+1，且N為非負(fù)整數(shù)，隊(duì)列中可挑選出不超過N個(gè)互不共用“廣義單元載體”的“匹配單元載體對(duì)”，這不超過N個(gè)的“匹配單元載體對(duì)”發(fā)生“組裝反應(yīng)”后得到的“廣義單元載體”替代原隊(duì)列中的這些“匹配單元載體對(duì)”，得到的隊(duì)列，仍然符合“可組裝隊(duì)列”的條件；
所述“初始可組裝隊(duì)列”是一個(gè)“可組裝隊(duì)列”，由含有“待組裝片段”的單元載體和“組裝宿主”構(gòu)成；并且，隊(duì)列中含有“待組裝片段”的“單元載體”的數(shù)量與所需組裝的片段的數(shù)量一致，并且，每個(gè)“單元載體”含有一個(gè)待組裝片段；并且，隊(duì)列中的單元載體所含的待組裝片段的順序與組裝實(shí)施者的目的組裝順序一致；
所述“隊(duì)列并行組裝”定義為如下過程根據(jù)前述定義，在“廣義單元載體”數(shù)量為2N或者2N+1 (N為非負(fù)整數(shù))的“可組裝隊(duì)列”中存在的不超過N個(gè)互不共用單元載體的“匹配單元載體對(duì)”，使這不超過N個(gè)“匹配單元載體對(duì)”同時(shí)并行進(jìn)行“組裝反應(yīng)”，并用每個(gè)“匹配單元載體對(duì)”的“組裝反應(yīng)”產(chǎn)物或“宿主中間體”替代原“匹配單元載體對(duì)”；
廣義單元載體
(1)所述“廣義單元載體”的“組裝職能”的所有種類進(jìn)一步滿足對(duì)于任意數(shù)量的“待組裝片段”，至少存在一種“匹配組裝隊(duì)列”；
并且，
(2)通過挑選“匹配”的“廣義單元載體”，使所述“初始可組裝隊(duì)列”滿足“匹配組裝隊(duì)列”的要求；
并且，
(3)對(duì)滿足“匹配組裝隊(duì)列”要求的“初始可組裝隊(duì)列”進(jìn)行“隊(duì)列并行匹配組裝”；
所述“匹配組裝隊(duì)列”是滿足以下2個(gè)條件的“可組裝隊(duì)列”
(1)當(dāng)隊(duì)列中“廣義單元載體”數(shù)量為2N或者2N+1，且N為非負(fù)整數(shù)，則隊(duì)列中存在N 個(gè)互不共用“廣義單元載體”的“匹配單元載體對(duì)”；
并且，
(2)用前述N個(gè)“匹配單元載體對(duì)”發(fā)生“組裝反應(yīng)”后得到的“廣義單元載體”替代原隊(duì)列中的這些“匹配單元載體對(duì)”，得到的隊(duì)列，仍然符合“匹配組裝隊(duì)列”的條件；
所述“隊(duì)列并行匹配組裝”定義為如下過程根據(jù)前述定義，在“廣義單元載體”數(shù)量為 2N或者2N+1，且N為非負(fù)整數(shù)的“匹配組裝隊(duì)列”中存在的N個(gè)互不共用“廣義單元載體” 的“匹配單元載體對(duì)”，使這N個(gè)“匹配單元載體對(duì)”同時(shí)并行進(jìn)行“組裝反應(yīng)”，并用每個(gè)“匹配單元載體對(duì)”的“組裝反應(yīng)”產(chǎn)物替代原“匹配單元載體對(duì)”；
第一種篩選標(biāo)記
(1)篩選標(biāo)記有至少1種，每種“單元載體”的左臂或右臂之一帶有篩選標(biāo)記；
并且，
(2)“組裝反應(yīng)”發(fā)生時(shí)，在“組裝宿主”所在的細(xì)胞中，“單元載體”不具有復(fù)制能力； 并且，“組裝宿主”為染色體；并且，回收載體在特定輔助質(zhì)粒存在時(shí)具有在組裝宿主中復(fù)制的能力；
并且，
(3)“單元載體”和“組裝宿主”發(fā)生“反應(yīng)端匹配重組”、“重構(gòu)位點(diǎn)匹配重組”的其中一組后，利用“單元載體”的篩選標(biāo)記篩選到中間體進(jìn)行篩選含有單元載體的篩選標(biāo)記的中間產(chǎn)物；中間產(chǎn)物再發(fā)生“反應(yīng)端匹配重組”、“重構(gòu)位點(diǎn)匹配重組”的其中的另一組后，利用 “單元載體”所帶的篩選標(biāo)記的丟失篩選“組裝反應(yīng)”產(chǎn)物；
并且，
(4)“載體置換”目的產(chǎn)物的篩選“廣義單元載體”和“回收載體”發(fā)生“載體置換”反應(yīng)的2個(gè)重組的其中一個(gè)后，利用“回收載體”的篩選標(biāo)記篩選到中間體；中間體再發(fā)生“載體置換”反應(yīng)的2個(gè)重組的其中的另一個(gè)，利用“回收載體”在特定復(fù)制蛋白下可復(fù)制篩選到“載體置換”產(chǎn)物；
并且，
(5)“輔助質(zhì)?！睘闇囟让舾行暂d體；并且，在每一步重組前將輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞；并且，在每一步重組后在“輔助質(zhì)?！辈痪哂袕?fù)制能力的溫度下培養(yǎng)，將輔助質(zhì)粒從宿主細(xì)胞中去除；
第二種篩選標(biāo)記
(1)篩選標(biāo)記有至少2種，每種“組裝職能”的“單元載體”的左臂或右臂各帶有一種篩選標(biāo)記，且兩臂所帶有的篩選標(biāo)記互不相同；并且，“組裝反應(yīng)”發(fā)生時(shí)，在“組裝宿主”所在的宿主細(xì)胞中，“單元載體”不具有復(fù)制能力；并且，“組裝宿主”為染色體，有至少2種不同 “組裝職能”的組裝宿主，每種含有一種不同的篩選標(biāo)記；并且，“回收載體”在含有其復(fù)制所需的復(fù)制蛋白的“輔助質(zhì)粒”存在時(shí)具有在宿主細(xì)胞中復(fù)制的能力；
(2)“單元載體”和“廣義單元載體”發(fā)生“組裝反應(yīng)”后，禾Ij用“廣義單元載體”所帶的篩選標(biāo)記的被“單元載體”的篩選標(biāo)記替換來篩選“組裝反應(yīng)”產(chǎn)物；
(3)“廣義單元載體”和“回收載體”發(fā)生“載體置換”反應(yīng)的2個(gè)重組的其中一個(gè)后， 利用“回收載體”和“廣義單元載體” 2個(gè)篩選標(biāo)記篩選到“載體置換”產(chǎn)物；
第三種篩選標(biāo)記
(1)篩選標(biāo)記有至少3種，每種“單元載體”的左臂和右臂各帶有一種篩選標(biāo)記，且兩臂所帶有的篩選標(biāo)記互不相同；
并且，
(2)“組裝反應(yīng)”所包含的2個(gè)重組同時(shí)進(jìn)行；并且，“組裝反應(yīng)”的目的產(chǎn)物含有不同于其2個(gè)“單元載體”前前體的篩選標(biāo)記組合，使該產(chǎn)物具有通過這種篩選標(biāo)記組合從重組產(chǎn)物、副產(chǎn)物和未發(fā)生反應(yīng)的單元載體的混合物種篩選出來的操作性；
并且，
(3)組裝過程不需要“回收載體”和“組裝宿主”；
并且，
(4)“輔助質(zhì)?！蓖瑫r(shí)表達(dá)“組裝反應(yīng)”包含的2個(gè)反應(yīng)所需的2個(gè)重組酶；
反應(yīng)端、回收重構(gòu)位點(diǎn)、拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)
所述反應(yīng)端、回收重構(gòu)位點(diǎn)、拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)為frt，IoxP, Lambda噬菌體的重組位 attB, attBl, attB2, attB3, attB4, attB5, attP, attPl, attP2 attP3, attP4, attP5, attL, attLl, attL2, attL3, attL4, attL5, attR, attRl, attR2, attR3, attR4, attR5，HK022噬菌體的重組位點(diǎn)attB, attP, attL, attR, phi80噬菌體的重組位點(diǎn) attB, attP, attL, attR, P21 噬菌體的重組位點(diǎn) attB, attP, attL, attR, P22 噬菌體的重組位點(diǎn)attB，attP, attL, attR ；所述反應(yīng)端為lambda red重組所需的同源序列；端粒酶識(shí)別位點(diǎn)
端粒酶識(shí)別位點(diǎn)或端粒為原核生物的端粒酶的識(shí)別位點(diǎn)或端粒，包括EntercAacteria phage N15、Vibrio phage VP882、Klebsiella phage phiK02、Yersinia phage PY54 等的端粒酶識(shí)別位點(diǎn)；端粒也為真核生物染色體的端粒； 單元載體、組裝宿主、回收載體
所述單元載體、組裝宿主、回收載體為原核生物或者真核生物的質(zhì)粒、也為原核生物或者真核生物的基因組；
單元載體、回收載體的轉(zhuǎn)化位點(diǎn)
所述單元載體、回收載體當(dāng)中含有接合轉(zhuǎn)化位點(diǎn)，且組裝宿主微生物具備接合轉(zhuǎn)化能力時(shí)，不需要宿主細(xì)胞外的分子操作；所述單元載體、回收載體當(dāng)中不含有接合轉(zhuǎn)化位點(diǎn)， 或且宿主微生物不具備接合轉(zhuǎn)化能力時(shí)，需要有宿主細(xì)胞外的分子操作； 重組位點(diǎn)重組酶
當(dāng)在細(xì)胞外使用重組位點(diǎn)的重組酶時(shí)，IoxP對(duì)應(yīng)Cre重組酶，frt對(duì)應(yīng)FLP重組酶， Lambda噬菌體的BP重組對(duì)應(yīng)Lambda Int和IHF，Lambda噬菌體的BP重組對(duì)應(yīng)Lambda Int、 Xis和IHF，，=HK022噬菌體的BP重組對(duì)應(yīng)HK022 Int和IHF，HK022噬菌體的BP重組對(duì)應(yīng) HK022 Int、Xis和IHF，phi80噬菌體的BP重組對(duì)應(yīng)phi80 Int和IHF，phi80噬菌體的BP 重組對(duì)應(yīng)phi80 Int、Xis和IHF，P21噬菌體的BP重組對(duì)應(yīng)P21 Int和IHF，P21噬菌體的 BP重組對(duì)應(yīng)P21 Int.Xis和IHF, P22噬菌體的BP重組對(duì)應(yīng)P22 Int和IHF, P22噬菌體的 BP重組對(duì)應(yīng)P22 Int. Xis和IHF，組裝過程中的重組反應(yīng)具有在細(xì)胞外進(jìn)行的能力； 其中
兩個(gè)線形載體重組后的單側(cè)端粒發(fā)生交換，視為在端粒位點(diǎn)發(fā)生了一次重組，因?yàn)榇诉^程等效于環(huán)形載體的兩次重組；例如線形載體A和B端粒標(biāo)記為T，左右兩個(gè)端粒分別用 L和R區(qū)分，在載體中X和Y之間發(fā)生重組，如下
Tl _v _v _ Te -ι- Tl —Y —V — Te λ Tl —Y —V — Te + Tl _γ _γ _ Te
1 A ΛΑ iA 1 A 十1 B ΛΒ liB 1Be 1 A ΛΑ iB 1 B 十1 B ΛΒ liA 1A
重組之后，每個(gè)載體的X-Y組合發(fā)生交換，同時(shí)末端端粒組合也發(fā)生交換。積極效果本發(fā)明選擇利用環(huán)形或線形單元載體置入到環(huán)形宿主或線形宿主，形成基因載體，再通過回收環(huán)形或線形載體，得到重組后的DNA遺傳物質(zhì)。其特點(diǎn)是，能夠?qū)崿F(xiàn)多段DNA的并行同時(shí)操作，從而提高DNA組裝形成新的DNA結(jié)構(gòu)的效率，并且防止DNA污染和歧化，保證組裝后DNA的質(zhì)量，使之達(dá)到設(shè)計(jì)目的。適宜在遺傳工程領(lǐng)域基因重組獲得新的生物體中應(yīng)用。


圖1為組裝的總流程圖。圖2為隊(duì)列并行組裝示意圖。圖3為第一種拓?fù)洚悩?gòu)位點(diǎn)重組示意圖。圖4為第二種拓?fù)洚悩?gòu)位點(diǎn)重組示意圖。圖5為第三種拓?fù)洚悩?gòu)位點(diǎn)重組示意圖。圖中，l.DNA，2.廣義單元載體，3.反應(yīng)端，4.拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式據(jù)圖1所示，DNAl經(jīng)過并行組裝后，成為設(shè)定結(jié)構(gòu)的DNA。據(jù)圖2所示，其中上方為組裝前的隊(duì)列，下方為組裝后的隊(duì)列。隊(duì)列并行組裝時(shí)， 匹配兩個(gè)廣義單元載體2發(fā)生“組裝反應(yīng)”，得到的產(chǎn)物載體具有來自于兩個(gè)反應(yīng)物的待組裝片段，并替換反應(yīng)物在隊(duì)列中的位置，形成新的隊(duì)列。此過程不斷重復(fù)，直到隊(duì)列中廣義單元載體數(shù)量為1。據(jù)圖3所示，4為拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)，分為左右反應(yīng)端3，DNA-I和DNA-2表示待組裝片段，雙向箭頭標(biāo)出了兩個(gè)組裝反應(yīng)發(fā)生的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)，線形載體末端的圓形頭部表示端粒。圖中左側(cè)表示利用線形載體端粒位點(diǎn)作為拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)時(shí)的組裝反應(yīng)，可以看到產(chǎn)物得到了分別來自兩個(gè)反應(yīng)載體的端粒，因此視為端粒發(fā)生了重組。圖中中間部分表示不利用線形載體端粒作為拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)的情形，此時(shí)端粒沒有發(fā)生交換，僅發(fā)生了箭頭標(biāo)出的兩個(gè)重組反應(yīng)。圖中右側(cè)是環(huán)形質(zhì)粒的組裝反應(yīng)，發(fā)生了箭頭標(biāo)出的兩個(gè)重組。以“回收重構(gòu)位點(diǎn)”為“位點(diǎn)匹配重組”的組裝反應(yīng)則相當(dāng)于將該圖中拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)的反應(yīng)換為回收重構(gòu)位點(diǎn)的反應(yīng)。本發(fā)明的描述中對(duì)“廣義單元載體”系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和不同“組裝職能”的關(guān)系做了描述。根據(jù)結(jié)構(gòu)定義和相互關(guān)系，可以得到廣義單元載體和回收載體的可行具體形式。以下給出了針對(duì)單個(gè)篩選標(biāo)記、雙篩選標(biāo)記、三篩選標(biāo)記系統(tǒng)的具體單元載體系統(tǒng)、組裝過程的具有一般代表意義的典型細(xì)化方案，更多篩選標(biāo)記的系統(tǒng)具有類似的特征。a)環(huán)形單元載體互組裝
(1)環(huán)形空單元載體互組裝系統(tǒng)的設(shè)計(jì)
拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)_載體骨架_篩選標(biāo)記AS-左反應(yīng)端AL-待組裝片段克隆位點(diǎn)-右反應(yīng)端BR-篩選標(biāo)記BS-(接開頭)；
拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)_載體骨架_篩選標(biāo)記AS-左反應(yīng)端AL-待組裝片段克隆位點(diǎn)-右反應(yīng)端CR-篩選標(biāo)記CS-(接開頭)；
拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)_載體骨架_篩選標(biāo)記BS-左反應(yīng)端BL-待組裝片段克隆位點(diǎn)-右反應(yīng)端AR-篩選標(biāo)記AS-(接開頭)；
拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)_載體骨架_篩選標(biāo)記BS-左反應(yīng)端BL-待組裝片段克隆位點(diǎn)-右反應(yīng)端CR-篩選標(biāo)記CS-(接開頭)；
拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)_載體骨架_篩選標(biāo)記CS-左反應(yīng)端CL-待組裝片段克隆位點(diǎn)-右反應(yīng)端AR-篩選標(biāo)記AS-(接開頭)；
拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)_載體骨架_篩選標(biāo)記CS-左反應(yīng)端CL-待組裝片段克隆位點(diǎn)-右反應(yīng)端BR-篩選標(biāo)記BS-(接開頭)；
其中復(fù)制子可以置于前臂或者后臂。(2)環(huán)形單元載體互組裝系統(tǒng)的組裝 ①初始材料
每個(gè)DNA片段可以都構(gòu)建6個(gè)亞版本的單元載體。但通常而言，對(duì)于既定順序的組裝， 僅使用其中3個(gè)亞版本即可。不妨取如下8個(gè)構(gòu)成“初始可組裝隊(duì)列”，并且滿足“匹配組裝隊(duì)列”要求
AlB: frt-0riS-0riT-AS-AL-DNAl-BR-BS-(接開頭)；B2Cfrt--OriS--OriT--BS--BL--DNA2--CR--CS-(接開頭)C3Afrt--OriS--OriT--CS--CL--DNA3--AR--AS-(接開頭)A4Bfrt--OriS--OriT--AS--AL--DNA4--BR--BS-(接開頭)B5Cfrt--OriS--OriT--BS--BL--DNA5--CR--CS-(接開頭)C6Afrt--OriS--OriT--CS--CL--DNA6--AR--AS-(接開頭)A7Bfrt--OriS--OriT--AS--AL--DNA7--BR--BS-(接開頭)B8Cfrt--OriS--OriT--BS--BL--DNA8--CR--CS-(接開頭)
其中左反應(yīng)端為AL、BL、CL ；右反應(yīng)端為AR、BR、CR ；拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)為frt。
②第一輪組裝 AlB與B2C反應(yīng) 反應(yīng)前
AlB: frt-0riS-0riT-AS-AL-DNAl-BR-BS-(接開頭)； B2C: frt-0riS-0riT-BS-BL-DNA2-CR-CS-(接開頭)；
接合轉(zhuǎn)化使其中一個(gè)載體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)載體的宿主當(dāng)中，BR和BL反應(yīng)，同時(shí)frt與 frt反應(yīng)，通過篩選標(biāo)記AS和CS篩選得到
A12C: frt-0riS-0riT-AS-AL-DNAl-BB-DNA2-CR-CS-(接開頭)； C3A與A4B反應(yīng) 反應(yīng)前
C3A: frt-0riS-0riT-CS-CL-DNA3-AR-AS-(接開頭)； A4B: frt-0riS-0riT-AS-AL-DNA4-BR-BS-(接開頭)；
接合轉(zhuǎn)化使其中一個(gè)載體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)載體的宿主當(dāng)中，AR和AL反應(yīng)，同時(shí)frt與 frt反應(yīng)，通過篩選標(biāo)記CS和BS篩選得到
C34B: frt-0riS-0riT-CS-CL-DNA3-AB-DNA4-BR-BS-(接開頭)； B5C與C6A反應(yīng) 反應(yīng)前
B5C: frt-0riS-0riT-BS-BL-DNA5-CR-CS-(接開頭)； C6A: frt-0riS-0riT-CS-CL-DNA6-AR-AS-(接開頭)；
接合轉(zhuǎn)化使其中一個(gè)載體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)載體的宿主當(dāng)中，CR和CL反應(yīng)，同時(shí)frt與 frt反應(yīng)，通過篩選標(biāo)記BS和AS篩選得到
B56A: frt-0riS-0riT-BS-BL-DNA5-CB-DNA6-AR-AS-(接開頭)； A7B與B8C反應(yīng) 反應(yīng)前
A7B: frt-0riS-0riT-AS-AL-DNA7-BR-BS-(接開頭)； B8C: frt-0riS-0riT-BS-BL-DNA8-CR-CS-(接開頭)；
接合轉(zhuǎn)化使其中一個(gè)載體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)載體的宿主當(dāng)中，BR和BL反應(yīng)，同時(shí)frt與 frt反應(yīng)，通過篩選標(biāo)記AS和CS篩選得到
A78C: frt-0riS-0riT-AS-AL-DNA7-BB-DNA8-CR-CS-(接開頭)； ③第二輪組裝 A12C與C34B反應(yīng)反應(yīng)前
A12C: frt-0riS-0riT-AS-AL-DNAl-BB-DNA2-CR-CS-(接開頭)； C34B: frt-0riS-0riT-CS-CL-DNA3-AB-DNA4-BR-BS-(接開頭)； 接合轉(zhuǎn)化使其中一個(gè)載體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)載體的宿主當(dāng)中，CR和CL反應(yīng)，同時(shí)frt與 frt反應(yīng)，通過篩選標(biāo)記AS和BS篩選得到
A1234B: frt-OriS-OriT-AS-AL-DNAl-BB-DNA2-CB-DNA3-AB-DNA4-BR-BS-(接開頭)； B56A與A78C反應(yīng) 反應(yīng)前
B56A: frt-0riS-0riT-BS-BL-DNA5-CB-DNA6-AR-AS-(接開頭)； A78C: frt-0riS-0riT-AS-AL-DNA7-BB-DNA8-CR-CS-(接開頭)； 接合轉(zhuǎn)化使其中一個(gè)載體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)載體的宿主當(dāng)中，AR和AL反應(yīng)，同時(shí)frt與 frt反應(yīng)，通過篩選標(biāo)記BS和CS篩選得到
B5678C: frt-0riS-0riT-BS-BL-DNA5-CB-DNA6-AB-DNA7-BB-DNA8-CR-CS-(接開頭)； ④第三輪組裝 A1234B 與 B5678C 反應(yīng) 反應(yīng)前
A1234B frt-OriS-OriT-AS-AL-DNA1-BB-DNA2-CB-DNA3-AB-DNA4-BR-BS-(接開頭) B5678C: frt-0riS-0riT-BS-BL-DNA5-CB-DNA6-AB-DNA7-BB-DNA8-CR-CS-(接開頭)； 接合轉(zhuǎn)化使其中一個(gè)載體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)載體的宿主當(dāng)中，BR和BL反應(yīng)，同時(shí)frt與 frt反應(yīng)，通過篩選標(biāo)記AS和CS篩選得到
A12345678C: fr t-0r i S-Or i T-AS-AL-DNA1-BB-DNA2-CB-DNA3-AB-DNA4-BB-DNA5-CB-D NA6-AB-DNA7-BB-DNA8-CR-CS-(接開頭)； b)線形單元載體互組裝系統(tǒng)
(1)線形單元載體互組裝系統(tǒng)的設(shè)計(jì)
端粒_載體骨架_篩選標(biāo)記AS-左反應(yīng)端AL-待組裝片段DNA-右反應(yīng)端BR-篩選標(biāo)記BS-端粒；
端粒_載體骨架_篩選標(biāo)記AS-左反應(yīng)端AL-待組裝片段克隆位點(diǎn)-右反應(yīng)端CR-篩選標(biāo)記CS-端粒；
端粒_載體骨架_篩選標(biāo)記BS-左反應(yīng)端BL-待組裝片段克隆位點(diǎn)-右反應(yīng)端AR-篩選標(biāo)記AS-端粒；
端粒_載體骨架_篩選標(biāo)記BS-左反應(yīng)端BL-待組裝片段克隆位點(diǎn)-右反應(yīng)端CR-篩選標(biāo)記CS-端粒；
端粒_載體骨架_篩選標(biāo)記CS-左反應(yīng)端CL-待組裝片段克隆位點(diǎn)-右反應(yīng)端AR-篩選標(biāo)記AS-端粒；
端粒_載體骨架_篩選標(biāo)記CS-左反應(yīng)端CL-待組裝片段克隆位點(diǎn)-右反應(yīng)端BR-篩選標(biāo)記BS-端粒；
(2)線形單元載體互組裝系統(tǒng)的組裝 ①初始材料
每個(gè)DNA片段都構(gòu)建6個(gè)亞版本的單元載體。但通常而言，對(duì)于既定順序的組裝，僅使用其中3個(gè)亞版本即可。不妨取如下8個(gè)構(gòu)成“初始可組裝隊(duì)列”，并且滿足“匹配組裝隊(duì)
要求AlB端粒-OriL--OriT--AS--AL--DNAl--BR--BS-端粒B2C端粒-OriL--OriT--BS--BL--DNA2--CR--CS-端粒C3A端粒-OriL--OriT--CS--CL--DNA3--AR--AS-端粒A4B端粒-OriL--OriT--AS--AL--DNA4--BR--BS-端粒B5C端粒-OriL--OriT--BS--BL--DNA5--CR--CS-端粒C6A端粒-OriL--OriT--CS--CL--DNA6--AR--AS-端粒A7B端粒-OriL--OriT--AS--AL--DNA7--BR--BS-端粒B8C端粒-OriL--OriT--BS--BL--DNA8--CR--CS-端粒
其中左反應(yīng)端為AL、BL、CL ；右反應(yīng)端為AR、BR、CR ；拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)為frt。
②第一輪組裝 AlB與B2C反應(yīng) 反應(yīng)前
AlB:端粒-OriL-OriT-AS-AL-DNAl-BR-BS-端粒； B2C:端粒-OriL-OriT-BS-BL-DNA2-CR-CS-端粒；
接合轉(zhuǎn)化使其中一個(gè)載體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)載體的宿主當(dāng)中，BR和BL反應(yīng)，同時(shí)frt與 frt反應(yīng)，通過篩選標(biāo)記AS和CS篩選得到
A12C:端粒-OriL-OriT-AS-AL-DNA1-BB-DNA2-CR-CS-端粒； C3A與A4B反應(yīng) 反應(yīng)前
C3A:端粒-OriL-Or iT-CS-CL-DNA3-AR-AS-端粒； A4B:端粒-OriL-Or iT-AS-AL-DNA4-BR-BS-端粒；
接合轉(zhuǎn)化使其中一個(gè)載體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)載體的宿主當(dāng)中，AR和AL反應(yīng)，同時(shí)frt與 frt反應(yīng)，通過篩選標(biāo)記CS和BS篩選得到
C34B:端粒-OriL-Or iT-CS-CL-DNA3-AB-DNA4-BR-BS-端粒； B5C與C6A反應(yīng) 反應(yīng)前
B5C:端粒-OriL-OriT-BS-BL-DNA5-CR-CS-端粒； C6A:端粒-OriL-OriT-CS-CL-DNA6-AR-AS-端粒；
接合轉(zhuǎn)化使其中一個(gè)載體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)載體的宿主當(dāng)中，CR和CL反應(yīng)，同時(shí)frt與 frt反應(yīng)，通過篩選標(biāo)記BS和AS篩選得到
B56A:端粒-OriL-Or iT-BS-BL-DNA5-CB-DNA6-AR-AS-端粒； A7B與B8C反應(yīng) 反應(yīng)前
A7B:端粒-OriL-Or iT-AS-AL-DNA7-BR-BS-端粒； B8C:端粒-OriL-Or iT-BS-BL-DNA8-CR-CS-端粒；
接合轉(zhuǎn)化使其中一個(gè)載體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)載體的宿主當(dāng)中，BR和BL反應(yīng)，同時(shí)frt與 frt反應(yīng)，通過篩選標(biāo)記AS和CS篩選得到A78C:端粒-OriL-OriT-AS-AL-DNA7-BB-DNA8-CR-CS-端粒；
③第二輪組裝 A12C與C34B反應(yīng) 反應(yīng)前
A12C:端粒-OriL-OriT-AS-AL-DNA1-BB-DNA2-CR-CS-端粒； C34B:端粒-OriL-OriT-CS-CL-DNA3-AB-DNA4-BR-BS-端粒； 接合轉(zhuǎn)化使其中一個(gè)載體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)載體的宿主當(dāng)中，CR和CL反應(yīng)，同時(shí)frt與 frt反應(yīng)，通過篩選標(biāo)記AS和BS篩選得到
A1234B:端粒-OriL-OriT-AS-AL-DNA1-BB-DNA2-CB-DNA3- AB-DNA4-BR-BS-端粒； B56A與A78C反應(yīng) 反應(yīng)前
B56A:端粒-OriL-Or iT-BS-BL-DNA5-CB-DNA6-AR-AS-端粒； A78C:端粒-OriL-OriT-AS-AL-DNA7-BB-DNA8-CR-CS-端粒； 接合轉(zhuǎn)化使其中一個(gè)載體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)載體的宿主當(dāng)中，AR和AL反應(yīng)，同時(shí)frt與 frt反應(yīng)，通過篩選標(biāo)記BS和CS篩選得到
B5678C:端粒-OriL-OriT-BS-BL-DNA5-CB-DNA6-AB-DNA7- BB-DNA8-CR-CS-端粒；
④第三輪組裝 A1234B 與 B5678C 反應(yīng) 反應(yīng)前
A1234B:端粒-OriL-OriT-AS-AL-DNA1-BB-DNA2-CB-DNA3- AB-DNA4-BR-BS-端粒； B5678C:端粒-OriL-OriT-BS-BL-DNA5-CB-DNA6-AB-DNA7- BB-DNA8-CR-CS-端粒； 接合轉(zhuǎn)化使其中一個(gè)載體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)載體的宿主當(dāng)中，BR和BL反應(yīng)，同時(shí)frt與 frt反應(yīng)，通過篩選標(biāo)記AS和CS篩選得到
A12345678C:端粒-OriL-OriT-AS-AL-DNAl-BB-DNA2_CB- DNA3-AB-DNA4-BB-DNA5-CB -DNA6-AB-DNA7-BB-DNA8-CR- CS-端粒； c)環(huán)形單元載體的宿主轉(zhuǎn)移回收組裝 (1)單元載體的設(shè)計(jì)
環(huán)形單元載體包括至少兩個(gè)載體，在組裝過程中交替使用。環(huán)形單元載體按照DNA堿基排列順序的結(jié)構(gòu)為
環(huán)形單元載體A 拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)IR、載體骨架、左反應(yīng)端AR、待組裝片段的克隆位點(diǎn)、右反應(yīng)端BL。環(huán)形單元載體B 拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)IP、載體骨架、左反應(yīng)端BR、待組裝片段的克隆位點(diǎn)、右反應(yīng)端AL。載體骨架包含復(fù)制子、篩選基因?？梢园Y(jié)合轉(zhuǎn)化位點(diǎn)或其他不參與重組反應(yīng)的序列。其排布順序不影響功能。單元載體在組裝宿主當(dāng)中不能復(fù)制。其中AL和AR重組得到AB和AP，BL和BR重組得到BB和BP。(2)重組宿主的設(shè)計(jì)
環(huán)形重組宿主當(dāng)從環(huán)形單元載體A開始組裝，環(huán)形重組宿主當(dāng)中按順序堿基依次含有如下位點(diǎn)回收載體插入位點(diǎn)EL、切出位點(diǎn)AL、組裝位點(diǎn)IL。
當(dāng)從環(huán)形單元載體B開始組裝，環(huán)形重組宿主當(dāng)中按順序堿基依次含有如下位點(diǎn)回收載體插入位點(diǎn)EL、切出位點(diǎn)BL、組裝位點(diǎn)IB。(3)回收載體的設(shè)計(jì)
環(huán)形回收載體當(dāng)回收前組裝宿主當(dāng)中含有AL，則對(duì)應(yīng)的回收載體具有如下結(jié)構(gòu)回收載體插入位點(diǎn)ER-組裝位點(diǎn)IR-載體骨架-切出位點(diǎn)BR。當(dāng)回收前組裝宿主當(dāng)中含有BL，則對(duì)應(yīng)的回收載體具有如下結(jié)構(gòu)回收載體插入位點(diǎn)ER-組裝位點(diǎn)IP-載體骨架-切出位點(diǎn)AR載體骨架包含復(fù)制子、篩選基因?？梢园Y(jié)合轉(zhuǎn)化位點(diǎn)或其他不參與重組反應(yīng)的序列。其排布順序通常不影響功能。單元載體在組裝宿主當(dāng)中不能復(fù)制。(4)環(huán)形單元載體的宿主轉(zhuǎn)移回收組裝過程 ①初始材料
先將待組裝DNA克隆到單元載體當(dāng)中得到“初始可組裝隊(duì)列”如下 組裝宿主染色體-EL-AL-IL-染色體。其中回收重構(gòu)位點(diǎn)為EL ；右反應(yīng)端為AL ；拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)為IL。C2R :IR_載體骨架-AR-DNA2-BL-接開頭。其中左反應(yīng)端為AR ；右反應(yīng)端為BL ；拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)為頂。ClP :IP-載體骨架-BR-DNAl-AL-接開頭。其中左反應(yīng)端為BR ；右反應(yīng)端為AL ；拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)為IP?；厥蛰d體B =ER-IR-載體骨架-BR-接開頭。其中回收重構(gòu)位點(diǎn)為ER ；拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)為IR0②組裝過程
組裝宿主初始狀態(tài)
組裝宿主染色體-EL-AL-IL-染色體；組裝C2R，IL和頂重組 組裝宿主染色體-EL-AL- IP-載體骨架-AR-DNA2-BL-IB-染色體；切出載體骨架，AL 和AR重組
組裝宿主為染色體-EL-AB-DNA2-BL-IB-染色體；組裝C1P，IB和IP重組 組裝宿主染色-EL-AB-DNA2-BL-IR-載體骨架-BR-DNAI-AL-1L-染色體，切出載體骨架，BL和BR重組
組裝宿主染色體-EL-AB-DNA2-BB-DNA1-AL-IL-染色體；使用回收載體使其變?yōu)橘|(zhì)粒形式，EL和ER重組
組裝宿主染色體-EP-IR-載體骨架-BR-DNA2-BB-DNA1-AL-IL-染色體；將組裝片段切出回收，頂和IL重組
組裝宿主染色體-EP-IB-染色體?；厥盏妮d體IP-載體骨架-BR-EB-AB-DNA2-BB-DNAI-AL-接開頭
回收到的載體具有的結(jié)構(gòu)“IP-載體骨架-BR-……-AL-接開頭”與單元載體一致，可用于進(jìn)一步組裝。④并行組裝
如果有N段DNA待組裝，先將DNA克隆到單元載體，將按設(shè)計(jì)的前后相接關(guān)系的DNA單元載體每2-3段劃分為一組，每組用順次組裝并回收，這些組可以同時(shí)操作，實(shí)現(xiàn)并行化。在下一輪中，將按設(shè)計(jì)的前后相接關(guān)系的回收的載體每2-3段劃分為一組，每組用順次組裝并回收，這些組可以同時(shí)操作，實(shí)現(xiàn)并行化。重復(fù)以上過程，直到所有需要組裝的DNA都按照設(shè)計(jì)的順序組裝到一起。d)線形單元載體的宿主轉(zhuǎn)移回收組裝
(1)單元載體的設(shè)計(jì)利用線形單元載體。線形單元載體包括至少兩個(gè)載體，在組裝過程中交替使用。線形單元載體可以有線形和環(huán)形，在實(shí)際發(fā)生重組時(shí)，底物為線性。線形單元載體按照DNA堿基排列順序的結(jié)構(gòu)為線形單元載體A線形形式載體左臂、左反應(yīng)端AR、待組裝片段的克隆位點(diǎn)、右反應(yīng)端BL、篩選標(biāo)記AS、載體右臂。線形單元載體B線形形式載體左臂、左反應(yīng)端BR、待組裝片段的克隆位點(diǎn)、后反應(yīng)端AL、篩選標(biāo)記BS、載體右臂。載體左臂包含端粒、復(fù)制原點(diǎn)。單元載體在組裝宿主當(dāng)中不能復(fù)制。載體右臂包含端粒。線形單元載體A的環(huán)形形式端粒酶識(shí)別位點(diǎn)、載體骨架、左反應(yīng)端AR、待組裝片段的克隆位點(diǎn)、右反應(yīng)端BL、篩選標(biāo)記AS。線形單元載體B的環(huán)形形式端粒酶識(shí)別位點(diǎn)、載體骨架、左反應(yīng)端BR、待組裝片段的克隆位點(diǎn)、右反應(yīng)端AL、篩選標(biāo)記BS。載體骨架包含復(fù)制子、篩選基因?？梢园Y(jié)合轉(zhuǎn)化位點(diǎn)或其他不參與重組反應(yīng)的序列。其排布順序通常不影響功能。單元載體在組裝宿主當(dāng)中不能復(fù)制。對(duì)于線形載體，端粒為拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)。線形重組宿主當(dāng)從線形單元載體A開始組裝，線形重組宿主的接近端粒末端處從內(nèi)側(cè)到端粒依次具有如下位點(diǎn)回收位點(diǎn)EL，插入位點(diǎn)AR。當(dāng)從線形單元載體B開始組裝，線形重組宿主的接近端粒末端處從內(nèi)側(cè)到端粒依次具有如下位點(diǎn)回收位點(diǎn)EL，插入位點(diǎn)BR。線形回收載體當(dāng)回收前組裝宿主含有AL時(shí)，則對(duì)應(yīng)的回收載體具有如下結(jié)構(gòu) 端粒、復(fù)制子、AR、回收載體插入位點(diǎn)er、篩選標(biāo)記AS、端粒。當(dāng)回收前組裝宿主含有BL時(shí)，則對(duì)應(yīng)的回收載體具有如下結(jié)構(gòu)端粒、復(fù)制子、 BR、回收載體插入位點(diǎn)ER、篩選標(biāo)記BS、端粒。(4)線形單元載體的宿主轉(zhuǎn)移回收組裝過程 ①初始材料
組裝宿主染色體-EL-AL-BS-端粒；其中回收重構(gòu)位點(diǎn)為EL ；右反應(yīng)端為AL ；拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)為端粒。L2A 端粒-復(fù)制原點(diǎn)-AR-DNA2-BL-AS-端粒；其中左反應(yīng)端為AR ；右反應(yīng)端為BL ； 拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)為端粒。LlB 端粒-復(fù)制原點(diǎn)-BR-DNA1-AL-BS-端粒；其中左反應(yīng)端為BR ；右反應(yīng)端為AL ； 拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)為端粒?；厥蛰d體B 端粒-復(fù)制原點(diǎn)-BR-ER-BS-復(fù)制起始蛋白基因-端粒。其中回收重構(gòu)位點(diǎn)為ER ；拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)為端粒。②順序組裝 組裝宿主初始狀態(tài)組裝宿主染色體-EL-AL-BS-端粒；組裝L2A，IL和頂重組。用AS篩選組裝宿主染色體-EL-AB-DNA2-BL-AS-端粒；組裝LIB、IL和頂重組，用BS篩選 組裝宿主染色體-EL-AB-DNA2-BB-DNAI-AL-BS-端粒；回收載體B與基因組交換，EL 和ER重組
組裝宿主染色體-EP-AS-復(fù)制起始蛋白基因-端粒； 回收載體端粒-復(fù)制原點(diǎn)-BR-EB-AB-DNA2-BB-DNAI-AL-BS-端粒 回收到的載體具有的結(jié)構(gòu)“端粒-復(fù)制原點(diǎn)-BR-……-AL-BS-端?！迸c單元載體一致， 可用于進(jìn)一步組裝。④并行組裝
如果有N段DNA待組裝，先將DNA克隆到單元載體，將按設(shè)計(jì)的前后相接關(guān)系的DNA單元載體每2-3段劃分為一組，每組用順次組裝并回收，這些組可以同時(shí)操作，實(shí)現(xiàn)并行化。 在下一輪中，將按設(shè)計(jì)的前后相接關(guān)系的回收的載體每2-3段劃分為一組，每組用順次組裝并回收，這些組可以同時(shí)操作，實(shí)現(xiàn)并行化。重復(fù)以上過程，直到所有需要組裝的DNA都按照設(shè)計(jì)的順序組裝到一起。由于部分基因序列長度較大，用NCBI數(shù)據(jù)庫中的引用代替。例如 “ [AY048744. 1 240-23] ”表示 NCBI 的 nucleotide 數(shù)據(jù)庫中編號(hào) AY048744. 1 的序列中(由于MO大于23，所以是反向互補(bǔ)序列)23堿基到240堿基的反向互補(bǔ)序列。 “[AY048744. 1 23-240] ”表示 NCBI 的 nucleotide 數(shù)據(jù)庫中編號(hào) AY048744. 1 序列中(由于 23小于240，是正向序列)23堿基到240堿基序列。基因合成所用的載體，合成的基因保存于該載體當(dāng)中
pQLV:接片段下游 TAGGAGAGACCGTGCAGGTACCCCGCGTTGTCTAGAAGCTTCCTATTGG GCTTGCTATCCCTCCATAGCAGAAAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACTATTACTCAACAGGT TTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACG[EF196094. 1:533-1581][JF313343. 1 1950-2222] AATACCGCGG[JF796098. 11967-2136]C[JF796098. 12138-2292]CGTGTTATCACTCATGGTTATG GCAGCACTA[JF796098. 12324-2798]TACCGAAGAAAGGCCCACCCGTGAAGGTGAGCCAGTGAGTTGATTG CGTTCGCAGAATTGGGAATCTGCAGGGTACCTGATCCTCTAGAGTCGACCTGCACAGGTCTCTAAG 接片段上游。實(shí)施例1 利用環(huán)形組裝系統(tǒng)組裝luxA、luxB、luxC、luxD、luxE。原始質(zhì)粒pAH57，表達(dá)Lambda Int Xis。pAH69，表達(dá) HK022 Int。pAH129， 表達(dá) Phi80 Int Xis。pAH83，表達(dá) HK022 Int Xis。pAH70，包含 HK022 attP。來源于 CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)。pCMR，表達(dá) HK022_Lambda Chemira Int Xis。 pAH69Pir，表達(dá) HK022 Int 禾Π Pir 基因。pCMRPir，表達(dá) HK022_Lambda Chemira Int Xis 和 Pir 基因。pAH129E,用 HindIII 破壞 pAH129 中的 lambda Cl 得到。構(gòu)建質(zhì)粒
(1)構(gòu)建輔助質(zhì)粒 合成引物
EVFACCTGACCGCTATCCCTGA EVRGCCCTTCAATCGCCAGA IHFTTGACTATTTTACCTCTGGCGG IHR:TCCGACTTATGCCCGAGAAGACGTTGIIFCAACGTCTTCTCGGGCATAAGTCGGA IIR:AATAACATGTAGCTTGGCATTGCTTATCAA 合成基因
plpir:ACTAGTTTGAATTGGTCACGACTTTGCGAAGCAAAGTCTAGTGAGTATACTCAAGCATTGAGTGGA TCGATGAGCTCAGGAGGTAATTATAATGCGTCTGAAAGTTATGATGGACGTTAACAAAAAAACCAAAATCCGTCACC GTAACGAACTGAACCACACCCTGGCGCAGCTGCCGCTGCCGGCGAAACGTGTTATGTACATGGCGCTGGCGCTGATC GACTCTAAAGAACCGCTGGAACGTGGTCGTGTTTTCAAAATCCGTGCGGAAGACCTGGCGGCGCTGGCGAAAATCAC CCCGTCTCTGGCGTACCGTCAGCTGAAAGAAGGTGGTAAACTGCTGGGTGCGTCTAAAATCTCTCTGCGTGGTGACG ACATCATCGCGCTGGCGAAAGAACTGAACCTGCTGTCTACCGCGAAAAACTCTTCTGAAGAACTGGACCTGAACATC ATCGAATGGATCGCGTACTCTCCGGACGAAGGTTACCTGTCTCTGAAATTCACCCGTACCATCGAACCGTACATCTC TTCTCTGATCGGTAAAAAAAACAAATTCACCACCCAGCTGCTGACCGCGTCTCTGCGTCTGTCTTCTCAGTACTCTT CTTCTCTGTACCAGCTGATCCGTAAACACTACTCTAACTTCAAAAAAAAAAACTACTTCATCATCTCTGTTGACGAA CTGAAAGAAGAACTGATCGCGTACACCTTCGACAAAGACGGTAACATCGAATACAAATACCCGGACTTCCCGATCTT CAAACGTGACGTTCTGAACAAAGCGATCGCGGAAATCAAAAAAAAAACCGAAATCTCTTTCGTTGGTTTCACCGTTC ACGAAAAAGAAGGTCGTAAAATCTCTAAACTGAAATTTGAATTTGTGGTGGATGAAGATGAATTTTCTGGTGACAAA GACGACGAAGCGTTCTTCATGAACCTGTCTGAAGCGGACGCGGCGTTCCTGAAAGTTTTCAACGAAACCGTTCCGCC GAAAAAAGCGAAAGGTTAGGAGCTCTCTAGAAACAAGCTT 實(shí)驗(yàn)步驟
構(gòu)建pAH129E 用HindIII對(duì)pAHU9作酶切，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在30°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在30°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒用引物EVF和EVR 進(jìn)行PCR驗(yàn)證篩選其中能夠產(chǎn)生248bp片段的，并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pAH129E。準(zhǔn)備PCR 以pAH129E為模板用引物EVF和EVR進(jìn)行PCR， 準(zhǔn)備pAH83
構(gòu)建pCMR 以pAH57為模板用引物IIF和UR進(jìn)行PCR，產(chǎn)物標(biāo)記為rl。以pAH83為模板用引物IHF和IHR進(jìn)行PCR，產(chǎn)物標(biāo)記為rH。以rH和rl為模板用引物IHF和UR進(jìn)行 PCR，用限制內(nèi)切酶EcoRI和PciI對(duì)PCR產(chǎn)物作酶切，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為cIH。 用限制內(nèi)切酶NcoI和EcoRI對(duì)pAH83作酶切，并加入CIAP去磷酸化處理，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為cAH83。用T4 DNA連接酶對(duì)cAH83和cIH進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化到E. coli DH5a制成的感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在30°C 培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在30°C 培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pCMR。準(zhǔn)備cPir 用限制內(nèi)切酶EcoRI和HindIII對(duì)plpir作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中1123bp的片段，標(biāo)記為cPir。構(gòu)建pCMRPir 用限制內(nèi)切酶EcoRI和HindIII對(duì)pCMR作酶切，并加入CIAP去磷酸化處理，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中4588bp的片段，標(biāo)記為cCMR。用T4 DNA連接酶對(duì)cPir和cCMR進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在30°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在30°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pCMRPir。構(gòu)建pAH69Pir 用限制內(nèi)切酶EcoRI和HindIII對(duì)pAH69作酶切，并加入CIAP去磷酸化處理，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中4371bp的片段，標(biāo)記為c69。用T4 DNA連接酶對(duì)cPir和c69進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在30°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在30°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pAH69Pir。(2)構(gòu)建單元載體 合成引物
hkpFGGTACCATAAATAGCCTGAAAGGCGCTGCTAATGCTCTGTCTCAGGTC
hkpRGTCGACATAATTACACTTCGTGATGGGACAAAATTGAAATCG
aplFGGTACCATAAATAGCCTGAAAGGCGAACACGTTTCAGTGAAACCATTTAAGAAAG
aplR:GTCGACATAATTACACTTCGTGGGTGAATCACGACAAAGCGTATCAAAAAC
vccFGGTACCATAAATAGCCTGAAAGGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTG
vccR:GTCGACATAATTACACTTCGTGATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATAC
cInFATAAGGTACCAGTCGACGCCGTCGAGGCCGATGC
cInRATATTTACACTTCGTGGGCCATGCTGGCGTCCG
aprFGGTACCATAAATAGCCTGAAAGGCACATTTTTGTTTTTGGGTACACA
aprRGTCGACATAATTACACTTCGTGAATATTGAATCTCTATTCAGAACACTTT
KNFATAAGTCGACAAAGCCAGTCCGCAGAAACG
KNRATAAGAATTCCCCGCTCAGAAGAACTCGTC
PUCFATAACAATTGCTTCGCCCACCCCAAAAGGATCTAG
PUCRAAAGTCGACAAGGAGGTACCACGGTTATCCACAGAATCAGGG
tesFCCTTTTTACGGTTCCTGGC
tesR:TGTCCAGATAGCCCAGTAGC
合成基因
attRHK022:GGTACCATAAATAGCCTGAAAGGCTCAGGTCACTAATACTATCTAAGTAGTTGATTCATAGT GACTGGATATGTTGCGTTTTGTCGCATTATGTAGTCTATCATTTAACCACAGATTAGTGTAATGCGATGATTTTTAA GTGATTAATGTTATTTTGTCATCCTTTAGGTGAAAAAGGTTGAGTCGCAAAGCGGCACGAAGTGTAATTATGTCGAC attLl:GGTACCATAAATAGCCTGAAAGGCCAAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTG CAACAAATTGATAAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCACGAAGTGTAATTATGTC GAC
attRl:GGTACCATAAATAGCCTGAAAGGCACAAGTTTGTACAAAAAAGCTGAACGAGAAACGTAAAATGAT ATAAATATCAATATATTAAATTAGATTTTGCATAAAAAACAGACTACATAATACTGTAAAACACAACATATCCAGTC ACTATGCACGAAGTGTAATTATGTCGAC
attR2:GGTACCATAAATAGCCTGAAAGGCACCACTTTGTACAAGAAAGCTGAACGAGAAACGTAAAATGAT ATAAATATCAATATATTAAATTAGATTTTGCATAAAAAACAGACTACATAATACTGTAAAACACAACATATCCAGTC ACTATGCACGAAGTGTAATTATGTCGACattL2:GGTACCATAAATAGCCTGAAAGGCCAAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTG CAACAAATTGATAAGCAATGCTTTCTTATAATGCCAACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCACGAAGTGTAATTATGTC GAC
phi80attR:ACATTTTTGTTTTTGGGTACACAAAAGTGTACACAAAGTTGCCCACTCAAAGCTACACGCAA TGTAACACTAGTTCGCAGAGTGTTATGGTTTACATCCTTGAAAGCCTGCTGGATAAGGGTTTAGCGTAACAGAACGT TTTTACGCGGAATTGTTCGTAATATGCCAAATGACAATTTAAGAAAGTGTTCTGAATAGAGATTCAATATT phi80attLGAACACGTTTCAGTGAAACC[AY048738. 1572-358]
Kan0ri:GGTACCATAAATAGCCTGAAAGGC[AY048744. 1:1271-110] CTCGAG[AY048744. 12104-1666]CACGAAGTGTAATTATGTCGAC 實(shí)驗(yàn)步驟
構(gòu)建pUCVHK022P 以pAH70為模板用弓丨物hkpF和hkpR進(jìn)行PCR，用限制內(nèi)切酶KpnI 和Mil對(duì)PCR產(chǎn)物作酶切，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為CHK022P。用T4 DNA連接酶對(duì) cUCV和CHK022P進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pUCVHK022P。準(zhǔn)備cUCVHK022P 用限制內(nèi)切酶DraIII和MlI對(duì)pUCVHK022P作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中介于IOOObp和3600bp之間的DNA片段，標(biāo)記為cUCVHK022P。構(gòu)建pUCVHK022PXLl 用限制內(nèi)切酶BglI和Mil對(duì)λ Ll作酶切，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為c λ Li。用"Γ4 DNA連接酶對(duì)CUCVHK022P和cXLl進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5ci制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB 瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為 PUCVHK022PA Ll0準(zhǔn)備PCR 以pUCVHK022P λ Ll為模板用引物tesF和tesR進(jìn)行PCR，
構(gòu)建pUCV 以pK18mobSacB為模板用引物KNF和KNR進(jìn)行PCR，用限制內(nèi)切酶Mil和 EcoRI對(duì)PCR產(chǎn)物作酶切，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為dKMS。以pUC18為模板用引物 PUCF和PUCR進(jìn)行PCR，用限制內(nèi)切酶Mil和MfeI對(duì)PCR產(chǎn)物作酶切，并加入CIAP去磷酸化處理，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為dUC。用T4 DNA連接酶對(duì)dUC和dKMS進(jìn)行連接， 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為 pUCV。準(zhǔn)備cUCV 用限制內(nèi)切酶KpnI和MlI對(duì)pUCV作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中1921bp的片段，標(biāo)記為cUCV。構(gòu)建pUCV080L:以Φ80 為模板用引物aplF和aplR進(jìn)行PCR，用限制內(nèi)切酶 KpnI和Mil對(duì)PCR產(chǎn)物作酶切，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為c080L。用T4 DNA連接酶對(duì)cUCV和c080L進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pUCV0 80L。構(gòu)建pUCV0 80LChlr 用限制內(nèi)切酶DraIII和SalI對(duì)pUCV080L作酶切，并加入CIAP去磷酸化處理，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為cUCVOSOL。以pKD3為模板用引物 vccF和vccR進(jìn)行PCR，用限制內(nèi)切酶BglI和MlI對(duì)PCR產(chǎn)物作酶切，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為cChlr。用T4 DNA連接酶對(duì)cChlr和cUCV0 80L進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到 E. coli DH5 α制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上， 在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在 37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pUCVOSOLChlr。構(gòu)建TARGET 用限制內(nèi)切酶BglI和DraI11對(duì)PCR產(chǎn)物作酶切，用溶液法回收酶切產(chǎn)物,標(biāo)記為CHK022P λ LlBD。用限制內(nèi)切酶BglI和DraIII對(duì)pUCV。80LChlr作酶切，并加入CIAP去磷酸化處理，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中介于IOOObp和1950bp之間的 DNA片段，用T4 DNA連接酶對(duì)分離產(chǎn)物和cHK022P λ LlBD進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Ε. coli S17-1 Pir制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氯霉素的LB瓊脂平板上，在 37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C 培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為TARGET。準(zhǔn)備cKanOri 用限制內(nèi)切酶BglI和Mil對(duì)KanOri作酶切，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為cKanOri。構(gòu)建pUCVX R2 用限制內(nèi)切酶KpnI和Mil對(duì)λ R2作酶切，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為cXR2。用Τ4 DNA連接酶對(duì)cUCV和c λ R2進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為PUCV λ R2。構(gòu)建pUCVAR2Kan0ri 用限制內(nèi)切酶DraIII和SalI對(duì)pUCV λ R2作酶切，并加入CIAP去磷酸化處理，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為CUCVXR2。用Τ4 DNA連接酶對(duì) cUCV λ R2和cKanOri進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Ε. coli DH5 α制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為PUCV λ R2Kan0ri。準(zhǔn)備cUCV λ R2Kan0ri :用限制內(nèi)切酶 DraI 11 和 Sal I 對(duì) pUCV λ R2Kan0ri 作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中介于IOOObp和4950bp之間的DNA片段，標(biāo)記為 cUCVA R2Kan0rio 構(gòu)建pUCVPreUnitP 用限制內(nèi)切酶BglI和SalI對(duì)PCR產(chǎn)物作酶切，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為 CHK022P λ LlBS0 用 Τ4 DNA 連接酶對(duì) cHK022P λ LlBS 和 cUCV λ R2Kan0ri 進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Ε. coli DH5 α制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pUCVPreUnitP。 準(zhǔn)備cBGL 以pBHR68為模板用引物clnF和clnR進(jìn)行PCR，用限制內(nèi)切酶DraIII和KpnI對(duì)PCR產(chǎn)物作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中介于IOObp和1500bp之間的DNA片段，標(biāo)記為cBGL。構(gòu)建pUCVUnitP 用限制內(nèi)切酶BglI和KpnI對(duì)pUCVPreUnitP作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中介于IOOObp和5100bp之間的DNA片段，標(biāo)記為cUCVPreUnitP。 用T4 DNA連接酶對(duì)cBGL和cUCVPreUnitP進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pUCVUnitP。構(gòu)建pUnitP 用限制內(nèi)切酶Mil對(duì)pUCVUnitP作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中26Mbp的片段，用T4 DNA連接酶對(duì)分離產(chǎn)物進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5a制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，在 37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在 37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pUnitP。構(gòu)建pUCVX Rl 用限制內(nèi)切酶KpnI和Mil對(duì)λ Rl作酶切，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為cXRl。用Τ4 DNA連接酶對(duì)cUCV和c λ Rl進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為PUCV λ Rl。構(gòu)建pUCV λ RlKanOri 用限制內(nèi)切酶DraIII和Mil對(duì)pUCV λ Rl作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中介于IOOObp和3000bp之間的DNA片段，標(biāo)記為cUCVX R1。用 T4 DNA連接酶對(duì)cUCVARl和cKanOri進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁， 從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pUCV λ RlKanOri。準(zhǔn)備cUCV λ RlKanOri 用限制內(nèi)切酶 DraI 11 和 Sal I 對(duì) pUCV λ RlKanOri 作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中介于IOOObp和4800bp之間的DNA片段，標(biāo)記為 cUCVλ RlKanOri0構(gòu)建pUCVHK022R 用限制內(nèi)切酶KpnI和Mil對(duì)HK022R作酶切，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為CHK022R。用"Γ4 DNA連接酶對(duì)cUCV和cHK022R進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到 E. coli DH5ci制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上， 在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在 37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒，標(biāo)記為pUCVHK022R。準(zhǔn)備cUCVHK022R 用限制內(nèi)切酶DraIII和Mil對(duì)pUCVHK022R作酶切，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為CUCVHK022R。構(gòu)建PUCVHK022IUL2 用限制內(nèi)切酶BglI和Mil對(duì)λ L2作酶切，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為c λ L2。用Τ4 DNA連接酶對(duì)cXL2和CUCVHK022R進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB 瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為PUCVHK022IU L2。構(gòu)建PUCVPreUnitR 用限制內(nèi)切酶BglI和Mil對(duì)pUCVHK022R λ L2作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中介于IOObp和1500bp之間的DNA片段，標(biāo)記為cHK022R λ L2。 用Τ4 DNA連接酶對(duì)CHK022R λ L2和cUCV λ RlKanOri進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pUCVPreUnitR。構(gòu)建pUCVUnitR 用限制內(nèi)切酶BglI和KpnI對(duì)pUCVPreUnitR作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中3977bp的片段，標(biāo)記為cUCVPreUnitR。用T4 DNA連接酶對(duì)cBGL 和cUCVPreUnitR進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pUCVUnitR。構(gòu)建pUnitR 用限制內(nèi)切酶Mil對(duì)pUCVUnitR作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中2527bp的片段，用T4 DNA連接酶對(duì)分離產(chǎn)物進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5a制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，在 37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在 37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pUnitR。準(zhǔn)備CcD80R:以0 801 為模板用引物即評(píng)和即沙進(jìn)行？0 ，用限制內(nèi)切酶8811 和Mil對(duì)PCR產(chǎn)物作酶切，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為c080R。構(gòu)建pUCVHK022P0 80R 用 T4 DNA 連接酶對(duì) cUCVHK022P 和 c080R 進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的 LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為 pUCVHK022P0 80R。構(gòu)建pUCVUnitExP 以pUCVHK022P Φ 80R為模板用弓丨物tesF和tesR進(jìn)行PCR，用限制內(nèi)切酶BglI和Mil對(duì)PCR產(chǎn)物作酶切，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為cHK022P080R。 用jM DNA連接酶對(duì)CUCVARlKanOri和cHK022P080R進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pUCVUnitExP。構(gòu)建pUnitExP 用限制內(nèi)切酶BglI和DraIII對(duì)pUCVUnitExP作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中2252bp的片段，用T4 DNA連接酶對(duì)分離產(chǎn)物進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5a制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pUnitExP。構(gòu)建cUCVHK02^080R 用 T4 DNA 連接酶對(duì) cUCVHK022R 和 c080R 進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的 LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為 cUCVHK022R0 80R。構(gòu)建pUCVUnitExR 以cUCVHK02^0 80R為模板用弓丨物tesF和tesR進(jìn)行PCR，用限制內(nèi)切酶BglI和Mil對(duì)PCR產(chǎn)物作酶切，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為cHK022R080R。 用jM DNA連接酶對(duì)cHK022R080R和cUCVA R2Kan0ri進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pUCVUnitExR。構(gòu)建pUnitExR 用限制內(nèi)切酶BglI和DraIII對(duì)pUCVUnitExR作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中2155bp的片段，用T4 DNA連接酶對(duì)分離產(chǎn)物進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5a制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pUnitExR。(3)構(gòu)建帶有啟動(dòng)子和發(fā)卡結(jié)構(gòu)的單元載體 基因合成
T7HP:TAGACAACGCGGGGTACCTGCACGGTCACTGCGTGCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCC CAAGGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGCAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGA TCTCAGCCACGTAGGCATAAGCCTTCGAGGCCGTTATCATCCAAAATACGGTACGGAGACGTCAACAATATCTCTAT TGAACTGCAGTCTCGAGATAAGTCGACTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTACACCGAGTGCCTGTGCAGGTCGACTCT AGAGGATCAGGTACCCTGCAGATTCCCAATTCTGCGAACGCAATCAA 實(shí)驗(yàn)步驟
準(zhǔn)備cT7HP 用限制內(nèi)切酶DraIII對(duì)T7HP作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中 248bp的片段，標(biāo)記為cT7HP。構(gòu)建pUnitRHP 用限制內(nèi)切酶BglI對(duì)pUnitR作酶切，并加入CIAP去磷酸化處理， 用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為cUnitR。用T4 DNA連接酶對(duì)cT7HP和cUnitR進(jìn)行連接， 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli S17-1 Pir制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pUnitRHP。構(gòu)建pUnitPHP 用限制內(nèi)切酶BglI對(duì)pUnitP作酶切，并加入CIAP去磷酸化處理， 用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為cUnitP。用T4 DNA連接酶對(duì)cUnitP和cT7HP進(jìn)行連接， 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli S17-1 Pir制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pUnitPHP。(4)組裝宿主 引物合成
delF:ACGCGCATGATAGCCTCATCAATAATAAGGCTTTATGCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC delR:TCATCGCAGTACTGTTGTATTCATTAAGCATCTGCCGACCTGTCAAACATGAGAATTAAVRSFGGTGAATCACGACAAAGCGTATC VRSRAAGTTGTCGCATTATTCGCCTG VRTFGAAACCAGGGCACACCAACG K2CGGTGCCCTGAATGAACTGC VRTF2AGGTTATCAGCCGAAAATGCCG VRSR2TGCCTGAGTGTTGTCTTTTTCCA 實(shí)驗(yàn)步驟
構(gòu)建E. coli TOPlO TARGET 將pAH69電轉(zhuǎn)化到E. coli TOPlO制成的感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在30°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在30°C培養(yǎng)至菌液渾濁，將TARGET電轉(zhuǎn)化到菌液制成的感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在LB培養(yǎng)基中重懸，在30°C培養(yǎng)30分鐘，在42°C 培養(yǎng)30分鐘，在30°C培養(yǎng)30分鐘，誘導(dǎo)菌液進(jìn)行HK022 BP重組，將重組產(chǎn)物涂布于含有氯霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，用引物VRSF和引物VRSR對(duì)長出的克隆進(jìn)行菌落PCR，篩選其中產(chǎn)生970bp產(chǎn)物的克隆，標(biāo)記為E. coli T0P10 TARGET。構(gòu)建Ε. coli TARKan JfE. coli T0P10 TARGET接種于含有氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，將pKD46轉(zhuǎn)化到菌液制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氯霉素和氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在30°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氯霉素和氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在30°C培養(yǎng)至菌液渾濁，以 PKD13為模板用引物delF和delR進(jìn)行PCR，將PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化到菌液制成的感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在LB培養(yǎng)基中重懸，在37°C培養(yǎng)1小時(shí)，誘導(dǎo)長出的克隆進(jìn)行λ Red重組，將重組產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，用引物VRTF和引物 K2對(duì)長出的克隆進(jìn)行菌落PCR，篩選其中產(chǎn)生1190bp產(chǎn)物的克隆，標(biāo)記為E. coli TARKan0構(gòu)建HOST JfE. coli TARKan接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C 培養(yǎng)至菌液渾濁，將PCP20電轉(zhuǎn)化到菌液制成的感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在30°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在30°C培養(yǎng)至菌液渾濁，取菌液涂布于LB瓊脂平板上，在42°C培養(yǎng) 1小時(shí)，誘導(dǎo)長出的克隆進(jìn)行frt重組，將重組產(chǎn)物涂布于LB瓊脂平板上，在42°C培養(yǎng)至可見單克隆，用引物VRTF2和引物VRSR2對(duì)長出的克隆進(jìn)行菌落PCR，篩選其中產(chǎn)生863bp產(chǎn)物的克隆，標(biāo)記為HOST。(5)單元載體 引物合成
IuxCFCCAGATCACCGAGTGAGGCTAATATGACTAAAAAAATTTCATTCA IuxCRCCAGATCACCGTGTGTTACGGGACAAATACAAGGAACTT IuxAFCCAGATCACCGAGTGAGGGCTCTCTATGAAATTTGGAA IuxARCCAGATCACCGTGTGCTATAATAGCGAACGTTGTTTTTCTTT IuxBFCCAGATCACCGAGTGAGGAAAAAGAAATGAAATTTGGATT IuxBRCCAGATCACCGTGTGCTACATGTGGTACTTTTTAATATTATCATT IuxEFCCAGATCACCGAGTGAGGACAGGTATGACTTCATATGTTGATAAACA IuxERCCAGATCACCGTGTGTCAACTATTAAATGCTTGGTTTAAGCIuxDFCCAAATCACCGAGTGAGATAAGTTCCTTGTATTTGTCCCG IuxDRCCAGATCACCGTGTGTTAAGACAGCGAAATCGCTTG 基因合成
IuxA:[BX571866. 1:27616-28695] IuxD:[BX571866. 1:26476-27439] IuxC:[BX571866. 1:25061-26503] IuxB:[BX571866. 1:28713-29687] IuxE:[BX571866. 1:29749-30861] 實(shí)驗(yàn)步驟
準(zhǔn)備cUnitRHP 用限制內(nèi)切酶BglI對(duì)pUnitRHP作酶切，并加入CIAP去磷酸化處理， 用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為cUnitRHP。準(zhǔn)備cUnitPHP 用限制內(nèi)切酶BglI對(duì)pUnitPHP作酶切，并加入CIAP去磷酸化處理，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為cUnitPHP。構(gòu)建pUnitRHPluxA 以IuxA為模板用引物IuxAF和IuxAR進(jìn)行PCR，用限制內(nèi)切酶DraIII對(duì)PCR產(chǎn)物作酶切，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶對(duì)cUnitRHP和分離產(chǎn)物進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli S17-1 Pir制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pUnitRHPluxA。構(gòu)建pUnitPHPluxD 與構(gòu)建 pUnitRHPluxA 相同，其中 IuxA、IuxAF、IuxAR、 cUnitRHP 分別替換為luxD、IuxDF, luxDR、cUnitPHP。構(gòu)建pUnitRHPluxC 與構(gòu)建 pUnitRHPluxA 相同，其中 IuxA、IuxAF、IuxAR、 cUnitRHP 分別替換為luxC、IuxCF, luxCR、cUnitRHP。構(gòu)建pUnitPHPluxB 與構(gòu)建 pUnitRHPluxA 相同，其中 IuxA、IuxAF、IuxAR、 cUnitRHP 分別替換為luxB、IuxBF, luxBR、cUnitPHP。構(gòu)建pUnitRHPluxE 與構(gòu)建 pUnitRHPluxA 相同，其中 IuxA、IuxAF、IuxAR、 cUnitRHP 分別替換為luxE、IuxEF, luxER、cUnitRHP。(6)組裝過程
構(gòu)建HOSTLuxAUnit 將pCMR電轉(zhuǎn)化到HOST制成的感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在30°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在30°C培養(yǎng)至菌液渾濁，將pUnitRHPluxA電轉(zhuǎn)化到菌液制成的感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在LB培養(yǎng)基中重懸，在30°C培養(yǎng)30分鐘，在42°C培養(yǎng)30分鐘， 在30°C培養(yǎng)30分鐘，誘導(dǎo)菌液進(jìn)行HK022 LR重組，將重組產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB 瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，標(biāo)記為HOSTLuxAUnit。構(gòu)建HOSTLuxA 將pAH57電轉(zhuǎn)化到HOSTLuxAUnit制成的感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在30°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在30°C培養(yǎng)至菌液渾濁，取菌液涂布于LB瓊脂平板上，在42°C培養(yǎng)1小時(shí)，誘導(dǎo)長出的克隆進(jìn)行λ LR重組，將重組產(chǎn)物涂布于LB瓊脂平板上，在42°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于LB液體培養(yǎng)基中，在42°C培養(yǎng)至菌液渾濁，標(biāo)記為HOSTLuxA。構(gòu)建HOSTLuxALuxBUnit 與構(gòu)建 HOSTLuxAUnit 相同，其中 pCMR、HOST、 pUnitRHPluxA、HK022 LR 重組分別替換為pAH69、HOSTLuxA、pUnitPHPluxB、HK022 BP 重組。構(gòu)建HOSTLuxALuxB 與構(gòu)建 HOSTLuxA 相同，其中 HOSTLuxAUnit 替換為 HOSTLuxALuxBUnit。構(gòu)建HOSTLuxALuxBLuxEUnit 與構(gòu)建 HOSTLuxAUnit 相同，其中 pCMR、HOST、 pUnitRHPluxA、HK022 LR 重組分別替換為pCMR、HOSTLuxALuxB、pUnitRHPluxE、HK022 LR重組。構(gòu)建HOSTLuxALuxBLuxE 與構(gòu)建 HOSTLuxA 相同，其中 HOSTLuxAUnit 替換為 HOSTLuxALuxBLuxEUnit。構(gòu)建HOSTLuxALuxBLuxEExP 將 pAHU9E 電轉(zhuǎn)化到 HOSTLuxALuxBLuxE 制成的感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在30°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在30°C培養(yǎng)至菌液渾濁，將PUnitExP電轉(zhuǎn)化到菌液制成的感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在LB培養(yǎng)基中重懸，在30°C 培養(yǎng)30分鐘，在42°C培養(yǎng)30分鐘，在30°C培養(yǎng)30分鐘，誘導(dǎo)菌液進(jìn)行Φ80 LR重組，將重組產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，標(biāo)記為 HOSTLuxALuxBLuxEExP。構(gòu)建pUnitLuxALuxBLuxE 將 pAH69Pir 電轉(zhuǎn)化到 HOSTLuxALuxBLuxEExP 制成的感受態(tài)中，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行HK022 BP重組，將重組產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素和卡那霉素的LB瓊脂平板上，在30°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氨芐青霉素和卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在30°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒，用瓊脂糖凝膠電泳分離質(zhì)粒中6246bp的片段，標(biāo)記為pUnitLuxALuxBLuxE。構(gòu)建HOSTLuxCUnit 與構(gòu)建 HOSTLuxAUnit 相同，其中 pCMR、HOST、pUnitRHPluxA、 HK022 LR 重組分別替換為pCMR、H0ST、pUnitRHPluxC、HK022 LR 重組。構(gòu)建HOSTLuxC 與構(gòu)建 HOSTLuxA 相同，其中 HOSTLuxAUnit 替換為 HOSTLuxCUnit。構(gòu)建HOSTLuxCLuxDUnit 與構(gòu)建 HOSTLuxAUnit 相同，其中 pCMR、HOST、 pUnitRHPluxA、HK022 LR 重組分別替換為pAH69、HOSTLuxC、pUnitPHPluxD、HK022 BP 重組。構(gòu)建pUnitLuxCLuxD 與構(gòu)建 HOSTLuxA 相同，其中 HOSTLuxAUnit 替換為 HOSTLuxCLuxDUnit。構(gòu)建HOSTLuxCLuxDExR 與構(gòu)建 HOSTLuxALuxBLuxEExP 相同，其中 HOSTLuxALuxBLuxE、pUnitExP 分別替換為pUnitLuxCLuxD、pUnitExR。準(zhǔn)備pUnitLuxCLuxD 與構(gòu)建 pUnitLuxALuxBLuxE 相同，其中 pAH69Pir、 HOSTLuxALuxBLuxEExP 分別替換為pCMRPir、HOSTLuxCLuxDExR。構(gòu)建HOSTLuxALuxBLuxELuxCLuxDUnit 與構(gòu)建 HOSTLuxAUnit 相同，其中pCMR、HOST、pUnitRHPluxA、HK022 LR 重組分另Ij 替換為pAH69、HOSTLuxALuxBLuxE、 pUnitLuxCLuxD、HK022 BP 重組。構(gòu)建HOSTLuxALuxBLuxELuxCLuxD 與構(gòu)建 HOSTLuxA 相同，其中 HOSTLuxAUnit 替換為HOSTLuxALuxBLuxELuxCLuxDUnit。HOSTLuxALuxBLuxELuxCLuxD即為5個(gè)基因組裝在一起的產(chǎn)物。實(shí)施例2 利用線形組裝系統(tǒng)組裝luxA、luxB、luxC、luxD、luxE。(1)構(gòu)建 pLUHelp : 基因合成
CrossInt [AY048 72 1. 1 878- 1 2 58 ] [AY048 72 1. 1 1 2 59- 1 60 2] [AY048715. 1:1614-2236]TTGGCACTGGCTGATCAGCTAGCACATGT 實(shí)驗(yàn)步驟
構(gòu)建pLUHelpH 用限制內(nèi)切酶NcoI和EcoRI對(duì)pAH83作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中3822bp的片段，將分離產(chǎn)物用堿式磷酸酶處理，產(chǎn)物標(biāo)記為cAH83。用限制內(nèi)切酶EcoRI和PciI對(duì)Crosslnt作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中1375bp的片段， 標(biāo)記為cCrossInt。用T4 DNA連接酶對(duì)cCrossInt和cAH83進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上， 在30°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中， 在30°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pLUHelpH。構(gòu)建pLUHelp 用限制內(nèi)切酶HindIII對(duì)pLUHelpH作酶切，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶對(duì)分離產(chǎn)物進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在30°C培養(yǎng)至可見單克隆， 挑取平板上的克隆接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在30°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pLUHelp。(2)單元載體和組裝宿主插入位點(diǎn) 引物合成
CNFAATAGTCGACCTTCGGAATAGGAACTTCATTTA CNRAATATCTAGAGCCTACCTGTGACGGAAGA pUFATAAGGTACCGGATTGCGAGGCTTTGCC pURTATAGTCGACGCAAGATCCGCAGTTCAACC KNFATTAGTCGACGATCCCCTTATTAGAAGAACTCG KNRTTCATCTAGAAGAGCGCTTTTGAAGCTCA ydeQFTTATTCATAGATAAAAGTGACACCAATGA ydeQRGTCGATTCGATTTTCTTAGCCTT 基因合成
CN (連接在 pQLV 中)[JF748716. 1 3633-3757]GGCCTCGACGGCCACGTTACTTAGTCATCGGC CTACGAGGCC[GU574773. 11425-1326]GGATCCGCAGCAGTAGAGCTCCTCGAGAGTGCAACGACTAGTCAC ATGGTG[AF064539. 124474-25037]CACACGGTGGGTACC
KN (連接在 pQLV 中)[JF748716. 1:2177-2053]GGCCTCGACGGCC[CP000948. 1: 1675439-1675498][AY048737. 12029-1922]TGCACCGACCGTGAATTTAAGGCCTACGAGGCC[GU931384. 1750-849]GGATCCGCAGCAGTAGAGCTCCTCGAGAGTGCAACGACTAGTCACATGGTG [A F064539.124474-25037]CACACGGTGGGTACC[CP000948. 1:1676351-1676410]
N15 (連接在 pQLV 中)GGATCC [FJ160465. 1:3530-6278] CCATGGGGCGCGTACTGAGAGCTC par (連接在 pQLV 中)CCATGG [FJ160465. 1 8082-9448] GCTC 實(shí)驗(yàn)步驟
構(gòu)建pN15Par 用限制內(nèi)切酶NcoI和&icl對(duì)附5作酶切，并加入CIAP去磷酸化處理， 用溶液法回收酶切產(chǎn)物，用限制內(nèi)切酶NcoI和Mel對(duì)par作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中1375bp的片段，用T4 DNA連接酶對(duì)分離產(chǎn)物進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5a制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在 37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在 37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pN15Par。準(zhǔn)備Cm5Par 用限制內(nèi)切酶BamHI和^icI對(duì)Pm5Par作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中4130bp的片段，標(biāo)記為cm5Par。準(zhǔn)備CR6Ky 以pKD13為模板用引物pUF和pUR進(jìn)行PCR，用限制內(nèi)切酶MlI和 KpnI對(duì)PCR產(chǎn)物作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中427bp的片段，標(biāo)記為cR6K γ。構(gòu)建pN12C 用限制內(nèi)切酶SpeI和B10I對(duì)CN作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中3308bp的片段，標(biāo)記為cCN。以pKD3為模板用引物CNF和CNR進(jìn)行PCR，用限制內(nèi)切酶Mil和^CbaI對(duì)PCR產(chǎn)物作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中905bp的片段，標(biāo)記為cCHL。用T4 DNA連接酶對(duì)cCHL和cCN進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α 制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為PN12C。構(gòu)建pR12C 用限制內(nèi)切酶MlI和KpnI對(duì)pN12C作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中1804bp的片段，標(biāo)記為cN12C。用T4 DNA連接酶對(duì)cN12C和cR6K γ進(jìn)行連接， 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Ε. coli S17-1 Pir制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氯霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氯霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為 pR12C。構(gòu)建pLSU21C 用限制內(nèi)切酶BamHI和&icl對(duì)pR12C作酶切，并加入CIAP去磷酸化處理，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中2212bp的片段，用T4 DNA連接酶對(duì)分離產(chǎn)物和cN15Par進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli S17-1 Pir制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氯霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為PLSU21C。構(gòu)建pN21K 以pKD13為模板用引物KNF和KNR進(jìn)行PCR，用限制內(nèi)切酶SalI和 XbaI對(duì)PCR產(chǎn)物作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中1182bp的片段，標(biāo)記為cKAN。 用限制內(nèi)切酶SpeI和B10I對(duì)KN作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中3540bp的片段，標(biāo)記為cKN。用"Γ4 DNA連接酶對(duì)cKN和cKAN進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C 培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為PN21K。構(gòu)建pR21K 用Mil和KpnI對(duì)pN21K作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中 2253bp的片段，標(biāo)記為cN21K。用T4 DNA連接酶對(duì)cR6Ky和cN21K進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli S17-1 Pir制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pR21K。構(gòu)建pLSUH 用BamHI和&icl對(duì)pR21K作酶切，并加入CIAP去磷酸化處理，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中2661bp的片段，用T4 DNA連接酶對(duì)分離產(chǎn)物和Cm5Par進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli S17-1 Pir制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為PLSU12K。構(gòu)建E. coli MG1655 HI 以 pN21K 為模板用引物 ydeQF 和 ydeQR 進(jìn)行 PCR，將 PKD46轉(zhuǎn)化到E. coli MG1655制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在30°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氨芐青霉素的 LB液體培養(yǎng)基中，在30°C培養(yǎng)至菌液渾濁，將PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化到菌液制成的感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在LB培養(yǎng)基中重懸，在37°C培養(yǎng)1小時(shí)，誘導(dǎo)長出的克隆進(jìn)行λ Red重組，將重組產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，標(biāo)記為E. coli MG1655 H2K0(3)組裝宿主線性化 引物合成
PGlFCGTTCGCAGAATTGGGAATC PG1RGGGATAGCAAGCCCAATAGG 基因合成
sopAB(連接在 pQLV 中)CTCGAG [AF064539. 1 22114-24973] AGCTT TacTelN (連接在 pQLV 中)ACTAGTGAAT [DQ997052. 1:49-228] [AF064539. 1:24981-26890]
實(shí)驗(yàn)步驟
構(gòu)建pBSTacTelN 以TacTelN為模板用引物PGlF和PGlR進(jìn)行PCR，用限制內(nèi)切酶SpeI 和HindIII對(duì)PCR產(chǎn)物作酶切，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為cTacTelN。用限制內(nèi)切酶 SpeI和HindIII對(duì)pBlueSCript2KS (-)作酶切，并加入CIAP去磷酸化處理，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中^^bp的片段，標(biāo)記為cBS。用T4 DNA連接酶對(duì)cBS和cTacTelN進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pBSTacTelN。構(gòu)建pBSTacTeINSop 用限制內(nèi)切酶 XhoI 和 HindIII 對(duì) pBSTacTelN 作酶切， 并加入CIAP去磷酸化處理，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中5043bp的片段，標(biāo)記為cBSTacTelN。用限制內(nèi)切酶)(hoI和HindIII對(duì)sopAB作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中^69bp的片段，標(biāo)記為cSop。用T4 DNA連接酶對(duì)cSop和cBSTacTelN進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氨芐青霉素的 LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒，標(biāo)記為pBSTacTelNSop。構(gòu)建pAHTacTelNSop 用EcoRI和BioI對(duì)pBSTacTelNSop作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中4998bp的片段，標(biāo)記為CBSTaCjTelNSop。用Mil和EcoRI對(duì)pAH153作酶切，并加入CIAP去磷酸化處理，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中2306bp的片段，標(biāo)記為cAH153。用T4 DNA連接酶對(duì)cAH153和cBSTacTelNSop進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli S17-1 Pir制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有慶大霉素的LB瓊脂平板上， 在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有慶大霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在 37 °C培養(yǎng)至菌液渾濁，提取質(zhì)粒，標(biāo)記為pAHTacTeINSop。構(gòu)建E. coli MG1655 H2KTS 將 pAH123 電轉(zhuǎn)化到 E. coli MG1655 HI 制成的感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在30°C培養(yǎng)至可見單克隆， 挑取平板上的克隆接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在30°C培養(yǎng)至菌液渾濁，將 pAHTacTeINSop電轉(zhuǎn)化到菌液制成的感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在LB培養(yǎng)基中重懸，在30°C培養(yǎng)30分鐘，在42°C培養(yǎng)30分鐘，在30°C培養(yǎng)30分鐘，誘導(dǎo)菌液進(jìn)行Φ80 BP重組， 將重組產(chǎn)物涂布于含有慶大霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，標(biāo)記為E. coli MG1655 H2KTS。在 iTelN 作用下，E. coli MG1655 H2KTS 形成端粒，標(biāo)記為 E. coli MG1655 H2KTSL0(4)構(gòu)建回收載體 引物合成
pUEFATAAGAGCTCGGATTGCGAGGCTTTGCC pUERTATAACTAGTGCAAGATCCGCAGTTCAACC KNFATTAGCGGCCGCGATCCCCTTATTAGAAGAACTCG KNRTTCAGGATCCAGAGCGCTTTTGAAGCTCA CNFAATAGCGGCCGCCTTCGGAATAGGAACTTCATTTA CNRAATAGGATCCGCCTACCTGTGACGGAAGA 基因合成
repl (連接在 pQLV 中)[EF397941. 1 3128-5246] TCCATAAGGACGTC r印2(連接在 pQLV 中)[EF583812. 1 8100-6349] ACGTC
rep3(連接在 pQLV 中)[EF397941.16985-7916]TGCTCGCAAAGTTGAAAAGAC AACAATTGAAGTAGATCGTGACCTCGACTTGAACATTGACATCCACGGAAATCCGCGTAGTAAAACT[E F397941. 1:8005-8515]GACGTC
KE(連接在 pQLV 中)GAGCTCATTAGCACGACCATGGTAGATTATGATTAATTAA[J F748716. 13633-3757]CGCTTTGCGACTCAACCTTT[AY048737. 11932-1784]GACGTCATCTTAGAT ACACTAGTAGATCTTATCGATGATCGCGGCCGCCACATGGTG [AF064539. 124474-25037]CACACGGTG
CE(連接在 pQLV 中)GAGCTCATTAGCACGACCATGGTAGATTATGATTAATTAA[JF748716.12177-2053]CGCTTTGCGACTCAACCTTT[AY048737. 11932-1784]GACGTCATCTTAGAT ACACTAGTAGATCTTATCGATGATCGCGGCCGCCACATGGTG[AF064539. 124474-25037]CACACGGTG 實(shí)驗(yàn)步驟
準(zhǔn)備cR6K γ 以pKD13為模板用引物pUEF和pUER進(jìn)行PCR，用SpeI和&icl對(duì)PCR產(chǎn)物作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中427bp的片段，標(biāo)記為cR6Ky。構(gòu)建pCBREP12 用AatII和PciI對(duì)r印2作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中1755bp的片段，標(biāo)記為cREP2。用AatII和PciI對(duì)r印1作酶切，并加入CIAP去磷酸化處理，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為cREPl。用T4 DNA連接酶對(duì)cREPl和cREP2進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為PCBREP12。構(gòu)建pCBREP 用AatII和BioI對(duì)r印3作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中1535bp的片段，標(biāo)記為cREP3。用AatII和XhoI對(duì)pCBREP 12作酶切，并加入CIAP去磷酸化處理，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為CREP12。用T4 DNA連接酶對(duì)cREP12和cREP3進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pCBREP。準(zhǔn)備cREP 用限制內(nèi)切酶AatII和)(baI對(duì)pCBREP作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中5392bp的片段，標(biāo)記為cREP。構(gòu)建pREPCE 用限制內(nèi)切酶AatII和SpeI對(duì)CE作酶切，并加入CIAP去磷酸化處理，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為cCE。用T4 DNA連接酶對(duì)cCE和cREP進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的 LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為 pREPCE。構(gòu)建P15aExlRC 用限制內(nèi)切酶BglII和NotI對(duì)pREPCE作酶切，并加入CIAP去磷酸化處理，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中8743bp的片段，標(biāo)記為cREPCE。以pKD3為模板用弓I物CNF和CNR進(jìn)行PCR，用限制內(nèi)切酶BamHI和NotI對(duì)PCR產(chǎn)物作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中906bp的片段，標(biāo)記為cCHL。用T4 DNA連接酶對(duì)cCHL和cREPCE 進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pl5aExlRC。構(gòu)建pLSExlRC 用限制內(nèi)切酶)(bal和^icI對(duì)P15aExlRC作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中7253bp的片段，標(biāo)記為cExlRC。用T4 DNA連接酶對(duì)cExlRC和cR6K γ 進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Ε. coli S17-1 Pir制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氯霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pLSExlRC。構(gòu)建pREPKE 用限制內(nèi)切酶AatII和SpeI對(duì)KE作酶切，并加入CIAP去磷酸化處理，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為cKE。用T4 DNA連接酶對(duì)cREP和cKE進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的 LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為 pREPKE。構(gòu)建P15aEx2RK 用限制內(nèi)切酶BglII和NotI對(duì)pREPKE作酶切，并加入CIAP去磷酸化處理，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中8743bp的片段，標(biāo)記為cREPKE。以pKD13 為模板用弓丨物KNF和KNR進(jìn)行PCR，用限制內(nèi)切酶BamHI和NotI對(duì)PCR產(chǎn)物作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中1183bp的片段，標(biāo)記為cKAN。用T4 DNA連接酶對(duì)cKAN和 cREPKE進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pl5aEx2RK。構(gòu)建pLSEx2RK 用限制內(nèi)切酶)(bal和^icI對(duì)P15aEx2RK作酶切，用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物中7530bp的片段，標(biāo)記為cEx2RK。用T4 DNA連接酶對(duì)cEx2RK和cR6K γ 進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Ε. coli S17-1 Pir制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為pLSEx2RK。(5)將基因連接到單元載體
此處引物 IuxCF> luxCR、IuxAF> IuxAR> IuxBF> luxBR、luxEF、luxER、luxDF、luxDR、基因 luxA、luxB、luxC、luxD、IuxE 與實(shí)施例 1 中一致。實(shí)驗(yàn)步驟
準(zhǔn)備CLSU21C 用SfiI對(duì)pLSU21C作酶切，并加入CIAP去磷酸化處理，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為CLSU21C。準(zhǔn)備CLSU12K:用限制內(nèi)切酶SfiI對(duì)pLSUia(作酶切，并加入CIAP去磷酸化處理， 用溶液法回收酶切產(chǎn)物，標(biāo)記為CLSU12K。構(gòu)建pLSU21CC:以IuxC為模板用引物IuxCF和IuxCR進(jìn)行PCR，用限制內(nèi)切酶 DraIII對(duì)PCR產(chǎn)物作酶切，用溶液法回收酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶對(duì)cLSU21C和分離產(chǎn)物進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E. coli S17-1 Pir制成的化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氯霉素的LB瓊脂平板上，在37°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的標(biāo)記為PLSU21CC。構(gòu)建pLSU21CA 與構(gòu)建 cLSU21C 相同，其中 luxC、luxCF、luxCR、cLSU21C 分別替換為luxA、IuxAF, luxAR、cLSU21C。構(gòu)建pLSU21CE 與構(gòu)建 cLSU21C 相同，其中 luxC、luxCF、luxCR、cLSU21C 分別替換、luxER、cLSU21C。構(gòu)建PLSU12KB :與構(gòu)建 cLSU21C 相同，其中 luxC、luxCF、luxCR、cLSU21C 分別替換為luxB、luxBF、luxBR、cLSU12K。構(gòu)建pLSU12KD :與構(gòu)建 cLSU21C 相同，其中 luxC、luxCF、luxCR、cLSU21C 分別替換為luxD、luxDF、luxDR、cLSU12K。(6)組裝過程
實(shí)驗(yàn)步驟
構(gòu)建 Ε. coli MG1655 H2KTSLHost 將 pLUHelp 電轉(zhuǎn)化到 Ε. coli MG1655 H2KTSL 制成的感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在30°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在30°C培養(yǎng)至菌液渾濁，標(biāo)記為 E. coli MG1655 H2KTSLHost。構(gòu)建Ε. coli MG1655 HITSLluxA 將 pLSU21CA 電轉(zhuǎn)化到 Ε. coli MG1655 H2KTSLHost制成的感受態(tài)中，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物形成端粒，誘導(dǎo)重組產(chǎn)物進(jìn)行λ LR重組，將重組產(chǎn)物涂布于含有氯霉素和氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在30°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氯霉素和氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在30°C培養(yǎng)至菌液渾濁，標(biāo)記為 E. coli MG1655 H2KTSLluxA。構(gòu)建E. coli MG1655 H2KTSLluxAB 將 pLSU12KB 電轉(zhuǎn)化到 E. coli MG1655 H2KTSLluxA制成的感受態(tài)中，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物形成端粒，誘導(dǎo)重組產(chǎn)物進(jìn)行λ LR重組，將重組產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素和氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在30°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素和氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在30°C培養(yǎng)至菌液渾濁，標(biāo)記為 E. coli MG1655 H2KTSLluxAB。構(gòu)建Ε. coli MG1655 H2KTSLluxABE 將 pLSU21CE 電轉(zhuǎn)化到 Ε. coli MG1655 H2KTSLluxAB制成的感受態(tài)中，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物形成端粒，誘導(dǎo)重組產(chǎn)物進(jìn)行λ LR重組，將重組產(chǎn)物涂布于含有氯霉素和氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在30°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氯霉素和氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在30°C培養(yǎng)至菌液渾濁，標(biāo)記為 E. coli MG1655 H2KTSLluxABE。準(zhǔn)備pLSU21CABE 將 pLSEx2RK 電轉(zhuǎn)化到 Ε. coli MG1655 H2KTSLluxABE 制成的感受態(tài)中，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物形成端粒，誘導(dǎo)重組產(chǎn)物進(jìn)行HK022 LR重組，將重組產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素、氨芐青霉素和氯霉素的LB瓊脂平板上，在30°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素、氨芐青霉素和氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在30°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒，用瓊脂糖凝膠電泳分離質(zhì)粒中9742bp的片段，標(biāo)記為 pLSU2ICABE。構(gòu)建Ε. coli MG1655 H2KTSLluxC 將 pLSU21CC 電轉(zhuǎn)化到 Ε. coli MG1655 H2KTSLHost制成的感受態(tài)中，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物形成端粒，誘導(dǎo)重組產(chǎn)物進(jìn)行λ LR重組，將重組產(chǎn)物涂布于含有氯霉素和氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在30°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氯霉素和氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在30°C培養(yǎng)至菌液渾濁，標(biāo)記為 E. coli MG1655 H2KTSLluxC。構(gòu)建E. coli MG1655 H2KTSLluxCD 將 pLSU12KD 電轉(zhuǎn)化到 E. coli MG1655 H2KTSLluxC制成的感受態(tài)中，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物形成端粒，誘導(dǎo)重組產(chǎn)物進(jìn)行λ LR重組，將重組產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素和氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在30°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有卡那霉素和氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在30°C培養(yǎng)至菌液渾濁，標(biāo)記為 E. coli MG1655 H2KTSLluxCD。準(zhǔn)備pLSUlICD將pLSExlRC 電轉(zhuǎn)化到Ε. coli MG1655 H2KTSLluxCD制成的感受態(tài)中，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物形成端粒，誘導(dǎo)重組產(chǎn)物進(jìn)行HK022 LR重組，將重組產(chǎn)物涂布于含有氯霉素、氨芐青霉素和卡那霉素的LB瓊脂平板上，在30°C培養(yǎng)至可見單克隆，挑取平板上的克隆接種于含有氯霉素、氨芐青霉素和卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在30°C培養(yǎng)至菌液渾濁，從菌液中提取質(zhì)粒，用瓊脂糖凝膠電泳分離質(zhì)粒中9189bp的片段，標(biāo)記為PLSU12KCD。構(gòu)建E. coli MG1655 HITSLluxABECD 將 pLSUlICD 電轉(zhuǎn)化到 E. coli MG1655 H2KTSLluxABE制成的感受態(tài)中，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物形成端粒，誘導(dǎo)重組產(chǎn)物進(jìn)行λ LR重組，將重組產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素和卡那霉素的LB瓊脂平板上，在30°C培養(yǎng)至可見單克隆， 挑取平板上的克隆接種于含有氨芐青霉素和卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在30°C培養(yǎng)至菌液渾濁，標(biāo)記為 E. coli MG1655 H2KTSLluxABECD。實(shí)施例3 環(huán)形無宿主無回收系統(tǒng)組裝Iux基因。(1)構(gòu)建 pUC-Gate: 合成引物
PGlCGTTCGCAGAATTGGGAATC PG2GGGATAGCAAGCCCAATAGG M13FTGTAAAACGACGGCCAGT M13R:CAGGAAACAGCTATGACC 合成基因
Gate (克隆在 pQLV 中):AAGCTTGCGGCCGCGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTA TAGGAACTTCTTAATTAACCAGCCTCGCAGAGCAGGATTCCCGTTGAGCACCGCCAGGTGCGAATAAGGGACAGTGA AGAAGGAACACCCGCTCGCGGGTGGGCCTACTTCACCTATCGGTACCTTCGAGAGCTCCACCGAGTGACTAGTATGA TGAATTCCACACGGTGGTCGACTACGTGCTAGCCTCGAGCAATTG
實(shí)驗(yàn)步驟用GPl和PG2對(duì)Gate進(jìn)行PCR，得到的片段用MfeI和HindIII在!^ermentas T Buffer中酶切。酶切產(chǎn)物溶液回收。標(biāo)記為片段cGate。在i^ermentas R Buffer中用 EcoRI和HindIII對(duì)pUC18載體進(jìn)行酶切，同時(shí)加入!^astAP去磷酸。酶切產(chǎn)物溶液回收。 標(biāo)記為片段cUC。用"Γ4 DNA Iigase對(duì)片段cfeite和cUC進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5 α 感受態(tài)當(dāng)中，轉(zhuǎn)化后涂布在氨芐抗性的LB平板上。生長出來的克隆用M13F和M13R引物做菌落PCR驗(yàn)證，篩選其中具有300bp的PCR產(chǎn)物的克隆。將得到的克隆培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證無突變。該質(zhì)粒記為pUC-Gate。(2)制備抗性片段 合成引物
CRFATAACTCGAGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGAAC CRRATAAGCTAGCCTTCGGAATAGGAACTTCATTTAAAT CLF ATAAGGTACCGCCTACCTGTGACGGAAGATC CLRATAAGAGCTCACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTG GRFATAACTCGAGACAAGTTTGTACAAAAAAGCTGAACG
41GRRATAAGCTAGCGAATTGTTAGGTGGCGGTACTTG GLFATAAGGTACCGGAGACCCCACACTACCATCG GLRATAAGAGCTCAGCCTGCTTTTTTGTACAAAGTTG KRFATAACTCGAGAACCTTTTTCACCTAAAGGATGACA KRRATAAGCTAGCGATCCCCTTATTAGAAGAACTCGTC KLFATAAGGTACCAGAGCGCTTTTGAAGCTCACG KLRATAAGAGCTCGGTGCACTTTAGGTGAATAAGTTGT 合成基因
C (在 pQLV 載體中)[JF748716. 1:3757-3633][GU589574. 1:1023-129] [⑶931384. 1:849-750]
G (在 pQLV 載體中)[JF748716. 1:2053-2177][AY048737. 1:3265-2481] [⑶574773. 1:1326-1425]
K (在 pQLV 載體中)AACCTTT[AY048737. 1:2015-1927][AY048744.1:1272-101] [AY048737. 11932-1816]TAAAGTGCACC
pUC-Gate-Cut 片段在 i^ermentas Seal Buffer 中用 SalI 和 NheI 對(duì) pUC-Gate 進(jìn)行酶切處理，同時(shí)加AhstAP進(jìn)行去磷酸。得到的片段用溶液回收，標(biāo)記為片段pUC-Gate-Cut。片段RC 用 CRF 和 CRR 對(duì) C 進(jìn)行 PCR，在 i^ermentas SdaI Buffer 中用 XhoI 和 NheI 對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切產(chǎn)物用溶液回收，標(biāo)記為片段RC。片段CL 用 CLF 和 CLR 對(duì) C 進(jìn)行 PCR，在 Fermentas BamHI Buffer 中用 SacI 和 KpnI對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切產(chǎn)物用溶液回收，標(biāo)記為片段CL。片段RG:用 GRF 和 GRR 對(duì) C 進(jìn)行 PCI ,在 i^ermentas SdaI Buffer 中用 XhoI 和 NheI對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切產(chǎn)物用溶液回收，標(biāo)記為片段RG。片段GL:用 GLF 和 GLR 對(duì) C 進(jìn)行 PCR,在 Fermentas BamHI Buffer 中用 SacI 和 KpnI對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切產(chǎn)物用溶液回收，標(biāo)記為片段GL。片段RK:用 KRF 和 KRR 對(duì) C 進(jìn)行 PCI ,在 Fermentas SdaI Buffer 中用 XhoI 和 NheI對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切產(chǎn)物用溶液回收，標(biāo)記為片段RK。片段KL:用 KLF 和 KLR 對(duì) C 進(jìn)行 PCI ,在 i^ermentas BamHI Buffer 中用 SacI 和 KpnI對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切產(chǎn)物用溶液回收，標(biāo)記為片段KL。(3)構(gòu)建質(zhì)粒pUC-C:用T4 DNA連接酶將片段pUC-Gate-Cut和RC連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5ci感受態(tài)當(dāng)中，轉(zhuǎn)化后涂布到氯霉素抗性平板。得到克隆用M13F和M13R引物測(cè)序驗(yàn)證。序列正確的為標(biāo)記為質(zhì)粒PUC-C。(4)構(gòu)建質(zhì)粒pUC-G:用T4 DNA連接酶將片段pUC-Gate-Cut和RG連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5ci感受態(tài)當(dāng)中，轉(zhuǎn)化后涂布到慶大霉素抗性平板。得到克隆用M13F和M13R 引物測(cè)序驗(yàn)證。序列正確的為標(biāo)記為質(zhì)粒PUC-G。(5)構(gòu)建質(zhì)粒pUC-K:用T4 DNA連接酶將片段pUC-Gate-Cut和RC連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5ci感受態(tài)當(dāng)中，轉(zhuǎn)化后涂布到卡納霉素抗性平板。得到克隆用M13F和M13R 引物測(cè)序驗(yàn)證。序列正確的為標(biāo)記為質(zhì)粒pUC-K。(6)構(gòu)建質(zhì)粒 pUC-GC:在 Fermentas BamHI Buffer 中用 McI 和 KpnI 對(duì) pUC_C 進(jìn)行酶切，同時(shí)加入i^astAP去磷酸化。得到的片段用溶液回收。用T4 DNA連接酶將該片段與GL片段連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5ci感受態(tài)當(dāng)中，轉(zhuǎn)化后涂布到慶大霉素氯霉素雙抗平板。得到克隆用M13F和M13R引物測(cè)序驗(yàn)證。序列正確的為標(biāo)記為質(zhì)粒pUC_GC。(7)構(gòu)建質(zhì)粒 pUC-KC:在 Fermentas BamHI Buffer 中用 SacI 和 KpnI 對(duì) pUC_C 進(jìn)行酶切，同時(shí)加入i^astAP去磷酸化。得到的片段用溶液回收。用T4 DNA連接酶將該片段與KL片段連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5ci感受態(tài)當(dāng)中，轉(zhuǎn)化后涂布到卡納霉素氯霉素雙抗平板。得到克隆用M13F和M13R引物測(cè)序驗(yàn)證。序列正確的為標(biāo)記為質(zhì)粒pUC_KC。(8)構(gòu)建質(zhì)粒 pUC-CG:在 Fermentas BamHI Buffer 中用 SacI 和 KpnI 對(duì) pUC_G 進(jìn)行酶切，同時(shí)加入i^astAP去磷酸化。得到的片段用溶液回收。用T4 DNA連接酶將該片段與CL片段連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5ci感受態(tài)當(dāng)中，轉(zhuǎn)化后涂布到氯霉素慶大霉素雙抗平板。得到克隆用M13F和M13R引物測(cè)序驗(yàn)證。序列正確的為標(biāo)記為質(zhì)粒pUC_CG。(9)構(gòu)建質(zhì)粒 pUC-KG:在 Fermentas BamHI Buffer 中用 SacI 和 KpnI 對(duì) pUC_G 進(jìn)行酶切，同時(shí)加入i^astAP去磷酸化。得到的片段用溶液回收。用T4 DNA連接酶將該片段與KL片段連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5ci感受態(tài)當(dāng)中，轉(zhuǎn)化后涂布到卡納霉素慶大霉素雙抗平板。得到克隆用M13F和M13R引物測(cè)序驗(yàn)證。序列正確的為標(biāo)記為質(zhì)粒pUC_KG。(10)構(gòu)建質(zhì)粒 pUC-CK:在 Fermentas BamHI Buffer 中用 SacI 和 KpnI 對(duì) pUC_K 進(jìn)行酶切，同時(shí)加入i^astAP去磷酸化。得到的片段用溶液回收。用T4 DNA連接酶將該片段與CL片段連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5ci感受態(tài)當(dāng)中，轉(zhuǎn)化后涂布到氯霉素卡納霉素雙抗平板。得到克隆用M13F和M13R引物測(cè)序驗(yàn)證。序列正確的為標(biāo)記為質(zhì)粒pUC_CK。(11)構(gòu)建質(zhì)粒 pUC-GK:在 Fermentas BamHI Buffer 中用 SacI 和 KpnI 對(duì) pUC_K 進(jìn)行酶切，同時(shí)加入i^astAP去磷酸化。得到的片段用溶液回收。用T4 DNA連接酶將該片段與GL片段連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5ci感受態(tài)當(dāng)中，轉(zhuǎn)化后涂布到慶大霉素卡納霉素雙抗平板。得到克隆用M13F和M13R引物測(cè)序驗(yàn)證。序列正確的為標(biāo)記為質(zhì)粒pUC_GK。(12)pUC-RFP 片段和 OriS 片段載體 J61031 來自 iGEM (http //partsregistry. org/Part:BBa_J61031)。在 BamHI Buffer 中用 EcoRI SpeI XhoI NotI 四個(gè)酶對(duì) J61031 質(zhì)粒進(jìn)行酶切。膠回收其中4. IKbp片段(理論4141bp)為pUC-RFP片段；膠回收其中4. 5Kbp 片段(理論4548bp)為OriS片段。(13)構(gòu)建環(huán)形無宿主無回收單元空載體pUC_GC、pUC_KC、pUC_CG、pUC_KG、 pUC-CK、pUC-GK 分別在 Fermentas SdaI Buffer 中用 EcoRI 和 SpeI 雙酶切，同時(shí)加入 !^astAP去磷酸化。得到片段分別用溶液回收，分別與pUC-RFP片段連接。連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化到DH5ci感受態(tài)當(dāng)中，轉(zhuǎn)化后6種分別涂布到AGC:氨芐青霉素+慶大霉素+氯霉素平板；AKC:氨芐青霉素+卡納霉素+氯霉素平板；ACG:氨芐青霉素+氯霉素+慶大霉素平板；AKG:氨芐青霉素+卡納霉素+慶大霉素平板；ACK:氨芐青霉素+氯霉素+卡納霉素平板；AGK:氨芐青霉素+慶大霉素+卡納霉素平板。以上六種克隆分別挑取5個(gè)，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用EcoRI和SpeI雙酶切鑒定。取其中正確的各一個(gè)。將酶切驗(yàn)證正確的6 個(gè)載體分別用》ιοΙ和NotI在i^rmentas 0 Buffer中進(jìn)行雙酶切。片段分別溶液回收。 回收到的片段分別與OriS片段用T4 DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)當(dāng)中，轉(zhuǎn)化后6種分別涂布到AGC:氨芐青霉素+慶大霉素+氯霉素平板;AKC:氨芐青霉素+卡納霉素+氯霉素平板；ACG:氨芐青霉素+氯霉素+慶大霉素平板；AKG:氨芐青霉素+卡納霉素+慶大霉素平板；ACK:氨芐青霉素+氯霉素+卡納霉素平板；AGK:氨芐青霉素+慶大霉素+卡納霉素平板；六種平板上的克隆用如下引物進(jìn)行兩組PCR驗(yàn)證a) attR 驗(yàn)證FRVF CCGCAAAAAAGGGAATAAGG 和 FRVR TCAGGCATCGTGTGTAAGCA ；b) attL 驗(yàn)證 FLVF:TCGGTGTGCGGTTGTATGC 和 FLVR:GACGGTGCTCTGAAAGGTGA。其中含氯霉素抗性的片段應(yīng)有約1. 3Kbp的PCR片段。含慶大霉素抗性的片段應(yīng)有約1. 5Kbp的PCR片段。含卡納霉素抗性的片段應(yīng)有約ι. SKbp的PCR片段。驗(yàn)證正確的六種克隆分別為六種單元載體rec、 FKC、FCG、FKG、FCK、FGK。(14)合成 FLP 載體(合成片段在 pQLV 當(dāng)中)，序列為CCATGGCATCACAGTATCGTGA TGACAGAGGCAGGGAGTGGGACAAAATTGAAATCAAATAAGGATCCTACTAAGGAGGTTGTATGCCACAATTTGA[F J797950.17321-6482]G[FJ797950. 16480-6064]TGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTT GCAACAAATTGATAAGCAATGCCGCTAGC
(15)構(gòu)建輔助質(zhì)粒pIXF:將實(shí)施實(shí)例2中的pLUHelp在Fermentas Buffer Tango當(dāng)中用NheI和NcoI進(jìn)行雙酶切，同時(shí)加入!^astAP去磷酸化。酶切產(chǎn)物用溶液回收。用引物PGl和PG2對(duì)FLP載體進(jìn)行PCR，將PCR產(chǎn)物在Fermentas Buffer Tango當(dāng)中用NheI 和NcoI進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用溶液回收。將回收的兩種片段用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)當(dāng)中，轉(zhuǎn)化后涂布在氨芐青霉素平板，在30攝氏度培養(yǎng)。長出來的克隆用引物 FPF CGCACGAAAAGCATCAGG 和 FI3R CGCAAAAACAACGAACCACA 作菌落 PCR驗(yàn)證。驗(yàn)證取其中能得到1. 7Kbp片段的克隆，提取質(zhì)粒用FPF和FPR引物測(cè)序驗(yàn)證。 測(cè)序驗(yàn)證為正確連接FLP的質(zhì)粒標(biāo)記為pIXFCl。在i^ermentas R Buffer中將pIXFCl用 HindIII酶切，溶液回收后自連。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)當(dāng)中，轉(zhuǎn)化后涂布在氨芐青霉素平板，在30攝氏度培養(yǎng)。長出來的克隆用引物C1F:ACCTGACCGCTATCCCTGA和 C1R:GCCCTTCAATCGCCAGA做菌落PCR驗(yàn)證。驗(yàn)證取其中能得到250bp片段的克隆，其質(zhì)粒標(biāo)記為PlXF。(16)構(gòu)建宿主菌S17-1-IXF 將pIXF轉(zhuǎn)化到E. coli S17-1當(dāng)中，30攝氏度在氨芐青霉素平板篩選。得到宿主菌S17-1-IXF。(17)構(gòu)建 FG-luxA-C、FC-luxB-K、FK-luxC-G、FG-luxD-C、FC-IuxE-K: 合成引物
GRGGGCATACGGGAAGAAGTG CFTCAACAGGGACACCAGGATTT CR:AGGGCGGGGCGTAAGG KFCGTTTCTGCGGACTGGC KR:CGCCTTCTTGACGAGTTCTTC GFGCCCCCGATGGTAGTGTG
IuxA、IuxB, IuxC, IuxD, IuxE的酶切片段來自于實(shí)施示例2當(dāng)中。將FGC、FCK、FKG 分別在Fermentas Buffer Tango當(dāng)中用DraIII酶切，同時(shí)加入FastAP去磷酸化?；厥誎iC片段，分別與luxA、IuxD片段連接；回收FCK片段，分別與luxB、IuxE片段連接；回收FKG片段，與IuxC片段連接。連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化到DH5ci感受態(tài)當(dāng)中，轉(zhuǎn)化后 5種分別按如下方式涂布并篩選reC+luxA 慶大霉素+氯霉素平板；引物篩選GR+CF ； FGC+luxD 慶大霉素+氯霉素平板；引物篩選GR+CF ；FCK+luxB 氯霉素+卡納霉素平板；引物篩選CR+KF ；FCK+luxE 氯霉素+卡納霉素平板；引物篩選CR+KF ；FKG+luxC 卡納霉素+慶大霉素平板；引物篩選KR+GF。驗(yàn)證正確的質(zhì)粒分別標(biāo)記為fG-luxA-C、 FG-luxD-C、FC-luxB-K、FC-luxE-K、FK-luxC-G。將這些質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到宿主菌 S17-1IXF 中，得到 5 中菌S17-1IXF(FG-IuxA-C)、S17-1IXF(FG-luxD-C)、S17-1IXF(FC-luxB-K)、 S17-1IXF(FC-IuxE-K)、S17-1IXF(FK-luxC-G)。(18)并行組裝 a)第一輪
將 S17-IIXF (FG-IuxA-C)和 S17-1IXF (FC-IuxB-K)兩種菌液各 2mL，分別析離心下來， 用500 μ L無抗生素LB培養(yǎng)基重懸；重復(fù)一次。將第二次重懸的兩種菌液混合在一起，在30 攝氏度培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)。4小時(shí)后，將混合菌液在慶大霉素+卡那霉素LB平板上劃線。培養(yǎng)至可見單克隆。挑取單克隆，在氯霉素LB平板劃線負(fù)篩，篩選其中不能在氯霉素中生長的克隆。標(biāo)記為 S17-lIXF(FG-luxAluxB-K)。將S17-1IXF (FK-luxC-G)和 S17-1IXF (FG-luxD-C)兩種菌液各 2mL，分別析離心下來，用500 μ L無抗生素LB培養(yǎng)基重懸；重復(fù)一次。將第二次重懸的兩種菌液混合在一起， 在30攝氏度培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)。4小時(shí)后，將混合菌液在卡那霉素+氯霉素LB平板上劃線。培養(yǎng)至可見單克隆。挑取單克隆，在慶大霉素LB平板劃線負(fù)篩，篩選其中不能在慶大霉素中生長的克隆。標(biāo)記為 S17-lIXF(FK-luxCluxD-C)。b)將 S17-lIXF(FG-luxAluxB-K)和 S17-1IXF (FK-luxCluxD-C)兩種菌液各 ^nL, 分別析離心下來，用500 μ L無抗生素LB培養(yǎng)基重懸；重復(fù)一次。將第二次重懸的兩種菌液混合在一起，在30攝氏度培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)。4小時(shí)后，將混合菌液在慶大霉素+氯霉素LB平板上劃線。培養(yǎng)至可見單克隆。挑取單克隆，在卡那霉素LB平板劃線負(fù)篩，篩選其中不能在卡那霉素中生長的克隆。標(biāo)記為S17-lIXF(re-luxAluxBluxCluxD-C)。c)將 S17-lIXF(FG-luxAluxBluxCluxD-C)和 S17-1IXF(FC-luxE-K)兩種菌液各 2mL,分別析離心下來，用500 μ L無抗生素LB培養(yǎng)基重懸；重復(fù)一次。將第二次重懸的兩種菌液混合在一起，在30攝氏度培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)。4小時(shí)后，將混合菌液在慶大霉素+卡納霉素 LB平板上劃線。培養(yǎng)至可見單克隆。挑取單克隆，在氯霉素LB平板劃線負(fù)篩，篩選其中不能在氯霉素中生長的克隆。標(biāo)記為S17-lIXF(re-luxAluxBluxCluxDluxE-K)。實(shí)施例4線形無宿主無回收系統(tǒng)。(1)全基因合成SopAB (連接在pQLV中)，序列為GGATCC[AF064539. 124970-22120]CTAGC
(2)構(gòu)造線性輔助質(zhì)粒pIXSop:將實(shí)施例3中的pIXFCl在i^ermentas Tango Buffer中用BamHI和NheI雙切，同時(shí)加入!^astAP去磷酸化。酶切產(chǎn)物用溶液回收。將合成的SopAB 質(zhì)粒在Fermentas Tango Buffer中用BamHI和NheI雙切，膠回收其中約2. 9Kbp的片段。 將兩個(gè)片段用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)當(dāng)中，轉(zhuǎn)化后涂布在氨芐青霉素平板，在30攝氏度培養(yǎng)。挑取6個(gè)長出來的克隆，培養(yǎng)菌液提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證篩選其中用BamHI和NheI雙切能產(chǎn)生約5. IKbp和2. 9Kbp的質(zhì)粒。正確的質(zhì)粒標(biāo)記為 pIXSopCl。在Fermentas R Buffer中將pIXSopCl用HindIII酶切，溶液回收后自連。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)當(dāng)中，轉(zhuǎn)化后涂布在氨芐青霉素平板，在30攝氏度培養(yǎng)。長出來的克隆用引物 C1F:ACCTGACCGCTATCCCTGA 和 C1R:GCCCTTCAATCGCCAGA 菌落 PCR 驗(yàn)證，篩選取其中能得到約250bp片段的克隆，其質(zhì)粒標(biāo)記為pIXSop。
(3)構(gòu)建宿主菌S17-l-IXSop 將pIXSop轉(zhuǎn)化到E. coll S17-1當(dāng)中，30攝氏度在氨芐青霉素平板篩選。得到宿主菌S17-1- IXSop0(4)構(gòu)建線形無宿主無回收單元載體pJAU-0C來自于Lucigen。在!^ermentas Seal Buffer中用XbaI和PacI對(duì)pJAZZ-OC進(jìn)行雙酶切?；厥掌渲蠭OKbp和0. 5Kbp的片段。在 Fermentas Seal Buffer 中用 NheI 和 PacI 分別對(duì)實(shí)施例 3 中的 pUC-GC、pUC-KC、 pUC-CG、pUC-KG、pUC-CK、pUC-GK 進(jìn)行雙酶切，分別用膠回收其中 2. lKbp、2. 5Kbp、2. IKbp, 2. 3Kbp、2. 5Kbp、2. 3Kbp的片段。回收的片段分別于pJAU_0C酶切產(chǎn)物中回收的兩個(gè)片段相連接。連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化到TSA感受態(tài)當(dāng)中(來自Lucigen)，涂布在如下平板上進(jìn)行培養(yǎng)和篩選:AGC:氨芐青霉素+慶大霉素+氯霉素平板；AKC:氨芐青霉素+卡納霉素+氯霉素平板；ACG:氨芐青霉素+氯霉素+慶大霉素平板；AKG:氨芐青霉素+卡納霉素+慶大霉素平板；ACK:氨芐青霉素+氯霉素+卡納霉素平板；AGK:氨芐青霉素+慶大霉素+卡納霉素平板。分別挑取將長出來的克隆分別，培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，挑選其中大于IOKbp的質(zhì)粒，并且在i^ermentas Buffer R當(dāng)中用BioI和DraIII雙酶切篩選其中能夠酶切得到三條片段 (其中一條接近IKbP)的質(zhì)粒。則挑選出的六種質(zhì)粒分別標(biāo)記為LGC、LKC、LCG、LKG、LCK、 LGK。(5)構(gòu)建 LG-luxA-C、LC-luxB-K、LK-luxC-G、LG-luxD-C、LC-IuxE-K: IuxA, luxB、 luxC、luxD、IuxE的酶切片段來自于實(shí)施例2當(dāng)中。將LGC、LCK、LKG分別在!^ermentas Buffer Tango當(dāng)中用DraI11酶切，同時(shí)加入!^astAP去磷酸化?；厥誏GC片段，分別與luxA、 IuxD片段連接；回收LCK片段，分別與1UXB、1UXE片段連接；回收LKG片段，與IuxC片段連接。連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化到S17-l-IXS0p感受態(tài)當(dāng)中，轉(zhuǎn)化后在30攝氏度培養(yǎng)，5種轉(zhuǎn)化物分別按如下方式涂布和篩選LGC+luxA 慶大霉素+氯霉素平板；引物篩選GR+CF ；LGC+luxD 慶大霉素+氯霉素平板；引物篩選GR+CF ；LCK+luxB 氯霉素+卡納霉素平板；引物篩選 CR+KF ；LCK+luxE 氯霉素+卡納霉素平板；引物篩選CR+KF ；LKG+luxC 卡納霉素+慶大霉素平板；引物篩選KR+GF。篩選用的引物序列為與實(shí)施例3中相同。驗(yàn)證正確的質(zhì)粒分別標(biāo)記為LG-luxA-C、LG-luxD-C、LC-luxB-K、LC-luxE-K、LK-luxC-G。含有這些質(zhì)粒的宿主菌記為S17-lIXSop (FG-IuxA-C)、S17-1 IXSop (FG-luxD-C)、S17-1 IXSop (FC-luxB-K)、 S17-lIXSop (FC-IuxE-K)、S17-1 IXSop (!7K-IuxC-G)。(6)并行組裝 a)第一輪:
將 S17-lIXSop (LG-luxA-C)和 S17_lIXSop (LC-luxB-K)兩種菌液各 2mL，分別析離心下來，用500 μ L無抗生素LB培養(yǎng)基重懸；重復(fù)一次。將第二次重懸的兩種菌液混合在一起，在30攝氏度培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)。4小時(shí)后，將混合菌液在慶大霉素+卡那霉素LB平板上劃線。培養(yǎng)至可見單克隆。挑取單克隆，在氯霉素LB平板劃線負(fù)篩，篩選其中不能在氯霉素中生長的克隆。標(biāo)記為S17-lIXSop (LG-luxAluxB-K)。將S17_lIXSop (LK-luxC-G)和 S17_lIXSop (LG-luxD-C)兩種菌液各 ^iiL,分別析離心下來，用500 μ L無抗生素LB培養(yǎng)基重懸；重復(fù)一次。將第二次重懸的兩種菌液混合在一起，在30攝氏度培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)。4小時(shí)后，將混合菌液在卡那霉素+氯霉素LB平板上劃線。培養(yǎng)至可見單克隆。挑取單克隆，在慶大霉素LB平板劃線負(fù)篩，篩選其中不能在慶大霉素中生長的克隆。標(biāo)記為S17-lIXSop (LK-luxCluxD-C)。
b)將 S17-lIXSop (LG-luxAluxB-K)和 S17_lIXSop (LK-luxCluxD-C)兩種菌液各 2mL,分別析離心下來，用500 μ L無抗生素LB培養(yǎng)基重懸；重復(fù)一次。將第二次重懸的兩種菌液混合在一起，在30攝氏度培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)。4小時(shí)后，將混合菌液在慶大霉素+氯霉素 LB平板上劃線。培養(yǎng)至可見單克隆。挑取單克隆，在卡那霉素LB平板劃線負(fù)篩，篩選其中不能在卡那霉素中生長的克隆。標(biāo)記為S17-lIXSop (LG-luxAluxBluxCluxD-C)。c)將 S17-1 IXSop (LG-luxAluxBluxCluxD-C)和 S17-1 IXSop (LC-IuxE-K)兩種菌液各2mL，分別析離心下來，用500 μ L無抗生素LB培養(yǎng)基重懸；重復(fù)一次。將第二次重懸的兩種菌液混合在一起，在30攝氏度培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)。4小時(shí)后，將混合菌液在慶大霉素+ 卡納霉素LB平板上劃線。培養(yǎng)至可見單克隆。挑取單克隆，在氯霉素LB平板劃線負(fù)篩，篩選其中不能在氯霉素中生長的克隆。標(biāo)記為S17-lIXSop (LG-luxAluxBluxCluxDluxE-K) 實(shí)施例5體外重組反應(yīng)實(shí)現(xiàn)組裝。提取實(shí)施例4中的兩種質(zhì)粒LK-luXC-G、LG-luXD-C。將兩種載體稀釋到等摩爾濃度，各取4μ1，與2μ1的Invitrogen的LR Clonase II Enzyme Mix混合均勻，在25攝氏度反應(yīng)1小時(shí)。轉(zhuǎn)化到TSA感受態(tài)當(dāng)中，涂布在卡那霉素和氯霉素的LB平板上培養(yǎng)。生長出來的克隆用慶大霉素負(fù)篩，取其中僅含有卡那霉素和氯霉素抗性的克隆。滿足條件的克隆包含質(zhì)粒LK-luxCluxD-C。此實(shí)施例證明組裝重組可以在體外進(jìn)行。本發(fā)明是一種多片段DNA組裝的系統(tǒng)和方法。涉及不可逆反應(yīng)的位點(diǎn)特異性重組、lambda red重組，線形質(zhì)粒和線形基因組。不可逆反應(yīng)的位點(diǎn)特異性重組以大腸桿菌Lambda噬菌體以及類似的噬菌體中的重組反應(yīng)是在Int和IHF酶催化下，attB + attP attL + attR ；在Int、Xis和IHF酶催化下attL + attR attB + attP。這種類型的重組系統(tǒng)可以將環(huán)形質(zhì)粒整合到染色體當(dāng)中，并可以從染色體中回收。本發(fā)明當(dāng)中環(huán)形單元載體的整合和篩選標(biāo)記部分的切除、環(huán)形組裝宿主、環(huán)形回收載體的整合和回收都利用了這個(gè)原理。本發(fā)明的特點(diǎn)
本發(fā)明中環(huán)形單元載體、環(huán)形組裝宿主進(jìn)行順次組裝過程與美國專利US7^7984有三點(diǎn)顯著區(qū)別
1、US7267984是順序組裝方法，因此US7^7984不包確保組裝的片段能夠進(jìn)一步組裝的特征。2、US7267984并且也不包含進(jìn)一步規(guī)范載體使組裝過程簡(jiǎn)化的系統(tǒng)。3、US7267984的重組過程中順序重組次序是先由兩個(gè)拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)反應(yīng)使載體插入，然后再由反應(yīng)端重組切出載體骨架使DNA相接；本專利描述過程可先由兩個(gè)反應(yīng)端反應(yīng)直接使DNA相接，然后再通過拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)反應(yīng)切出載體骨架，也可以通過。
權(quán)利要求
1. 一種多段DNA并行組裝的方法，其特征是 對(duì)待組裝片段進(jìn)行克隆，得到符合“廣義單元載體”結(jié)構(gòu)的單元載體； 根據(jù)單元載體的“組裝職能”選出一系列含有不同待組裝片段的廣義單元載體，形成 “可組裝隊(duì)列”；對(duì)“可組裝隊(duì)列“進(jìn)行“隊(duì)列并行組裝”； 具體步驟(1)首先，根據(jù)組裝實(shí)施者的需要，將“待組裝片段”克隆到“空單元載體”當(dāng)中形成“單元載體”；取含有待組裝片段的“單元載體”和其他“廣義單元載體”構(gòu)成至少一種“初始可組裝隊(duì)列”；然后，對(duì)“初始可組裝隊(duì)列”進(jìn)行“隊(duì)列并行組裝”，直到形成的“可組裝隊(duì)列”中單元載體數(shù)量等于1 ；最后隊(duì)列中所得的1個(gè)載體，包含按照組裝實(shí)施者需要設(shè)計(jì)順序排列的所有待組裝片段的組裝產(chǎn)物；并且，(2)組裝若在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生，則所需的重組酶由“輔助質(zhì)?！北磉_(dá)；組裝若在細(xì)胞外發(fā)生， 則所需的重組酶以蛋白形式直接加入；并且，(3)當(dāng)“隊(duì)列并行組裝”需要時(shí)，組裝過程中有“輔助質(zhì)粒”、“組裝宿主”、“回收載體”的輔助；所述“廣義單元載體”包括“單元載體”和“組裝宿主”；所述“單元載體”的結(jié)構(gòu)特征如下“單元載體”結(jié)構(gòu)具有以下2種可能性(1)一種是含有單重構(gòu)位點(diǎn)“單元載體”，按序列順序依次包括左臂、左反應(yīng)端、待組裝片段、右反應(yīng)端、右臂、拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)、接左臂；或者，(2)另一種是含有雙重構(gòu)位點(diǎn)單元載體，按序列順序依次包括固定臂、回收重構(gòu)位點(diǎn)、左臂、左反應(yīng)端、待組裝片段、右反應(yīng)端、右臂、拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)、接前述固定臂；所述“待組裝片段”連接到“空單元載體”當(dāng)中形成含有“待組裝片段”的“單元載體”； 所述“組裝宿主”是“待組裝片段”長度為0的“單元載體”，具有如下結(jié)構(gòu)特征固定臂、回收重構(gòu)位點(diǎn)、左臂、左反應(yīng)端和右反應(yīng)端有至少其一、右臂、拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)、接前述固定臂；所述“廣義單元載體”具有如下特征(1)“廣義單元載體”的“組裝職能”類型的差別在于左反應(yīng)端、右反應(yīng)端、拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)、回收重構(gòu)位點(diǎn)的差別；并且，(2)“廣義單元載體”有至少1種類型的“組裝職能”； 并且，(3)不同種類型“組裝職能”的“廣義單元載體”的反應(yīng)端和重構(gòu)位點(diǎn)的選擇要滿足任何一種“組裝職能”的“廣義單元載體”，并且至少存在一種“組裝職能”的“廣義單元載體” 與其“互相匹配”；并且，(4)“廣義單元載體”的“組裝職能”的所有種類要滿足對(duì)于任意數(shù)量待組裝片段，至少存在一種“可組裝隊(duì)列”；所述“回收載體”的結(jié)構(gòu)特征如下(1)“回收載體”具有回收重構(gòu)位點(diǎn)、左反應(yīng)端、右反應(yīng)端、拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)、接前述固定臂4個(gè)重組位點(diǎn)當(dāng)中至少其中2個(gè)；并且，(2)“回收載體”與“匹配”的“廣義單元載體”進(jìn)行“載體置換”的目的產(chǎn)物仍然為“廣義單元載體”；所述“待組裝片段”，是組裝實(shí)施者需要組裝的片段；“待組裝片段”的DNA序列，允許是任意不參與反應(yīng)端、拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)、回收重構(gòu)位點(diǎn)的重組的，并且不參與復(fù)制子和篩選標(biāo)記的篩選的DNA序列；所述待組裝片段的“左反應(yīng)端”和“右反應(yīng)端”是具有發(fā)生重組能力的DNA序列；并且， 在“組裝反應(yīng)”中，同一個(gè)單元載體內(nèi)的左反應(yīng)端和右反應(yīng)端不具有互相重組能力；并且，在 “組裝反應(yīng)”中，來自不同“組裝職能”的“廣義單元載體”的左反應(yīng)端和右反應(yīng)端重組后消失或者變?yōu)樵谠撝亟M酶下沒有重組活性的DNA序列；并且，“左反應(yīng)端”和“右反應(yīng)端”來自于空單元載體、或者來自于待組裝片段；所述“拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)”是序列特異性重組位點(diǎn)，或者是端粒酶位點(diǎn)，或者是相互斷開的 2個(gè)端粒，并且在同一 “組裝反應(yīng)”中具有發(fā)生重組能力，并且在同一 “組裝反應(yīng)”中不具有與同一載體內(nèi)的反應(yīng)端或回收重構(gòu)位點(diǎn)重組的能力；并且，當(dāng)拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)是相互斷開的 2個(gè)端粒時(shí)，含有拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)的載體DNA分子在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上為線形；所述“回收重構(gòu)位點(diǎn)”是在“組裝反應(yīng)”中具有發(fā)生重組能力的DNA序列，并且在同一 “組裝反應(yīng)”中不具有與同一載體內(nèi)的任何反應(yīng)端重組的能力，并且同一“組裝反應(yīng)”中不具有與同一載體內(nèi)的拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)重組的能力；所述“固定臂”、“左臂”、“右臂”，是任意在“組裝反應(yīng)”中不具有與反應(yīng)端、拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)、回收重構(gòu)位點(diǎn)重組能力的DNA序列，其中包括至少一個(gè)復(fù)制子和至少一個(gè)篩選標(biāo)記； 所述“置換臂”，是任意不參與反應(yīng)端、拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)、回收重構(gòu)位點(diǎn)的重組的DNA序列；所述“回收載體”與“廣義單元載體”的“位點(diǎn)匹配”具有如下3點(diǎn)特征(1)“回收載體”包含的重組位點(diǎn)中與“廣義單元載體”的回收重構(gòu)位點(diǎn)、左反應(yīng)端、右反應(yīng)端、拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)重組位點(diǎn)當(dāng)中至少2個(gè)具有發(fā)生重組的能力；并且，(2)“回收載體”與“廣義單元載體”發(fā)生“載體置換”之后的目的產(chǎn)物符合“廣義單元載體”的結(jié)構(gòu)特征，并且具有區(qū)別于反應(yīng)前的篩選特征；所述“回收載體”與“廣義單元載體”的“載體置換”定義包括如下2個(gè)反應(yīng)的 (1) “回收載體”與“廣義單元載體”回收重構(gòu)位點(diǎn)、左反應(yīng)端、右反應(yīng)端、拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn) 4個(gè)重組位點(diǎn)當(dāng)中至少具有其中2個(gè)發(fā)生重組；所述“載體置換”的目的產(chǎn)物是“載體置換”反應(yīng)后，得到反應(yīng)物當(dāng)中“廣義單元載體” 的“待組裝片段”的、并且符合“廣義單元載體”特征的載體；所述“廣義單元載體”的“互相匹配”定義為同時(shí)滿足以下三個(gè)條件(1)滿足反應(yīng)端匹配2個(gè)單元載體，或者至多其中2個(gè)單元載體經(jīng)過“載體置換”之后，其中一個(gè)單元載體的右反應(yīng)端具有與另一個(gè)單元載體的左反應(yīng)端重組的能力，或者其中一個(gè)單元載體的左反應(yīng)端具有與另一個(gè)單元載體的右反應(yīng)端重組的能力；上述兩種情況在同一種酶催化下不同時(shí)發(fā)生；該重組定義為“反應(yīng)端匹配重組”；并且，(2)滿足重構(gòu)位點(diǎn)匹配2個(gè)單元載體本身，或者至多其中兩者單元載體經(jīng)過“載體置換”之后，在同一種酶催化下，其中一個(gè)單元載體與另一個(gè)單元載體的拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)具有重組能力，或者其中一個(gè)單元載體與另一個(gè)單元載體的拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)同時(shí)為斷開的端粒形式，或者其中一個(gè)單元載體與另一個(gè)單元載體的回收重構(gòu)位點(diǎn)具有重組能力；上述三種情況在同一種酶催化下不同時(shí)發(fā)生；該重組定義為“重構(gòu)位點(diǎn)匹配重組”；并且，(3)滿足篩選特征匹配互相匹配的2個(gè)單元載體本身，或者至多其中兩者單元載體經(jīng)過“載體置換”之后，單元載體之間進(jìn)行組裝的每一步重組產(chǎn)物，都有區(qū)別于過反應(yīng)前體的篩選特征變化；所述“匹配單元載體對(duì)”定義為滿足“互相匹配”關(guān)系的2個(gè)“廣義單元載體”；所述“組裝反應(yīng)”是“互相匹配”的2個(gè)“廣義單元載體”之間發(fā)生的重組反應(yīng)，其特征如下(1)在“互相匹配”需要的情況下先與“回收載體”進(jìn)行所需的“載體置換”，然后發(fā)生 “反應(yīng)端匹配重組”和“重構(gòu)位點(diǎn)匹配重組” 2個(gè)重組；并且，(2)“組裝反應(yīng)”產(chǎn)物是重組反應(yīng)產(chǎn)物當(dāng)中含有其2個(gè)“廣義單元載體”前體中所包含的所有待組裝片段的載體；根據(jù)所述單元載體的結(jié)構(gòu)，“組裝反應(yīng)”的產(chǎn)物，滿足單元載體的定義，仍稱為“單元載體”，具有繼續(xù)與匹配的“廣義單元載體”發(fā)生組裝反應(yīng)的能力；所述“可組裝隊(duì)列”是由“廣義單元載體”構(gòu)成的隊(duì)列；并且滿足當(dāng)隊(duì)列中“廣義單元載體”數(shù)量為2N或者2N+1，且N為非負(fù)整數(shù)，隊(duì)列中可挑選出不超過N個(gè)互不共用“廣義單元載體”的“匹配單元載體對(duì)”，這不超過N個(gè)的“匹配單元載體對(duì)”發(fā)生“組裝反應(yīng)”后得到的“廣義單元載體”替代原隊(duì)列中的這些“匹配單元載體對(duì)”，得到的隊(duì)列，仍然符合“可組裝隊(duì)列”的條件；所述“初始可組裝隊(duì)列”是一個(gè)“可組裝隊(duì)列”，由含有“待組裝片段”的單元載體和“組裝宿主”構(gòu)成；并且，隊(duì)列中含有“待組裝片段”的“單元載體”的數(shù)量與所需組裝的片段的數(shù)量一致，并且，每個(gè)“單元載體”含有一個(gè)待組裝片段；并且，隊(duì)列中的單元載體所含的待組裝片段的順序與組裝實(shí)施者的目的組裝順序一致；所述“隊(duì)列并行組裝”定義為如下過程根據(jù)前述定義，在“廣義單元載體”數(shù)量為2N或者2N+1 (N為非負(fù)整數(shù))的“可組裝隊(duì)列，，中存在的不超過N個(gè)互不共用單元載體的“匹配單元載體對(duì)”，使這不超過N個(gè)“匹配單元載體對(duì)”同時(shí)并行進(jìn)行“組裝反應(yīng)”，并用每個(gè)“匹配單元載體對(duì)”的“組裝反應(yīng)”產(chǎn)物或“宿主中間體”替代原“匹配單元載體對(duì)”；廣義單元載體(1)所述“廣義單元載體”的“組裝職能”的所有種類進(jìn)一步滿足對(duì)于任意數(shù)量的“待組裝片段”，至少存在一種“匹配組裝隊(duì)列”；并且，(2)通過挑選“匹配”的“廣義單元載體”，使所述“初始可組裝隊(duì)列”滿足“匹配組裝隊(duì)列”的要求；并且，(3)對(duì)滿足“匹配組裝隊(duì)列”要求的“初始可組裝隊(duì)列”進(jìn)行“隊(duì)列并行匹配組裝”；所述“匹配組裝隊(duì)列”是滿足以下2個(gè)條件的“可組裝隊(duì)列”(1)當(dāng)隊(duì)列中“廣義單元載體”數(shù)量為2N或者2N+1，且N為非負(fù)整數(shù)，則隊(duì)列中存在N 個(gè)互不共用“廣義單元載體”的“匹配單元載體對(duì)”；并且，(2)用前述N個(gè)“匹配單元載體對(duì)”發(fā)生“組裝反應(yīng)”后得到的“廣義單元載體”替代原隊(duì)列中的這些“匹配單元載體對(duì)”，得到的隊(duì)列，仍然符合“匹配組裝隊(duì)列”的條件；所述“隊(duì)列并行匹配組裝”定義為如下過程根據(jù)前述定義，在“廣義單元載體”數(shù)量為 2N或者2N+1，且N為非負(fù)整數(shù)的“匹配組裝隊(duì)列”中存在的N個(gè)互不共用“廣義單元載體” 的“匹配單元載體對(duì)”，使這N個(gè)“匹配單元載體對(duì)”同時(shí)并行進(jìn)行“組裝反應(yīng)”，并用每個(gè)“匹配單元載體對(duì)”的“組裝反應(yīng)”產(chǎn)物替代原“匹配單元載體對(duì)”；第一種篩選標(biāo)記(1)篩選標(biāo)記有至少1種，每種“單元載體”的左臂或右臂之一帶有篩選標(biāo)記；并且，(2)“組裝反應(yīng)”發(fā)生時(shí)，在“組裝宿主”所在的細(xì)胞中，“單元載體”不具有復(fù)制能力； 并且，“組裝宿主”為染色體；并且，回收載體在特定輔助質(zhì)粒存在時(shí)具有在組裝宿主中復(fù)制的能力；并且，(3)“單元載體”和“組裝宿主”發(fā)生“反應(yīng)端匹配重組”、“重構(gòu)位點(diǎn)匹配重組”的其中一組后，利用“單元載體”的篩選標(biāo)記篩選到中間體進(jìn)行篩選含有單元載體的篩選標(biāo)記的中間產(chǎn)物；中間產(chǎn)物再發(fā)生“反應(yīng)端匹配重組”、“重構(gòu)位點(diǎn)匹配重組”的其中的另一組后，利用 “單元載體”所帶的篩選標(biāo)記的丟失篩選“組裝反應(yīng)”產(chǎn)物；并且，(4)“載體置換”目的產(chǎn)物的篩選“廣義單元載體”和“回收載體”發(fā)生“載體置換”反應(yīng)的2個(gè)重組的其中一個(gè)后，利用“回收載體”的篩選標(biāo)記篩選到中間體；中間體再發(fā)生“載體置換”反應(yīng)的2個(gè)重組的其中的另一個(gè)，利用“回收載體”在特定復(fù)制蛋白下可復(fù)制篩選到“載體置換”產(chǎn)物；并且，(5)“輔助質(zhì)?！睘闇囟让舾行暂d體；并且，在每一步重組前將輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞；并且，在每一步重組后在“輔助質(zhì)粒”不具有復(fù)制能力的溫度下培養(yǎng)，將輔助質(zhì)粒從宿主細(xì)胞中去除；第二種篩選標(biāo)記(1)篩選標(biāo)記有至少2種，每種“組裝職能”的“單元載體”的左臂或右臂各帶有一種篩選標(biāo)記，且兩臂所帶有的篩選標(biāo)記互不相同；并且，“組裝反應(yīng)”發(fā)生時(shí)，在“組裝宿主”所在的宿主細(xì)胞中，“單元載體”不具有復(fù)制能力；并且，“組裝宿主”為染色體，有至少2種不同“組裝職能”的組裝宿主，每種含有一種不同的篩選標(biāo)記；并且，“回收載體”在含有其復(fù)制所需的復(fù)制蛋白的“輔助質(zhì)粒”存在時(shí)具有在宿主細(xì)胞中復(fù)制的能力；(2)“單元載體”和“廣義單元載體”發(fā)生“組裝反應(yīng)”后，禾Ij用“廣義單元載體”所帶的篩選標(biāo)記的被“單元載體”的篩選標(biāo)記替換來篩選“組裝反應(yīng)”產(chǎn)物；(3)“廣義單元載體”和“回收載體”發(fā)生“載體置換”反應(yīng)的2個(gè)重組的其中一個(gè)后， 利用“回收載體”和“廣義單元載體” 2個(gè)篩選標(biāo)記篩選到“載體置換”產(chǎn)物；第三種篩選標(biāo)記(1)篩選標(biāo)記有至少3種，每種“單元載體”的左臂和右臂各帶有一種篩選標(biāo)記，且兩臂所帶有的篩選標(biāo)記互不相同；并且，(2)“組裝反應(yīng)”所包含的2個(gè)重組同時(shí)進(jìn)行；并且，“組裝反應(yīng)”的目的產(chǎn)物含有不同于其2個(gè)“單元載體”前前體的篩選標(biāo)記組合，使該產(chǎn)物具有通過這種篩選標(biāo)記組合從重組產(chǎn)物、副產(chǎn)物和未發(fā)生反應(yīng)的單元載體的混合物種篩選出來的操作性；并且，(3)組裝過程不需要“回收載體”和“組裝宿主”；并且，(4)“輔助質(zhì)?！蓖瑫r(shí)表達(dá)“組裝反應(yīng)”包含的2個(gè)反應(yīng)所需的2個(gè)重組酶；反應(yīng)端、回收重構(gòu)位點(diǎn)、拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)所述反應(yīng)端、回收重構(gòu)位點(diǎn)、拓?fù)渲貥?gòu)位點(diǎn)為frt，IoxP, Lambda噬菌體的重組位 attB, attBl, attB2, attB3, attB4, attB5, attP, attPl, attP2 attP3, attP4, attP5, attL, attLl, attL2, attL3, attL4, attL5, attR, attRl, attR2, attR3, attR4, attR5，HK022噬菌體的重組位點(diǎn)attB, attP, attL, attR, phi80噬菌體的重組位點(diǎn) attB, attP, attL, attR, P21 噬菌體的重組位點(diǎn) attB, attP, attL, attR, P22 噬菌體的重組位點(diǎn)attB，attP, attL, attR ；所述反應(yīng)端為lambda red重組所需的同源序列；端粒酶識(shí)別位點(diǎn)端粒酶識(shí)別位點(diǎn)或端粒為原核生物的端粒酶的識(shí)別位點(diǎn)或端粒，包括Enterobacteria phage N15、Vibrio phage VP882、Klebsiella phage phiK02、Yersinia phage PY54 等的端粒酶識(shí)別位點(diǎn)；端粒也為真核生物染色體的端粒；單元載體、組裝宿主、回收載體所述單元載體、組裝宿主、回收載體為原核生物或者真核生物的質(zhì)粒、也為原核生物或者真核生物的基因組；單元載體、回收載體的轉(zhuǎn)化位點(diǎn)所述單元載體、回收載體當(dāng)中含有接合轉(zhuǎn)化位點(diǎn)，且組裝宿主微生物具備接合轉(zhuǎn)化能力時(shí)，不需要宿主細(xì)胞外的分子操作；所述單元載體、回收載體當(dāng)中不含有接合轉(zhuǎn)化位點(diǎn)， 或且宿主微生物不具備接合轉(zhuǎn)化能力時(shí)，需要有宿主細(xì)胞外的分子操作；重組位點(diǎn)重組酶當(dāng)在細(xì)胞外使用重組位點(diǎn)的重組酶時(shí)，IoxP對(duì)應(yīng)Cre重組酶，frt對(duì)應(yīng)FLP重組酶， Lambda噬菌體的BP重組對(duì)應(yīng)Lambda Int和IHF，Lambda噬菌體的BP重組對(duì)應(yīng)Lambda Int、 Xis和IHF，，=HK022噬菌體的BP重組對(duì)應(yīng)HK022 Int和IHF，HK022噬菌體的BP重組對(duì)應(yīng)HK022 Int.Xis和IHF，phi80噬菌體的BP重組對(duì)應(yīng)phi80 Int和IHF，phi80噬菌體的BP 重組對(duì)應(yīng)phi80 Int.Xis和IHF，P21噬菌體的BP重組對(duì)應(yīng)P21 Int和IHF，P21噬菌體的 BP重組對(duì)應(yīng)P21 Int.Xis和IHF, P22噬菌體的BP重組對(duì)應(yīng)P22 Int和IHF, P22噬菌體的 BP重組對(duì)應(yīng)P22 Int. Xis和IHF，組裝過程中的重組反應(yīng)具有在細(xì)胞外進(jìn)行的能力； 其中兩個(gè)線形載體重組后的單側(cè)端粒發(fā)生交換，視為在端粒位點(diǎn)發(fā)生了一次重組，因?yàn)榇诉^程等效于環(huán)形載體的兩次重組；例如線形載體A和B端粒標(biāo)記為T，左右兩個(gè)端粒分別用 L和R區(qū)分，在載體中X和Y之間發(fā)生重組，如下
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種多段DNA并行組裝的方法。選擇利用環(huán)形或線形單元載體置入到環(huán)形宿主或線形宿主，形成基因載體，再通過回收環(huán)形或線形載體，得到重組后的DNA遺傳物質(zhì)。其特點(diǎn)是，能夠?qū)崿F(xiàn)多段DNA的并行同時(shí)操作，從而提高DNA組裝形成新的DNA結(jié)構(gòu)的效率，并且防止DNA污染和歧化，保證組裝后DNA的質(zhì)量，使之達(dá)到設(shè)計(jì)目的。組裝多段DNA所需時(shí)間與log(N)近似成正比。組裝操作在細(xì)胞外或者細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，使多段DNA分子能夠按照任意順序拼接形成新的DNA結(jié)構(gòu)體。適宜在遺傳工程領(lǐng)域基因重組獲得新的生物體中應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/66GK102296059SQ20111023591
公開日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月17日
發(fā)明者石振宇 申請(qǐng)人:石振宇