專利名稱：擴(kuò)增馬傳染性貧血病毒主要經(jīng)典毒株gp90基因的通用nest-PCR引物組的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及馬傳染性貧血病毒的檢測引物，尤其涉及基于nest-PCR設(shè)計(jì)的檢測馬傳染性貧血病毒主要經(jīng)典毒株gp90基因的通用nest-PCR引物組，及其檢測方法和應(yīng)用， 屬于馬傳染性貧血病毒的檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
馬傳染性貧血病毒(Equine infectious anemia virus, EIAV)屬反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬成員，是嚴(yán)重危害馬屬動物的傳染病-馬傳染性貧血病(Equine infectious anemia, EIA)的病原體。Gp90基因是編碼EIAV囊膜蛋白Gp90的病毒基因，全長約1. 41Λ。囊膜蛋白Gp90， 作為配體與宿主細(xì)胞受體ELR相互作用，幫助病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。由于慢病毒的反轉(zhuǎn)錄酶忠實(shí)性差，使慢病毒在復(fù)制時(shí)會產(chǎn)生高頻率基因突變，導(dǎo)致病毒抗原持續(xù)漂移。無論是不同 EIAV毒株間，亦或由同一毒株體內(nèi)進(jìn)化出的不同準(zhǔn)種間，病毒蛋白中發(fā)生突變頻率最高的均為Gp90蛋白。而Gp90蛋白突變，是病毒逃逸宿主免疫監(jiān)視，形成持續(xù)進(jìn)化的主要原因， 體外擴(kuò)增EIAVgp90基因序列并對其進(jìn)行序列分析，對開展EIAV分子流行病學(xué)、抗原變異分析和免疫逃逸機(jī)制等研究，均具有重要意義。由于gp90基因的高突變和地區(qū)間進(jìn)化的影響，不同EIAV毒株間具有較高水平的基因組差異。例如EIAV美洲代表株EIAVwyo與我國的EIAVm4ci基因組差異高達(dá)30%。該高變異特點(diǎn)，使得以某一代表株基因背景設(shè)計(jì)的用于擴(kuò)增gp90基因的引物，當(dāng)用于其他毒株的基因擴(kuò)增時(shí)，可能并不適合。因此，若能設(shè)計(jì)不受EIAV基因多樣性影響，可通用于主要 EIAV代表毒株和EIAV現(xiàn)地流行株gp90基因擴(kuò)增的引物，對于EIAV分子流行病學(xué)研究的及時(shí)、有效開展，提高監(jiān)測EIAV流行和變異工作的效率，十分必要。
發(fā)明內(nèi)容
針對上述問題本發(fā)明的發(fā)明人通過對EIAV主要經(jīng)典毒株EIAVwy。、EIAVArgen, EIAVln40的全基因序列進(jìn)行比對，并基于保守區(qū)設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，使用分子生物學(xué)軟件 01igo6.0輔助完成引物設(shè)計(jì)。本發(fā)明所解決的技術(shù)問題之一提供了一組用于擴(kuò)增馬傳染性貧血病毒主要經(jīng)典毒株gp90基因的通用nest-PCR引物組，其特征在于所述的引物組由外套引物對和內(nèi)套引物對組成，所述的外套引物對序列如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，所述內(nèi)套引物對序列如 SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 所示。確定的nest-PCR引物組序列如下外套引物，上游P-EIAV-gp90-f，5' CA CCA GAG TGT TGT GGA AAG GTG A 3'(艮口 SEQ ID No. 1)，下游P-EIAV-gp90-r,5' GA CCC CAT GAT TCA TTC CA 3'(艮口 SEQ ID No. 2)。內(nèi)套引物，上游:p-EIAV-gp90-f-l,5' TG TAA GGT TTG GTG TAT GGG 3'(即 SEQ ID No. 3)，
3下游p-EIAV-gp90-r-l，5' TG GCA GCT ATT ATA GCA GA 3'(即 SEQ ID No. 4)。本發(fā)明所解決的技術(shù)問題之二提供一種用于馬傳染性貧血病毒檢測的方法，其特征在于使用以上所述的引物組對待測樣品進(jìn)行nest-PCR擴(kuò)增。其中，所述的nest-PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，優(yōu)選的，外套引物對的退火溫度為53°C，內(nèi)套引物對的退火溫度為51°C;延伸時(shí)間分別為aiiin和lmin30sec，兩次反應(yīng)分別各進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。本發(fā)明所解決的技術(shù)問題之三是提供所述的用于擴(kuò)增馬傳染性貧血病毒主要經(jīng)典毒株gp90基因的通用nest-PCR引物組在制備檢測或診斷馬傳染性貧血病毒的生物試劑中的用途。本研究結(jié)果表明，本發(fā)明設(shè)計(jì)的nest-PCR引物可通用于EIAV主要代表毒株gp90 基因的擴(kuò)增，而對于本研究使用的現(xiàn)地分離株的擴(kuò)增結(jié)果，提示其同樣具有擴(kuò)增特異性。以上研究結(jié)果證明，本研究建立的nest-PCR引物，是可用于臨床EIAV流行毒株分子流行病學(xué)研究、擴(kuò)增gp90基因的有效通用引物。
圖1為使用本發(fā)明設(shè)計(jì)的nest-PCR引物擴(kuò)增不同EIAV檢測樣本的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。泳道 1-8 分別為 1，DNA 分子量 marker2000 ；2, EIAVwyo ；3，EIAVtogen ；4, EIAVln40 ；5, EIAVfddv12 ；6， EIAV-I ；7，EIAV-2 ；8，陰性對照(EIAV 陰性馬組織 DNA)。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例11實(shí)驗(yàn)材料、方法1. 1.毒株、病料、檢測樣本用于驗(yàn)證引物擴(kuò)增特異性的EIAV樣本包括EIAV北美代表株EIAVwy。(Genbank No, AF033820)、南美代表株EIAVa,gen(記載于耿慶華。我國馬傳染性貧血弱毒疫苗株與美洲流行毒株鑒別診斷方法的建立及標(biāo)記疫苗的研究。中國博士論文，北京，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，2006.)、中國代表株EIAVl_ (Genbank No, AF327877)、中國EIAV疫苗弱毒株 EIAVdlv125 (Genbank No，AF327878)和中國境內(nèi)現(xiàn)地分離株EIAV_1、EIAV_2 (由專利申請人所在實(shí)驗(yàn)室保存，分別于2004年和2005年分離自黑龍江)。1.2引物設(shè)計(jì)和引物序列基于EIAV主要經(jīng)典毒株EIAVwy。、EIAVa,gen、EIAVln40的全基因序列比對，基于保守區(qū)設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。使用分子生物學(xué)軟件01igo6.0輔助完成引物設(shè)計(jì)。確定的nest-PCR 引物序列如下外套引物，上游P-EIAV-gp90-f，5' CA CCA GAG TGT TGT GGA AAG GTG A 3'，下游P-EIAV-gp90-r，5' GA CCC CAT GAT TCA TTC CA 3 ‘。內(nèi)套引物，上游 p-EIAV-gp90-f-l,5' TG TAA GGT TTG GTG TAT GGG 3'，下游p-EIAV-gp90-r_l，5' TG GCA GCT ATT ATA GCA GA3'。1.3病毒前DNA的提取
使用組織DNA提取試劑盒(Tissue DNA kit, Omega, USA, D3396-01)對不同毒株感染細(xì)胞或組織，進(jìn)行總DNA提取?？侱NA中包含有EIAV的前病毒DNA。該DNA提取物，作為nest-PCR的模板，用于后續(xù)的擴(kuò)增研究。不同毒株的前病毒DNA的獲取過程具體如下EIAVwyo株使用EIAVwyo株的衍生感染性克隆株體外感染驢胎皮膚細(xì)胞。接毒6 天后，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，使用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞。將收獲的細(xì)胞用200 μ 1冷PBS 重懸，之后對上述細(xì)胞樣本，使用組織DNA提取試劑盒進(jìn)行細(xì)胞總DNA提取。DNA提取過程具體參見試劑盒說明書。EIAVdlv125株該毒株的前病毒DNA獲取方法與EIAVwy。株相同。使用EIAVwyo株的衍生感染性克隆株及EIAVmm5株體外感染驢胎皮膚細(xì)胞，驢胎細(xì)胞為本專利申請實(shí)驗(yàn)室自制的取自驢胎兒的原代皮膚細(xì)胞(趙立平等，馬傳染性貧血瓊擴(kuò)抗原生產(chǎn)工藝的改進(jìn)，畜牧獸醫(yī)科技信息，2004年09期，37-39頁。)。EIAVtogen株該毒株前病毒DNA獲取于該毒株感染馬的淋巴結(jié)。取該毒株感染馬的腸系膜淋巴結(jié)，約30mg，用剪刀充分剪碎，加入200 μ 1冷PBS重懸。之后使用組織DNA提取試劑盒，對該樣本進(jìn)行DNA提取，具體過程參見試劑盒說明書。該毒株前病毒DNA獲取于本專利申請實(shí)驗(yàn)室使用該毒株進(jìn)行人工感染馬的淋巴結(jié)。EIAVln40, EIAV-I和EIAV-2株前病毒DNA的獲取過程，與EIAVtogen株相一致。1. 4Nest-PCR的擴(kuò)增條件優(yōu)化退火溫度是本研究主要優(yōu)化的PCR反應(yīng)參數(shù)。在不同拷貝數(shù)的定量模板作為擴(kuò)增模板的前提下，通過梯度PCR儀進(jìn)行優(yōu)化。1.5擴(kuò)增基因的測序鑒定對不同毒株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送商業(yè)測序公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果通過生物學(xué)軟件 DNAstar進(jìn)行序列比對分析，以確定獲得基因是否為EIAVgp90基因。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2. INest-PCR 的擴(kuò)增條件經(jīng)優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件為25 μ L反應(yīng)液中包括1. 2mmol MgCl2,0. 5mmoldNTP,上下游引物各10 μ mol, 1. 25U rTaq酶以及DNA模板2 μ L。最終確定的nest-PCR預(yù)變性溫度為95°C，時(shí)間5min ；退火溫度為，外套:53°C,內(nèi)套51°C，時(shí)間為40sec ；延伸溫度為72°C, 時(shí)間分別為anin和lmin30sec。兩次反應(yīng)分別各進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后再進(jìn)行72°C IOmin 反應(yīng)。PCR產(chǎn)物以1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳并在紫外燈下觀察結(jié)果。2. 2不同毒株和檢測樣本的PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果使用上述PCR擴(kuò)增條件，對試驗(yàn)樣本DNA進(jìn)行nest-PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物的電泳分析圖片如圖1。由圖1可知，不同檢測樣本經(jīng)本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的PCR引物擴(kuò)增，均得到了 1. 41Λ左右的PCR產(chǎn)物。初步證明本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物針對本研究選用的EIAV經(jīng)典代表毒株和我國國內(nèi)部分地區(qū)的現(xiàn)地流行株，均具通用性。2. 3序列測定和比對結(jié)果對上述不同檢測樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，獲得的序列與參考序列進(jìn)行比對分析。分析結(jié)果表明，上述序列均為EIAVgp90基因，證明本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的nest-PCR引物對不同EIAV代表毒株和現(xiàn)地流行株等檢測樣本均具有通用性。3實(shí)驗(yàn)結(jié)論本研究結(jié)果表明，設(shè)計(jì)的nest-PCR引物可通用于EIAV主要代表毒株gp90基因的擴(kuò)增，而對于本研究使用的現(xiàn)地分離株的擴(kuò)增結(jié)果，提示其同樣具有擴(kuò)增特異性。以上研究結(jié)果證明，本研究建立的nest-PCR引物，是可用于臨床EIAV流行毒株分子流行病學(xué)研究、 擴(kuò)增gp90基因的有效通用引物。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，對本發(fā)明而言僅是說明性的，而非限制性的； 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對其進(jìn)行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.擴(kuò)增馬傳染性貧血病毒主要經(jīng)典毒株gp90基因的通用nest-PCR引物組，其特征在于所述的引物組由外套引物對和內(nèi)套引物對組成，所述的外套引物對序列如SEQ ID No. 1 和SEQ ID No. 2所示，所述內(nèi)套引物對序列如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示。
2.一種用于馬傳染性貧血病毒檢測的方法，其特征在于使用權(quán)利要求1所述的引物組對待測樣品進(jìn)行nest-PCR擴(kuò)增。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的nest-PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，外套引物對的退火溫度為53°C，內(nèi)套引物對的退火溫度為51°C ；延伸時(shí)間分別為aiiin和lmin30sec， 兩次反應(yīng)分別各進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。
4.權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增馬傳染性貧血病毒主要經(jīng)典毒株gp90基因的通用nest-PCR 引物組在制備檢測或診斷馬傳染性貧血病毒的生物試劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了擴(kuò)增馬傳染性貧血病毒主要經(jīng)典毒株gp90基因的通用nest-PCR引物組，還涉及使用所述的引物組對待測樣品進(jìn)行nest-PCR擴(kuò)增，檢測馬傳染性貧血病毒的方法以及所述引物組在制備檢測或診斷馬傳染性貧血病毒的生物試劑中的用途。本發(fā)明基于EIAV主要經(jīng)典毒株EIAVwyo、EIAVArgen、EIAVLN40的全基因序列比對，基于保守區(qū)設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明設(shè)計(jì)的nest-PCR引物可通用于EIAV主要代表毒株gp90基因的擴(kuò)增，對于現(xiàn)地分離株同樣具有擴(kuò)增特異性。本研究建立的nest-PCR引物，可用于臨床EIAV流行毒株分子流行病學(xué)研究，是擴(kuò)增gp90基因的有效通用引物。
文檔編號C12N15/11GK102277451SQ20111023567
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月17日
發(fā)明者周建華, 李利, 杜承, 林躍智, 王雪峰, 馬建 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所