專利名稱：一種分離回收氯過氧化物酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種分離回收氯過氧化物酶的方法。
背景技術(shù)：
氯過氧化物酶(Chloroperoxidase, EC 1. 11. 1. 10，CP0)分子為一種血紅素糖蛋白，其輔基是高鐵(IX)原卟啉，它的許多光譜學(xué)和化學(xué)性質(zhì)都與細(xì)胞色素P-450高度相似， 而過氧化物酶本身又具有類似過氧化氫酶的結(jié)合位點(diǎn)，因此，CPO具有較為廣泛的底物適應(yīng)性，可以催化多種物質(zhì)進(jìn)行過氧化反應(yīng)，如能夠催化鹵素離子、芳香族化合物、脂肪族化合物和醇類化合物等進(jìn)行過氧化反應(yīng)。目前，CPO已經(jīng)被應(yīng)用到多種手性化合物合成和藥物生產(chǎn)中，以減少反應(yīng)過程中手性異構(gòu)體的損失，去除藥物手性對映體的毒性，減輕廢棄物對環(huán)境的污染等，是一種十分有應(yīng)用前景的“手性生物催化劑”。海洋真菌Caldariomycesfumago是目前發(fā)酵生產(chǎn)CPO的主要菌種，但是，發(fā)酵液中 CPO的濃度積累卻很低(一般小于100mg/L)，酶活性穩(wěn)定性也較差，傳統(tǒng)的CPO提純方法的酶回收率普遍低下，這是造成CPO生產(chǎn)成本居高不下的主要原因，嚴(yán)重限制了 CPO的開發(fā)與使用?，F(xiàn)有技術(shù)中，CPO的提純都是采用傳統(tǒng)鹽析加層析的操作方法，利用蛋白質(zhì)的可逆沉淀反應(yīng)---蛋白質(zhì)的鹽析作用，用大量中性鹽使蛋白質(zhì)從溶液中析出。蛋白質(zhì)是親水膠體，在中性鹽影響下，蛋白質(zhì)分子被鹽脫去水化層，同時(shí)，蛋白質(zhì)分子所帶的電荷被中和，結(jié)果蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性遭到破壞而沉淀析出。沉出的蛋白質(zhì)仍保持其天然蛋白的性質(zhì)，因此，降低鹽的濃度時(shí)，還能溶解。沉淀不同的蛋白質(zhì)所需中性鹽的濃度不同，而鹽類不同也有差異。氯過氧化物酶的鹽析一般用硫酸銨。通常，為獲得高純度CP0，往往需要綜合利用目標(biāo)產(chǎn)物的理化特性，采用多種分離技術(shù)組合，以往的CPO提純過程中，由于目標(biāo)蛋白濃度極低，發(fā)酵液組成復(fù)雜，細(xì)胞代謝物含量大，除雜、提取純化工序復(fù)雜，環(huán)節(jié)繁多，最終層析純化產(chǎn)品的得率一般低于6%。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種分離回收氯過氧化酶的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種分離回收氯過氧化物酶的方法，包括如下步驟(1) CPO發(fā)酵液的制備將海洋真菌菌苔接入發(fā)酵培養(yǎng)基，25 33°C下發(fā)酵6 8d 得CPO發(fā)酵液；(2) CPO發(fā)酵液的預(yù)處理將CPO發(fā)酵液在4-10°C的條件下離心，或者采用真空抽濾去除菌絲以及其它固形物，收集含黑色素的清液，所得清液在冰浴條件下緩慢加入聚合度4000 6000的PEG并不斷攪拌混合，靜置待PEG與黑色素絮凝穩(wěn)定后在4 10°C下離心，收集黃綠色的脫色液，用稀磷酸調(diào)節(jié)PH至4-6 ；
(3)CPO與PEG的共沉淀在冰浴條件下，向上述脫色液中邊攪拌邊緩慢加入固體 (NH4)2SO4至沉淀開始出現(xiàn)，4-10°C下靜置8-10h，抽濾得淡黃色復(fù)合沉淀物；(4)沉淀物的復(fù)溶解用磷酸鹽緩沖液溶解步驟( 所得沉淀物至形成上下相體積比為1/5 1/4的雙水相體系，上層水相富含PEG，下層水相富含(NH4)2SO4，萃取分離兩相；所述的磷酸鹽緩沖溶液PH4 6 ；與沉淀物的質(zhì)量比為30% 40%，優(yōu)選為35% ；(5)CP0凝膠層析純化將步驟(4)所得的下層酶液用pH值為4_6的磷酸鹽緩沖液透析至無硫酸根離子，埋入經(jīng)過干燥的PEG固體粉末中吸水濃縮到透析后體積的1/5 1/4，上層析柱純化；收集酶活與Rz值大于1. 2的收集液合并，再經(jīng)真空冷凍干燥濃縮，得氯過氧化物酶，Rz = A4Q3/A28Q，其中A4tl3為血紅素輔基在403nm處的光吸收值；A28(1為蛋白質(zhì)在 ^Onm處的光吸收值。本發(fā)明中所述PEG優(yōu)選聚合度為6000的PEG;步驟O)中所述PEG與所述清液質(zhì)量比為4% 8%，優(yōu)選為6%。本發(fā)明通過研究提出合理可行的雙水相CPO提取純化條件，總結(jié)微小含量生物活性物質(zhì)的分離技術(shù)，提出一種分離回收氯過氧化物酶的方法，比常規(guī)鹽析-層析法提純周期明顯縮短，回收率遠(yuǎn)大于鹽析作用，且對初始發(fā)酵液的體積要求小，解決或改善了目前 CPO生產(chǎn)過程存在的提取干擾大、回收率低、產(chǎn)品價(jià)格高、提純周期長、不能規(guī)模化生產(chǎn)等問題。
圖1為PEG聚合度對沉淀CPO回收率的影響。圖2為PEG6000添加量對CPO共沉淀回收的影響。圖3為PBS添加量對CPO雙水相組成、CPO分配系數(shù)及得率的影響。圖4為PBS的pH對CPO在雙水相中分配系數(shù)及酶得率的影響。圖5為CPO復(fù)溶提純液層析洗脫曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例應(yīng)理解為僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。在閱讀了本發(fā)明記載的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等效變化和修飾同樣落入本發(fā)明權(quán)利要求所限定的范圍。實(shí)施例1 (I)CPO發(fā)酵液的制備將PDA平板上培養(yǎng)IOd的Caldariomyces fumago菌苔按2cm2菌苔/250mL三角瓶的接種量接入為發(fā)酵培養(yǎng)基(包含g/L 麥芽糖40、NaNO3 2，KC12，KH2PO4 2，MgSO4 · 7H20 0. 5，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 02，CaCl2 0. 09，另加體積比為20%的馬鈴薯浸出液，初始pH為7.0)， 搖瓶裝液量50ml/250mL三角瓶，發(fā)酵溫度25°C、搖床轉(zhuǎn)速M(fèi)Or/min，發(fā)酵6d。(2) CPO發(fā)酵液的預(yù)處理發(fā)酵液在4000g，10°C的條件下離心lOmin，或者采用真空抽濾去除菌絲以及其它固形物，收集含黑色素的清液，清液在冰浴條件下緩慢加入質(zhì)量為該清液質(zhì)量的6%的PEG400并不斷攪拌混合，靜置4h待PEG與黑色素絮凝穩(wěn)定后離心(6000 X g，4°C，IOmin)， 收集黃綠色的脫色液，用0. 2mol/L稀磷酸調(diào)節(jié)pH至5. 8。(3) CPO與PEG的共沉淀在冰浴條件下，向脫色液中緩慢加入固體^扎)2504至60%飽和度。過程中不斷攪拌，防止局部鹽濃度過高而造成酶的失活。待沉淀開始出現(xiàn)后4°C下靜置他，抽濾得淡黃色復(fù)合沉淀物；(4)分別考察沉淀物與殘留液的總酶活。結(jié)果顯示沉淀物總酶活為原液總酶活的35%，殘留液總酶活為原液總酶活的 63%,總酶活損失1 %。說明使用PEG400對CPO的回收效果不好。實(shí)施例2:過程與實(shí)施例1相同，不同之處在于步驟(2)使用PEG800。結(jié)果顯示沉淀物總酶活為原液總酶活的60%，殘留液總酶活為原液總酶活的 36%,總酶活損失4%。說明使用PEG800對CPO的回收效果仍不理想，但較使用PEG400有明顯改善。實(shí)施例3 過程與實(shí)施例1相同，不同之處在于步驟(2)使用PEG4000。結(jié)果顯示沉淀物總酶活為原液總酶活的78%，殘留液總酶活為原液總酶活的 18%,總酶活損失4%。說明使用PEG4000對CPO的回收效果較好，但總酶活損失較大。實(shí)施例4 過程與實(shí)施例1相同，不同之處在于步驟(2)使用PEG6000。結(jié)果顯示沉淀物總酶活為原液總酶活的95%，殘留液總酶活為原液總酶活的 4 %，總酶活損失1 %。說明使用PEG6000對CPO的回收效果理想，總酶活損失也較小。實(shí)施例5過程與實(shí)施例4相同，不同之處在于步驟(2)使用的PEG6000質(zhì)量為O。結(jié)果顯示沉淀物總酶活為原液總酶活的對％，殘留液總酶活為原液總酶活的 76%，總酶活損失O%。較使用清液質(zhì)量6%的PEG6000對CPO的回收效果相差巨大。實(shí)施例6過程與實(shí)施例4相同，不同之處在于步驟(2)使用的PEG6000與清液的質(zhì)量比為
2 % ο結(jié)果顯示沉淀物總酶活為原液總酶活的35%，殘留液總酶活為原液總酶活的 60%，總酶活損失10%。較使用清液質(zhì)量6%的PEG6000對CPO的回收效果相差仍然較大， 但較不使用PEG6000效果要好。實(shí)施例7過程與實(shí)施例4相同，不同之處在于步驟(2)使用的PEG6000與清液的質(zhì)量比為4%。結(jié)果顯示沉淀物總酶活為原液總酶活的66%，殘留液總酶活為原液總酶活的 31%,總酶活損失3%。較使用清液質(zhì)量2%的PEG6000對CPO的回收效果進(jìn)一步提高，但仍較使用清液質(zhì)量6%的PEG6000對CPO的回收效果差。實(shí)施例8
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過程與實(shí)施例4相同，不同之處在于步驟(2)使用的PEG6000與清液的質(zhì)量比為8%。結(jié)果顯示沉淀物總酶活為原液總酶活的85%，殘留液總酶活為原液總酶活的 ^^，總酶活損失*1^。較使用清液質(zhì)量6%的PEG6000對CPO的回收效果有所下降。上述實(shí)施例中PEG聚合度和添加量對沉淀CPO回收率的影響分別如圖1和圖2所示，由圖1、圖2及上述實(shí)施例可知PEG的聚合度和PEG的添加量對CPO的回收率有較大影響隨著聚合度的提高，PEG對CPO的沉降作用越來越強(qiáng)；PEG的添加量并非越多越好，隨著 PEG的添加量的增加，其對CPO的沉降作用首先隨之增強(qiáng)，到達(dá)一定添加量使其對CPO的沉降作用反而下降。據(jù)以上實(shí)施例可以得出為達(dá)到對CPO最好的沉降效果，以使用PEG6000， 添加量為清液質(zhì)量的6%為佳。實(shí)施例9 取實(shí)施例4所得黃色復(fù)合沉淀物在分液漏斗中加入與該沉淀物質(zhì)量比5%的 PH5. 8的0. lmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行溶解，形成PEG/(NH4) 2SO4雙水相體系，雙水相分層后萃取分離兩相，分別測出上下相的體積和酶濃度，并根據(jù)如下定義計(jì)算分配系數(shù)和下相酶的得率，即回收率。雙水相系統(tǒng)中的分配系數(shù)定義為Hill!下相酶的得率采用百分含量形式表示
Y下相(%) = #111 χ 100O/O = (W0% = ^^ 下相兩相總酶活力CaVa+CbVb (1 + KR)式中Ca為上相液酶濃度(u/mL)，Cb為下相液酶濃度(u/mL)，R表示上下相溶液體積的比值，K表示分配系數(shù)。結(jié)果顯示分配系數(shù)為14. M3，下相酶的得率為5%。實(shí)施例10 過程同實(shí)施例9，不同之處在于PBS與沉淀物的質(zhì)量比為10%。結(jié)果顯示分配系數(shù)為12. M5，下相酶的得率為7. 9%。實(shí)施例11 過程同實(shí)施例9，不同之處在于PBS與沉淀物的質(zhì)量比為15%。結(jié)果顯示分配系數(shù)為8. 401，下相酶的得率為12. 5%。實(shí)施例12 過程同實(shí)施例9，不同之處在于PBS與沉淀物的質(zhì)量比為20%。結(jié)果顯示分配系數(shù)為6. 491，下相酶的得率為23. 1%。實(shí)施例13 過程同實(shí)施例9，不同之處在于PBS與沉淀物的質(zhì)量比為25%。結(jié)果顯示分配系數(shù)為4. 646，下相酶的得率為48. 3%。實(shí)施例14 過程同實(shí)施例9，不同之處在于PBS與沉淀物的質(zhì)量比為30%。結(jié)果顯示分配系數(shù)為3. 842，下相酶的得率為7%。
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實(shí)施例15 過程同實(shí)施例9，不同之處在于PBS與沉淀物的質(zhì)量比為35%。結(jié)果顯示分配系數(shù)為0. 383，下相酶的得率為64. 7%。實(shí)施例16 過程同實(shí)施例9，不同之處在于PBS與沉淀物的質(zhì)量比為40%。結(jié)果顯示分配系數(shù)為4，下相酶的得率為39. 6%。實(shí)施例17 過程同實(shí)施例9，不同之處在于PBS與沉淀物的質(zhì)量比為45%。結(jié)果顯示分配系數(shù)為5. 862，下相酶的得率為34. 8%。實(shí)施例9到實(shí)施例17中PBS添加量對分配系數(shù)和回收率的影響如附圖3所示，由上述結(jié)果可見，隨著PBS添加比例的增加，共沉淀物開始溶解并形成不同相系組成的PEG/ (NH4)2SO4雙水相體系，其中下相(NH4)2SO4相為CPO易分配相，至共沉淀物中加入其質(zhì)量的 35%的0. lmol/L的PBS時(shí)形成的雙水相，下相(NH4)2SO4相中CPO分配系數(shù)為0. 383，為最小值，此時(shí)下相溶液與上相溶液體積比Vt 約為1 5，CPO的回收率達(dá)到64.7%，說明在35% PBS復(fù)溶時(shí)的相系組成中最有利于CPO的溶解釋放，分配比例最高。實(shí)施例18 (I)CPO發(fā)酵液的制備將PDA平板上培養(yǎng)IOd的Caldariomyces fumago菌苔按2cm2菌苔/250mL三角瓶的接種量接入為發(fā)酵培養(yǎng)基(包含g/L 麥芽糖40、NaNO3 2，KC12，KH2PO4 2，MgSO4 · 7H20 0. 5，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 02，CaCl2 0. 09，另加體積比為20%的馬鈴薯浸出液，初始pH為7.0)， 搖瓶裝液量50ml/250mL三角瓶，發(fā)酵溫度^°C、搖床轉(zhuǎn)速M(fèi)Or/min，發(fā)酵8d。(2) CPO發(fā)酵液的預(yù)處理發(fā)酵液在4000g，10°C的條件下離心lOmin，或者采用真空抽濾去除菌絲以及其它固形物，收集含黑色素的清液，清液在冰浴條件下緩慢加入質(zhì)量為該清液質(zhì)量的6%的 PEG6000并不斷攪拌混合，靜置4h待PEG與黑色素絮凝穩(wěn)定后離心(6000g，4°C，IOmin)，收集黃綠色的脫色液，用0. 2mol/L稀磷酸調(diào)節(jié)pH至5. 8。(3) CPO與PEG的共沉淀在冰浴條件下，向脫色液中緩慢加入固體^扎)2504至60%飽和度。過程中不斷攪拌，防止局部鹽濃度過高而造成酶的失活。待沉淀開始出現(xiàn)后10°C下靜置10h，抽濾得淡黃色復(fù)合沉淀物；(4)取上述黃色復(fù)合沉淀物在分液漏斗中加入與該沉淀物質(zhì)量比35%的pH4的 0. lmol/L磷酸鹽緩沖液(PBQ進(jìn)行溶解，形成PEG/(NH4) 2S04雙水相體系，雙水相分層后萃取分離兩相，分別測出上下相的體積和酶濃度，計(jì)算分配系數(shù)和下相酶的得率。實(shí)施例19 過程同實(shí)施例18，不同之處在于步驟中的PBS的pH為5。結(jié)果顯示分配系數(shù)為0. 231，下相酶的得率為63. 1%。實(shí)施例20 過程同實(shí)施例18，不同之處在于步驟(4)中的PBS的pH為6。結(jié)果顯示分配系數(shù)為0. M3，下相酶的得率為65. 2%。
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實(shí)施例21 過程同實(shí)施例18，不同之處在于步驟(4)中的PBS的pH為7。結(jié)果顯示分配系數(shù)為0. 538，下相酶的得率為55. 2%。實(shí)施例22:過程同實(shí)施例18，不同之處在于步驟(4)中的PBS的pH為8。結(jié)果顯示分配系數(shù)為0.81，下相酶的得率為51.8%。實(shí)施例23:過程同實(shí)施例18，不同之處在于步驟(4)中的PBS的pH為9。結(jié)果顯示分配系數(shù)為0. 873，下相酶的得率為30. 04%。圖4顯示實(shí)施例18到實(shí)施例23中PBS的pH對CPO分配系數(shù)和回收率的影響， 由圖可見，雙水相系統(tǒng)中PH在4-6區(qū)間CPO的分配系數(shù)K較為穩(wěn)定，分配系數(shù)較低，為 0. 228-0. 243, pH大于6以后K逐漸增大，而在pH為6附近酶的得率最高，約為65. 2%，pH 超過6以后得率逐漸減少。實(shí)施例稱取kphadex G_75層析凝膠10g，用蒸餾水浸泡lh，傾去含細(xì)微懸浮物的上層液體，后用0. lmol/L pH 5. 8的PBS平衡至pH為5. 8，裝柱。取實(shí)施例15所得雙水相萃取的下層酶液裝入透析袋，先用0. lmol/L pH 5. 8的PBS透析至無硫酸根離子后，再埋入經(jīng)過干燥的PEG6000固體粉末中吸水濃縮到透析后體積的1/5，上柱。上柱量不超過柱床體積的 5%，用0. lmol/L pH 5. 8的PBS洗脫，當(dāng)深黃色色譜條帶(上樣液為淡黃色)移動(dòng)至接近柱底時(shí)開始收集流出液，每管收集2mL，測定CPO酶濃度和蛋白質(zhì)濃度，再分別在280nm和 403nm波長下檢測收集液的吸光度，采用Rz值驗(yàn)證酶純度( = A403A280)，其中A4tl3代表血紅素輔基在403nm處的光吸收值，A28tl代表蛋白質(zhì)在^Onm處的吸收值。收集含高組分酶活的洗脫液，測定其Rz值，將Rz值大于1. 2的收集液合并，再經(jīng)真空冷凍干燥濃縮，得氯過氧化物酶。圖5顯示的是復(fù)溶物雙水相萃取液凝膠層析洗脫液曲線，圖中高組分蛋白質(zhì)與高酶活組分峰值明顯，兩峰的重疊性較好，5-9管的收集液的Rz值為1. 05，整個(gè)洗脫過程中雜蛋白峰很少，說明上樣組分中蛋白質(zhì)為高純度CP0，證明了共沉復(fù)溶法提純高純度CPO的高效性和可行性。表1共沉復(fù)溶法提純CPO回收率和純度
權(quán)利要求
1.一種分離回收氯過氧化物酶的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)CPO發(fā)酵液的制備將海洋真菌菌苔接入發(fā)酵培養(yǎng)基，25 33°C下發(fā)酵6 8d得 CPO發(fā)酵液；(2)CPO發(fā)酵液的預(yù)處理將CPO發(fā)酵液在4-10°C的條件下離心，或者采用真空抽濾去除菌絲以及其它固形物，收集含黑色素的清液，所得清液在冰浴條件下緩慢加入聚合度 4000 6000的PEG并不斷攪拌混合，靜置待PEG與黑色素絮凝穩(wěn)定后在4 10°C下離心， 收集黃綠色的脫色液，用稀磷酸調(diào)節(jié)PH至4-6 ；(3)CP0與PEG的共沉淀在冰浴條件下，向上述脫色液中邊攪拌邊緩慢加入固體 (NH4)2SO4至沉淀開始出現(xiàn)，4-10°C下靜置8-10h，抽濾得淡黃色復(fù)合沉淀物；(4)沉淀物的復(fù)溶解用磷酸鹽緩沖液溶解步驟( 所得沉淀物至形成上下相體積比為1/5 1/4的雙水相體系，上層水相富含PEG，下層水相富含(NH4)2SO4,萃取分離兩相；所述的磷酸鹽緩沖溶液pH4 6 ；(5)CPO凝膠層析純化將步驟(4)所得的下層酶液用pH值為4-6的磷酸鹽緩沖液透析至無硫酸根離子，埋入經(jīng)過干燥的PEG固體粉末中吸水濃縮到透析后體積的1/5 1/4， 上層析柱純化；收集含高組分酶活的洗脫液，測定其&值，將民值大于1. 2的收集液合并， 再經(jīng)真空冷凍干燥濃縮，得氯過氧化物酶，Rz = A4c13/A28(1，其中A4tl3為血紅素輔基在403nm處的光吸收值，A280為蛋白質(zhì)在^Onm處的光吸收值。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離回收氯過氧化物酶的方法，其特征在于，所述PEG為聚合度為6000的PEG。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離回收氯過氧化物酶的方法，其特征在于，步驟(2)中所述PEG與所述清液的質(zhì)量比為4% 8%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離回收氯過氧化物酶的方法，其特征在于，步驟(2)中所述PEG與所述清液的質(zhì)量比為6%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離回收氯過氧化物酶的方法，其特征在于，步驟(4)中所用的磷酸鹽緩沖溶液與沉淀物的質(zhì)量比為30% 40%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分離回收氯過氧化物酶(Chloroperoxidase，EC 1.11.1.10，CPO)的方法，利用共沉復(fù)溶法，即親水性高分子聚乙二醇在高鹽濃度下沉淀夾帶CPO分子，從而富集CPO蛋白濃度，再運(yùn)用雙水相萃取技術(shù)高效分離回收高純度CPO，即利用分離目標(biāo)產(chǎn)物和雜質(zhì)在親水性高分子相溶液中分配系數(shù)不同而對不同蛋白質(zhì)加以分離。本發(fā)明通過研究提出合理可行的雙水相CPO提取純化條件，總結(jié)微小含量生物活性物質(zhì)的分離技術(shù)，解決或改善了目前CPO生產(chǎn)過程存在的提取干擾大、回收率低、產(chǎn)品價(jià)格高、提純周期長、不能規(guī)?；a(chǎn)等問題。
文檔編號(hào)C12R1/645GK102277339SQ20111023501
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月16日
發(fā)明者張書翠, 許甜甜, 諸葛俊貴, 陳軍 申請人:上海師范大學(xué)