甘露聚糖酶及其突變體的制作方法

專利名稱：甘露聚糖酶及其突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甘露聚糖酶及其突變體，屬于微生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
i3-l，4_D-甘露聚糖酶(EC 3.2. 1.78)又稱為甘露聚糖酶，它能水解含有β_1， 4-D-甘露糖苷鍵，生成甘露寡糖或甘露多糖，屬于半纖維素酶類。在自然界中，甘露聚糖是僅次于纖維素的第二大可再生的半纖維素碳水化合物， 廣泛存在于植物細胞壁，尤其是在豆科植物種子中，半乳糖-甘露聚糖含量高達干重的 20%以上。同時，甘露聚糖的結(jié)構(gòu)也有很多種，如半乳糖-甘露聚糖、葡萄糖-甘露聚糖和半乳糖-葡萄糖-甘露聚糖等。半乳糖-甘露聚糖的結(jié)構(gòu)是主鏈由3-l，4-D-甘露糖苷鍵連接而成的甘露聚糖，側(cè)鏈則是α-1，6-半乳糖苷鍵連接的半乳糖。葡萄糖-甘露聚糖主鏈是由β -1，4-D-甘露糖苷鍵連接而成，但其主鏈上一些甘露糖被葡萄糖取代。半纖維素酶，包括甘露聚糖酶、木聚糖酶和葡聚糖酶等，廣泛用于纖維素生產(chǎn)乙醇、食品、飼料和造紙等行業(yè)。飼用酶制劑要適應(yīng)動物如豬和禽類等的消化道特點，需要具有耐酸性強，同時在pH6. 0 7. 0范圍活性最強等特點。大豆粕是生產(chǎn)飼料的重要原料，如果在飼料中添加適量甘露聚糖酶，既能提高飼料的消化率，又能降低飼料成本(楊鴻昆等， 2007，飼料研究；段蕾等，2008，飼料研究；范志恒，2008，飼料工業(yè))。很多微生物能產(chǎn)甘露聚糖酶，包括曲霉，芽孢桿菌甚至是鏈霉菌等。但是，通過菌種的篩選和誘變選育的自然菌株所產(chǎn)的甘露聚糖酶的酶活水平< 100U/ml，往往不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要(楊文博，1995，微生物通報)。因此，克隆基因進行異源表達而獲得高效表達工程菌是當前開發(fā)甘露聚糖酶的熱點(丁宏標等，2006，畜牧與飼料；譚秀華等，2005，微生物學(xué)報)。作為飼料添加劑，尋找高酶活、耐酸和最適溫度接近體溫的甘露聚糖酶是當前研究的熱點和難點。而蛋白質(zhì)工程改造是獲得理想蛋白的重要手段之一。定向進化是獲得理想的飼用甘露聚糖酶的重要手段(毛紹名等，2007，微生物通報)。定向進化是利用隨機突變而篩選大量突變體來獲得目的蛋白，其工作量大，偶然性也非常大(張紅纓等，1999，科學(xué)通報；許欽坤等，2005，生物技術(shù)通訊)。而理性設(shè)計雖然工作量相對較小，但是往往難于找到合適氨基酸位點進行突變改造(張秀艷等，2006，生物工程雜志；王凡業(yè)等，2006，應(yīng)用化工)。本發(fā)明提供了 pH偏中性的甘露聚糖酶及其多個酶的突變體。這些突變體是從地衣芽孢桿菌的不同菌株中克隆得到，它們間不完全同源，同源性為99%。盡管這些突變體的同源性非常高，但是彼此間活性(比活)存在很大的差異。這說明這些突變/取代位點是影響其活性的關(guān)鍵位點，這為甘露聚糖酶的定向進化和理性設(shè)計通過提供了可供選擇的關(guān)鍵位點和方向
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供高酶活的甘露聚糖酶及其變體。本發(fā)明提供了新的重組甘露聚糖酶及其突變體，其中所述重組甘露聚糖酶的氨基酸序列(a)包含選自 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8、、SEQ IDNO 10或SEQ ID NO 12其中之一；或者(b)是在選自 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8、、SEQ IDNO 10或SEQ ID NO :12其中之一上取代、缺失或添加一個或數(shù)個氨基酸殘基得到。在一個實施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列為SEQ ID NO :2，其編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO =I0在一個實施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列為SEQ ID NO :4，其編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO :3ο在一個實施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列為SEQ ID NO :6，，其編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO :5ο在一個實施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列為SEQ ID NO :8，其編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO -J0在一個實施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列為SEQ ID Ν0:10，其編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO :9ο在一個實施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列為SEQ ID Ν0:12，其編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO 11。酶活實驗結(jié)果表明本發(fā)明提供的甘露聚糖酶具有良好的酶活。其中氨基酸為SEQ IDNO 12的高比活甘露聚糖酶具有很好的穩(wěn)定性。在701、801、851和901條件下水浴5 分鐘，分別還能保持90%、30%、20%和18%的酶活。最適ρΗ分析顯示，該酶在pH5. 0-9. O 范圍內(nèi)均有活性，且有2個最適ρΗ作用峰，即ρΗ6· 5和ρΗ8· 5。另一方面，本發(fā)明還提供了一種制備重組甘露聚糖酶的方法，該方法包括(a)提取地衣芽孢桿菌的基因組DNA ；(b)以提取的基因組DNA為模板，進行PCR擴增；(c)將PCR擴增產(chǎn)物克隆入表達載體；(d)用步驟(C)得到的重組表達載體轉(zhuǎn)化表達宿主；(e)分離、鑒定并純化表達產(chǎn)物。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述PCR擴增使用的引物對為Pl :GCACACACCGTTTCTCCGGTG，禾口P2 CACGACAGGCGTCAAAGAATCG 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述PCR擴增條件為95°C 4min ；94°C 30s ； 55°C 40s, 72°C Imin 30 個循環(huán)；72°C 7min。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述表達載體為pET28。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述表達宿主為大腸桿菌BL21。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述擴增產(chǎn)物的核苷酸序列分別為SEQ ID NO=U SEQ IDNO 3, SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO :9 禾口 SEQ ID NO :11。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，利用PPIC9K質(zhì)粒構(gòu)建了 SEQ ID NO 11的重組表達載體，并轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株，獲得了高效表達的畢赤酵母工程菌，為規(guī)?；陌l(fā)酵和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本申請用生物軟件DNAMAN6. 0分析顯示所述酶編碼基因之間存在不同位點的不同程度突變。為研究這些突變對酶學(xué)活性的影響，分別將這些突變基因進行了重組表達。通過M-agarose純化重組蛋白并分析其酶學(xué)性質(zhì)。酶學(xué)性質(zhì)分析顯示6個突變體的酶活(比活)存在明顯的差異，說明這些位點氨基酸殘基是影響甘露聚糖酶活性的關(guān)鍵位點。本發(fā)明提供了地衣芽孢桿菌6個甘露聚糖酶突變體基因及其相應(yīng)的氨基酸序列。6個甘露聚糖酶氨基酸序列之間存在 20、27、31、48、64、78、81、89、102、105、122、123、179、187、195、2；34、 248,254,255,292,302,312,313和325位點上存在突變。這些位點氨基酸殘基的突變造成酶活的較大差異，這為甘露聚糖酶的理性設(shè)計和定向進化提供了參考。另一方面，本發(fā)明還提供了一種測定甘露聚糖酶測定方法，該方法包括以0.6%槐豆膠甘露聚糖(Sigma公司，Batch#125K0091)為底物。以0. IM醋酸-醋酸鈉(pH5. 5)為緩沖液，將甘露聚糖底物37°C平衡20min ；將待測酶液37°C平衡lOmin。取 4支試管，分別加入酶液anl，取其中3支作為測定管，分別加入2ml底物溶液，另一支作為空白管加入5ml DNS溶液，在37°C 士0. 5°C水浴30分鐘，三支測定管分別加入5ml DNS溶液，空白管加入2ml底物溶液，在沸水浴中反應(yīng)5分鐘，冷卻后定容至25ml，以空白管調(diào)零， 在分光光度計540rm處測吸光度。酶活定義是在37°C pH5. 5的條件下，每分鐘水解底物產(chǎn)生Iymol甘露糖所需酶液的量為一個甘露聚糖活性單位。蛋白含量測定參照Bradford法。


圖1圖示的是用DNAMAN比對分析蛋白序列圖2圖示的是Clustal X分析蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育圖3圖示的是Man6酶學(xué)性質(zhì)最適溫度和pH分析本發(fā)明優(yōu)點從不同地衣芽孢桿菌菌株中克隆多個甘露聚糖酶基因的突變體，并分析甘露聚糖酶突變體酶學(xué)特性。這些甘露聚糖酶氨基酸序列同源性最高達99%以上，但是不同位點的突變?nèi)〈斐闪嗣富钚缘拿黠@差別。這為蛋白質(zhì)的定向進化和蛋白質(zhì)工程改造提供了選擇位點，為選擇高活性的甘露聚糖酶進行異源高效表達奠定基礎(chǔ)
實施例以下實施例是為了更好地說明闡述本發(fā)明內(nèi)容，本領(lǐng)域相關(guān)的技術(shù)人員可以借助實施例更好地理解和掌握本發(fā)明。但是，本發(fā)明的保護和權(quán)利要求范圍不限于所提供的案例。實施例1地衣芽孢桿菌甘露聚糖酶基因的克隆1. 1提取地衣芽孢桿菌不同菌株的總基因組DNA將本實驗室保存的6株地衣芽孢桿菌過夜培養(yǎng)，各取1. 5ml, 12000rpm離心1分鐘，除上清；加入 200 μ 1 裂解緩沖液(60mM Tris-HCl，pH7. 8，20mM Na-Ac, ImM EDTA, 1. 5% SDS)，用移液器劇烈吹打；加入66 μ 1 5Μ高氯酸鈉溶液混勻，12000rpm離心10分鐘，取上清；加入等體積苯酚抽提一次，12000rpm離心2分鐘，取上清；加入等體積異丙醇沉淀5分鐘，12000rpm離心5分鐘；70%乙醇洗滌兩次；最后將干燥的DNA溶于ddH20。1.2基因克隆以1. 1中提取的基因組總DNA為模板，分別利用引物對(GCACACACCGTTTCTCCGGTG 和 CACGACAGGCGTCAAAGAATCG)進行 PCR 擴增。PCR 擴增條件為 95 "C 4min ；94 "C 30S ； 550C 40S，72°C Imin 30個循環(huán)；72°C 7min。利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產(chǎn)物。1. 3測序分析將1. 2中回收的擴增產(chǎn)物分別連接到pMD18 T-載體，相應(yīng)的克隆載體分別命名為 pMDT-Manl、pMDT-Man2、pMDT-Man3、pMDT-Man4、pMDT-Man5 和 pMDT_Man6 ；最后把陽性克隆送至北京華大基因研究中心進行測序分析。測序結(jié)果為Manl、Man2、Man3、Man4、Man5、 Man6 的核苷酸序列分別為 SEQ ID NO =USEQ ID N0:3、SEQ ID NO 5,SEQID N0:7、SEQ ID NO :9和SEQ ID NO =Il0其編碼蛋白的氨基酸序列分別為SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6, SEQ ID N0:8、SEQ ID NO :10 禾口 SEQ ID NO :12。實施例2甘露聚糖酶的序列分析將測序結(jié)果在NCBI上BLAST比對分析顯示這些序列與甘露聚糖酶基因高度同源。 利用生物軟件DNAMAN6. 0分析核酸序列發(fā)現(xiàn)6個序列不是完全同源。把相應(yīng)的核酸序列翻譯為氨基酸序列，并分別命名為Manl、Man2、Man3、Man4、Man5和Man6。對氨基酸序列同源比對分析，結(jié)果顯示以下一個位點或幾個位點存在突變，即20、27、31、48、64、78、81、89、102、 105、122、123、179、187、195、234、248、254、255、292、302、312、313 和 325 位點。這些位點的氨基酸殘基可能的取代是 Y20N，D27N, N31S, L48T, V64I, E78K, V81D, S89R, R102Q, L105M, S122P, S123N, S179T, A187E, R195Q, H234Y, H248Y, D254E, Q255E, N292K, G302E, G312D, A313T，D325E，序列比對分析結(jié)果見圖1。生物軟件Clustal X分析蛋白的氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育，6個突變體親緣關(guān)系特別近，見圖2。實施例3甘露聚糖酶在大腸桿菌中的重組表達及純化分別以質(zhì)粒pMDT-Manl、pMDT-Man2、pMDT-Man3、pMDT-Man4、pMDT-Man5 和 pMDT-Man6 為模板，利用引物(AGAGCTAGCGCACACACCGTTTCTCCGGTG-—Nhe I 和 ACACTCGAG CACGACAGGCGTCAAAGAATCG—XhoI)進行 PCR 擴增，PCR 擴增條件是 95 °C 4min ；94 °C 30S ； 550C 40S,72°C Imin 30個循環(huán)；72°C 7min。擴增產(chǎn)物凝膠回收后，先進行Nhe I酶切，然后回收酶切產(chǎn)物進行》ιο I酶切。同樣，對表達質(zhì)粒pET28a也分別進行Nhe I酶切和Bio I 酶切。用T4連接酶把雙酶切產(chǎn)產(chǎn)物即克隆基因和表達載體4°C連接過夜。最后，把連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌BL21。相應(yīng)的陽性克隆表達質(zhì)粒分別命名為pET-Manl、pET-Man2、pET-Man3、 pET_Man4、pET_Man5 禾口 pET_Man6。把陽性克隆菌落接種5ml LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)至0D600 = 0. 3時加入ImM IPTG 誘導(dǎo)表達4-5小時。離心收集表達細胞于-20°C凍存過夜，然后加入ImL裂解緩沖液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,10mM imidazole)進行超聲波破碎，不時進行顯微鏡觀察，待細胞完全破碎后按照QIAGEN公司的M-NTA SPIN試劑盒所提供的方法進行蛋白純化回收。電泳結(jié)果顯示回收得到相應(yīng)的目的蛋白。實施例4酶學(xué)性質(zhì)分析以0. 6%槐豆膠甘露聚糖(Sigma公司，Batch#125K0091)為底物。測定在實施例 3中所純化的重組甘露聚糖酶的活性，步驟如下以0. IM醋酸-醋酸鈉(pH5. 5)為緩沖液，將甘露聚糖底物37°C平衡20min ；將待測酶液37°C平衡lOmin。取4支試管，分別加入酶液 anl，取其中3支作為測定管，分別加入2ml底物溶液，另一支作為空白管加入5ml DNS溶液， 在37°C 士0. 5°C水浴30分鐘，三支測定管分別加入5ml DNS溶液，空白管加入2ml底物溶液，在沸水浴中反應(yīng)5分鐘，冷卻后定容至25ml，以空白管調(diào)零，在分光光度計540rm處測吸光度。酶活定義是在37°C pH5. 5的條件下，每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μ mol甘露糖所需酶液的量為一個甘露聚糖活性單位。蛋白含量測定參照Bradford法。純化蛋白酶活為5. 5 5620IU/ml不等，比活測定為12 7020IU/mg不等。其中 SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5編碼的蛋白Man4和Man5活性極低。此外，還測定了 Man6在不同pH和溫度條件下酶學(xué)活性，其中緩沖液分別是0. IM 醋酸-醋酸鈉緩沖液(PH4. 0、pH 5. 0、pH 6. 0)、0. IM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液 (pH6. 5、7. 0，7. 5、8. 0)和0. IM甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(ρΗ8· 5、9· 0、10. 0)。結(jié)果如圖3 所示，最適溫度為50°C，在pH6. 5和pH8. 5是2個最適峰，而且在pH6. 0-7. 0之間甘露聚糖
酶酶活很穩(wěn)定。實施例5在畢赤酵母中的表達5. 1表達質(zhì)粒pPIC_Man2的構(gòu)建設(shè)計引物Man2-F 和 Man2_R(ATA \GAATT0{ GCACACACCGTTTCTCCGGTG [EcoRI]和 ATA \GCGGCCGd\ CACGACAGGCGTCAAAGAATCG[Not I])以質(zhì)粒 pET_Man2 為模板，以 Man2_F 和 Man2-R 為引物進行 PCR 擴增。PCR 條件為:95°C 4min ；94°C 40s,54°C 40s, 72°C lmin，共 30個循環(huán)；72°C 7min。凝膠回收PCR產(chǎn)物，并以Eco RI和Not I雙酶切。同樣，以Eco RI 和Not I雙酶切pPIC9K，然后把兩個酶切產(chǎn)物連接過夜后導(dǎo)入大腸桿菌DH5 α，獲得重組表達質(zhì)粒 pPIC-Man6。5. 2重組工程菌的構(gòu)建表達質(zhì)粒pPIC-Man2用Ml I酶切電泳鑒定后，經(jīng)乙醇沉淀濃縮，測定DNA濃度， 以3yg/μ L濃度稀釋質(zhì)粒片段保存?zhèn)溆?。制備畢赤酵母GSl 15電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，最后重懸于ImL預(yù)冷的電泳緩沖液中(含ImM MgC12, IOmM HEPES，250mM蔗糖，pH 7. 8)。在80 μ L 感受態(tài)細胞中加入5 μ L線性化重組質(zhì)粒；電轉(zhuǎn)化(條件為1500V、200 Ω、25 μ F)；最后涂布于匪平板(MM培養(yǎng)基組分1.34% YNB，4X10_5%生物素，0. 5%甲醇)，挑選重組菌株。5. 3搖瓶誘導(dǎo)表達將挑選工程菌接種于5ml BMGY(1%酵母提取物，2%蛋白陳，1. ;Μ%ΥΝΒ，4Χ1(Γ5% 生物素，甘油)，30°C培養(yǎng)過夜，離心收集菌體，把菌體加入50ml BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1 % 酵母提取物，2 %蛋白陳，1. ；34% YNB，4X 10_5%生物素，0. 5 %甲醇)，每12小時補加50 μ L甲醇。5. 4酶活測定不同時間取樣測定上清酶活，結(jié)果顯示其上清液最高酶活為600IU/mL。
權(quán)利要求
1.重組甘露聚糖酶及其突變體，其中所述重組甘露聚糖酶的氨基酸序列(a)包含選自SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :6、SEQ ID N0:8、、SEQ IDNO :10 或SEQ IDNO 12其中之一；或者(b)是在選自SEQ ID NO 2,SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8、、SEQ IDNO :10 或SEQ ID NO :12其中之一上取代、缺失或添加一個或數(shù)個氨基酸殘基得到。
2.權(quán)利要求1所述的重組甘露聚糖酶，其氨基酸序列為SEQID N0:2、SEQ ID NO :4、 SEQID NO 6, SEQ ID N0:8、、SEQ ID NO :10 或 SEQ ID NO :12。
3.編碼權(quán)利要求1或2所述甘露聚糖酶的DNA分子。
4.權(quán)利要求3所述的DNA分子，其核苷酸序列為SEQID NO :1、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 5, SEQ ID N0:7、SEQ ID NO :9 或 SEQ ID NO :11。
5.一種重組表達質(zhì)粒，其中含有權(quán)利要求3或4所述的DNA分子。
6.一種表達宿主，其被權(quán)利要求5所述的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。
7.權(quán)利要求6所述的表達宿主，其選自大腸桿菌(Escherichiacoli)、酵母或芽孢桿菌。
8.權(quán)利要求6所述的表達宿主，其中所述的酵母是巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)。
9.權(quán)利要求6所述的表達宿主，其中所述的芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。
10.一種制備重組甘露聚糖酶的方法，該方法包括(a)提取地衣芽孢桿菌的基因組DNA；(b)以提取的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。(c)將PCR擴增產(chǎn)物克隆入表達載體；(d)用步驟(c)得到的重組表達載體轉(zhuǎn)化表達宿主；(e)分離、鑒定并純化表達產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了高酶活的甘露聚糖酶及其突變體。本發(fā)明提供了6個從地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)不同菌株中克隆得到的甘露聚糖酶基因及其編碼的甘露聚糖酶，并通過生物信息學(xué)分析了6個突變體間的差異和親緣關(guān)系。本發(fā)明提供的甘露聚糖酶在中性pH條件下具有高活性，其最適溫度適中，可作為作飼用酶制劑。
文檔編號C12R1/10GK102277342SQ201110234218
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月16日
發(fā)明者劉魯民, 王華明, 程斯達, 許韡, 陳亮珍, 陳剛, 黃亦鈞 申請人:青島康地恩生物科技有限公司