專利名稱：一種基于多種微生物的急性毒性試驗方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種急性毒性的評價方法及其試劑盒，具體涉及一種基于多種微生物的急性毒性試驗方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
微生物試驗相對于其他生物試驗方法，在毒性檢測中具有不可比擬的優(yōu)勢。微生物世代時間短，可以大大縮短試驗時間；操作容量小而受試生物量大，能夠反映整個群體的染毒效應(yīng)，而非個別效應(yīng)；微生物適應(yīng)力強，能用于各種靈敏度要求不同的環(huán)境樣品的測定；沒有道德上的爭議存在。目前用于水質(zhì)檢測的微生物檢測法主要有以下幾種生物發(fā)光法、生長抑制法、呼吸計量法、酶活法及硝化速率法等等。脫氫酶活性法是其中一種應(yīng)用較多的生物試驗。應(yīng)用脫氫酶檢測樣品毒性是通過測定毒物對細(xì)菌體內(nèi)的脫氫酶活性的影響來確定毒物毒性。實驗中應(yīng)用細(xì)菌活細(xì)胞作為酶源，在毒物作用下，微生物代謝作用的任何改變必將影響反應(yīng)系統(tǒng)中脫氫酶活性。脫氫酶在各種生物的新陳代謝中都起著重要的作用。通過測定廢水、污染水體或化學(xué)品對脫氫酶活性的影響，了解污染物的毒性和生態(tài)學(xué)效應(yīng)。在生物新陳代謝過程中，脫氫酶起著傳遞體作用，即將有機質(zhì)的氫脫下，使有機質(zhì)氧化，并將氫轉(zhuǎn)移給氧化型化合物。在無氧反應(yīng)系統(tǒng)中， 受毒物作用，脫氫酶活性降低，其程度與毒物毒性存在一定關(guān)系，所以可以用毒物對脫氫酶活性的影響確定毒物毒性的大小。測定脫氫酶活性要用到四氮唑鹽——一種在脫氫酶作用下還原為不同顏色的物質(zhì)，用得較多的有TTC (2，3，5-氯化三苯基四氮唑)、MTT (溴化噻唑藍(lán)四氮唑)、INT(碘硝基氯化四氮唑藍(lán))以及新一代水溶性的XTT(3，3' -[1-(苯氨?；?-3，4-四氮唑]-二甲氧基-6-硝基)苯磺酸鈉)、們1~-10-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5- ，4-苯二磺酸)-2H-四唑單鈉鹽)等。結(jié)合現(xiàn)代物理學(xué)的光電檢測技術(shù)和計算機數(shù)據(jù)處理技術(shù)，還可制成便攜式野外水質(zhì)毒性檢測儀，從而實現(xiàn)對水質(zhì)毒性野外現(xiàn)場快速的檢測。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的是提供一種基于多種微生物急性毒性試驗方法，利用該方法對待測樣品的急性毒性進行檢測，具有穩(wěn)定性好，可靠的優(yōu)點。本發(fā)明的基于多種微生物的急性毒性試驗方法，其特征在于，包括以下步驟以 Comamonas testosterone HJK 1.4-9， Brevibacterium epidermidis HJK 2. 11-1, Staphylococcus sciuri HJK8· 2—17，Diaphorobacter nitroreducens HJK 2.2—7，Brevundimonas diminuta HJK 2.2—9，Pseudomonas Sp. HJK 1.6—3，Ochrobactrum anthropi HJK1.2-13, Citrobacter freundii HJK 2. 3-11, Pantoea agglomerans HJK 2· 3—6，Enterococcus casseliflavus HJK 2. 3-10,Saccharomyces cerevisiae HJK 5. 1-5 作為受試微生物，利用脫氫酶活性法檢測待測樣品對上述11種微生物細(xì)胞的脫氫酶活性變化來評價待測樣品的毒性大小。
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本發(fā)明還提供一種檢測待測樣品急性毒性的檢測試劑盒，包括受試微生物、培養(yǎng)受試微生物的培養(yǎng)液、培養(yǎng)受試微生物的器皿和四氮唑鹽，其特征在于，所述的受試微生物為 Comamonas testosterone HJK 1. 4-9，Brevibacterium epidermidis HJK 2. 11-1, Staphylococcus sciuri HJK8. 2-17, Diaphorobacter nitroreducens HJK 2.2-7， Brevundimonas diminuta HJK 2.2—9，Pseudomonas Sp. HJK 1.6—3，Ochrobactrum anthropi HJK 1.2-13， Citrobacter freundii HJK 2.3-11， Pantoea agglomerans HJK 2.3-6， Enterococcus casseliflavus HJK 2.3-10 禾口 Saccharomyces cerevisiae HJK 5. l-5o所述的培養(yǎng)受試微生物的器皿優(yōu)選為96孔板，96孔板能使11種微生物和空白對照在同一個板上面反應(yīng)，顯示，便于利用和觀察。所述的四氮唑鹽優(yōu)選為2，3，5-氯化三苯基四氮唑。H 明的 gii it L Comamonas testosterone HJK 1. 4-9, Brevibacterium epidermidis HJK2. 11-1，Staphylococcus sciuri HJK8. 2-17, Diaphorobacter nitroreducens HJK 2. 2—7，Brevundimonas diminuta HJK 2. 2—9，Pseudomonas Sp. HJK L 6—3，Ochrobactrum anthropiHJK L 2—13，Citrobacter freundii HJK 2· 3—11，Pantoea agglomerans HJK 2.3-6， Enterococcus casseliflavus HJK 2.3-10 禾口 Saccharomyces cerevisiae HJK 5. 1_5都可以從廣東省微生物菌種保藏中心(廣東省廣州市越秀區(qū)先烈中路100號大院廣東省微生物研究所)中購買到。本發(fā)明選擇上述11種微生物作為檢測待測樣品的急性毒性的受試微生物，根據(jù)微生物細(xì)胞脫氫酶在外界毒物作用下受阻，通過四氮唑鹽檢測微生物細(xì)胞的脫氫酶活性變化來評價樣品的毒性大小，這是由于經(jīng)本發(fā)明人實驗發(fā)現(xiàn)，上述11種微生物作為檢測待測樣品的急性毒性的受試微生物時，其重復(fù)性較好，穩(wěn)定性高，以其作為急性毒性試驗獲取均值MTC是可靠的。并且一次試驗可以提供11個急性毒性值，可避免單個物種試驗的靈敏度單一性，在化學(xué)品毒性評價和環(huán)境樣品毒性檢測中具有較好的應(yīng)用前景。
圖1是實施例1的TOXPlate的96孔板的使用示意圖；圖2是11種微生物對測試化合物的均值MTC的變異系數(shù)CV值的散點分布圖。
具體實施例方式以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。一、穩(wěn)定性測試方法1)將 Comamonas testosterone HJK 1. 4-9 (1#)，Brevibacterium epidermidis HJK 2. 11-1(2#) , Staphylococcus sciuri HJK8. 2-17(3#), Diaphorobacter nitroreducens HJK 2. 2-7 (4#), Brevundimonas diminuta HJK 2. 2-9 (5#), Pseudomonas Sp. HJK 1.6_3(6#), Ochrobactrum anthropiHJKl. 2-13(7#), CitrobacterfreundiiHJK 2.3-11(8#), PantoeaagglomeransHJK 2. 3-6(9#)禾口 Enterococcus casseliflavus HJK 2. 3-10 (10#)接種于LB液體培養(yǎng)基中，300C，175r/min,培養(yǎng)18小時，然后再用LB液體培養(yǎng)基將菌液密度調(diào)至0D_ = 1. 0，再用2倍濃度的LB液體培養(yǎng)基+0. 01 % (w/v) TTC將其稀釋 100 倍制成菌懸液；將 Saccharomyces cerevisiae HJK 5. 1-5 (11#)接種于 YPD 液體培養(yǎng)基中，300C，175r/min,培養(yǎng)18小時，用YPD液體培養(yǎng)基將菌液密度調(diào)至OD6tltl = 1. 0，再用 2倍濃度的YPD液體培養(yǎng)基+0. 01 % (w/v) TTC將其成稀釋100倍制成菌懸液。2)將樣品絲裂霉素、氟化鈉、硫酸鋰，苯酚，敵克松，氯化鉀和丙烯酰胺配制成 10mg/mL，再進行2倍梯度稀釋，稀釋液液待用(即用二次去離子水分別將樣品稀釋2、4、8、 16、32、64 倍)。3)如圖1所示，TOXPlate 96孔板，其橫向12列，每一列作為一種受試微生物的反應(yīng)孔，每一列的8個孔加入待測樣品的2倍梯度濃度稀釋液，即在第1列每孔加入菌株1# 菌懸液50 μ 1，第2列每孔加入菌株2#菌懸液50 μ 1，如此類推，第11列每孔加入菌株11# 菌懸液50 μ 1。往第H行加入50 μ L未經(jīng)稀釋的待檢測樣品(原樣)，由G往上至B依次是加入2、4、8、16、32、64倍梯度稀釋液各50 μ 1，第A行每孔加入50 μ 1純水作為陰性對照； 合上蓋子，30°C恒溫培養(yǎng)18h，用酶標(biāo)儀測定490nm吸光值。4)a、分別計算單個菌MTC和均值MTC的變異系數(shù)CV(coefficient ofvariations) 并繪成散點圖；b、畫出劑量與MTC值的回歸曲線，計算相關(guān)系數(shù)值MTC值的計算方法如下
權(quán)利要求
1.一種基于多種微生物的急性毒性試驗方法，其特征在于，包括以下步驟以 Comamonas testosterone HJK L 4-9，Brevibacterium epidermidis HJK 2.11-1， Staphylococcus sciuri HJK8.2-17, Diaphorobacter nitroreducens HJK 2.2-7， Brevundimonas diminuta HJK 2.2—9，Pseudomonas Sp. HJK 1.6—3，Ochrobactrum anthropi HJK1. 2-13, Citrobacter freundii HJK 2. 3-11, Pantoea agglomerans HJK 2· 3—6，Enterococcus casseliflavus HJK 2. 3-10,Saccharomyces cerevisiae HJK 5. 1-5 作為受試微生物，利用脫氫酶活性法檢測待測樣品對上述11種微生物細(xì)胞的脫氫酶活性變化來評價待測樣品的毒性大小。
2.—種檢測待測樣品急性毒性的檢測試劑盒，包括受試微生物、培養(yǎng)受試微生物的培養(yǎng)液、培養(yǎng)受試微生物的器皿和四氮唑鹽，其特征在于，所述的受試微生物為Comamonas testosterone HJK 1.4—9， Brevibacterium epidermidis HJK 2.11-1, Staphylococcus sciuri HJK8. 2-17,Diaphorobacter nitroreducens HJK 2.2—7，Brevundimonas diminuta HJK 2. 2—9，Pseudomonas Sp. HJK L 6—3，Ochrobactrum anthropi HJKL 2—13，Citrobacter freundii HJK 2. 3—11，Pantoea agglomerans HJK 2. 3—6，Enterococcus casseliflavus HJK 2. 3-10 禾口 Saccharomyces cerevisiae HJK5. 1_50
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測待測樣品急性毒性的檢測試劑盒，其特征在于，所述的培養(yǎng)受試微生物的器皿為96孔板。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測待測樣品急性毒性的檢測試劑盒，其特征在于，所述的四氮唑鹽為2，3，5-氯化三苯基四氮唑。
全文摘要
本發(fā)明公開一種基于多種微生物的急性毒性試驗方法及其試劑盒。它以Comamonas test osterone HJK 1.4-9，Brevibacterium epidermidis HJK 2.11-1，Staphylococcus sciuri HJK8.2-17，Diaphorobacter nitroreducens HJK 2.2-7，Brevundimonas diminuta HJK 2.2-9，Pseudom onas Sp.HJK 1.6-3，Ochrobactrum anthropi HJK1.2-13，Citrobacter freundii HJK 2.3-11，Pantoea agglomerans HJK 2.3-6，Enterococcus casseliflavus HJK 2.3-10，Saccharomyces cere visiae HJK 5.1-5作為受試微生物，利用脫氫酶活性法檢測待測樣品對上述11種微生物細(xì)胞的脫氫酶活性變化來評價待測樣品的毒性大小。以上述11種微生物作為檢測待測樣品的急性毒性的受試微生物時，其重復(fù)性較好，穩(wěn)定性高，以其作為急性毒性試驗獲取均值MTC是可靠的。且一次試驗可以提供11個急性毒性值，可避免單個物種試驗的靈敏度單一性，在化學(xué)品毒性評價和環(huán)境樣品毒性檢測中具有較好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12Q1/02GK102277409SQ20111023199
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月12日
發(fā)明者吳泳標(biāo), 孫國萍, 張國霞, 蔣雍君, 許玫英, 郭詩韻 申請人:佛山市環(huán)保技術(shù)與裝備研發(fā)專業(yè)中心, 廣東省微生物研究所