專利名稱：禽卡氏桿菌溶血素基因pcr診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，尤其是一種禽卡氏桿菌溶血素基因PCR診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
禽卡氏桿菌病是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的蛋雞的一種傳染病，是由卡氏桿菌 (Gallibacterium anatis)引起蛋雞群的一種產(chǎn)蛋量下降的疾病，臨床上以輸卵管囊腫和卵巢炎等為主要特征?？ㄊ蠗U菌不僅是禽卡氏桿菌病的病原，而且還能夠引起其他多種禽類患病?？ㄊ蠗U菌常與雞減蛋綜合征病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、霉形體、禽肺病毒等病原混合感染，使病情加重和復(fù)雜化，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。有些觀點(diǎn)認(rèn)為，該菌是雞和其他禽類上呼吸道正常菌群，但是有報(bào)道顯示在不同生物安全系統(tǒng)中檢測(cè)雞群的帶菌狀態(tài)，有些雞為陰性。至于該菌如何從上呼吸道突破屏障變?yōu)橄到y(tǒng)感染以及該菌對(duì)正常雞的健康狀況照成何種影響，現(xiàn)在還沒(méi)有闡明。最簡(jiǎn)單的描述，該菌是帶有莢膜的，非運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌，同時(shí)大部分菌株具有溶血活性。溶血素是該菌一種重要的毒力因子，現(xiàn)在缺少一種能對(duì)臨床樣品中的禽卡氏桿菌病溶血素毒力基因進(jìn)行簡(jiǎn)便、快捷、靈敏、準(zhǔn)確的試劑盒。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種禽卡氏桿菌溶血素基因PCR診斷試劑盒，它可以快速檢測(cè)到分離到的禽卡氏桿菌是否含有溶血素這個(gè)重要的毒力基因，并且簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)備。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的禽卡氏桿菌溶血素基因PCR診斷試劑盒，它包括500 μ 1 濃度為25 mg/ml的蛋白酶K，1500 μ 1裂解液，2000 μ ITE緩沖液，50 μ IPCR酶，200 μ 1超純水，30 μ 1的Marker DL2000,50y 1等體積混合的引物PI, P2，引物PU P2的濃度均為 20 μ M, 30 μ 1的陰性對(duì)照以及30 μ 1的陽(yáng)性對(duì)照。裂解液為由！"ris-base 50mM, EDTA 2 mM，pH為8. 0，以及占裂解液總體積5%的 triton X-100組成的混合溶液。PCR 酶的組分包括 IOmM 的 Tris-base，50mM 的 KCl、3mM 的 MgCl2、25mM 的 dNTP Mixture 以及 0. 5U 的 Taq DNA polymerase/μ 1。引物Ρ1，Ρ2的序列分別為 陰性對(duì)照為去離子水；
陽(yáng)性對(duì)照為重組PMD18-T-gtxA質(zhì)粒。PCR方法的建立
PCR體系在25 μ 1反應(yīng)體系中最佳反應(yīng)條件為，退火溫度60° C，Taq DNA polymerase 1 U，引物濃度ΙΟμΜ，用引物均有效擴(kuò)增出了其目的片段，片段大小為116^p。無(wú)非特異性片段產(chǎn)生(見圖1)。結(jié)果表明禽卡氏桿菌溶血素基因PCR檢測(cè)方法建立成功。
敏感性試驗(yàn)
在PCR反應(yīng)中，10CFU/ml 1 X IO8 CFU/ml稀釋的卡氏桿菌進(jìn)行PCR，卡氏桿菌溶血素基因的最低檢測(cè)量為100 CFU (見圖2)。結(jié)果表明建立的PCR敏感性高。特異性試驗(yàn)
以禽卡氏桿菌、豬鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌進(jìn)行PCR反應(yīng)。 禽卡氏桿菌為陽(yáng)性，而豬鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性(見圖3)。應(yīng)用建立的PCR方法，重復(fù)檢測(cè)卡氏桿菌DNA樣品3次，結(jié)果均一致。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以知道禽卡氏桿菌溶血素基因PCR診斷試劑盒能夠?qū)εR床中禽卡氏桿菌溶血素基因進(jìn)行快捷、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)。由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，研制了檢測(cè)禽卡氏桿菌溶血素基因PCR試劑盒，通過(guò)PCR檢測(cè)結(jié)果與陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照比較，可以得到檢測(cè)結(jié)論，從而起到快速檢測(cè)分離到的禽卡氏桿菌是否溶血素基因的目的。本發(fā)明檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，并且快捷、靈敏，檢測(cè)方式簡(jiǎn)單，使用效果好。
附圖1為禽卡氏桿菌溶血素基因PCR試驗(yàn)圖；M :DL2000 ；1 禽卡氏桿菌溶血素基因PCR結(jié)果。附圖2為禽卡氏桿菌溶血素基因PCR敏感性試驗(yàn)圖；M:DL2000 ；1 8 =IXlO8 CFU/ml 10CFU/ml稀釋的禽卡氏桿菌溶血素基因PCR結(jié)果。附圖3為PCR特異性試驗(yàn)圖；M :DL2000 ；1 溶血素陽(yáng)性的禽卡氏桿菌PCR產(chǎn)物；2 溶血素陰性的禽卡氏桿菌PCR產(chǎn)物；3 豬鏈球菌PCR產(chǎn)物；4 多殺性巴氏桿菌PCR產(chǎn)物；5 鼠傷寒沙門氏菌PCR產(chǎn)物；6 大腸桿菌PCR產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施例方式禽卡氏桿菌溶血素基因PCR診斷試劑盒，它包括500 μ 1濃度為25 mg/ml的蛋白酶K，1500 μ 1裂解液，2000 μ ITE緩沖液，TE緩沖液的具體組成成分為 Tris-base 50mM, EDTA 2 mM，pH 為 8. 0 ；50 μ IPCR 酶，PCR 酶為自配的 PCR 預(yù)混液，其具體成分為 IOmM 的 Tris-base，50mM 的 KCl、3mM 的 MgCl2、25mM 的 dNTP Mixture 以及 0. 5U 的 Taq DNA polymerase/ μ 1 ；200 μ 1 超純水，30 μ 1 的 Marker DL2000, 50 μ 1 等體積混合的引物Pl，Ρ2，引物PI、Ρ2的濃度均為20 μ Μ，30 μ 1的陰性對(duì)照以及30 μ 1的陽(yáng)性對(duì)照。
權(quán)利要求
1.一種禽卡氏桿菌溶血素基因PCR診斷試劑盒，其特征在于它包括500 μ 1濃度為25 mg/ml的蛋白酶K，1500 μ 1裂解液，2000 μ ITE緩沖液，50 μ IPCR酶，200 μ 1超純水，30 μ 1 的Marker DL2000, 50 μ 1等體積混合的引物Pl，Ρ2，引物PI、Ρ2的濃度均為20 μ Μ，30 μ 1 的陰性對(duì)照以及30 μ 1的陽(yáng)性對(duì)照。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的禽卡氏桿菌溶血素基因PCR診斷試劑盒，其特征在于裂解液為由！"ris-base 50mM, EDTA 2 mM，pH為8. 0，以及占裂解液總體積5%的triton X-100 組成的混合溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的禽卡氏桿菌溶血素基因PCR診斷試劑盒，其特征在于PCR 酶的組分包括 IOmM 的 Tris-base，50mM 的 KCl、3mM 的 MgCl2、25mM 的 dNTP Mixture 以及 0. 5U 的 Taq DNA polymerase/μ 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的禽卡氏桿菌溶血素基因PCR診斷試劑盒，其特征在于引物 PI, Ρ2 的序列分別為P1 :CTCCACGGCAGTACACGA ；P2 :GGCGGTAGAGGCATTAGA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的禽卡氏桿菌溶血素基因PCR診斷試劑盒，其特征在于陰性對(duì)照為去離子水。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的禽卡氏桿菌溶血素基因PCR診斷試劑盒，其特征在于陽(yáng)性對(duì)照為重組PMD18-T-gtxA質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種禽卡氏桿菌溶血素基因PCR診斷試劑盒，它包括500μl濃度為25mg/ml的蛋白酶K，1500μl裂解液，2000μlTE緩沖液，50μlPCR酶，200μl超純水，30μl的MarkerDL2000，50μl等體積混合的引物P1，P2，引物P1、P2的濃度均為20μM，30μl的陰性對(duì)照以及30μl的陽(yáng)性對(duì)照。本發(fā)明通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，研制了禽卡氏桿菌溶血素基因PCR診斷試劑盒，通過(guò)PCR檢測(cè)結(jié)果與陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照比較，得出檢測(cè)結(jié)論，從而起到快速鑒定菌株中是否含有禽卡氏桿菌溶血素基因。本發(fā)明檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，并且快捷、靈敏，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，使用效果確實(shí)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102251049SQ20111022709
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月9日
發(fā)明者馮惠明, 孫志華, 徐安衡, 李武魁, 楊向東, 楊德明, 許玉清 申請(qǐng)人:昆明云嶺廣大種禽飼料有限公司