專利名稱：一種復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥檢測領(lǐng)域，涉及一種復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片的檢測方法，更具體地說是測定復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片中苯巴比妥含量和丹酚酸B含量的檢測方法，
背景技術(shù)：
癲癇祖國醫(yī)學(xué)稱為“癇厥”，民間稱“羊癇風”。為內(nèi)科常見病之一。1963年吉林省中醫(yī)中藥研究院著名精神病專家李振教授就開始探尋治療癲癇病的有效藥物，在浩瀚的中醫(yī)治療方劑中，選出千余品種逐個推敲和歸納分析，同時根據(jù)前蘇聯(lián)醫(yī)學(xué)家卡爾馬諾夫的一個治療癲癇病的處方，采用中西藥相結(jié)合的方式，經(jīng)過了反復(fù)試驗和較長時期的臨床實踐考驗，在整個過程中做過四次較大的改革，最終組成了 “復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片”現(xiàn)在的組方，制定了該產(chǎn)品科學(xué)的生產(chǎn)工藝及加工方法。該藥品是中西結(jié)合標本兼治。西藥抗癲癇治療主要是對癥治療，患者需長期服藥，有的甚至是終身服藥以控制癇性發(fā)作。隨著臨床藥物應(yīng)用經(jīng)驗的不斷積累，抗癲癇藥物的不良反應(yīng)問題也逐漸為人們所認識。西藥抗癲癇藥物不良反應(yīng)的發(fā)生率高。“復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片”為復(fù)方制劑，其中中藥成分針對不良反應(yīng)有良好的治療效果，以西藥控制癇性發(fā)作，配合中藥拮抗西藥的不良反應(yīng)。復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片主要成分有苯巴比妥、溴化鈉、樟腦、丹參干膏、黃花敗醬干膏、纈草流浸膏、珍珠母、冰片中醫(yī)治療癲癇總的治則是以“痰” “風”之論，多以“祛痰熄風”為主，配合以“安神定志” “活血化瘀” “芳香開竅”藥物。該方的定義，基本上以“祛痰熄風，鎮(zhèn)靜安神”為主， 具體組成藥物為珍珠母有消痰，散結(jié)軟堅之功，敗醬、纈草清熱安神，樟腦、冰片開竅醒腦， 丹參活血化瘀。在上述藥物基礎(chǔ)上加入目前常用的化學(xué)合成藥苯巴比妥和溴化鈉，以加強其速效，長效之作用。通過臨床驗證和廣大患者反應(yīng)，該藥具有收效快、療效高，耐藥性小，服用安全等特點。本方采用中西醫(yī)結(jié)合的治療原則，即克服了單純應(yīng)用西藥副作用大，不良反應(yīng)多， 應(yīng)用中藥療效慢的缺點。中西藥結(jié)合標本兼治，從而達到了最佳的治療效果。處方中的苯巴比妥分子式C12H12N2O3,分子量232. 24。白色結(jié)晶粉末。具有以下作用1.鎮(zhèn)靜如焦慮不安、煩躁、甲狀腺功能亢進、高血壓、功能性惡心、小兒幽門痙攣等癥。 2.安眠偶用于頑固性失眠癥，但醒后往往有疲倦、思睡等后遺效應(yīng)。3.抗驚厥常用其對抗中樞興奮藥中毒或高熱、破傷風、腦炎、腦出血等疾病引起的驚厥。4.抗癲癇用于癲癇大發(fā)作的防治，作用出現(xiàn)快，也可用于癲癇持續(xù)狀態(tài)。5.麻醉前給藥。6.與解熱鎮(zhèn)痛藥配伍應(yīng)用，以增強其作用。7.治療新生兒核黃疸。巴比妥類是普遍性中樞抑制藥。隨劑量由小到大，相繼出現(xiàn)鎮(zhèn)靜、安眠、抗驚厥和麻醉作用。10倍催眠量時則可抑制呼吸，甚至致死。巴比妥類在非麻醉劑量時主要抑制多突觸反應(yīng)，減弱易化，增強抑制。此作用主要見于GABA能神經(jīng)傳遞的突觸。它增強GABA介導(dǎo)的Cl內(nèi)流，減弱谷氨酸介導(dǎo)的除極。但與苯二氮類不同，巴比妥類是通過延長氯通道開放時間而增加Cl內(nèi)流，引起超極化。較高濃度時，則抑制Ca依賴性動作電位，抑制Ca依賴性遞質(zhì)釋放，并且呈現(xiàn)擬GABA作用，即在無 GABA時也能直接增加Cl內(nèi)流。
因此，嚴格控制苯巴比妥的劑量，對復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片的療效和用藥安全非
常必要。處方中的丹參干膏是丹參經(jīng)提取、濃縮、干燥而得，丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖。性味與歸經(jīng)苦，微寒。歸心、肝經(jīng)。功能與主治祛瘀止痛，活血通經(jīng)，清心除煩。用于月經(jīng)不調(diào)，經(jīng)閉痛經(jīng)，徵瘕積聚， 胸腹刺痛，熱痹疼痛，瘡瘍腫痛，心煩不眠；肝脾腫大，心絞痛?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究丹參對中樞神經(jīng)有明顯的作用1.丹參水提液對小鼠自主活動的影響動物均為瑞士種小白鼠，雄性，體重為17_26g，僅給水合氯醛的動物，實驗的前一夜停食供水，其余動物均不禁食。用Tainter的方法求半數(shù)睡眠劑量(SD50)。所用丹參制劑是水提乙醇沉淀后的上清液。使用時用生理鹽水稀釋成所需濃度，并調(diào)至PH7。丹參劑量均按g/kg計。苯丙胺、氯丙嗪、眠爾通、戊巴比妥、巴比妥和丹參均腹腔注射給藥，水合氯醛為口服給藥。實驗表明，丹參能明顯抑制小鼠自主活動，作用與劑量大小成正比與眠爾通和氯丙嗪合用能增強抑制效果。2.丹參合并應(yīng)用催眠藥對小鼠睡眠的影響給予小鼠巴比妥125mg/kg或150mg/kg，注射后30分鐘再注射丹參。注射丹參后 15-30分鐘，再給水合氯醛250mg/kg，或戊巴比妥鈉25mg/kg。丹參按不同劑量合并應(yīng)用。結(jié)果單獨給藥與合并給藥組均有非常顯著的差異。為了進一步觀察丹參與戊巴比妥鈉的協(xié)同作用，一組小鼠單獨給戊巴比妥鈉，求SD50，另一組小鼠先給丹參10g/kg，再注射戊巴比妥鈉，觀察劑量_反應(yīng)線的移動。結(jié)果丹參使戊巴比妥鈉的SD50由38. 5mg/kg,降至21. 6mg/ kg。丹參增強戊巴比妥鈉的作用與劑量相關(guān)，丹參2. 5g/kg和5g/kg，使戊巴比妥鈉150mg/ kg組動物的睡眠百分率由20%分別提高到40%和90%。戊巴比妥鈉的劑量降低到125mg/ kg，丹參的增強作用亦非常明顯。給小鼠水合氯醛250mg/kg，動物均處于清醒狀態(tài)。若與丹參合并應(yīng)用，水合氯醛的中樞抑制作用顯著增強，并且這種增強作用與丹參的劑量成正比。3.丹參對抗士的寧的驚厥作用實驗方法同上，注射丹參30-60分鐘后，由小白鼠尾靜脈注射咖啡因，戊四唑，士的寧和-葉荻堿，容積不超過0. lug/kg體重，用上下法求半數(shù)驚厥劑量(CD50)，結(jié)果抗驚作用不明顯，但對苯丙胺的精神運動興奮作用卻有明顯的對抗作用。古代文獻記載丹參有養(yǎng)陰定志，益氣解煩是有一定道理的。4.丹參對貓丘腦后核內(nèi)臟放電的影響2. 5_3kg貓19只，雌雄不拘，在氯醛醣淺麻(60mg/kg)下，氣管切開插管以備人工呼吸。按文獻135方法制成模型。在貓清醒狀態(tài)下。注射三磺季銨酚(5mg/kg)使動物無動化，人工呼吸，體溫保持在36-39°C條件下進行實驗觀察。首先用較強單一或雙脈沖刺激內(nèi)臟大神經(jīng)于P區(qū)內(nèi)尋找產(chǎn)生內(nèi)臟大神經(jīng)誘發(fā)放電的單位，找到后按1. 4-9g/kg的不同劑量靜脈注射丹參注射液，每隔3分鐘刺激一次內(nèi)臟大神經(jīng)，觀察丹參注射前后P發(fā)放電的變化。結(jié)果表明，丹參能抑制丘腦后核內(nèi)臟痛放電，但直接作用于神經(jīng)干不能阻斷其神經(jīng)興奮傳導(dǎo)、表明其鎮(zhèn)痛作用是中樞性的另有報道，清醒兔靜脈注射丹參4. 5g/kg后10-30分鐘，大腦皮層的自發(fā)電活動明顯減少。120分鐘才恢復(fù)。用較強的電刺激重復(fù)刺激兔大腦皮層，可以引起節(jié)律性的電活動，停止刺激后，電活動往往還可以延續(xù)數(shù)秒至數(shù)十分鐘(即后發(fā)放)。靜脈注射丹參后，電刺激引起后發(fā)放的閾值明顯升高，約50分鐘后恢復(fù)。用氯醛糖和脲酯..的兔，刺激一側(cè)大腦皮層體感覺運動區(qū)，在對側(cè)皮層對稱點單極記錄，得到一個大體上是先正后負的電反應(yīng)， 在刺激電極下或記錄電極下局部給丹參，都可使電反應(yīng)增大；由靜脈注射給藥，則電反應(yīng)的增大更為明顯。當靜脈注射小劑量丹參時，沒有出現(xiàn)明顯的作用，大劑量時才產(chǎn)生壓抑作用，以上實驗結(jié)果表明，丹參能使大腦皮層自發(fā)電活動振幅減小，重復(fù)刺激引起后發(fā)放閾值升高，單刺激大腦皮層出現(xiàn)的重復(fù)電反應(yīng)減少，在大腦皮層電活動振幅減h，對較高頻率的組分無明顯增加，所以此電活動減小不是去同步的結(jié)果。丹參具有抑制體外試驗中各組織的環(huán)腺苷酸磷酸二酯酶的活力，尤以大腦和肺和抑制最為敏感，推測大腦皮層的抑制作用， 可能是通過抑制環(huán)腺苷酸二酯酶的活力，增加環(huán)腺苷酸水平而實現(xiàn)的。從上述文獻報道表明，丹參及其有效成分丹酚酸B的藥理作用與復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片的臨床作用是相一致的。嚴格控制復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片中丹參有效成分的含量， 是保證產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵，所以為保證復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片的質(zhì)量和療效，增加丹酚酸B 的含量測定是非常有必要的。另外在現(xiàn)有國家食品藥品監(jiān)督管理局復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片試行標準中(WS-10001-(HD-1155)-2002，苯巴比妥含量測定方法為分光光度法，該方法經(jīng)過實際使用，發(fā)現(xiàn)測得的結(jié)果誤差較大。為此，我們發(fā)明了一種新的復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片檢測方法，即(1)采用高效液相色譜法測定復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片中苯巴比妥的含量； (2)采用高效液相色譜法測定復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片中丹酚酸B的含量。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片的檢測方法，(1)采用高效液相色譜法測定復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片中苯巴比妥的含量；(2)采用高效液相色譜法測定復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片中丹酚酸B的含量。本發(fā)明包括下列步驟(1)采用高效液相色譜法測定復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片中苯巴比妥的含量(a)供試品溶液制備取本品20片，精密稱定，研細，精密稱取相當于苯巴比妥 30mg的量，置50 150ml量瓶中，加40%甲醇溶液40 120ml，超聲處理10分鐘，功率 250W，頻率40kHz，加40%甲醇至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5ml，置50ml量瓶中，力口 40%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。(b)色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；檢測器為紫外檢測器； 以甲醇水=30 50 70 50為流動相；檢測波長為215nm，理論板數(shù)按苯巴比妥峰計算應(yīng)不低于3000 ；(c)對照品溶液制備取苯巴比妥對照品適量，精密稱定，用40%甲醇溶解并定量稀釋制成每Iml含苯巴比妥10 50 μ g的溶液，即得；(d)測定方法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μ 1，注入液相色譜儀，測定，按外標法計算，即得；(2)采用高效液相色譜法測定復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片中丹酚酸B的含量
(a)供試品溶液制備取本品20片，精密稱定，研細，取本品粉末1 2g，精密稱定，置50ml量瓶中，加入75%甲醇40ml，超聲30分鐘，功率250W，頻率40kHz，放冷，用75% 甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；(b)色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，檢測器為紫外檢測器， 以甲醇乙腈甲酸水=30 10 1 59為流動相；檢測波長為286nm，理論板數(shù)按丹酚酸B峰計算應(yīng)不低于3000 ；(c)對照品溶液制備取丹酚酸B對照品適量，加75%甲醇制成每Iml含0. 1 0. 2mg的溶液，即得；(d)測定方法分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20 μ 1，注入液相色譜儀，測定，按外標法計算，即得。本發(fā)明的一種實施方式是，包括如下步驟 (1)采用高效液相色譜法測定復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片中苯巴比妥含量的一種方式(a)供試品溶液制備取本品20片，精密稱定，研細，精密稱取相當于苯巴比妥 30mg的量，置IOOml量瓶中，加40%甲醇溶液80ml，超聲處理10分鐘，加40%甲醇至刻度， 搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5ml，置50ml量瓶中，加40%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。(b)色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；檢測器為紫外檢測器； 以甲醇水=40 60為流動相；檢測波長為215nm。理論板數(shù)按苯巴比妥峰計算應(yīng)不低于 3000。(c)對照品溶液制備取苯巴比妥對照品適量，精密稱定，用40%甲醇溶解并定量稀釋制成每Iml含苯巴比妥30 μ g的溶液，即得。(d)測定方法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μ 1，注入液相色譜儀，測定，按外標法計算，即得。(2)采用高效液相色譜法測定復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片中丹酚酸B含量的一種方式(a)供試品溶液制備取本品20片，精密稱定，研細，取本品粉末1. 5g，精密稱定， 置50ml量瓶中，加入75 %甲醇40ml，超聲30分鐘，放冷，用75 %甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，(b)色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；檢測器為紫外檢測器； 以甲醇乙腈甲酸水=30 10 1 59為流動相；檢測波長為286nm，理論板數(shù)按丹酚酸B峰計算應(yīng)不低于3000 ；(c)對照品溶液制備取丹酚酸B對照品適量，加75%甲醇制成每Iml含0. 15mg 的溶液，即得。(d)測定方法分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20 μ 1，注入液相色譜儀，測定，按外標法計算，即得。本發(fā)明方法學(xué)研究表明，采用高效液相色譜法測定本品中苯巴比妥含量和采用高效液相色譜法測定本品中丹酚酸B含量具有較好重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和精密度。本發(fā)明是通過大量試驗所得到的切實可行的方法，本方法具有操作簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好、易掌握的特點，達到了有效控制藥物質(zhì)量的發(fā)明目的。
具體實施方式
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，根據(jù)本發(fā)明所公開的技術(shù)內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員將很清楚本發(fā)明的其它實施方案，本發(fā)明實施例僅作為示例。在不違反本發(fā)明主旨及范圍的情況下，可對本發(fā)明進行各種改變和改進，但只要使用本發(fā)明所述的檢測方法，均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。實驗例1.復(fù)方苯巴比 妥溴化鈉片中苯巴比妥含量測定方法的建立1.1 方法1. 1. 1儀器與試劑LC-2010高效液相色譜儀；SPD-MlOAvp紫外檢測器；CLASS-VP工作站；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。1.1. 2 色譜條件色譜柱Diamonsil C18(4. 6mmX250mm)；甲醇-水(40 60)為流動相；檢測波長為215nm。理論板數(shù)按苯巴比妥峰計算應(yīng)不低于3000。1. 2.對照品的來源及純度苯巴比妥對照品，購自中國藥品生物制品檢定所，采用反相高效液相色譜法歸一化法標定，色譜條件同上，進樣量20μ 1，純度為99. 34%。1. 3.方法學(xué)考察1.3. 1流動相的選擇比較流動相(1)甲醇水=25 75 ； (2)甲醇水= 30 70 ；(3)甲醇水=40 60 ； (4)甲醇磷酸鹽緩沖液=40 60，結(jié)果流動相(3)、 (4)中苯巴比妥峰達到基線分離，分離度很好。但考慮到緩沖鹽污染色譜柱，故選用流動相甲醇水=40 60。1. 3. 2測定波長的選擇經(jīng)測定苯巴比妥對照品的紫外吸收光譜，最大吸收波長為 196nm，屬于末端吸收，在此波長處，基線嚴重漂移，參考2005版藥典苯巴比妥片的含量測定條件選擇215nm作為檢測波長。1. 3. 3系統(tǒng)適用性試驗根據(jù)上述確定的條件，得到苯巴比妥對照品及樣品的色譜圖，計算其理論塔板數(shù)N = 6579。1. 3. 4供試品提取條件的選擇試驗參考2005年版藥典苯巴比妥片的含量測定的樣品提取方法，分別采用純甲醇超聲提取30分鐘，40%甲醇超聲提取10分鐘、20分鐘、30 分鐘，40%甲醇回流提取30分鐘，結(jié)果見表1。表1不同提取方法的樣品含量測定
權(quán)利要求
1.一種復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片的檢測方法，其特征在于包括下列步驟(1)采用高效液相色譜法測定復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片中苯巴比妥的含量(a)供試品溶液制備取本品20片，精密稱定，研細，精密稱取相當于苯巴比妥30mg的量，置50 150ml量瓶中，加40%甲醇溶液40 120ml，超聲處理10分鐘，功率250W，頻率 40kHz，加40%甲醇至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5ml，置50ml量瓶中，加40%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得；(b)色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；檢測器為紫外檢測器；以甲醇水=30 50 70 50為流動相；檢測波長為215nm，理論板數(shù)按苯巴比妥峰計算應(yīng)不低于 3000 ；(c)對照品溶液制備取苯巴比妥對照品適量，精密稱定，用40%甲醇溶解并定量稀釋制成每Iml含苯巴比妥10 的溶液，即得；(d)測定方法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μ1，注入液相色譜儀，測定，按外標法計算，即得；(2)采用高效液相色譜法測定復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片中丹酚酸B的含量(a)供試品溶液制備取本品20片，精密稱定，研細，取本品粉末1 2g，精密稱定， 置50ml量瓶中，加入75%甲醇40ml，超聲30分鐘，功率250W，頻率40kHz，放冷，用75%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；(b)色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，檢測器為紫外檢測器，以甲醇乙腈甲酸水=30 101 :59為流動相；檢測波長為286nm，理論板數(shù)按丹酚酸B峰計算應(yīng)不低于3000 ；(c)對照品溶液制備取丹酚酸B對照品適量，加75%甲醇制成每Iml含0.1 0. 2mg 的溶液，即得；(d)測定方法分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20μ1，注入液相色譜儀，測定，按外標法計算，即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片檢測方法，其特征在于包括下列步驟(1)采用高效液相色譜法測定復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片中苯巴比妥含量的一種方式(a)供試品溶液制備取本品20片，精密稱定，研細，精密稱取相當于苯巴比妥30mg的量，置IOOml量瓶中，加40%甲醇溶液80ml，超聲處理10分鐘，加40%甲醇至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5ml，置50ml量瓶中，加40%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得；(b)色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；檢測器為紫外檢測器； 以甲醇水=40 60為流動相；檢測波長為215nm，理論板數(shù)按苯巴比妥峰計算應(yīng)不低于 3000 ；(c)對照品溶液制備取苯巴比妥對照品適量，精密稱定，用40%甲醇溶解并定量稀釋制成每Iml含苯巴比妥的溶液，即得；(d)測定方法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μ1，注入液相色譜儀，測定，按外標法計算，即得；(2)采用高效液相色譜法測定復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片中丹酚酸B含量的一種方式(a)供試品溶液制備取本品20片，精密稱定，研細，取本品粉末1.5g，精密稱定，置50ml量瓶中，加入75%甲醇40ml，超聲30分鐘，放冷，用75%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；(b)色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；檢測器為紫外檢測器；以甲醇乙腈甲酸水=30 10 1 :59為流動相；檢測波長為286nm，理論板數(shù)按丹酚酸B峰計算應(yīng)不低于3000 ；(c)對照品溶液制備取丹酚酸B對照品適量，加75%甲醇制成每Iml含0.15mg的溶液，即得； (d)測定方法分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20μ1，注入液相色譜儀，測定，按外標法計算，即得。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片的檢測方法，屬于中藥檢測領(lǐng)域。采用高效液相色譜法測定復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片中苯巴比妥的含量；采用高效液相色譜法測定復(fù)方苯巴比妥溴化鈉片中丹酚酸B的含量。這種方法具有操作簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好、易掌握的特點，達到了有效控制藥物質(zhì)量的發(fā)明目的。
文檔編號G01N30/02GK102323348SQ20111022270
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月4日
發(fā)明者于翠霞, 王旭佳, 蔡蕾 申請人:吉林省中研藥業(yè)有限公司