專利名稱:Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)用引物組及其檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)試劑,具體涉及一種Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)用引物組及其診斷試劑盒。
背景技術(shù):
孟山都公司于1994年研制的抗草甘膦品種大豆,轉(zhuǎn)化了來自于微生物 Agrobacterium tumefaciens的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(CP4 EPSPS)編碼基因,能夠抵抗除草劑草甘膦對(duì)莽草酸合成途徑的抑制,使轉(zhuǎn)基因大豆在噴灑除草劑之后能夠正常生長。該品種的受體是大豆品種A5403,轉(zhuǎn)基因大豆基因組中整合了外源的CP4 EPSPS基因、E35S啟動(dòng)子和NOS終止子。該品種是目前種植面積最大的轉(zhuǎn)基因大豆品種, 廣泛應(yīng)用在食用油和食品的加工生產(chǎn)當(dāng)中。為了加強(qiáng)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的監(jiān)督和管理,目前發(fā)展了多種轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)方法,從基于蛋白質(zhì)的ELISA檢測(cè)技術(shù)到基于核酸的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)以及快速發(fā)展的基因芯片技術(shù)。其中PCR檢測(cè)技術(shù)以其靈敏性、特異性、高效性而最為通用,這種技術(shù)通過檢測(cè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中含有的外源核酸片段來鑒定,隨著熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time PCR)的出現(xiàn),不僅能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定性鑒定,而且可以對(duì)轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行定量。以PCR技術(shù)為代表的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中也存在一些問題,如普通PCR技術(shù)需要專門的儀器,而且存在容易交叉污染和操作過程煩瑣的缺點(diǎn)。而Real time PCR技術(shù)雖然較好地解決了交叉污染的問題,并簡(jiǎn)化了操作過程,但卻需要更復(fù)雜的定量測(cè)定儀器,因此不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。而且實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)中熒光探針的成本較高,加大了推廣應(yīng)用的難度。基因芯片技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)快速和高通量的檢測(cè),然而價(jià)格昂貴,檢測(cè)成本高。所以及時(shí)運(yùn)用生物技術(shù)發(fā)展的最新成果對(duì)滿足轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)要求的不斷提高具有重要意義。其中等溫?cái)U(kuò)增(Isothermal Amplification)核酸快速檢測(cè)技術(shù)是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)上的長足進(jìn)步,現(xiàn)已建立起來的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) (loop-mediated isothermal amplication of DNA,簡(jiǎn)稱 LAMP)具有很多的優(yōu)越性,且目前也未見有用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆快速診斷試劑盒。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種對(duì)可用于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆EPSPS-N0S基因,且對(duì)該EPSPS-N0S基因具有高特異性的檢測(cè)用引物組。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種檢測(cè)成本低、使用方便、檢測(cè)速度快、特異性高的基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的轉(zhuǎn)基因大豆快速診斷試劑盒。本發(fā)明的上述目的是通過如下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的
一、本發(fā)明的Roundup Ready轉(zhuǎn)基因檢測(cè)用引物組,是基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),根據(jù)已公開的Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆EPSPS -NOS基因序列,選取Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆EPSPS-N0S基因的特異性序列,然后分析設(shè)計(jì)出的,能專一性鑒別Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆EPSPS-N0S基因的特異性引物組,通過LAMP法來鑒定Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆 EPSPS-N0S基因,該EPSPS-N0S基因引物組由如下四條引物組成 外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示; 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示; 內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示; 內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示; 或者,
外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示; 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示; 內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示; 內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示; 或者,
外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示; 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示; 內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示; 內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示; 或者,
外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示; 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:12所示; 內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:13所示; 內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:14所示; 或者,
外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:15所示; 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:16所示; 內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:17所示; 內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:18所示。
二、本發(fā)明的大豆內(nèi)源性基因lectin基因檢測(cè)用引物組,是基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),根據(jù)已公開的lectin基因序列,選取lectin基因的特異性序列,然后分析設(shè)計(jì)出的, 通過LAMP法來鑒定lectin基因,該內(nèi)源性基因lectin引物組由如下四條引物組成 外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:19所示; 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:20所示; 內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:21所示; 內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:22所示; 或者,
外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:23所示; 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:24所示; 內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:25所示;內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。三、本發(fā)明的Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆快速診斷試劑盒,是由EPSPS-N0S基因引物、lectin基因引物、feiDNA聚合酶、反應(yīng)液、穩(wěn)定液、顯色液和陽性對(duì)照液組成,以上七種液體分別置于容器中,其中
上述每 IL 反應(yīng)液中含有 1. 6 2mmol dNTP、20 25mmol Tris-HCl、10 12. 5mmol 氯化鉀、10 12. 5mmol 硫酸銨、8 IOmmol 硫酸鎂、1 1. 25ml TritonX_100、0. 8 Imol 甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各1. 6 2mol和外引物F3/B3各0. 2 0. 25mol ;優(yōu)選的比例是每 IL 反應(yīng)液中含有 2mmol dNTP、25mmol Tris-HCl、12. 5mmol 氯化鉀、12. 5mmol 硫酸銨、 IOmmol 硫酸鎂、1. 25ml TritonX-IOOUmol 甜菜堿、內(nèi)引物 FIP/BIP 各 2mol 和外引物 F3/ B3 各 0. 25moL·上述顯色液優(yōu)選為熒光染料STOR Green I或EvaGreen。
上述穩(wěn)定液優(yōu)選為石蠟油。上述陽性對(duì)照為EPSPS-N0S基因DNA片段。四、本發(fā)明基因快速診斷試劑盒的生產(chǎn)工藝
1、分別將EPSPS-N0S基因和lectin基因內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后, 定量配制,濃度檢測(cè),抽樣質(zhì)檢;
2、將反應(yīng)液無菌分裝,并按照實(shí)驗(yàn)用進(jìn)行濃度確定,抽樣質(zhì)檢;
3、將穩(wěn)定液無菌分裝,抽樣質(zhì)檢;
4、將陽性對(duì)照標(biāo)本制備,分裝,抽樣質(zhì)檢;
5、組裝試劑盒。五、本發(fā)明基因快速診斷試劑盒的檢測(cè)方法 1、樣品處理
待測(cè)樣品中DNA的提取和含量測(cè)定按國標(biāo)按照GB/T 19495. 3-2004中的規(guī)定執(zhí)行。對(duì)樣品進(jìn)行DNA提取時(shí)要保證DNA的質(zhì)量和濃度的穩(wěn)定,以保證PCR反應(yīng)的可重復(fù)性。要確保提取的DNA片段大于擴(kuò)增片段。2、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)過程
在反應(yīng)管中加入反應(yīng)液38 40體積%,Bst DNA聚合酶大片段0. 9 1. 8體積%,穩(wěn)定液52 54. 5體積%,樣品模板DNA 4. 5 9體積%,63 65°C恒溫反應(yīng)45 90min。 所述體積百分比是指占四個(gè)組分總體積的體積百分比。3、反應(yīng)后處理
在上述反應(yīng)管和陽性對(duì)照組中分別加入顯色液,混勻,樣品組顯色與對(duì)照組相同則為陽性,否則為陰性。本發(fā)明的原理是利用feiDNA聚合酶和根據(jù)靶基因序列設(shè)計(jì)的兩對(duì)特殊的內(nèi)、外引物(即內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3),特異性識(shí)別靶序列上的六個(gè)獨(dú)立區(qū)域,啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng),在靶標(biāo)DNA區(qū)啟動(dòng)互補(bǔ)鏈合成,結(jié)果在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物。LAMP反應(yīng)過程中,從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合,產(chǎn)生副產(chǎn)物——焦磷酸鎂乳白色沉淀,即可通過肉眼觀察判定結(jié)果。LAMP反應(yīng)是在恒溫(63 65 °C )條件下45 90分鐘內(nèi)完成。這種比較溫和的溫度條件以及沒有溫度循環(huán)使所需儀器簡(jiǎn)單化,克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測(cè)時(shí)間長、容易污染及檢測(cè)成本高等缺點(diǎn)。此外,這種檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)人員的技術(shù)素質(zhì)要求較低,實(shí)際操作極為簡(jiǎn)便,不需要特殊的試劑和儀器設(shè)備,有利于建立成本低廉的快速篩選體系。LAMP法是一種簡(jiǎn)便、快速、高度特異性的基因擴(kuò)增法。將恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)與PCR技術(shù)(包括熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù))進(jìn)行比較,可以發(fā)現(xiàn)該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測(cè)范圍等方法學(xué)指標(biāo)上相當(dāng)于或優(yōu)于PCR技術(shù),且不依賴任何專門的儀器設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè),而且檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR技術(shù)。國內(nèi)目前尚未有這方面的試劑盒出售。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有如下有益效果
1.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒只需一個(gè)恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng),不需要特殊試劑與設(shè)備,檢測(cè)成本低;
2.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒應(yīng)用六個(gè)區(qū)段,四條引物,根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷靶標(biāo)物質(zhì)的存在與否,因此具有高特異性;
3.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒擴(kuò)增快速且高效,在不到1小時(shí)即可完成擴(kuò)增,且產(chǎn)
率尚;
4.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒靈敏度高,擴(kuò)增模板僅需10拷貝或更少;
5.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒鑒定簡(jiǎn)便,從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合,產(chǎn)生副產(chǎn)物一焦磷酸鎂沉淀,可通過肉眼觀察鑒定,并且加入顯色液后,陰陽性結(jié)果顯色差異顯著,驗(yàn)證率高,更加明顯可靠。
圖1為試劑盒特異性檢測(cè)結(jié)果圖(目的基因EPSPS-N0S); 圖2為試劑盒特異性檢測(cè)結(jié)果圖(目的基因lectin);
其中,1為TE緩沖液,2為ddH20,3為油菜非轉(zhuǎn)基因樣品DNA,4為玉米非轉(zhuǎn)基因樣品 DNA,5為大米非轉(zhuǎn)基因樣品DNA,6為大豆非轉(zhuǎn)基因樣品DNA,7為50ng大豆轉(zhuǎn)基因樣品 DNA, 8為IOOng大豆轉(zhuǎn)基因樣品DNA,9為250ng大豆轉(zhuǎn)基因樣品DNA。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地闡述,但具體實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何限定。實(shí)施例1 Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆快速診斷試劑盒的制備 (1)按以下序列經(jīng)DNA合成儀合成EPSPS-N0S基因引物 外引物F3,其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示;
外引物B3,其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示; 內(nèi)引物FIP,其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示; 內(nèi)引物BIP,其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。(2)按以下序列經(jīng)DNA合成儀合成lectin基因引物 外引物F3,其核苷酸序列如SEQ ID NO: 19所示; 外引物B3,其核苷酸序列如SEQ ID N0:20所示; 內(nèi)引物FIP,其核苷酸序列如SEQ ID N0:21所示; 內(nèi)引物BIP,其核苷酸序列如SEQ ID N0:22所示。
(3)購置DNA聚合酶-.Bst DNA polymerase (大片段),置于容器。(4)分別配制EPSPS-N0S基因和lectin基因反應(yīng)液反應(yīng)液的配方按每IL溶液含有 2mmol dNTP、25mmol Tris-Cl、12. 5mmol 氯化鉀、12. 5mmol 硫酸銨、IOmmol 硫酸鎂、 1. 25ml TritonX-IOOUmol 甜菜堿、內(nèi)引物 FIP/BIP 各 2mol 和外引物 F3/B3 各 0. 25mol 配
制,置于容器。(5)購置穩(wěn)定液石蠟油,置于容器。(6)購置顯色液STOR Green I,置于容器。(7)提取陽性對(duì)照制備EPSPS基因DNA片段分別置于容器。(8)將上述6個(gè)容器裝成試劑盒,封裝。制備工藝簡(jiǎn)述如下
1、將內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后,定量配制,濃度檢測(cè),抽樣質(zhì)檢;
2、將反應(yīng)液無菌分裝,并按照實(shí)驗(yàn)用進(jìn)行濃度確定,抽樣質(zhì)檢;
3、將穩(wěn)定液分裝,抽樣質(zhì)檢;
4、將陽性對(duì)照標(biāo)本制備,分裝,抽樣質(zhì)檢;
5、組裝試劑盒。實(shí)施例2 Roundup ready轉(zhuǎn)基因大豆快速診斷試劑盒的制備 EPSPS-N0S基因兩對(duì)引物為
外引物F3,其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示; 外引物B3,其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示; 內(nèi)引物FIP,其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示; 內(nèi)引物BIP,其核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示。Lectin基因兩對(duì)引物為
外引物F3,其核苷酸序列如SEQ ID N0:23所示; 外引物B3,其核苷酸序列如SEQ ID N0:24所示; 內(nèi)引物FIP,其核苷酸序列如SEQ ID N0:25所示; 內(nèi)引物BIP,其核苷酸序列如SEQ ID N0J6所示。反應(yīng)液的配方為每IL反應(yīng)液中含有1. 6mmol dNTP、20mmol Tris-HCl、IOmmol氯化鉀、IOmmol硫酸銨、8mmol硫酸鎂、Iml TritonX-IOO,0. 8mol甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各 1. 6mol 和外引物 F3/B3 各 0. 2mol ;
顯色液為EvaGreen0其他同實(shí)施例1。實(shí)施例3 Roundup ready轉(zhuǎn)基因大豆快速診斷試劑盒的制備 EPSPS-N0S基因兩對(duì)引物為
外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示; 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示; 內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示; 內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示; Lectin基因兩對(duì)引物為 外引物F3,其核苷酸序列如SEQ ID N0:23所示;外引物B3,其核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示; 內(nèi)引物FIP,其核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示; 內(nèi)引物BIP,其核苷酸序列如SEQ ID N0J6所示。反應(yīng)液的配方為每IL反應(yīng)液中含有2mmol dNTP、25mmol iTris_HCl、Ilmmol氯化鉀、12mmol 硫酸銨、9mmol 硫酸鎂、1. 25 ml TritonX-IOOU mol 甜菜堿、內(nèi)引物 FIP/BIP 各 2mol 和外引物 F3/B3 各 0. 25mol ;
顯色液為EvaGreen0其他同實(shí)施例1。實(shí)施例4 Roundup ready轉(zhuǎn)基因大豆快速診斷試劑盒的制備 EPSPS-N0S基因兩對(duì)引物為
外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示; 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:12所示; 內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:13所示; 內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:14所示; Lectin基因兩對(duì)引物為 外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:19所示; 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:20所示; 內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:21所示; 內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:22所示。反應(yīng)液的配方為每IL反應(yīng)液中含有1. 6mmol dNTP、22mmol Tris-HCl、IOmmol氯化鉀、IOmmol硫酸銨、8mmol硫酸鎂、Iml TritonX-IOO,0. 8mol甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各 1. 6mol 和外引物 F3/B3 各 0. 2mol ;
顯色液為EvaGreen0其他同實(shí)施例1。實(shí)施例5 Roundup ready轉(zhuǎn)基因大豆快速診斷試劑盒的制備 EPSPS-N0S基因兩對(duì)引物為
外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:15所示; 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:16所示; 內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:17所示; 內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:18所示。Lectin基因兩對(duì)引物為
外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:23所示; 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:24所示; 內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:25所示; 內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:26所示。反應(yīng)液的配方為每IL反應(yīng)液中含有1. 6mmol dNTP、21mmol Tris-HCl、IOmmol氯化鉀、IOmmol硫酸銨、8mmol硫酸鎂、Iml TritonX-IOO,0. 8mol甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各 1. 6mol 和外引物 F3/B3 各 0. 2mol ;
顯色液為EvaGreen0
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其他同實(shí)施例1。實(shí)施例6 Roundup ready轉(zhuǎn)基因大豆快速診斷試劑盒的應(yīng)用
本實(shí)施例采用實(shí)施例1制備的Roundup ready轉(zhuǎn)基因大豆快速診斷試劑盒進(jìn)行待測(cè)樣品中的快速診斷。1、樣品處理(模板DNA提取)
1)將IOOmg經(jīng)預(yù)處理的試樣,在液氮中充分研磨成粉末后加人700μ L CTAB提取緩沖
液I中(不需研磨的試樣直接加入),振蕩后混勻,65°C保溫30 min,其間不時(shí)輕緩顛倒混勻 2-3 次。2)加人700μ L三氯甲烷-異戊醇,輕緩顛倒混勻溶液2_3次。12000g離心5 min
至分相。3)將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中,加人0.6倍體積的4°C預(yù)冷的異丙醇, 于-20°C靜置 5min,12 000 g 離心 5 min。4)棄上清液,加入IOOOPL 70%乙醇,輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管,4°C下8000g離心1 min, 棄上清液后,再加入20μ L Rnase A酶(10μ g /μ L),37°C溫浴30min。5)加入600μ 氯化鈉溶液,65°C溫浴lOmin。加入600μ 三氯甲烷-Tris飽和酚, 顛倒混勻后,12000g離心5 min,轉(zhuǎn)移上清液至1. 5mL離心管中。6)加人0. 6倍體積的4°C預(yù)冷的異丙醇,于4°C靜置30min,12 000 g離心10 min,
棄去上清液。7)加入1000 μ 4°C預(yù)冷70%乙醇,輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管,4°C下12 000 g離心10 min,
棄上清液。重復(fù)一次操作。室溫下?lián)]發(fā)液體。8)沉淀干燥后,加入50μ TE緩沖液充分溶解DNA,_20°C保存?zhèn)溆谩?、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的反應(yīng)過程
1)在200μ 反應(yīng)管配制反應(yīng)體系反應(yīng)液22PL,fei DNA聚合酶0. 5PL(4U),模板DNA 2. 5μ 。2)將配制好的反應(yīng)管于64°C恒溫反應(yīng)lh。3、反應(yīng)后處理
向上述PCR反應(yīng)產(chǎn)物中加入2PL SYBR Green I,混勻,同時(shí)也向陽性對(duì)照管中加入STOR Green I混勻,若反應(yīng)管與對(duì)照管一樣顯現(xiàn)綠色則為陽性,若反應(yīng)管顯現(xiàn)橙色則為陰性。實(shí)施例7 Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆快速診斷試劑盒的特異性驗(yàn)證
本實(shí)施例采用實(shí)施例2制備的Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆快速診斷試劑盒進(jìn)行試劑盒的特異性檢測(cè)。采用實(shí)施例2制備的Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆快速診斷試劑盒,分別對(duì)大豆轉(zhuǎn)基因樣品、大豆非轉(zhuǎn)基因樣品、油菜非轉(zhuǎn)基因樣品、玉米非轉(zhuǎn)基因樣品、大米非轉(zhuǎn)基因樣品、 ddH20和TE緩沖液進(jìn)行擴(kuò)增,非轉(zhuǎn)基因樣品DNA分別加入250ng,大豆轉(zhuǎn)基因樣品DNA分別加入250ng、IOOng和50ng,每個(gè)樣品設(shè)置2個(gè)重復(fù)。反應(yīng)體系為反應(yīng)液22Pl、feiDNA聚合酶0. 5μ1、穩(wěn)定液30μ1和DNA模板2. 5μ1。反應(yīng)程序金屬浴中65°C,1小時(shí)。反應(yīng)完畢后加入顯色液2. Ομ ,觀察結(jié)果,如表1、表2和圖1、圖2所示。
表1試劑盒特異性檢測(cè)結(jié)果(目的基因EPSPS-N0S)
-t¥lS名警爾2SOng大里特基Hl羊ιβ DNAPFICKMg大豆_基因3I羊晶DNAPP50iig大豆轉(zhuǎn)基因 羊S DNAPP大豆DMA NN大米_轉(zhuǎn)基因樣品DNA NN玉基因祥S DNANN油菜非轉(zhuǎn)基因樣S DNA NNCkIH2O TE緩沖概 ]M
上述表1中,P代表擴(kuò)增陽性;N代表擴(kuò)增陰性。
表2試劑盒特異性檢測(cè)結(jié)果(目的基因lectin)
上述表2中,P代表擴(kuò)增陽性;N代表擴(kuò)增陰性。
從表1的結(jié)果可以看出,在含有50ng、IOOng和250ng大豆轉(zhuǎn)基因樣品DNA的反應(yīng)中能夠擴(kuò)增出EPSPS-N0S基因的產(chǎn)物,呈現(xiàn)擴(kuò)增陽性,而在含有大豆非轉(zhuǎn)基因樣品DNA、大米非轉(zhuǎn)基因樣品DNA和油菜非轉(zhuǎn)基因DNA以及ddH20和TE中都不能擴(kuò)增出產(chǎn)物,呈現(xiàn)擴(kuò)增陰性,由此說明,本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因作物EPSPS-N0S基因快速診斷試劑盒具有高特異性,能夠正確的鑒定出轉(zhuǎn)基因大豆樣品。從表二的結(jié)果可以看出,在大豆轉(zhuǎn)基因樣品DNA和大豆非轉(zhuǎn)基因樣品DNA的反應(yīng)中均能擴(kuò)增出lectin基因的產(chǎn)物,呈現(xiàn)擴(kuò)增陽性,說明無假陰性的存在,確保結(jié)果的可靠性。
權(quán)利要求
1.一種Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)用的EPSPS-N0S基因引物組,其特征在于,由外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP和內(nèi)引物BIP組成,其中外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示; 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示; 內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示; 內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示; 或者,外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示; 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示; 內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示; 內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示; 或者,外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示; 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示; 內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示; 內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示; 或者,外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示; 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 12所示; 內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO: 13所示; 內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO: 14所示; 或者,外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 15所示; 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 16所示; 內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO: 17所示; 內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO: 18所示。
2.—種Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)用的內(nèi)源性基因lectin引物組,其特征在于, 由外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP和內(nèi)引物BIP組成,其中外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 19所示; 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示; 內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0:21所示; 內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示; 或者,外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示; 外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 24所示; 內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示; 內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。
3.一種Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆快速檢測(cè)試劑盒,其特征在于該試劑盒由權(quán)利要求1所述EPSPS-N0S基因引物組、權(quán)利要求2所述內(nèi)源性基因lectin引物組、fei DNA聚合酶、反應(yīng)液、穩(wěn)定液、顯色液和陽性對(duì)照液組成,以上七種液體分別置于容器中,其中,所述反應(yīng)液的配方為每IL反應(yīng)液中含有1. 6 2mmol dNTP、20 25mmol Tris-HClUO 12. 5mmol 氯化鉀、10 12. 5mmol 硫酸銨、8 IOmmol 硫酸鎂、1 1. 25ml TritonX-100、 0.8 Imol甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各1. 6 2mol和外引物F3/B3各0. 2 0. 25mol ;所述陽性對(duì)照為EPSPS-N0S基因DNA片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速檢測(cè)試劑盒,其特征在于所述的顯色液為STORGreen I 或 EvaGreen0
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速檢測(cè)試劑盒,其特征在于所述每IL反應(yīng)液中含有 2mmol dNTP、25mmol Tris-HCl,12. 5mmol 氯化鉀、12. 5mmol 硫酸銨、IOmmol 硫酸鎂、1. 25ml TritonX-IOOUmol 甜菜堿、內(nèi)引物 FIP/BIP 各 2mol 和外引物 F3/B3 各 0. 25mol。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速檢測(cè)試劑盒,其特征在于所述穩(wěn)定液為石蠟油。
全文摘要
本發(fā)明公開Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)用引物組及其檢測(cè)試劑盒。本試劑盒由引物組、BstDNA聚合酶、穩(wěn)定液、反應(yīng)液、顯色液和陽性對(duì)照液組成,該試劑盒應(yīng)用六個(gè)區(qū)段,四條引物,根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷靶標(biāo)物質(zhì)的存在與否,具有高特異性。本發(fā)明的快速診斷試劑盒快速、高效、靈敏度高,只需一個(gè)恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng),不需要特殊試劑與設(shè)備,檢測(cè)成本低,而且鑒定簡(jiǎn)便,從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合,產(chǎn)生副產(chǎn)物—焦磷酸鎂沉淀,可通過肉眼觀察鑒定,加入顯色液后,陰陽性結(jié)果顯色差異顯著,更加明顯可靠。采用了大豆內(nèi)源性基因lectin作為內(nèi)標(biāo),避免核酸提取造成的誤差及假陰性的產(chǎn)生,實(shí)行了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),大大節(jié)省檢測(cè)時(shí)間,節(jié)約人力物力。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102337331SQ20111020846
公開日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2011年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月25日
發(fā)明者曹以誠, 李志勇, 杜正平, 茅麗娜, 陳洵, 高東微 申請(qǐng)人:廣州華峰生物科技有限公司