專利名稱：一種綿羊支原體肺炎抗性基因型的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體說是涉及一種綿羊支原體肺炎抗性基因型的篩選方法。
背景技術(shù)：
綿羊支原體性肺炎又稱綿羊傳染性胸膜肺炎的病原，是一種由綿羊肺炎支原體 (Mycoplasma ovipneumoniae,MO)所引起的以咳嗽、喘氣、漸進性消瘦以及肺間質(zhì)增生性炎癥為特征的呼吸道疾病，本病的直接損失是羔羊死亡率增加、疾病監(jiān)測治療的費用提高；間接損失主要是疾病的慢性營養(yǎng)消耗、體重減輕、上市推遲、繁殖力降低等。因此從抗病育種的角度，通過研究MBL基因多態(tài)性與疾病的相關(guān)性，采用PCR-SSCP技術(shù)研究其MBL基因外顯子和內(nèi)含子的遺傳多態(tài)性，并統(tǒng)計分析MBL基因不同的基因型與湖羊血清MBL水平的相關(guān)性，尋找抗性型與易感型個體，為研究綿羊MBL基因的多態(tài)性與疾病的關(guān)系奠定堅實的基礎(chǔ)，對合理開發(fā)利用新疆地方綿羊品種遺傳資源以及引進新品種具有重要的現(xiàn)實意義；MBL存在于人及動物的血液和肝臟組織中，是一種重要的天然免疫防御分子，MBL 能直接介導(dǎo)調(diào)理吞噬作用或通過MBL途徑激活補體，在機體先天性免疫防御、免疫監(jiān)視和免疫復(fù)合物清除中起重要作用。MBL生物學(xué)功能的實現(xiàn)有賴于其完整的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，MBL結(jié)構(gòu)基因突變影響了蛋白多聚體的功能性和穩(wěn)定性，使得MBL血清濃度明顯降低，機體的免疫防御和監(jiān)視能力削弱，導(dǎo)致機體對多種病原的易感。研究表明編碼區(qū)上游(主要是外顯子1、2)的點突變則會影響血清MBL檢測濃度，而內(nèi)含子區(qū)域的突變可能影響轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致功能區(qū)翻譯不全，使得MBL的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因此MBL基因外顯子和內(nèi)含子的多態(tài)性與 MBL的表達(dá)水平具有一定的相關(guān)性，為進一步選育綿羊支原體肺炎抗性基因型個體奠定實驗基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是以常發(fā)病綿羊支原體肺炎為疾病模型，實驗證實該病與MBL多態(tài)性及血清水平有相關(guān)性，并提供綿羊MBL基因與MBL水平相關(guān)的21種基因型和各自的突變位點，分析了綿羊MBL基因外顯子1、4和內(nèi)含子1、2的多態(tài)性，通過測序找到他們的突變位點，并經(jīng)過EILSA檢測發(fā)現(xiàn)這些位點的突變對綿羊支原體肺炎的抗性是有意義的，最后用人工感染的方法進行了驗證的一種綿羊支原體肺炎抗性基因型的篩選方法，以克服上述不足。本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種綿羊支原體肺炎抗性基因型的篩選方法，其特征是綿羊支原體肺炎抗性基因多態(tài)性分析及篩選，具體篩選包括以下方法(1)樣品采集和綿羊基因組DNA的提??；(2)對MBL外顯子1和4、內(nèi)含子1和2逐段進行多態(tài)性分析，設(shè)計了 7對引物， 進行PCR擴增，篩選出與MBL水平相關(guān)的基因型21種，其中外顯子1上有4種基因型，即AA、BB、CC和BC型，含5個突變位點，分別位于第27、41、43、83、105位點，其中g(shù). 27T > C 和 gl05C > T 為同義突變，g41T > A (Val 14 Glu)，g43G > A (Val 15 Met)，g83A > G(Glu28 Gly) 3處為錯義突變；外顯子4上有3種基因型，即GG、GH和HH型，含5個突變位點，分別位于第 3235、3243、3257、3331、3334 位點，其中 g. 3235T > C，g. 3331C > T，g. 3334C > T 為同義突變，g. 3243A>G(Glu 181 Gly)，g. 3257G > A (Gly 186 Ser) 2 處為錯義突變；內(nèi)含子 1上有3種基因型，含AA、BB、AB型，1個突變位點，位于第288位點；內(nèi)含子2上有11種基因型，包括PP、OP、CC、CD、DD、EE、EF、FF、GG、GH、HH型，含3個突變位點，分別位于第1091、 1096、1784位點，均為同義突變位點；(3)進行綿羊支原體肺炎EILSA抗體水平檢測，以外顯子1的多態(tài)性分析為基礎(chǔ)， 對同一基因型綿羊支原體肺炎陰性和陽性不同個體進行差異顯著性分析，篩選出綿羊支原體肺炎抗性基因型和易感性基因型；(4)以外顯子1的多態(tài)性分析為基礎(chǔ)，篩選出中國美利奴羊四種不同MBL基因型， 即BB型、BC型、CC型和DD型各9只，建立供試群體，EILSA檢測群體MBL水平，結(jié)果顯示 CC型MBL血清水平最高，BB、BC次之，DD型MBL血清水平最低，預(yù)測CC型為抗性組，DD型為易感組，人工感染綿羊肺炎支原體，結(jié)果抗性組中發(fā)病2只，未發(fā)病7只；易感組中發(fā)病7 只，未發(fā)病2只，對照組均未發(fā)病，BC組中發(fā)病5只，未發(fā)病5只；BB組中發(fā)病5只，未發(fā)病 4只，表明抗性組綿羊支原體肺炎的感染率顯著低于易感組。本發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明以綿羊支原體肺炎為疾病模型，從補體角度入手，通過對綿羊自身MBL基因的研究，研究發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性與綿羊支原體的抗性緊密相關(guān)，預(yù)測MBL基因為綿羊支原體肺炎抗性性狀的候選基因，可作為選育高抗性綿羊的分子標(biāo)記，并能快速、準(zhǔn)確地建立抗綿羊支原體肺炎新品系，同時，本發(fā)明也可為該疾病的治療提供新的思路，MBL作為廣泛參與多種疾病免疫途徑的重要因素，該發(fā)明為其它疾病研究提供借鑒，因此通過PCR-SSCP篩選得到的基因型和多態(tài)位點對綿羊支原體肺炎的抗病育種有一定意義，對合理開發(fā)利用新疆地方綿羊品種遺傳資源以及引進新品種具有重要的現(xiàn)實意義。
圖1是本發(fā)明綿羊全血基因組DNA提取結(jié)果圖；圖2是本發(fā)明湖羊MBL基因外顯子1的PCR-SSCP電泳圖；圖3是本發(fā)明湖羊MBL基因外顯子4的PCR-SSCP電泳圖；圖4是本發(fā)明弓丨物對③PCR擴增產(chǎn)物的SSCP分析圖；圖5是本發(fā)明引物對④PCR擴增產(chǎn)物的SSCP分析圖；圖6是本發(fā)明弓丨物對⑤PCR擴增產(chǎn)物的SSCP分析圖；圖7是本發(fā)明弓丨物對⑥PCR擴增產(chǎn)物的SSCP分析圖；圖8是本發(fā)明弓丨物對⑦PCR擴增產(chǎn)物的SSCP分析圖。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步描述，
具體實施例方式實施例檢測各個樣本的基因型，篩選出和我們測到的抗性型基因一致的個體進行育種，淘汰易感性基因型個體，以徹底從遺傳水平上消滅支原體肺炎。如圖1-圖8所示，一種綿羊支原體肺炎抗性基因型的篩選方法，其特征是由綿羊支原體綿羊肺炎抗性基因提取篩選，具體篩選包括以下方法和步驟(1)樣品采集和綿羊基因組DNA的提取；(2)對MBL外顯子1和4、內(nèi)含子1和2逐段進行多態(tài)性分析，設(shè)計了 7對引物， 進行PCR擴增，篩選出與MBL水平相關(guān)的基因型21種，其中外顯子1上有4種基因型，即 AA、BB、CC和BC型，含5個突變位點，分別位于第27、41、43、83、105位點，其中g(shù). 27T > C 和 gl05C > T 為同義突變，g41T > A (Val 14 Glu)，g43G > A (Val 15 Met)，g83A > G(Glu28 Gly) 3處為錯義突變；外顯子4上有3種基因型，即GG、GH和HH型，含5個突變位點，分別位于第 3235、3243、3257、3331、3334 位點，其中 g. 3235T > C，g. 3331C > T，g. 3334C > T 為同義突變，g. 3243A>G(Glu 181 Gly)，g. 3257G > A (Gly 186 Ser) 2 處為錯義突變；內(nèi)含子 1上有3種基因型，含AA、BB、AB型，1個突變位點，位于第288位點；內(nèi)含子2上有11種基因型，包括PP、OP、CC、CD、DD、EE、EF、FF、GG、GH、HH型，含3個突變位點，分別位于第1091、 1096、1784位點，均為同義突變位點；(3)進行綿羊支原體肺炎EILSA抗體水平檢測，以外顯子1的多態(tài)性分析為基礎(chǔ)， 對同一基因型綿羊支原體肺炎陰性和陽性不同個體進行差異顯著性分析，篩選出綿羊支原體肺炎抗性基因型和易感性基因型；(4)以外顯子1的多態(tài)性分析為基礎(chǔ)，篩選出中國美利奴羊四種不同MBL基因型， 即BB型、BC型、CC型和DD型各9只，建立供試群體，EILSA檢測群體MBL水平，結(jié)果顯示 CC型MBL血清水平最高，BB、BC次之，DD型MBL血清水平最低，預(yù)測CC型為抗性組，DD型為易感組，人工感染綿羊肺炎支原體，結(jié)果抗性組中發(fā)病2只，未發(fā)病7只；易感組中發(fā)病7 只，未發(fā)病2只，對照組均未發(fā)病，BC組中發(fā)病5只，未發(fā)病5只；BB組中發(fā)病5只，未發(fā)病 4只，表明抗性組綿羊支原體肺炎的感染率顯著低于易感組；材料和方法實驗動物選擇新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團農(nóng)九師某羊場，隨機采集血樣105只，所采血樣提取基因組DNA，引物設(shè)計及PCR擴增，引物設(shè)計利用 Primer premier5. 0 軟件，參照 Genbank 中的綿羊 MBL 基因序列(Accession No. FJ977629)設(shè)計2個外顯子和2個內(nèi)含子如下引物(表1)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。表1 MBL基因外顯子和內(nèi)含子引物序列信息Table 1 Primer sequences Information of MBL exon and intron Gene
權(quán)利要求
1. 一種綿羊支原體肺炎抗性基因型的篩選方法，其特征是綿羊支原體肺炎抗性基因的多態(tài)性分析及提取篩選，具體篩選包括以下方法(1)樣品采集和綿羊基因組DNA的提取；(2)對MBL外顯子1和4、內(nèi)含子1和2逐段進行多態(tài)性分析，設(shè)計了7對引物，進行PCR 擴增，篩選出與MBL水平相關(guān)的基因型21種，其中外顯子1上有4種基因型，即AA、BB、CC 和BC型，含5個突變位點，分別位于第27、41、43、83、105位點，其中g(shù). 27T > C ^P gl05C > T 為同義突變，g41T > A、Vall4 Glu，g43G > A、Vall5 Met, g83A > G,Glu28 Gly3 處為錯義突變；外顯子4上有3種基因型，即GG、GH和HH型，含5個突變位點，分別位于第3235、 3243,3257,3331,3334 位點，其中 g. 3235T > C, g. 3331C > T, g. 3334C > T 為同義突變， g. 3243A > G、Glu 181 Gly, g. 3257G > A、Gly 186 Ser,2 處為錯義突變；內(nèi)含子 1 上有 3 種基因型，含AA、BB、AB型，1個突變位點，位于第288位點；內(nèi)含子2上有11種基因型，包括 PP> OP、CC、CD、DD、EE、EF、FF、GG、GH、HH 型，含 3 個突變位點，分別位于第 1091、1096、1784 位點，均為同義突變位點；(3)進行綿羊支原體肺炎EILSA抗體水平檢測，以外顯子1的多態(tài)性分析為基礎(chǔ)，對同一基因型綿羊支原體肺炎陰性和陽性不同個體進行差異顯著性分析，篩選出綿羊支原體肺炎抗性基因型和易感性基因型；(4)以外顯子1的多態(tài)性分析為基礎(chǔ)，篩選出中國美利奴羊四種不同MBL基因型，即BB 型、BC型、CC型和DD型各9只，建立供試群體，EILSA檢測群體MBL水平，結(jié)果顯示CC型 MBL血清水平最高，BB,BC次之，DD型MBL血清水平最低，預(yù)測CC型為抗性組，DD型為易感組，人工感染綿羊肺炎支原體，結(jié)果抗性組中發(fā)病2只，未發(fā)病7只；易感組中發(fā)病7只，未發(fā)病2只，對照組均未發(fā)病，BC組中發(fā)病5只，未發(fā)病5只；BB組中發(fā)病5只，未發(fā)病4只， 表明抗性組綿羊支原體肺炎的感染率顯著低于易感組。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體說是涉及一種綿羊支原體肺炎抗性基因型的篩選方法，本發(fā)明從補體角度入手，通過對綿羊自身MBL基因的研究，研究發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性與綿羊支原體的抗性緊密相關(guān)，預(yù)測MBL基因為綿羊支原體肺炎抗性性狀的候選基因，可作為選育高抗性綿羊的分子標(biāo)記，并能快速、準(zhǔn)確地建立抗綿羊支原體肺炎新品系，同時，本發(fā)明也可為該疾病的治療提供新的思路，MBL作為廣泛參與多種疾病免疫途徑的重要因素，該發(fā)明為其它疾病研究提供借鑒，對合理開發(fā)利用新疆地方綿羊品種遺傳資源以及引進新品種具有重要的現(xiàn)實意義，為進一步選育綿羊支原體肺炎抗性基因型個體奠定實驗基礎(chǔ)。
文檔編號C12Q1/68GK102277425SQ20111020609
公開日2011年12月14日 申請日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月22日
發(fā)明者余鵬, 劉賢俠, 張慧, 張紅梅, 王建梅, 賈斌, 趙鳳, 趙宗勝 申請人:趙宗勝