專利名稱：一株枯草芽孢桿菌及其在防治白粉病的生防制劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥領(lǐng)域，主要涉及一株枯草芽孢桿菌和其工業(yè)制備方法，本發(fā)明還涉及一種防治瓜類、煙草、蔬菜、草莓等經(jīng)濟(jì)作物白粉病的的生防制劑。
背景技術(shù)：
白粉病菌的種類多、分布廣，目前在世界上已正式命名的大約有650多種。分屬于3個(gè)屬、6個(gè)種的真菌都可引起瓜類白粉病。瓜類白粉病主要由單囊殼白粉菌 (Podosphaera xanthii，原名為 Sphaerotheca fuliginea)禾口二3^( )" (Golovinomyces cichoracearum，原名為Erysiphe cichoracearum)引起的，是一種世界性病害，各種栽培條件下均可發(fā)生，常年危害，嚴(yán)重阻礙了瓜類的綠色生產(chǎn)。白粉病菌生理小種眾多，分化演替快，在不同地區(qū)和不同瓜類作物上的分布也不盡相同。迄今為止，單囊殼白粉菌生理小種有 11個(gè)，二孢白粉菌生理小種有2個(gè)。它具有氣流傳染、潛育期短、再侵染頻繁、流行性強(qiáng)等特點(diǎn)。該病對(duì)瓜類生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的危害，在苗期造成瓜類生長(zhǎng)減弱甚至死亡，生育期造成瓜果畸形，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因該病菌是專性寄生菌，這為室內(nèi)防治該病的研究帶來了很大的困難。在我國，白粉菌G. cichoracearum主要分布在黑龍江、甘肅、青海、新疆、江蘇；而 P. xanthi主要分布在河北、內(nèi)蒙、遼寧、江蘇、臺(tái)灣、廣西、云南、四川等地。目前，在我國一些地區(qū)也有瓜類白粉病菌的種類與生理小種鑒定的研究報(bào)道，如在杭州地區(qū)鑒定出單囊殼白粉菌的生理小種2 ；在北京地區(qū)初步鑒定出單囊殼白粉菌的生理小種1和2F，優(yōu)勢(shì)生理小種為2F ；在海南三亞地區(qū)初步鑒定出單囊殼白粉菌的生理小種1和2F，優(yōu)勢(shì)生理小種為 2F，而且還可能存在新的生理小種；新疆和甘肅皋蘭地區(qū)鑒定出單囊殼白粉菌的生理小種均為1 ；而長(zhǎng)春地區(qū)鑒定出單囊殼白粉菌是該地區(qū)的主要白粉病菌。兩種白粉菌都是嚴(yán)格的專性寄生菌，它們的寄主范圍都很廣，除葫蘆科作物外，還可以侵染其它科的多種植物。兩種菌均具有明顯的寄生?；?，有許多不同的變種和生理小種，非瓜類作物上同屬同種的白粉菌，不一定能侵染瓜類作物。由于白粉病菌的生理小種分化嚴(yán)重，且易產(chǎn)生抗藥性。同時(shí)，由于農(nóng)業(yè)設(shè)施的不斷興起，為白粉病的猖獗傳染提供了更有利的環(huán)境條件，該病害造成的經(jīng)濟(jì)損失在逐年增加。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，人們主要采用化學(xué)農(nóng)藥防治此病，如杜邦福星乳油，烯哇醇、硫懸浮劑、 多硫懸浮劑、甲基托布津、百菌清、粉必清、綠穎、敵死蟲多抗靈、特富靈、粉銹寧、瑞毒銅、多菌靈、氟硅唑微、仙生、世高等。但現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)白粉病菌對(duì)苯丙咪唑類、有機(jī)磷類、羥基嘧啶類、 甲氧基丙稀酸酯類和苯氧基喹啉類產(chǎn)生了抗藥性，很難達(dá)到預(yù)期的防治效果。化學(xué)農(nóng)藥發(fā)展到20世紀(jì)60年代，“農(nóng)藥公害”問題如農(nóng)藥的高殘留、高抗病蟲害的猖獗發(fā)生、天敵生物群落的嚴(yán)重破壞及農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的污染等不斷暴露，且日益嚴(yán)重，在國際上引起了轟動(dòng)，使農(nóng)藥的發(fā)展發(fā)生了轉(zhuǎn)折，引出了生物農(nóng)藥。生物農(nóng)藥是指利用生物活體或其代謝產(chǎn)物對(duì)害蟲、病菌、雜草、線蟲、鼠類等有害生物進(jìn)行防治的一類農(nóng)藥制劑，或者是通過仿生合成具有特異作用的農(nóng)藥制劑。隨著社會(huì)的發(fā)展、科技的進(jìn)步及公眾環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，減少使用化學(xué)農(nóng)藥，保護(hù)人類生存環(huán)境的呼聲日益高漲，研究開發(fā)利用生物農(nóng)藥防治農(nóng)作物病蟲害，發(fā)展成為國內(nèi)外植物保護(hù)科學(xué)工作者的重要研究課題之一。生物農(nóng)藥具有安全、有效、無污染等特點(diǎn)，與保護(hù)生態(tài)環(huán)境和社會(huì)協(xié)調(diào)發(fā)展的要求相吻合。因此，近年來我國生物農(nóng)藥的研究開發(fā)也開始呈現(xiàn)出新的局面。生物農(nóng)藥在病蟲害綜合防治中的地位和作用顯得愈來愈重要。生防菌如賭蚧輪枝菌(Verticilliumlecanii)、哈茨木霉(Truchoderma harziamum)、Tilleiopsis pallescens、Τ· washingtonensis、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(B. firmus)、鏈霉菌 (Streptomycete spp)、嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdus nematophlus)等對(duì)白粉病都有良好的防治效果。但生防菌株對(duì)白粉病的防效多數(shù)來源于溫室實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而絕大多數(shù)菌株在露天的大田中，由于受到紫外線或其他環(huán)境因素的影響，很難對(duì)白粉病的有良好的防治效果。瓜類作物在百姓的“菜籃子工程”中占有重要的地位。通過生物防治的方法控制白粉病的發(fā)生，對(duì)提高瓜類作物的品質(zhì)、減少化學(xué)農(nóng)藥的使用、促進(jìn)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的和諧發(fā)展有著重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了適應(yīng)有機(jī)農(nóng)業(yè)的發(fā)展需求，提供一種枯草芽孢桿菌，可以有效解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的問題。本發(fā)明的另一目的在于提供該枯草芽孢桿菌的工業(yè)制備及其應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的在于提供含有上述枯草芽孢桿菌的生防制劑。本發(fā)明的另一目的在于提供所述生防制劑的使用方法。本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)FBRl已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；地址中國北京朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院；保藏編號(hào)為 CGMCC No. 4915 ；保藏日期2011 年 05 月 27 日。本發(fā)明的菌株為枯草芽孢桿菌FBR1，分離自山東鄒平縣城郊區(qū)的黃瓜根際中。該菌株的分離方法是稱根際土 10g，用無菌水進(jìn)行梯度稀釋至10-6到10-5，取100 μ L涂在 NA固體平板上(NA培養(yǎng)基為牛肉浸膏3g，酵母浸膏l(xiāng)g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，瓊膠15g ； 蒸餾水1000. 0ml，pH6. 8-7. O。)，挑去單克隆，并進(jìn)行純化，最終得到該菌株。該菌株的特征如下(1)在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)速度快，12-M個(gè)小時(shí)可以長(zhǎng)滿直徑為9厘米的培養(yǎng)皿，并呈明顯的同心圓狀，菌落呈膿狀，在菌落邊緣有褶皺；( 在LB培養(yǎng)基上，菌落呈膿狀，透明，凸起饅頭狀，表面光滑，不易產(chǎn)生褶皺；菌體呈球棒狀，大小為0. 5-0. 9 X 1. 9-2. 5 微米，鞭毛端生，具有運(yùn)動(dòng)性；產(chǎn)生芽孢，芽孢中生，呈橢圓型。( 該菌株在植物葉面定殖能力強(qiáng)，具有殺菌防病的作用；(4)好氧型，革蘭氏染色陽性；可以利用多種單糖或二聚糖， 可水解淀粉、纖維素、酪素及明膠，低于5°C或高于55°C都不能正常生長(zhǎng)。本發(fā)明還公開了枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)FBRl的工業(yè)生產(chǎn)方法，發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉0.8%、黃豆粉1.5%、酵母粉0. 1%、蛋白胨0.5%、磷酸二氫鉀0.8%、碳酸鈣0. 15 %、硫酸鎂0.02%、消泡劑0.005 %、pH 7.0，用水定容；發(fā)酵溫度為，通氣量為0. 2v/v/min-0. 4v/v/min，攪拌速度為100-150轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時(shí)間為M-36小時(shí)。優(yōu)選的是所述發(fā)酵培養(yǎng)基中還包含蔗糖2. 0%。
本發(fā)明還公開了枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)FBRl的工業(yè)生產(chǎn)方法，本發(fā)明還公開了該枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)FBRl在防治農(nóng)作物白粉病中的應(yīng)用。優(yōu)選的是所述農(nóng)作物為瓜類、蔬菜、煙草或者草莓。優(yōu)選的是所述白粉病是由單囊殼白粉菌引起的。優(yōu)選的是所述白粉病是由二孢白粉菌引起的。本發(fā)明還公開了一種生防制劑，所述生物制劑含有保藏號(hào)為CGMCCNo. 4915的枯草芽孢桿菌FBRl。本發(fā)明還公開了上述生物制劑的田間使用方法，將所述生物制劑稀釋0-1000倍。優(yōu)選的是將所述生防制劑稀釋300-500倍。本發(fā)明的可以用于瓜類白粉病生物防治的菌株-FBR1，通過工業(yè)發(fā)酵得到其活性發(fā)酵液，用于大田瓜類白粉病的生物防治，而且治愈效果良好。該發(fā)明易于工業(yè)化生產(chǎn)、不產(chǎn)生工業(yè)三廢、對(duì)環(huán)境安全，對(duì)有機(jī)農(nóng)業(yè)發(fā)展的有著重要意義。
附圖1示出了本發(fā)明菌體在顯微鏡下的形態(tài)。本發(fā)明菌體的保藏信息如下保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；地址中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院；保藏日期2011年05月27日；保藏編號(hào)CGMCCNo. 4915。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例僅用于對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，并不是用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1菌株活化及擴(kuò)繁將菌株在LB固體培養(yǎng)基(1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1.0%氯化鈉，pH值 7. 0左右，1. 5%瓊脂)上劃線活化，并在LB液體培養(yǎng)基(1. 0%胰蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%氯化鈉，pH值7. 0左右)擴(kuò)繁，得到發(fā)酵種子。工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基玉米粉1%、黃豆粉！^^、酵母粉化！^^蛋白胨化日^^磷酸二氫鉀 0.8%、碳酸鈣0. 15%、硫酸鎂0.02%、消泡劑0.005%、蔗糖2.0%、pH 7. 0 ；發(fā)酵條件發(fā)酵溫度為^_35°C、通氣量為0. 4v/v/min，攪拌速度為100轉(zhuǎn)/分鐘、M小時(shí)；在發(fā)酵過程中，間隔2個(gè)小時(shí)取樣1次，測(cè)定pH值，觀察菌落形態(tài)。在芽孢數(shù)達(dá)到5%時(shí)，添料一次，在芽孢數(shù)達(dá)到90%時(shí)，停止發(fā)酵，并通過顯微鏡觀察確定是否為本生物制劑，并用血球計(jì)數(shù)板來統(tǒng)計(jì)菌體數(shù)，每毫升中含有2億個(gè)活菌量。所得發(fā)酵液即為本發(fā)明的生物制劑。實(shí)施例2菌株活化及擴(kuò)繁將菌株在LB固體培養(yǎng)基(1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1.0%氯化鈉，pH值7. 0左右，1. 5%瓊脂)上劃線活化，并在LB液體培養(yǎng)基(1. 0%胰蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%氯化鈉，pH值7. 0左右)擴(kuò)繁，得到發(fā)酵種子。將發(fā)酵種子接種于玉米粉0.8%、黃豆粉1.5%、酵母粉0. 1%、蛋白胨0.5%、磷酸二氫鉀0. 8%、碳酸鈣0. 15%、硫酸鎂0. 02%、消泡劑0. 005%, pH 7. 0 ；發(fā)酵條件發(fā)酵溫度為、通氣量為0. 2v/v/min,攪拌速度為100轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時(shí)間36小時(shí)；在發(fā)酵過程中，間隔2個(gè)小時(shí)取樣1次，測(cè)定pH值，觀察菌落形態(tài)。在芽孢數(shù)達(dá)到5%時(shí)，添料一次，在芽孢數(shù)達(dá)到90%時(shí)，停止發(fā)酵，并通過顯微鏡觀察確定是否為本生物制劑，并用血球計(jì)數(shù)板來統(tǒng)計(jì)菌體數(shù)，每毫升中含有2億個(gè)活菌量。所得發(fā)酵液即為本發(fā)明的生物制劑。實(shí)施例3菌株活化及擴(kuò)繁將菌株在LB固體培養(yǎng)基(1. 0%胰蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%氯化鈉，pH值 7. 0左右，1. 5%瓊脂)上劃線活化，并在LB液體培養(yǎng)基(1. 0%胰蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%氯化鈉，pH值7. 0左右)擴(kuò)繁，得到發(fā)酵種子。將發(fā)酵種子接種于玉米粉0.8%、黃豆粉1.5%、酵母粉0. 1%、蛋白胨0.5%、磷酸二氫鉀0. 8%、碳酸鈣0. 15%、硫酸鎂0. 01%、消泡劑0. 005%, pH 5. 5 ；發(fā)酵條件發(fā)酵溫度為30°C、通氣量為0. 2v/v/min，攪拌速度為100轉(zhuǎn)/分鐘、34小時(shí)；在發(fā)酵過程中，間隔 2個(gè)小時(shí)取樣1次，測(cè)定pH值，觀察菌落形態(tài)。在芽孢數(shù)達(dá)到5%時(shí)，添料一次，在芽孢數(shù)達(dá)到90%時(shí)，停止發(fā)酵，并通過顯微鏡觀察確定是否為本生物制劑，并用血球計(jì)數(shù)板來統(tǒng)計(jì)菌體數(shù)，每毫升中含有2億個(gè)活菌量。所得發(fā)酵液即為本發(fā)明的生物制劑。實(shí)施例4菌株活化及擴(kuò)繁將菌株在LB固體培養(yǎng)基(1. 0%胰蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%氯化鈉，pH值 7. 0左右，1. 5%瓊脂)上劃線活化，并在LB液體培養(yǎng)基(1. 0%胰蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%氯化鈉，pH值7. 0左右)擴(kuò)繁，得到發(fā)酵種子。將發(fā)酵種子接種于玉米粉0.8%、黃豆粉1.5%、酵母粉0. 1%、蛋白胨0.2%、磷酸二氫鉀0. 8%、碳酸鈣0. 15%、硫酸鎂0. 01%、消泡劑0. 005%, pH 7. 0 ；發(fā)酵條件發(fā)酵溫度為35°C、通氣量為0. 4v/v/min，攪拌速度為150轉(zhuǎn)/分鐘、36小時(shí)；在發(fā)酵過程中，間隔 2個(gè)小時(shí)取樣1次，測(cè)定pH值，觀察菌落形態(tài)。在芽孢數(shù)達(dá)到5%時(shí)，添料一次，在芽孢數(shù)達(dá)到90%時(shí)，停止發(fā)酵，并通過顯微鏡觀察確定是否為本生物制劑，并用血球計(jì)數(shù)板來統(tǒng)計(jì)菌體數(shù)，每毫升中含有2億個(gè)活菌量。所得發(fā)酵液即為本發(fā)明的生物制劑。實(shí)施例5菌株活化及擴(kuò)繁將菌株在LB固體培養(yǎng)基(1. 0%胰蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%氯化鈉，pH值 7. 0左右，1. 5%瓊脂)上劃線活化，并在LB液體培養(yǎng)基(1. 0%胰蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1. 0%氯化鈉，pH值7. 0左右)擴(kuò)繁，得到發(fā)酵種子。將發(fā)酵種子接種于玉米粉0. 5%、黃豆粉1 %、酵母粉0. 1 %、蛋白胨0. 5%、磷酸二氫鉀0. 3%、碳酸鈣0. 09%、硫酸鎂0. 02%、消泡劑0. 005%, pH 8. 5 ；發(fā)酵條件發(fā)酵溫度為35°C、通氣量為0. 4v/v/min,攪拌速度為150轉(zhuǎn)/分鐘、36小時(shí)；在發(fā)酵過程中，間隔2個(gè)小時(shí)取樣1次，測(cè)定PH值，觀察菌落形態(tài)。在芽孢數(shù)達(dá)到5%時(shí)，添料一次，在芽孢數(shù)達(dá)到90%時(shí)，停止發(fā)酵，并通過顯微鏡觀察確定是否為本生物制劑，并用血球計(jì)數(shù)板來統(tǒng)計(jì)菌體數(shù)，每毫升中含有2億個(gè)活菌量。所得發(fā)酵液即為本發(fā)明的生物制劑。本發(fā)明生防制劑防治白粉病的田間防治效率實(shí)驗(yàn)。1.實(shí)驗(yàn)材料以黃瓜、煙草、草莓白粉病為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，測(cè)定FBRl制備的生物制劑控制白粉病的田間效果。生物制劑中有效活菌數(shù)為至少為2X109。2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)A稀釋100倍，葉面噴施；B稀釋300倍，葉面噴施；C稀釋500倍，葉面噴施；D稀釋800倍，葉面噴施；E稀釋1000倍，葉面噴施；CK清水對(duì)照。每個(gè)處理噴施100棵植株，重復(fù)3次。并間隔7到9天噴施一次。3.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)0級(jí)無病斑；1級(jí)-病斑面積占葉面積的1/4以下；2級(jí)-病斑面積占葉面積的 1/4-2/4 ；3級(jí)-病斑面積占葉面積的2/4-3/4 ；4級(jí)-病斑面積占葉面積的3/4以上。病情指數(shù)=[Σ (病級(jí)值X該級(jí)發(fā)病葉數(shù))/(調(diào)查總?cè)~數(shù)X最高病級(jí)值)]X100防治效率的計(jì)算公式=[1_(處理的病情指數(shù)/對(duì)照的病情指數(shù))]X 100以SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果下表是對(duì)黃瓜白粉病生防效果的數(shù)據(jù)
權(quán)利要求
1.一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)FBRl，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 4915。
2.權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) FBRl在防治農(nóng)作物白粉病中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征是所述農(nóng)作物為瓜類、蔬菜、煙草或者草莓。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征是所述白粉病是由單囊殼白粉菌引起的。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征是所述白粉病是由二孢白粉菌引起的。
6.一種制造如權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的工業(yè)方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉0. 5-1. 0%、黃豆粉1. 0-1. 5 %、酵母粉0-0. 1 %、蛋白胨0. 2-0. 5 %、磷酸二氫鉀0. 3-0. 8 %、碳酸鈣0. 09-0. 15 %、硫酸鎂0. 01-0. 02 %、消泡劑 0. 005%, PH 5. 5-8. 5，用水定容；發(fā)酵溫度為 28_;35°C，通氣量為 0. 2v/v/min_0. 4v/v/min， 攪拌速度為100-150轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時(shí)間為24-36小時(shí)。
7.如權(quán)利要求6所述的工業(yè)方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中還包含蔗糖 0-2. 0%。
8.—種生防制劑，其特征是所述生防制劑含有保藏號(hào)為CGMCC No. 4915的草芽孢桿菌 FBRl。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述生防制劑的田間使用方法，其特征是將所述生防制劑稀釋 0-1000 倍。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的使用方法，其特征是將所述生防制劑稀釋300-500倍。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株枯草芽孢桿菌及其在防治白粉病的生防制劑中的應(yīng)用，屬于微生物農(nóng)藥領(lǐng)域，該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)FBR1，保藏編號(hào)CGMCC No.4915；其工業(yè)發(fā)酵的培養(yǎng)基為玉米粉0.8％、黃豆粉1.5％、酵母粉0.1％、蛋白胨0.5％、磷酸二氫鉀0.8％、碳酸鈣0.15％、硫酸鎂0.02％、消泡劑0.001％、pH 7.0，用水定容；在發(fā)酵溫度為28-35℃、通氣量為0.2v/v/min-0.4v/v/min、攪拌速度為100-150轉(zhuǎn)/分鐘的條件下發(fā)酵24-36小時(shí)；本發(fā)明還公開了一種生防劑，包含所述的枯草芽孢桿菌，可以用于瓜類、蔬菜、煙草及草莓等經(jīng)濟(jì)作物白粉病的防治，替代了化學(xué)農(nóng)藥的噴灑，綠色環(huán)保，沒有污染。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102250814SQ201110203240
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月20日
發(fā)明者熊國如, 范成明 申請(qǐng)人:范成明