專利名稱：一種黃檗轉基因體系建立的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種轉基因體系建立的方法。
背景技術：
黃檗(Phellodendron amurense Rupr.)，別名黃波羅，為蕓香科(Rutaceae)黃檗屬(Phellodendron Rupr)植物。黃檗是古老的殘遺植物，對研究古代植物區(qū)系，古地理及第四紀冰期氣候有科學價值，是國家二級保護植物(崔麗莉等，2004)，具有重要的經(jīng)濟、藥用和保護價值，木材紋理美觀，切面有光澤，材質(zhì)堅韌，耐水濕及耐腐性強，不翹不裂，用于軍工、制造家具及工藝美術。樹皮木栓可作工業(yè)軟木塞、浮標、救生圈或用于隔音、隔熱、防震等。內(nèi)皮可作黃色染料的來源及藥用在我國和日本，黃檗中的藥用物質(zhì)被當作一種天然藥使用，抗侵襲腸功能的病菌，防燥及退熱劑(Ikuta et al. 1998)。葉可提取芳香油；花是很好的蜜源；果實含有甘露醇及不揮發(fā)的油分，可供工業(yè)及醫(yī)藥用。由于人們盲目采扒黃檗樹皮，造成大規(guī)模的破壞。加上木材砍伐量較大，也造成資源枯竭。目前我國的黃檗野生資源已受到嚴重威脅。種子繁殖能力低，萌芽率低，以及切斷面生根能力低，在引種栽培上尚未能大面積推廣。近年來，有關黃檗的植株再生體系建立研究已有報道，然而，目前還沒有有關黃檗轉基因體系的研究。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種黃檗轉基因體系建立的方法。黃檗轉基因體系建立的方法按以下步驟實現(xiàn)一、將黃檗去皮后的成熟種子在超凈工作臺內(nèi)用體積濃度為70%的酒精浸泡30s lmin，滅菌水沖洗2 3遍，然后轉入質(zhì)量濃度為1 %的NaClO溶液中消毒10 20min，滅菌水沖洗3 5遍，再接種到含％ig/L苯基噻二唑脲、0. 2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和5. 5g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 3天；二、將含⑶S基因的載體pCAMBIA1303利用電轉方法轉到根癌農(nóng)桿菌EHA105中， 獲得含⑶S基因的工程菌，然后接種到LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)至菌液的OD6tltl值為0. 5 1. 0，再稀釋至菌液的0D_值為0. 1，以5000r/min的轉速離心5min，棄上清后加入等體積的含^ig/ L苯基噻二唑脲、0. 2mg/L萘乙酸和30g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基并混勻，獲得侵染液，然后倒入培養(yǎng)皿中，再放入步驟一中培養(yǎng)后的種子，將種子末端的子葉先切去，然后沿著胚軸縱切成兩半，侵染30min后取出種子接種到含％ig/L苯基噻二唑脲、0. 2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和 5. 5g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 3天，然后剝離胚乳并用滅菌水沖洗帶子葉的下胚軸 3 5遍，再放入含200mg/L頭孢霉素的滅菌水中進行脫菌；三、脫菌后的種子接種到含10mg/L卡那霉素、200mg/L頭孢霉素、lmg/L苯基噻二唑脲、0. 2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和5. 5g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)1個月，獲得抗性芽；四、將抗性芽接種到含0. 5mg/L 6_芐氨基嘌呤、0. 2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和 5. 5g/L瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)至抗性芽高于3cm，然后轉接于含lmg/L乙哚丁酸、30g/ L蔗糖和5. 5g/L瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，再挑選根系發(fā)達的植株移栽到栽培基質(zhì)中，澆透水并覆蓋塑料膜，在21°C培養(yǎng)室中培養(yǎng)6周后去掉覆蓋的塑料膜，獲得黃檗轉基因再生植株，即完成黃檗轉基因體系建立。本發(fā)明黃檗轉基因體系建立的方法，可實現(xiàn)轉基因黃檗的快速培育，為黃檗優(yōu)良品種的開發(fā)奠定基礎，從而培育出速生、豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆的黃檗新品種，使該樹種的生態(tài)效益、經(jīng)濟效益和社會效益得到迅速、充分發(fā)揮。本發(fā)明黃檗轉基因體系建立的方法，所得黃檗轉基因再生植株移栽成活率達 94 %，產(chǎn)生的后代遺傳穩(wěn)定性好，可極大地縮短林木育種周期，加速育種進程，創(chuàng)造新種質(zhì)， 選育新品種，對營造優(yōu)質(zhì)人工林，緩解木材供需矛盾，保護生態(tài)環(huán)境具有重要意義。
圖1為具體實施方式
四中PCR檢測擴增的電泳圖，其中M表示Marker DL2000，N表示陰性對照，P表示陽性對照，泳道1-4表示轉基因植株；圖2為具體實施方式
四中RT-PCR 檢測的電泳圖，其中M表示MarkerDL2000，泳道1_4表示轉基因植株。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式黃檗轉基因體系建立的方法按以下步驟實現(xiàn)一、 將黃檗去皮后的成熟種子在超凈工作臺內(nèi)用體積濃度為70%的酒精浸泡30s lmin，滅菌水沖洗2 3遍，然后轉入質(zhì)量濃度為1 %的Natno溶液中消毒10 20min，滅菌水沖洗 3 5遍，再接種到含％ig/L苯基噻二唑脲、0. 2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和5. 5g/L瓊脂的 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 3天；二、將含⑶S基因的載體pCAMBIA1303利用電轉方法轉到根癌農(nóng)桿菌EHA105中， 獲得含⑶S基因的工程菌，然后接種到LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)至菌液的OD6tltl值為0. 5 1. 0，再稀釋至菌液的0D_值為0. 1，以5000r/min的轉速離心5min，棄上清后加入等體積的含^ig/ L苯基噻二唑脲、0. 2mg/L萘乙酸和30g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基并混勻，獲得侵染液，然后倒入培養(yǎng)皿中，再放入步驟一中培養(yǎng)后的種子，將種子末端的子葉先切去，然后沿著胚軸縱切成兩半，侵染30min后取出種子接種到含％ig/L苯基噻二唑脲、0. 2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和 5. 5g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 3天，然后剝離胚乳并用滅菌水沖洗帶子葉的下胚軸 3 5遍，再放入含200mg/L頭孢霉素的滅菌水中進行脫菌；三、脫菌后的種子接種到含10mg/L卡那霉素、200mg/L頭孢霉素、lmg/L苯基噻二唑脲、0. 2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和5. 5g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)1個月，獲得抗性芽；四、將抗性芽接種到含0.5mg/L 6_芐氨基嘌呤、0. 2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和 5. 5g/L瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)至抗性芽高于3cm，然后轉接于含lmg/L乙哚丁酸、30g/ L蔗糖和5. 5g/L瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，再挑選根系發(fā)達的植株移栽到栽培基質(zhì)中，澆透水并覆蓋塑料膜，在21°C培養(yǎng)室中培養(yǎng)6周后去掉覆蓋的塑料膜，獲得黃檗轉基因再生植株，即完成黃檗轉基因體系建立。本實施方式中根癌農(nóng)桿菌EHA105購買自東北林業(yè)大學林木遺傳育種實驗室。本實施方式中1/2MS培養(yǎng)基即MS培養(yǎng)基中大量元素濃度減半，成分如表1所示。表 權利要求
1.一種黃檗轉基因體系建立的方法，其特征在于黃檗轉基因體系建立的方法按以下步驟實現(xiàn)一、將黃檗去皮后的成熟種子在超凈工作臺內(nèi)用體積濃度為70%的酒精浸泡 30s lmin，滅菌水沖洗2 3遍，然后轉入質(zhì)量濃度為1 %的NaClO溶液中消毒10 20min,滅菌水沖洗3 5遍，再接種到含％ig/L苯基噻二唑脲、0. 2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和5. 5g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 3天；二、將含GUS基因的載體pCAMBIA1303利用電轉方法轉到根癌農(nóng)桿菌EHA105中，獲得含⑶S基因的工程菌，然后接種到LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)至菌液的OD6tltl值為0. 5 1. 0，再稀釋至菌液的OD6tltl值為0. 1，以5000r/min的轉速離心5min，棄上清后加入等體積的含％ig/L 苯基噻二唑脲、0. 2mg/L萘乙酸和30g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基并混勻，獲得侵染液，然后倒入培養(yǎng)皿中，再放入步驟一中培養(yǎng)后的種子，將種子末端的子葉先切去，然后沿著胚軸縱切成兩半，侵染30min后取出種子接種到含％ig/L苯基噻二唑脲、0. 2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和 5. 5g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 3天，然后剝離胚乳并用滅菌水沖洗帶子葉的下胚軸 3 5遍，再放入含200mg/L頭孢霉素的滅菌水中進行脫菌；三、脫菌后的種子接種到含10mg/L卡那霉素、200mg/L頭孢霉素、lmg/L苯基噻二唑脲、 0. 2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和5. 5g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)1個月，獲得抗性芽；四、將抗性芽接種到含0.5mg/L 6-芐氨基嘌呤、0. 2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和5. 5g/ L瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)至抗性芽高于3cm，然后轉接于含lmg/L乙哚丁酸、30g/L蔗糖和5. 5g/L瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，再挑選根系發(fā)達的植株移栽到栽培基質(zhì)中，澆透水并覆蓋塑料膜，在21°C培養(yǎng)室中培養(yǎng)6周后去掉覆蓋的塑料膜，獲得黃檗轉基因再生植株，即完成黃檗轉基因體系建立。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種黃檗轉基因體系建立的方法，其特征在于步驟一中將黃檗去皮后的成熟種子在超凈工作臺內(nèi)用體積濃度為70%的酒精浸泡30s lmin，滅菌水沖洗2 3遍，然后轉入質(zhì)量濃度為的NaClO溶液中消毒10 20min。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種黃檗轉基因體系建立的方法，其特征在于步驟四中栽培基質(zhì)按體積份數(shù)比由1份滅菌的沙子和3份滅菌的泥土組成。
全文摘要
一種黃檗轉基因體系建立的方法，它涉及一種轉基因體系建立的方法。方法一、成熟種子預處理；二、載體pCAMBIA1303利用電轉方法轉到根癌農(nóng)桿菌EHA105中，獲得含GUS基因的工程菌，然后制備侵染液，侵染后脫菌；三、獲得抗性芽；四、抗性芽伸長及生根并移栽，獲得黃檗轉基因再生植株，即完成。本發(fā)明黃檗轉基因體系建立的方法，可實現(xiàn)轉基因黃檗的快速培育，為黃檗優(yōu)良品種的開發(fā)奠定基礎，從而培育出速生、豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆的黃檗新品種，所得黃檗轉基因再生植株移栽成活率達94％，產(chǎn)生的后代遺傳穩(wěn)定性好，可極大地縮短林木育種周期，加速育種進程，對營造優(yōu)質(zhì)人工林，緩解木材供需矛盾，保護生態(tài)環(huán)境具有重要意義。
文檔編號C12N15/82GK102260705SQ201110166079
公開日2011年11月30日 申請日期2011年6月20日 優(yōu)先權日2011年6月20日
發(fā)明者劉桂豐, 劉立輝, 周晨光, 李成浩, 李春燕, 杜佳, 楊靜莉, 趙波, 靳春蓮 申請人:東北林業(yè)大學