專利名稱：一種CdSe/ZnS量子點(diǎn)與植物細(xì)胞的共孵育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及納米技術(shù)在植物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域中的應(yīng)用技術(shù)，具體涉及一種Cdk/ZnS 量子點(diǎn)與植物細(xì)胞的共孵育方法。
背景技術(shù)：
量子點(diǎn)(quantum dots，QDS)作為半導(dǎo)體熒光納米顆粒，具有熒光發(fā)射波長(zhǎng)可調(diào)、 激發(fā)光譜寬而連續(xù)、熒光量子產(chǎn)率高等特點(diǎn)，且可經(jīng)受多次激發(fā)，實(shí)現(xiàn)一元激發(fā)多元發(fā)射； 尤其熒光性質(zhì)穩(wěn)定，在某些情況下其發(fā)光時(shí)間是有機(jī)染料分子的100倍。憑借這些獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，量子點(diǎn)探針技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域中，越來越受到人們的青睞。盡管在醫(yī)學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上應(yīng)用已比較成熟，但其在植物細(xì)胞中的應(yīng)用還處于起始階段，主要集中在(1)對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)態(tài)標(biāo)記，追蹤其動(dòng)力學(xué)過程；(2)對(duì)靶分子進(jìn)行標(biāo)記，研究其在細(xì)胞內(nèi)生物功能的實(shí)現(xiàn)情況；(3)充當(dāng)非病毒納米基因載體，建立高效的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因體系；(4)同時(shí)作為質(zhì)粒DNA的生物標(biāo)記，對(duì)植物轉(zhuǎn)基因過程進(jìn)行跟蹤和機(jī)理揭示。對(duì)于上述這些應(yīng)用，都需要通過對(duì)量子點(diǎn)納米顆粒和植物細(xì)胞相互作用機(jī)制的了解來實(shí)現(xiàn)。所以研究它們的相互作用的細(xì)胞生物學(xué)特征，并實(shí)現(xiàn)其過程的有效調(diào)控，逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)。相對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞， 植物細(xì)胞具有致密細(xì)胞壁，使納米顆粒導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的難度增加。為避開細(xì)胞壁的阻礙，人們常通過分離的植物細(xì)胞的原生質(zhì)體為生物材料，研究其和納米顆粒之間的相互作用。但隨著納米技術(shù)的發(fā)展，有關(guān)于利用植物細(xì)胞的胞吞作用，將碳納米管導(dǎo)入完整植物細(xì)胞的研究報(bào)道。但利用表面修飾后的Cdk/ZnS納米顆粒穿過植物壁進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的研究未見報(bào)道。 同時(shí)利用CdS或CcKe等量子點(diǎn)材料作用于活體細(xì)胞的另一個(gè)問題是，CdS或CcKe等量子點(diǎn)材料會(huì)分解釋放出有毒重金屬離子Cd2+，結(jié)合線粒體蛋白質(zhì)內(nèi)巰基后，使蛋白失活。因此， 量子點(diǎn)表面涂層降解后的潛在生物毒性也不容忽視。但量子點(diǎn)材料對(duì)植物細(xì)胞毒理的研究尚未見報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種Cdk/ZnS量子點(diǎn)與植物細(xì)胞的共孵育方法，以通過研究植物懸浮細(xì)胞與經(jīng)不同條件表面化學(xué)修飾的納米顆粒，在不同的共培養(yǎng)條件下相互作用的細(xì)胞生物學(xué)特征和細(xì)胞毒性等影響，為植物基因工程提供新型的無機(jī)納米基因載體和轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
一種CcKe/ZnS量子點(diǎn)與植物細(xì)胞的共孵育方法取1 IOmL濃度為廣5 X IO5個(gè)/mL 鵝掌楸單細(xì)胞懸浮液，放置于離心管中，加入10 50 μ L濃度為1 6 μ mol/L的Cdk/ZnS 水溶性量子點(diǎn)，控溫20 37°C，5(Tl00r/min，搖床培養(yǎng)3 9h ；200(T4000r/m離心5 lOmin，棄上清，用細(xì)胞培養(yǎng)液洗去未被細(xì)胞內(nèi)吞的Cdk/ZnS量子點(diǎn)，即可。所述的CcKe/ZnS量子點(diǎn)，尺寸為1 30nm以內(nèi)，表面電荷性質(zhì)為正電荷。優(yōu)選加入CcKe/ZnS水溶性量子點(diǎn)后，再加入PEG-4000至質(zhì)量濃度為20%。
上述Cdk/ZnS水溶性量子點(diǎn)在以納米基因載體建立高效的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因體系中的應(yīng)用。本發(fā)明研究了鵝掌楸懸浮細(xì)胞和Cdk/ZnS量子點(diǎn)之間相互作用過程以及分析了 CdSe/ZnS量子點(diǎn)的細(xì)胞毒性，通過調(diào)控Cdk/ZnS量子點(diǎn)的表面電荷、培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度等條件，系統(tǒng)地探討了兩者之間的相互作用機(jī)理(1)納米顆粒主要通過植物細(xì)胞膜的液相胞吞作用進(jìn)入其細(xì)胞內(nèi)部，尺寸合適的外源物質(zhì)進(jìn)入植物細(xì)胞的困難并非細(xì)胞壁本身， 而在于細(xì)胞膜；(2) PEG介導(dǎo)作用可以增加植物細(xì)胞的攝入納米顆粒的能力；(3)相對(duì)于 (-)CdSe/ZnS量子點(diǎn)，(+ ) CdSe/ZnS量子點(diǎn)作為鵝掌楸細(xì)胞的納米基因載體更具有優(yōu)勢(shì)， 共孵育時(shí)間廣證以內(nèi)為宜。因此，適用于植物細(xì)胞的量子點(diǎn)材料應(yīng)該具備尺寸大小應(yīng)該控制在30nm以內(nèi)(植物細(xì)胞壁空隙在2(T40nm)；表面電荷性質(zhì)應(yīng)避免為負(fù)電荷，降低其自身的細(xì)胞毒性；還可以進(jìn)一步通過生物偶聯(lián)技術(shù)固定靶分子和細(xì)胞膜中相應(yīng)的受體相互締合，誘導(dǎo)細(xì)胞高效攝入；同時(shí)可以利用PEG等化學(xué)試劑增加細(xì)胞膜通透性，增加細(xì)胞攝入納米顆粒的能力。此外，還可以利用超聲、電刺激等物理手段來達(dá)到同一目的。有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明采用不同條件對(duì)雜交鵝掌楸的胚性懸浮細(xì)胞與經(jīng)不同表面化學(xué)修飾的Cdk/ZnS納米顆粒之間進(jìn)行共孵育，結(jié)果表明，在共孵育后池以內(nèi)，激光共聚焦顯微鏡和電子掃描顯微鏡下，均可在細(xì)胞內(nèi)部的表面觀察到經(jīng)表面后修飾帶正電荷的Cdk/ZnS納米顆粒，胞吞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的表面攜帶正電荷的Cdk/ZnS納米顆粒的量明顯與共培養(yǎng)時(shí)間、溫度有明顯的依賴關(guān)系，表明它們可以通過細(xì)胞的液相胞吞作用進(jìn)入雜交鵝掌楸細(xì)胞內(nèi)，且不影響細(xì)胞的活性，而表面帶負(fù)電荷的Cdk/ZnS納米顆粒則主要聚集在細(xì)胞外壁附近，在培養(yǎng)溶液中添加質(zhì)量濃度比為20% 聚乙二醇，可進(jìn)一步提高鵝掌楸細(xì)胞胞吞Cdk/ZnS納米顆粒的量和減輕Cdk/ZnS納米顆粒的細(xì)胞毒性。因此以表面攜帶正電荷的Cdk/ZnS量子點(diǎn)納米材料作為基因載體，在植物懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因研究和應(yīng)用中具有廣泛的前景，能夠?yàn)橹参锘蚬こ烫峁┬滦偷臒o機(jī)納米基因載體和轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。
圖1是鵝掌楸細(xì)胞和(士)CdSe/ZnS量子點(diǎn)共孵育9h后典型的激光共聚焦顯微鏡圖片。圖中，(A) ( + )CcKe/ZnS :(a)熒光，(b)明場(chǎng)，(c)明場(chǎng)/熒光重疊；(B) (-)CdSe/ ZnS (a)熒光，(b)明場(chǎng)，(c)明場(chǎng)/熒光重疊；(C)大范圍下的(+ ) Cdk/ZnS (a)熒光， (b)明場(chǎng)，(c)明場(chǎng)/熒光重疊；(D) (-) CdSe/ZnS (a)熒光，(b)明場(chǎng)，(c)明場(chǎng)/熒光重疊；
圖2是(士)Cdk/ZnS量子點(diǎn)和鵝掌楸細(xì)胞共孵育的不同時(shí)間階段典型的激光共聚焦顯微鏡圖片。圖中，(A) ( + )CcKe/ZnS，3h :(a)熒光，(b)明場(chǎng)，(c)明場(chǎng)/熒光重疊；(B) (+ ) CdSe/ZnS, 9h (a)熒光，(b)明場(chǎng)，(c)明場(chǎng) / 熒光重疊；(C) ( + ) CdSe/ZnS, 24h (a) 熒光，(b)明場(chǎng)，(c)明場(chǎng)/熒光重疊；(D) (-) CdSe/ZnS, 3h (a)熒光，(b)明場(chǎng)，(c)明場(chǎng)/熒光重疊；(E) (_)CcKe/ZnS，9h :(a)熒光；(b)明場(chǎng)；(c)明場(chǎng)/熒光重疊；(F)(-) CdSe/ZnS, 24h (a)熒光，(b)明場(chǎng)，(c)明場(chǎng)/熒光重疊;
圖3 ( + ) CdSe/ZnS量子點(diǎn)和鵝掌楸細(xì)胞共孵育池后電子SEM圖片； 圖4是(+ ) CdSe/ZnS量子點(diǎn)和鵝掌楸細(xì)胞共孵育池后能量譜分析圖；圖5是PEG介導(dǎo)(士)Cdk/ZnS量子點(diǎn)和鵝掌楸細(xì)胞共孵育的不同時(shí)間階段典型的激光共聚焦顯微鏡圖片；圖中，(A) (a) ( + )Cc^e/ZnS，3h:①熒光，②明場(chǎng)，③明場(chǎng)/熒光重疊；(b) ( + )CcKe/ZnS，9h ①熒光，②明場(chǎng)，③明場(chǎng)/熒光重疊；(c) (l)CdSe/ZnS,3h 熒光，②明場(chǎng)，③明場(chǎng)/熒光重疊；(d) (-) CdSe/ZnS, 9h ①熒光，②明場(chǎng)，③明場(chǎng)/熒光重疊；(B)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度和共孵育時(shí)間關(guān)系柱狀圖6是PEG介導(dǎo)(士)Cdk/ZnS量子點(diǎn)和鵝掌楸細(xì)胞共孵育的不同時(shí)間階段典型的平均熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖7是(士)Cdk/ZnS量子點(diǎn)細(xì)胞毒性FDA染色圖；圖中，(A) (a) ( + ) CdSe/ZnS, 3h, (b) (-) CdSe/ZnS，3h，(c) ( + ) CdSe/ZnS, 9h, (d) (-) CdSe/ZnS，9h，(e) PEG 介導(dǎo)下(+ ) CdSe/ZnS, 9h, (f) PEG 介導(dǎo)下(-)CdSe/SiS，9h，(g)和(h)為空白樣品，即未與 CcKe/ZnS 納米顆粒作用的鵝掌楸細(xì)胞；
圖8是在4°C ( + )CdSe/ZnS量子點(diǎn)和鵝掌楸細(xì)胞共孵育的不同時(shí)間段典型的激光共聚焦顯微鏡圖片；圖中，(A)汕(a)熒光，(b)明場(chǎng)，(c)明場(chǎng)/熒光重疊；(B) 9h (a)熒光， (b)明場(chǎng)，(c)明場(chǎng)/熒光重疊。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。以下實(shí)施例所用到的藥品和設(shè)備具體如下
Cdk/ZnS水溶性量子點(diǎn)(W1-585，珈源量子點(diǎn)技術(shù)開發(fā)有限公司，武漢，中國(guó))、熒光素二乙酸酯(FDA) (F0M0，東京化成工業(yè)株式會(huì)社，日本)、聚乙二醇(PEG-4000，分析純，光華化學(xué)試劑公司，中國(guó))、去離子水(電阻率高于18ΜΩ · cm)、其他試劑均為分析純。激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SL, Heidelberg, Germany)、離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge-5418, Hamburg, Germany)、Milli-Q 超純水終端系統(tǒng)(Millipore SYNS-000CN, USA)、微量移液槍 (Pipet-one, Rainin, USA)、搖床(培英-TCYQ，中國(guó))。實(shí)施例1
雜交鵝掌揪(Liriodendron chinense (Hemsl. )Sarg. X L. tulipifera Linn.)的胚性懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)體系按照現(xiàn)有方法(陳志、陳金慧、邊黎明等，雜交鵝掌楸胚性細(xì)胞懸浮系的建立，分子植物育種，2007，5 :1137 - 1140 ；專利申請(qǐng)20101(^98850. 6)建立。使用時(shí)， 取ImL鵝掌楸單細(xì)胞懸浮液，濃度為1. 5 X IO5個(gè)/mL，放置于1. 5mL Eppendorf離心管中， 接著加入10 μ LCdSe/ZnS水溶性量子點(diǎn)，濃度為4 μ mol/L,激發(fā)波長(zhǎng)為455士 lOnm，熒光最大發(fā)射波長(zhǎng)585士 lOnm。然后在23°C下，轉(zhuǎn)速為90r/min的搖床上進(jìn)行共培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，放入Eppendorf離心機(jī)中以2000r/m離心8min，棄上清。再利用細(xì)胞培養(yǎng)液清洗3次， 以洗去未被細(xì)胞內(nèi)吞的Cdk/ZnS量子點(diǎn)，制得細(xì)胞樣品。在制備細(xì)胞樣品中，各參數(shù)可以適當(dāng)調(diào)整，以不超過以下參數(shù)范圍為宜鵝掌楸單細(xì)胞懸浮液濃度為廣5 X IO5個(gè)/mL，體積為1 IOmL ；CdSe/ZnS水溶性量子點(diǎn)濃度為1 6ymol/L，體積為 10 50 μ L ；溫度 20 37°C，50 100r/min，搖床培養(yǎng) 3 9h ；2000 4000r/m 離心5 lOmin。本實(shí)施例所用( + )CdSe/ZnS量子點(diǎn)為商用的氨基修飾Cdk/ZnS量子點(diǎn)，大小約為 20nm,表面電荷約為+15mV，而相應(yīng)的(-)CdSe/ZnS量子點(diǎn)為同樣商用的羧基修飾CcKe/ZnS量子點(diǎn)，大小約為20nm，表面電荷為-40mV -30mV。二者除了在表面電荷有差異外，其他性質(zhì)(包括大小、構(gòu)成組分及熒光性質(zhì))都相同。實(shí)驗(yàn)中，將攜帶正負(fù)電荷的Cdk/ZnS量子點(diǎn)分別在相同條件下和雜交鵝掌楸單細(xì)胞懸浮液共培養(yǎng)9h后，利用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，將處理完的樣品滴加到載玻片，再蓋上蓋玻片，以便于激光共聚焦顯微鏡觀察，激發(fā)波長(zhǎng)為455nm，熒光波長(zhǎng)為585nm，并通過激光共聚焦顯微鏡自帶的圖片分析LAS AF Lite 軟件，Version :2. 2.0 build 4785，統(tǒng)計(jì)分析50個(gè)細(xì)胞內(nèi)部的熒光強(qiáng)度，取平均值，結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明，雜交鵝掌楸單細(xì)胞懸浮液和( + )Cc^e/ZnS量子點(diǎn)共培養(yǎng)后，細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)明顯的熒光，如圖1中(A) (a)和(C)。該結(jié)果顯示，( + XMk/ZnS量子點(diǎn)可以被鵝掌楸細(xì)胞攝入到體內(nèi)，且在胞內(nèi)分布均勻。而在同樣共培養(yǎng)條件下，(-XMk/ZnS量子點(diǎn)發(fā)生團(tuán)聚后附著在鵝掌楸細(xì)胞壁或細(xì)胞膜附近(紅線方框中的成團(tuán)熒光顯示)，如圖1中(B) (C)。 上述差異現(xiàn)象存在于大量細(xì)胞中，而非實(shí)驗(yàn)中的個(gè)別現(xiàn)象，如圖1 (C) (D)0實(shí)施例2
進(jìn)一步分析鵝掌楸細(xì)胞攝入(士)Cdk/ZnS量子點(diǎn)的動(dòng)力學(xué)過程，從實(shí)施例1制得的細(xì)胞樣品中，取100 μ L分裝于1.5mL Eppendorf離心管中，接著加入去離子水至lmL，加入 FDA染料，濃度為100μ g/mL，激發(fā)波長(zhǎng)為488 士 lOnm，熒光最大發(fā)射波長(zhǎng)530 士 lOnm，避光靜置lOmin，離心8min，1000r/m,反復(fù)3次，得到濃縮的細(xì)胞樣品，最后在激光共聚焦顯微鏡下觀察，激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，熒光波長(zhǎng)為530nm，同樣通過LAS AF Lite軟件定量分析50個(gè)細(xì)胞內(nèi)部的熒光強(qiáng)度，取平均值。結(jié)果如圖2所示。由圖2可見，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)部的( + )CdSe/ZnS量子點(diǎn)數(shù)量都有所增加，且( + )CdSe/ZnS量子點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)一直分布均勻， 比較圖2 (A) (a), (B) (a)和(C) (a)。對(duì)于(_) CcKe/ZnS量子點(diǎn)而言，在3h內(nèi)，主要團(tuán)聚在細(xì)胞壁外，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，在細(xì)胞內(nèi)部也發(fā)現(xiàn)了團(tuán)聚的量子點(diǎn)，比較圖2 (D) (a), (E) (a)和(F) (a)。實(shí)施例3
本實(shí)施例同時(shí)利用SEM，觀察與( + )CdSe/ZnS量子點(diǎn)共孵育池后的鵝掌楸細(xì)胞內(nèi)部特征。利用適量4%戊二醛，pH7. 2,0. 2mol/L磷酸緩沖液溶液(PBS)，立即固定實(shí)施例1制得的細(xì)胞樣品4h，pH7. 2,0. lmol/L PBS溶液清洗3次。乙醇梯度脫水2次(30%，15min ；50%, 15min ；70%, 15min ；90%, 15min ； 100%, 15min), 15min醋酸異戊酯置換2次，取出樣品放入干燥籃，進(jìn)行(X)2臨界點(diǎn)干燥，接著15mA噴金處理90s，最后用于掃描電子顯微鏡(SEM)觀察， 結(jié)果如圖3所示。通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)部表面進(jìn)行EDS分析發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞內(nèi)部含有Zn，S, Cd等元素，如圖4中的紅色圓圈標(biāo)注，這進(jìn)一步證明Cdk/ZnS量子點(diǎn)可以穿越鵝掌楸細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。實(shí)施例4
PEG可以導(dǎo)致植物細(xì)胞高度脫水，引起原生質(zhì)體皺縮、扭曲變形，在細(xì)胞膜表面形成可逆性小孔。由于細(xì)胞膜通透性增加，外源物質(zhì)可以經(jīng)細(xì)胞膜上的小孔進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。利用激光共聚焦顯微鏡，進(jìn)一步研究質(zhì)量濃度比為20%PEG對(duì)鵝掌楸細(xì)胞和Cdk/ZnS量子點(diǎn)相互作用的影響，方法同實(shí)施例1，在加入CcKe/ZnS水溶性量子點(diǎn)后，加入PEG-4000至質(zhì)量濃度比為20%。結(jié)果如圖5和圖6所示，PEG可以有效提高鵝掌楸細(xì)胞攝入Cdk/ZnS量子點(diǎn)的能力，尤其可以顯著增加對(duì)(_) CdSe/ZnS的攝入量。實(shí)施例5(士)CdSe/ZnS量子點(diǎn)作為納米基因載體，其自身的細(xì)胞毒性是必須考慮的。已有的動(dòng)物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，CdSe/ZnS量子點(diǎn)具有一定的細(xì)胞毒性，所以本實(shí)驗(yàn)采用FDA染色法，方法同實(shí)施例2，系統(tǒng)分析(士)Cdk/ZnS量子點(diǎn)對(duì)鵝掌楸細(xì)胞造成的生理毒性，類似實(shí)驗(yàn)尚未見報(bào)道。FDA本身無熒光、無極性，但通過細(xì)胞膜后，將會(huì)受到酯酶分解而產(chǎn)生具有熒光性質(zhì)的熒光素，它不能自由出入細(xì)胞膜。因此有活力的細(xì)胞能產(chǎn)生熒光，同時(shí)也可以利用其熒光強(qiáng)度定量分析細(xì)胞的活力。結(jié)果顯示，依據(jù)與空白樣品分析結(jié)果，鵝掌楸細(xì)胞在與( + )CdSe/ ZnS量子點(diǎn)共培養(yǎng)池之后，仍具有很好的活力，如圖7 (A) (a)所示，而和(-)CdSe/ZnS量子點(diǎn)共培養(yǎng)池后，鵝掌楸細(xì)胞活力已受到抑制，如圖7 (A) (b)所示。而在9h后，無論(+ ) Cdk/ZnS或(-)Cc^e/ZnS樣品中都出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞死亡現(xiàn)象。類似的情況同樣發(fā)生在 PEG介導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，所以相對(duì)于(-)Cc^e/ZnS量子點(diǎn)，( + )Cc^e/ZnS量子點(diǎn)更有可能成為鵝掌楸細(xì)胞的納米基因載體，但需要控制在較短的共孵育時(shí)間(廣5h以內(nèi))。實(shí)施例6
對(duì)于植物細(xì)胞攝入納米顆粒的機(jī)理一直存在爭(zhēng)議，Exteberria等人認(rèn)為，假挪威槭 (Acer pseudoplatanus)原生質(zhì)體可以通過細(xì)胞液相內(nèi)吞作用攝入量子點(diǎn)；Liu等人也報(bào)道了完整的煙草細(xì)胞(Nicotiana tabacum)可以通過細(xì)胞液相內(nèi)吞作用攝入碳納米管；最近，Serag等人提出了碳納米管主要是通過刺入長(zhǎng)春花(Catharanthus roseus)原生質(zhì)體的細(xì)胞膜機(jī)理，進(jìn)入其內(nèi)部。為了進(jìn)一步探索鵝掌楸細(xì)胞攝入Cdk/ZnS量子點(diǎn)的相關(guān)機(jī)理，在4°C下進(jìn)行( + )CdSe/ZnS量子點(diǎn)和鵝掌楸細(xì)胞共培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。對(duì)比圖 2中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為，共培養(yǎng)的初期(3h以內(nèi))，鵝掌楸細(xì)胞主要是依靠液相內(nèi)吞作用攝入 ( + )CdSe/ZnS量子點(diǎn)，而(-)CdSe/ZnS量子點(diǎn)由于其自身團(tuán)聚和靜電作用，導(dǎo)致無法被細(xì)胞通過液相內(nèi)吞攝入。在4°C，鵝掌楸細(xì)胞沒有攝入( + )CdSe/ZnS量子點(diǎn)，這主要是由于低溫可以抑制細(xì)胞的液相胞吞作用。隨著時(shí)間延長(zhǎng)到9h后，鵝掌楸細(xì)胞的細(xì)胞膜喪失完整性， (士)Cdk/ZnS量子點(diǎn)可以通過濃度擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，而不再依靠細(xì)胞的液相內(nèi)吞作用， 這也導(dǎo)致了無論在4或23°C，(士)Cdk/ZnS量子點(diǎn)都可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部?？傊?，植物細(xì)胞攝入納米顆粒機(jī)理相當(dāng)復(fù)雜，其過程是多種作用相互協(xié)同發(fā)生的。同時(shí)，盡管植物細(xì)胞壁是大分子物質(zhì)胞間運(yùn)輸?shù)闹饕琳?，但尺寸合適的外源物質(zhì)進(jìn)入植物細(xì)胞的困難并不是由于細(xì)胞壁造成的，而是在于細(xì)胞膜。所以提高外源物質(zhì)導(dǎo)入植物細(xì)胞內(nèi)部的效率，可以利用 PEG介導(dǎo)，增加植物細(xì)胞膜的通透性來實(shí)現(xiàn)。實(shí)施例7
上述實(shí)施例1至實(shí)施例6，可知量子點(diǎn)材料CcKe/ZnS量子點(diǎn)，尺寸為30nm以內(nèi)，表面電荷性質(zhì)為正電荷，可以在以納米基因載體建立高效的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因體系中的應(yīng)用。適用于植物細(xì)胞的量子點(diǎn)材料應(yīng)該具備尺寸大小應(yīng)該控制在30nm以內(nèi)(植物細(xì)胞壁空隙在2(T40nm);表面電荷性質(zhì)應(yīng)避免為負(fù)電荷，降低其自身的細(xì)胞毒性；還可以進(jìn)一步通過生物偶聯(lián)技術(shù)固定靶分子和細(xì)胞膜中相應(yīng)的受體相互締合，誘導(dǎo)細(xì)胞高效攝入；同時(shí)可以利用PEG等化學(xué)試劑增加細(xì)胞膜通透性，增加細(xì)胞攝入納米顆粒的能力。此外，還可以利用超聲、電刺激等物理手段來達(dá)到同一目的。
權(quán)利要求
1.一種Cdk/ZnS量子點(diǎn)與植物細(xì)胞的共孵育方法，其特征在于取1 IOmL濃度為廣5X IO5個(gè)/mL鵝掌楸單細(xì)胞懸浮液，放置于離心管中，加入10 50 μ L濃度為 1 ~ 6ymol/L的CdSe/ZnS水溶性量子點(diǎn)，控溫20 37 °C，5(Tl00r/min，搖床培養(yǎng)3 9h ； 200(T4000r/m離心5 lOmin，棄上清，用細(xì)胞培養(yǎng)液洗去未被細(xì)胞內(nèi)吞的Cdk/ZnS量子點(diǎn)， 即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Cdk/ZnS量子點(diǎn)與植物細(xì)胞的共孵育方法，其特征在于所述的CcKe/ZnS量子點(diǎn)，尺寸為1 30nm以內(nèi)，表面電荷性質(zhì)為正電荷。
3.權(quán)利要求2所述的Cdk/ZnS量子點(diǎn)在以納米基因載體建立高效的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因體系中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Cdk/ZnS量子點(diǎn)與植物細(xì)胞的共孵育方法，其特征在于加入CcKe/ZnS水溶性量子點(diǎn)后，再加入PEG-4000至質(zhì)量濃度為20%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種CdSe/ZnS量子點(diǎn)與植物細(xì)胞的共孵育方法，所述的量子點(diǎn)材料為CdSe/ZnS量子點(diǎn)，尺寸為30nm以內(nèi)，表面電荷性質(zhì)為正電荷。該植物細(xì)胞的量子點(diǎn)材料在以納米基因載體建立高效的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因體系中的應(yīng)用。本發(fā)明以CdSe/ZnS量子點(diǎn)與雜交鵝掌楸的胚性懸浮細(xì)胞采用不同的條件進(jìn)行共孵育，結(jié)果表明胞吞進(jìn)入完整細(xì)胞內(nèi)部的表面攜帶正電荷的CdSe/ZnS納米顆粒的量明顯與共培養(yǎng)時(shí)間、溫度有明顯的依賴關(guān)系，它們可以通過細(xì)胞的液相胞吞作用進(jìn)入雜交鵝掌楸細(xì)胞內(nèi)，且不影響細(xì)胞的活性；因此以表面攜帶正電荷的CdSe/ZnS量子點(diǎn)納米材料作為基因載體，在植物懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因研究和應(yīng)用中具有廣泛的前景，能夠?yàn)橹参锘蚬こ烫峁┬滦偷臒o機(jī)納米基因載體和轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102250944SQ20111014662
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月2日
發(fā)明者夏兵, 施季森, 董琛, 陳金慧 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)