一種含有l(wèi)oxP-kan^r-loxP片段的重組質(zhì)粒載體p18-kan^±的構(gòu)建方法

專利名稱：一種含有l(wèi)oxP-kan^r-loxP片段的重組質(zhì)粒載體p18-kan^±的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
在進(jìn)行真核生物基因敲除、替換等實驗過程中，往往會用到karf基因作為篩選標(biāo)記，應(yīng)用IoxP位點作為去除抗性標(biāo)記基因工具位點。在實際應(yīng)用中，這一功能片段通常是應(yīng)用融合PCR等互補(bǔ)PCR手段與目的基因重組連接的。但是，在實際操作中往往會因為PCR 錯配及引物特異性等不足，使得連接失敗或產(chǎn)物基因失活，最終導(dǎo)致實驗失敗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種含有l(wèi)oxP-karf-loxP片段的重組質(zhì)粒載體plS-kaf 的構(gòu)建方法。含有l(wèi)oxP-karf-loxP片段的重組質(zhì)粒載體plS-kaf的構(gòu)建方法按以下步驟進(jìn)行一、采用PCR技術(shù)從pUG6質(zhì)粒中獲得loxP-karf-loxP片段；二、膠回收1.6Kb的 loxP-kanr-loxP片段，然后以2. 7Kb的pMD18_T載體作為骨架，通過T-A末端連接，獲得連接產(chǎn)物；三、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，然后涂布于氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，挑取陽性克隆，接種于氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)后采用堿裂解法提取重組質(zhì)粒，即完成含有l(wèi)oxP-karf-loxP片段的重組質(zhì)粒載體plS-kar^的構(gòu)建。本發(fā)明利用pMDIS-T載體作為模板，向其多克隆位點上引入loxP-karf-loxP基因片段，同時構(gòu)建出一對連接方向相反的重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒loxP-karf-loxP位點兩端具有多個常用酶切位點，外源基因便于與loxP-karf-ΙοχΡ片段連接，為真核生物基因敲除、替換提供了新的操作途徑。本發(fā)明PCR獲得loxP-karf-loxP基因片段，將其連入到質(zhì)粒載體pMD18_T多克隆位點中，獲得重組質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)化、藍(lán)白篩選后獲得含有l(wèi)oxP-karf-loxP片段的重組質(zhì)粒載體 plS-kaf，經(jīng)PCR及酶切鑒定，結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符，測序結(jié)果顯示loxP-karf-loxP片段以兩個不同方向成功連入質(zhì)粒中，含有l(wèi)oxP-karf-loxP片段的重組質(zhì)粒載體plS-kar^構(gòu)建成功。
具體實施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式含有l(wèi)oxP-karf-loxP片段的重組質(zhì)粒載體plS-kaf的構(gòu)建方法按以下步驟進(jìn)行一、采用PCR技術(shù)從pUG6質(zhì)粒中獲得 loxP-kanr-loxP 片段；二、膠回收 1. 6Kb 的 loxP-karf-loxP 片段，然后以 2. 7Kb 的 pMD18_T 載體作為骨架，通過T-A末端連接，獲得連接產(chǎn)物；三、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，然后涂布于氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，挑取陽性克隆，接種于氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)后采用堿裂解法提取重組質(zhì)粒，即完成含有l(wèi)oxP-karf-loxP 片段的重組質(zhì)粒載體Pl8-kan±的構(gòu)建。本實施方式中pUG6質(zhì)粒、大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞、pMD18_T載體均為購買得到(NewEngland Biolabs Inc. ,MA,USA)；本實施方式在具體操作中涉及使用的各種反應(yīng)試劑或試劑盒均為購買得到(寶生物工程有限公司)，且使用均按說明書操作。本實施方式步驟二中連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，然后涂布于氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的具體過程將大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞從-70°C取出，在冰上融化后加入5μ 1連接產(chǎn)物，冰中放置30分鐘，然后42°C熱休克90秒，再冰浴 2-3分鐘，加入37°C預(yù)熱的S. 0. C培養(yǎng)基900 μ 1，37°C振蕩培養(yǎng)1小時(160-200rpm)，然后 4000r/min離心3分鐘，棄上清，保留200 μ 1培養(yǎng)基，將沉淀重新混勻后，涂布于氨芐抗性的 LB固體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜。本實施方式步驟三中采用堿裂解法提取重組質(zhì)粒的具體過程隨機(jī)挑取生長于氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上的數(shù)個白色菌落分別接種于氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 振蕩培養(yǎng)過夜；取1. 5ml培養(yǎng)液于微量離心管中，10, OOOg離心30秒，棄上清，將沉淀重懸于100 μ 1冰預(yù)冷的溶液I (50mM葡萄糖，25mMTris_HCI，IOmM EDTA, pH8. 0)中，劇烈振蕩以分散沉淀；再加入200 μ 1新配制的溶液II (0. 2Μ NaOH, 1 % SDS)，顛倒混勻幾次后置冰浴5分鐘，然后加入150 μ 1溶液III (5Μ乙酸鉀60ml，冰乙酸11. 5ml，水28. 5ml配制而成)， 顛倒混勻數(shù)次，冰浴10分鐘后于4°C 12000r/min離心10分鐘，取上清加入等體積的酚、氯仿各抽提一次，取上層水相加入1倍體積的異丙醇，-20°C沉淀10分鐘；4°C 12000r/min離心15分鐘，棄上清，沉淀用70% (體積)乙醇洗滌1次后真空干燥；沉淀用適量含RNA酶 (20 μ g/ml)的 TE(10mM Tris-HCI, ImM EDTA, ρΗ8· 0)(不含 DNA 酶)溶解，37°C作用 30 分鐘。本實施方式步驟三中提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定PCR的反應(yīng)體系為18 μ L反應(yīng)體系，由下列成分組成
成分
模板 DNA pUG6 20pmol/L 引物 1 5'- GTACGCTGCAGGTCGAC -3' 20pmol/L 引物 2 5'- GCCACTAGTGGATCTGATATC -3 10 X擴(kuò)增緩沖液 2.5mM mmol/L dNTP 混合液 5υ/μ1 U Taq DNA 聚合酶 ddH20
4
用量
Ιμ Ιμ
Ιμ
2.5μL Ιμ 0.5|iL ΙΙμ
PCR 條件為94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 10s，57°C退火 15s，72°C延伸 2min，共 30 個循環(huán)，再72°C延伸10min，4°C保溫。重組質(zhì)粒進(jìn)行單酶切鑒定PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，進(jìn)行Hind III單酶切，酶切體系如下
重組質(zhì)粒2μ1
HindlllΙμ
IOXMBuffer2μ1
ddH20補(bǔ)至終體積為15μ1重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測定測序工作交由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。含有l(wèi)oxP-karf-loxP片段的重組質(zhì)粒載體pl8-kan±中kan抗性及兩端酶切位點測序結(jié)果如下可見同原始序列中沈 1619bp部分相同(原始序列參見pUG6質(zhì)粒的全長編碼序列，見SEQ ID No. 1)，沒有變化；測序結(jié)果顯示loxP-karf-loxP片段以兩個不同方向
成功連入質(zhì)粒中，含有l(wèi)oxP-karf- οχΡ片段的jI組質(zhì)粒載體Pl8-kan±構(gòu)建成功。
GTACGCTGCAGGTCGACAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTA
TTAGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGCCGGGTCACCCGGCCAGCGACAT
GGAGGCCCAGAATACCCTCCTTGACAGTCTTGACGTGCGCAGCTCAGGGGCATGATGTGA
CTGTCGCCCGTACATTTAGCCCATACATCCCCATGTATAATCATTTGCATCCATACATTT
TGATGGCCGCACGGCGCGAAGCAAAAATTACGGCTCCTCGCTGCAGACCTGCGAGCAGGG
AAACGCTCCCCTCACAGACGCGTTGAATTGTCCCCACGCCGCGCCCCTGTAGAGAAATAT
AAAAGGTTAGGATTTGCCACTGAGGTTCTTCTTTCATATACTTCCTTTTAAAATCTTGCT
AGGATACAGTTCTCACATCACATCCGAACATAAACAACCATGGGTAAGGAAAAGACTCAC
GTTTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCT
CGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCG
CCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATG
GTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGT
ACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGCAAAACAGCATTCCAGGTA
TTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGC
CGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTC
GCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAG
CGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCA
CCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGG
AAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTT
GCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAA
AAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAG
TTTTTCTAATCAGTACTGACAATAAAAAGATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTAT
AGTTTTTTTATATTGTAGTTGTTCTATTTTAATCAAATGTTAGCGTGATTTATATTTTTT
TTCGCCTCGA CATCATCTGC CCAGATGCGA AGTTAAGTGC GCAGAAAGTA ATATCATGCGTCAATCGTAT GTGAATGCTG GTCGCTATAC TGCTGTCGAT TCGATACTAA CGCCGCCATCCAGTGTCGAA AACGAGCTCT CGAGAACCCT TAATATAACT TCGTATAATG TATGCTATACGAAGTTATTA GGTGATATCA GATCCACTAG TGGC。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中PCR的反應(yīng)體系為18 μ L反應(yīng)體系，由下列成分組成
成分
用量 Ιμ Ιμ
模板 DNA pUG6 20pmol/L 引物 1 5'- GTACGCTGCAGGTCGAC -3'
20pmol/L 引物 2l|iL
5'- GCCACTAGTGGATCTGATATC -3'
10 X擴(kuò)增緩沖液2.5|iL
2.5mM mmol/L dNTP 混合液l|iL
5υ/μ1 U rTaq DNA 聚合酶0.5|iL
ddH20ΙΙμ PCR 條件為94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 10s，57°C退火 15s，72°C延伸 2min，共 30 個循環(huán)，再72°C延伸10min，4°C保溫。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
下
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中連接的體系如
成分用量
pMD18-T 載體l|iL
loxP-kanr"loxP 片段4|iL
Solutionl5 μι連接條件為16°C連接池。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。本實施方式中Solutionl是商品化產(chǎn)品，購買自TAKARA公司，是一種連接酶及緩沖液的混合物，購買試劑盒中標(biāo)配試劑，按照說明書操作使用。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟三中氨芐抗性的 LB固體培養(yǎng)基每IOOOmL由100 μ g的氨芐青霉素、IOg的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、20g的瓊脂、IOg的NaCl和余量的水組成，pH值為6. 0 8. 0。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟三中氨芐抗性的 LB液體培養(yǎng)基每IOOOmL由100 μ g的氨芐青霉素、IOg的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、IOg的NaCl和余量的水組成，pH值為6. 0 8. 0。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
權(quán)利要求
1.一種含有l(wèi)oxP-karf-loxP片段的重組質(zhì)粒載體pl8-kan±的構(gòu)建方法，其特征在于含有l(wèi)oxP-karf-loxP片段的重組質(zhì)粒載體pl8-kan±的構(gòu)建方法按以下步驟進(jìn)行一、采用 PCR技術(shù)從pUG6質(zhì)粒中獲得loxP-kanr-loxP片段；二、膠回收1. 6Kb的loxP-kanr-loxP片段，然后以2. 7Kb WpMDlS-T載體作為骨架，通過T-A末端連接，獲得連接產(chǎn)物；三、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，然后涂布于氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，挑取陽性克隆，接種于氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)后采用堿裂解法提取重組質(zhì)粒， 即完成含有l(wèi)oxP-kar^-loxP片段的重組質(zhì)粒載體plS-kaf的構(gòu)建。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含有l(wèi)oxP-karf-loxP片段的重組質(zhì)粒載體plS-kaf的構(gòu)建方法，其特征在于步驟一中PCR的反應(yīng)體系為18 μ L反應(yīng)體系，由下列成分組成成分用量模板 DNA pUG6Ιμ 20pmol/L 引物 1l|iL 5'- GTACGCTGCAGGTCGAC -3'20pmol/L 引物 2l|iL 5'- GCCACTAGTGGATCTGATATC -3'10 X擴(kuò)增緩沖液2.5|iL2.5mM mmol/L dNTP 混合液1 μ 5υ/μ1 Taq DNA 聚合酶0.5|iLddH20ΙΙμ PCR條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性10s，57°C退火15s，72°C延伸2min，共30個循環(huán)，再72°C延伸10min，4°C保溫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含有l(wèi)oxP-karf-loxP片段的重組質(zhì)粒載體plS-kaf的構(gòu)建方法，其特征在于步驟二中連接的體系如下成分用量pMD18-T 載體l|iLloxP-kanr"loxP 片段4|iLSolutionl5 μι連接條件為16°C連接池。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含有l(wèi)oxP-karf-loxP片段的重組質(zhì)粒載體plS-kaf的構(gòu)建方法，其特征在于步驟三中氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基每IOOOmL由100 μ g的氨芐青霉素、IOg的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、20g的瓊脂、IOg的NaCl和余量的水組成，pH值為6. 0 8. 0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含有l(wèi)oxP-karf-loxP片段的重組質(zhì)粒載體pl8-kan±的構(gòu)建方法，其特征在于步驟三中氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基每IOOOmL由100 μ g的氨芐青霉素、IOg的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、IOg的NaCl和余量的水組成，pH值為6. 0 8. 0。
全文摘要
一種含有l(wèi)oxP-kanr-loxP片段的重組質(zhì)粒載體p18-kan±的構(gòu)建方法，它涉及一種重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法。方法1、從pUG6質(zhì)粒中獲得loxP-kanr-loxP片段；2、以pMD18-T載體作為骨架，通過T-A末端連接獲得連接產(chǎn)物；3、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，提取重組質(zhì)粒即完成。本發(fā)明利用pMD18-T載體作為模板，向其多克隆位點上引入loxP-kanr-loxP基因片段，同時構(gòu)建出一對連接方向相反的重組質(zhì)粒，質(zhì)粒loxP-kanr-loxP位點兩端具有多個常用酶切位點，外源基因便于與loxP-kanr-loxP片段連接，為真核生物基因敲除、替換提供了新的操作途徑。
文檔編號C12N15/64GK102250937SQ20111014284
公開日2011年11月23日 申請日期2011年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月30日
發(fā)明者原韜, 張曉彥, 沙長青, 谷軍, 趙曉龍, 陳兵 申請人:黑龍江省科學(xué)院微生物研究所