重組IgE-Fc-抗EGFR單鏈抗體融合蛋白及其制備方法和用途的制作方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：重組IgE-Fc-抗EGFR單鏈抗體融合蛋白及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及編碼包含IgE-Fc段和抗EGFR的單鏈抗體(ScFv)重組融合蛋白的編碼DNA、其所編碼的融合蛋白、該融合蛋白的生產(chǎn)方法、該融合蛋白的藥物用途以及該融合蛋白的治療方法。
背景技術(shù)：
人體免疫球蛋白分為IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五類(lèi)。作為機(jī)體體液免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)分子，不同的免疫球蛋白行使著不同的功能。其中IgG是體液免疫反應(yīng)的主要抗體，它在血清中的含量最高，達(dá)6 16mg/ml，占血清Ig總量的75% 80%，分子量150kDa。IgG 的Fc段可與中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等表面的Fc受體結(jié)合，激活效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷，發(fā)揮抗感染、中和毒素及免疫調(diào)理作用。IgE是正常人血清中含量最少的一種免疫球蛋白，其含量為0. 0001 0. 009mg/ml，約為IgG濃度的0. 05%，其分子量約為190kDa。 一直以來(lái)大家都認(rèn)為IgE的功能主要是參與抗寄生蟲(chóng)免疫以及與某些環(huán)境因子作用引起I 型超敏反應(yīng)。寄生在人和動(dòng)物體多種病原寄生物(如線蟲(chóng)、血吸蟲(chóng)等)就是被這種抗體抑制和清除的。當(dāng)病原物或者過(guò)敏物與IgE結(jié)合后，其Fc段與肥大細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞表面多個(gè)IgE-Fc受體分子(Fe ε Rs)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致肥大細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞的活化和生物活性物質(zhì)的釋放[1’2]。IgE-Fc主要有兩種受體=Fc ε RI和Fc ε RII (CD23)， 其中高親和力受體Fc ε RI主要分布在肥大細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞和單核細(xì)胞表面，低親和力受體Fc ε RII主要分布在巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞表面[3’4]。IgE與這些效應(yīng)細(xì)胞表面的受體結(jié)合后刺激效應(yīng)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和趨化因子，引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，這些細(xì)胞因子包括白介素、組織胺、趨化因子、腫瘤壞死因子等。IgE與效應(yīng)細(xì)胞上受體結(jié)合的區(qū)域位于其Fc段(IgE-Fc)，也就是其重鏈的C ε 2、C ε 3、C ε 4區(qū)域。如果受體分子在巨噬細(xì)胞上，則介導(dǎo)細(xì)胞吞噬作用來(lái)殺死對(duì)應(yīng)的細(xì)胞或者病原物，即抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞吞噬作用(antibody-d印endent cellular phagocytosis，ADCP)[6]。近年來(lái)的一些研究表明 IgE在腫瘤發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要的免疫監(jiān)控和免疫增強(qiáng)作用。本發(fā)明利用IgE所介導(dǎo)的免疫增強(qiáng)反應(yīng)其實(shí)就是利用IgE-Fc來(lái)偶聯(lián)效應(yīng)細(xì)胞，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行局部的殺傷[7』。近20年來(lái)，單克隆抗體作為藥物治療疾病尤其是治療腫瘤取得了突破性進(jìn)展，已經(jīng)有27個(gè)抗體被FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床，如抗CD20單抗美羅華(Rituximab)[8]和抗VEGF單抗貝伐單抗(Bevac izumab，Avast in) M。同時(shí)，有近500個(gè)抗體目前處于臨床前和臨床研究階段。經(jīng)典的抗腫瘤抗體不管是鼠源化的還是嵌合的或是人源化的甚至是全人的抗體基本都是以IgG型(主要是IgGl)為基礎(chǔ)的。其抗腫瘤機(jī)理為(1)介導(dǎo)補(bǔ)體的溶細(xì)胞效應(yīng)，即補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒效應(yīng)(complement dependent cytotoxicity, CDC)，IgG (IgGl 和 IgG3)類(lèi)抗體與腫瘤表面抗原結(jié)合后，激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑，最終形成膜攻擊復(fù)合物(membrane attack complex，MAC)，溶解腫瘤細(xì)胞。(2)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)，即NK細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞通過(guò)其表面FcyR與抗腫瘤抗體(IgG)結(jié)合，借助細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)效應(yīng)而殺傷月中瘤。(3)抗體的免疫調(diào)理作用，即抗腫瘤抗體與吞噬細(xì)胞表面FcyR結(jié)合，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬功能。此外，抗腫瘤抗體與腫瘤抗原結(jié)合能活化補(bǔ)體，借助所產(chǎn)生的Ob與吞噬細(xì)胞表面CRl結(jié)合， 促進(jìn)其吞噬作用。(4)抗體封閉腫瘤細(xì)胞表面某些受體抗體可通過(guò)封閉腫瘤細(xì)胞表面某些受體影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。(5)干擾腫瘤細(xì)胞粘附作用，某些抗體可阻斷腫瘤細(xì)胞表面粘附分子與血管內(nèi)皮細(xì)胞或其他細(xì)胞表面的粘附分子配體結(jié)合，從而阻止腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、粘附和轉(zhuǎn)移。機(jī)體抗腫瘤效應(yīng)十分復(fù)雜，特異性和非特異性抗腫瘤機(jī)制相互交錯(cuò)，體液免疫與細(xì)胞免疫機(jī)制相互協(xié)調(diào)和補(bǔ)充，共同執(zhí)行免疫監(jiān)視功能[1°’11]。總的來(lái)說(shuō)，IgG大部分是通過(guò)ADCC和CDC途徑介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；而本研究的IgE抗腫瘤活性的機(jī)制與此有所不同，我們更多的是利用細(xì)胞因子療法，即通過(guò)IgE介導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子在腫瘤細(xì)胞表面進(jìn)行局部殺傷作用。所以，它們的抗腫瘤機(jī)制側(cè)重不同，而IgE抗體與傳統(tǒng)的IgG相比不僅具有IgG的主要免疫功能，更具有一些IgG不可替代的優(yōu)勢(shì)，這將在文章的討論部分逐一探討[12]。本研究以此理論為基礎(chǔ)，選擇了 IgE作為抗體改建的原型來(lái)構(gòu)建更新型、更高效的免疫應(yīng)答融合蛋白分子。所以，作為一種前瞻性的治療策略，IgE的抗腫瘤功能和活性的驗(yàn)證是非常值得探索的。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是原癌基因 c-erbBl的表達(dá)產(chǎn)物。EGFR廣泛分布于哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞表面，EGFR信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化等生理過(guò)程發(fā)揮重要的作用。其自分泌途徑是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素，在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、腫瘤血管新生及轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[13]。通常情況下，EGFR酪氨酸激酶以單體形式存在，在結(jié)構(gòu)上由胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)3個(gè)部分組成，其中胞外區(qū)具有兩個(gè)半胱氨酸豐富區(qū)，胞內(nèi)區(qū)具有典型的ATP 結(jié)合位點(diǎn)和酪氨酸激酶區(qū)。當(dāng)特異性的配體和EGFR受體結(jié)合后，引起受體由失活的單體狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ畹亩刍癄顟B(tài)，進(jìn)而激活胞內(nèi)內(nèi)在的酪氨酸激酶，其胞內(nèi)段的酪氨酸殘基被自磷酸化或交叉磷酸化，引起下游包括PII-Akt、MAPK-ERK等信號(hào)通路的激活，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、存活以及新生血管生成[14]。目前在多種實(shí)體瘤如乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、頭頸癌、卵巢癌、腦腫瘤中均發(fā)現(xiàn)EGFR的過(guò)表達(dá)。近年來(lái)，靶向 EGFR家族的抗腫瘤藥物研發(fā)已經(jīng)成為一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域，其中針對(duì)EGFR的單抗西妥昔(C225， Erbitux)和小分子酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼(Gefitinib，Ireasa)已經(jīng)成功地應(yīng)用于臨
ι± [15,16]
沐 ο單鏈抗體(single chain variable fragment, scFv)是將抗體的重鏈可變區(qū)VH 和輕鏈可變區(qū)VL通過(guò)連接肽(Linker)重組而成的一種小分子基因工程抗體，它保有了原有抗體良好的抗原結(jié)合能力，且具有分子量小，穿透力強(qiáng)，體內(nèi)循環(huán)半衰期短以及免疫原性低等特性。在此基礎(chǔ)上，可與其它效應(yīng)分子構(gòu)建成多種具有新功能的抗體分子，是構(gòu)建免疫毒素和雙特異性抗體的基礎(chǔ)元件。近年來(lái)單鏈抗體的研發(fā)越來(lái)越受到重視，并且也有一些這樣的抗體進(jìn)入到臨床試驗(yàn)[17]。本發(fā)明目前需要進(jìn)行新型的高效、低副作用的抗腫瘤治療藥物的研制，以滿足人們的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是為抗腫瘤藥物治療提供一種新的有效選擇。本發(fā)明解決該技術(shù)問(wèn)題的主要方案是提供了一種新的融合蛋白質(zhì)。本發(fā)明融合蛋白質(zhì)是由抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體EGFR scFv與來(lái)自人免疫球蛋白IgE的Fc段IgE-Fc構(gòu)成，EGFR scFv和IgE-Fc之間由連接肽相連。該融合蛋白質(zhì)可稱(chēng)為重組IgE-Fc-抗EGFR單鏈抗體融合蛋白。單鏈抗體可以輕鏈在前，也可重鏈在前。EGFR scFv和IgE-Fc之間可EGFR scFv在前，也可IgE-Fc。優(yōu)選的是EGFR scFv在前(N端)。其中，上述的融合蛋白質(zhì)中所述的人免疫球蛋白IgE的Fc段的氨基酸序列為(1)如序列表中SEQ ID NO. 4所述；或者O):在SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸所得功能相同或相似的多肽。其中，上述的融合蛋白質(zhì)中所述的人抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體的氨基酸序列為(1)如序列表中SEQ ID NO. 2所述?；蛘逴)在SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸所得功能相同或相似的多肽。其中，上述融合蛋白質(zhì)中所述的連接肽為人免疫球蛋白鉸鏈區(qū)。其中，上述融合蛋白質(zhì)中所述的人免疫球蛋白鉸鏈區(qū)的氨基酸序列為EPKSCDKTHTCPPCPo如無(wú)特別說(shuō)明，本發(fā)明中列舉的氨基酸序列從左到右均是從氮端到碳端。其中，上述融合蛋白質(zhì)中所述的抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體EGFR scFv的內(nèi)部有連接輕鏈和重鏈的連接肽，其連接肽的氨基酸序列為GGGGSGGGGSGGGGS。其中，上述融合蛋白質(zhì)的氨基酸序列為(1)如序列表中SEQ ID NO. 12所示；或者( 在SEQ ID No. 12所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/ 或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸所得功能相同或相似的蛋白質(zhì)。該融合蛋白質(zhì)可表示為 IgE-Fc-EGFRscFv。進(jìn)一步的，上述的融合蛋白質(zhì)，其特征在于，還在N端連接有信號(hào)肽。其中，上述融合蛋白質(zhì)的氨基酸序列為(1)如序列表中SEQ ID NO. 8所示；或者O)在SEQ ID No. 8所示的蛋白的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸所得的與SEQ ID No. ？所示的融合蛋白質(zhì)的功能相同或相似的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了編碼上述融合蛋白質(zhì)的重組DNA。其中，上述的重組DNA的核苷酸序列為(1)如序列表中的 SEQ ID N0. 7 或 SEQ ID NO. 11所或者為 SEQ ID N0. 7 或 SEQ ID NO. 11的簡(jiǎn)并序列；或者O)在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且與(1)限定的核苷酸序列編碼功能相同或相似的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了包含上述重組DNA的重組載體。
其中，上述重組載體為質(zhì)粒載體或病毒載體。同時(shí)，本發(fā)明還提供了包含上述重組載體的重組體。進(jìn)一步的，所述重組體是宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞最好是真核宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以用于分泌表達(dá)該融合蛋白。另外，本發(fā)明還提供了上述融合蛋白質(zhì)、上述的重組載體、或者上述的重組體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還進(jìn)而提供了一種藥物組合物。該藥物組合物包括上述的融合蛋白質(zhì)、重組載體、或者上述的重組體作為活性成分并添加藥學(xué)上的輔料。進(jìn)一步的，上述的藥物組合物，還包括任何一種或幾種其他的抗腫瘤藥物。本發(fā)明的要點(diǎn)在于設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一種人免疫球蛋白IgE的Fc段與抗人表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的單鏈抗體(scFv)的融合蛋白，其目的是利用EGFRscFv的靶向治療功能同時(shí)偶聯(lián)IgE-Fc這樣的免疫增強(qiáng)分子。既能夠靶向腫瘤細(xì)胞表面抗原發(fā)揮EGFRscFv的抗腫瘤機(jī)制，同時(shí)激發(fā)IgE-Fc介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，功能互補(bǔ)。對(duì)于EGFRscFv來(lái)說(shuō)，作為 EGFR的抗體，它本來(lái)就扮演著阻斷EGF和EGFR結(jié)合的功能，從而抑制由此引發(fā)的一系列信號(hào)通路所導(dǎo)致的血管生長(zhǎng)和腫瘤細(xì)胞增殖。而對(duì)于IgE-Fc利用它所介導(dǎo)ADCC、ADCP及多種抗腫瘤細(xì)胞因子來(lái)抑制或者殺死腫瘤細(xì)胞，二者相互配合，以得到更好的腫瘤治療效果。 由于加了人免疫球蛋白的Fc片段，以基因工程方式制備的融合蛋白會(huì)通過(guò)Fc片段的間形成二硫鍵以二聚體形式存在。本發(fā)明描述的包含人免疫球蛋白IgE的Fc段與抗人表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR) 的單鏈抗體(scFv)融合蛋白是通過(guò)常規(guī)的基因重組技術(shù)所構(gòu)建，具體實(shí)驗(yàn)步驟如《分子克隆》第三版(Jo^ph Sambrook，科學(xué)出版社)及類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)所記載。其中，IgE Fe、 EGFRscFv和連接肽分別是1.人免疫球蛋白IgE的Fc段，表示為IgE-Fc，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1 所述。2.抗人表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的單鏈抗體(scFv)，表示為EGFRscFv，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所述。3. IgE-Fc和EGFRscFv之間的所用的連接肽，表示為EPKSCDKTHTCPPCP，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 6所述。上述的優(yōu)化融合蛋白及其編碼的DNA可以通過(guò)常規(guī)的基因重組技術(shù)獲得。比如所需編碼人免疫球蛋白IgE的Fc段的DNA序列可從臨床哮喘患者外周血淋巴細(xì)胞克隆所得， 抗人表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的單鏈抗體(scFv)可從噬菌體抗體庫(kù)篩選所得，然后將編碼上述優(yōu)化融合蛋白的DNA序列用PCR或直接合成獲得后分別克隆到載體中，所用載體可以是分子生物學(xué)常用的質(zhì)粒、病毒或DNA片段。在編碼上述優(yōu)化融合蛋白的DNA序列前端加上蛋白分泌信號(hào)肽序列，以保證重組蛋白從細(xì)胞中分泌出來(lái)。載體序列中包括用于驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的啟動(dòng)子、蛋白質(zhì)翻譯起始和終止信號(hào)、以及多聚腺苷酸(PolyA)序列。載體中含有抗生素抗性基因，以利于載體在宿主細(xì)胞如細(xì)菌和真核細(xì)胞中的復(fù)制和表達(dá)。另外，載體中還包括真核細(xì)胞選擇性基因，用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞株的選擇。在完成含編碼上述優(yōu)化融合蛋白的DNA序列的質(zhì)粒構(gòu)建以后，即可用該重組載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，表達(dá)相應(yīng)的融合蛋白質(zhì)。能夠用于表達(dá)這些融合蛋白的表達(dá)系統(tǒng)有多種，可以是真核細(xì)胞，也可以是原核細(xì)胞，它們包括(但不限于)哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞等。由于本發(fā)明優(yōu)化融合蛋白的氨基酸序列中包含可糖基化的氨基酸，因此哺乳動(dòng)物細(xì)胞是表達(dá)該蛋白的優(yōu)選系統(tǒng)?？捎糜诖笠?guī)模表達(dá)蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞有多種， 例如CHO細(xì)胞、293細(xì)胞、NSO細(xì)胞、COS細(xì)胞、BHK細(xì)胞等，其它許多細(xì)胞也可以用于蛋白的表達(dá)，因此都包括在本發(fā)明所能使用的細(xì)胞之列。含有編碼上述優(yōu)化融合蛋白基因的重組質(zhì)?？山?jīng)轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法有多種，其中包括(但不限于)電穿孔法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和磷酸鈣轉(zhuǎn)染法等。一種較佳的蛋白表達(dá)方法是在已經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中對(duì)重組載體進(jìn)行基因擴(kuò)增，以提高相應(yīng)重組融合蛋白的表達(dá)量。例如，用含有新霉素(Neomycin)抗性基因的重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染無(wú)新霉素抗性的宿主細(xì)胞后，可在細(xì)胞培養(yǎng)液中增加新霉素的濃度以擴(kuò)增重組載體在宿主細(xì)胞中的拷貝數(shù)量；又例如用含有二氫葉酸還原酶(DHFR)基因的重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染缺乏DHFR的宿主細(xì)胞后，可在細(xì)胞培養(yǎng)液中增加氨甲喋呤(MTX)的濃度以擴(kuò)增重組載體在宿主細(xì)胞中的拷貝數(shù)量。哺乳動(dòng)物細(xì)胞以外的其他表達(dá)系統(tǒng)，例如細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞等也可以用于表達(dá)本發(fā)明的優(yōu)化融合蛋白，它們也被包含本發(fā)明所能使用的宿主細(xì)胞之列。這些表達(dá)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)量比哺乳動(dòng)物細(xì)胞的較高，但是所表達(dá)的蛋白質(zhì)缺乏糖基化或形成的糖鏈結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物細(xì)胞有所不同。優(yōu)化融合蛋白表達(dá)后，可用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)或其他方法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中的融合蛋白濃度。由于這些優(yōu)化融合蛋白含有免疫球蛋白Fe，因此可以用蛋白A親和層析法來(lái)純化所表達(dá)的優(yōu)化融合蛋白。此外，與其它蛋白純化方法如離子交換層析等聯(lián)合使用，可進(jìn)一步純化本發(fā)明的優(yōu)化融合蛋白。從重組體培養(yǎng)液中獲得相應(yīng)的優(yōu)化融合蛋白后，可以用細(xì)胞ELISA和流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢測(cè)其對(duì)EGFR的結(jié)合活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的優(yōu)化融合蛋白能夠結(jié)合EGFR陽(yáng)性的細(xì)胞如A431細(xì)胞，因此本發(fā)明所構(gòu)建的優(yōu)化融合蛋白可以阻斷IgE-Fc-EGFRscFv的結(jié)合， 是一種靶向EGFR，通過(guò)趨化和激活免疫效應(yīng)細(xì)胞來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。應(yīng)用純化方法獲得高純度的優(yōu)化融合蛋白后，可利用體外細(xì)胞模型和體內(nèi)動(dòng)物模型來(lái)檢測(cè)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效應(yīng)。在體外實(shí)驗(yàn)中，EGFR表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞如A549肺癌細(xì)胞、MDA-MB-435乳腺癌、Raji淋巴瘤細(xì)胞等都可以用MTT等方法來(lái)檢測(cè)優(yōu)化融合蛋白對(duì)這些細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，上述EGFR陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞可以用來(lái)構(gòu)建小鼠腫瘤模型，腫瘤模型可通過(guò)腹背側(cè)皮下、腹腔、尾靜脈等方法構(gòu)建，以用于觀察融合蛋白的抗腫瘤或抗轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明還提供了以病毒載體來(lái)運(yùn)載和表達(dá)這些優(yōu)化蛋白的方法。這些病毒載體包括但不限于腺病毒載體(adenoviral vectors)、腺相關(guān)病毒載體(adeno-associated viral vectors)、反轉(zhuǎn)錄病毒載體(retroviral vectors)、單純皰疫病毒載體(herpes simplex virus-based vectors)、t曼病毒載體(lentiviral vectors)。本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明融合蛋白和藥用載體的藥物組合物。該藥物組合物可以按照藥劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制備成各種形式的藥物制劑，較優(yōu)選的是注射劑，最優(yōu)選的是冷凍干燥注射劑。本發(fā)明的藥物組合物，其中還包括任何一種或幾種其它的具有協(xié)同作用的抗腫瘤藥物，所述組合物可以和其它治療方法一起治療腫瘤，所述其它治療方法包括化學(xué)療法、放射療法、生物療法。本發(fā)明以EGFR為靶點(diǎn)，構(gòu)建了 EGFRscFv，進(jìn)而聯(lián)合IgE-Fc構(gòu)建了 IgE-Fc-EGFRscFv這樣的融合蛋白類(lèi)的雙特異性抗體，其目的是利用EGFRscFv的靶向治療功能同時(shí)偶聯(lián)IgE-Fc這樣的免疫增強(qiáng)分子。既能夠靶向腫瘤細(xì)胞表面抗原發(fā)揮EGFRscFv 的抗腫瘤機(jī)制，同時(shí)激發(fā)IgE-Fc介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，功能互補(bǔ)。對(duì)于EGFRscFv來(lái)說(shuō)，作為EGFR的抗體，它本來(lái)就扮演著阻斷EGF和EGFR結(jié)合的功能，從而抑制由此引發(fā)的一系列信號(hào)通路所導(dǎo)致的血管生長(zhǎng)和腫瘤細(xì)胞增殖。而對(duì)于IgE-Fc利用它所介導(dǎo)ADCC、ADCP及多種抗腫瘤細(xì)胞因子來(lái)抑制或者殺死腫瘤細(xì)胞。希望二者能夠相互配合，以得到更好的腫瘤治療效果。在本發(fā)明不僅利用了抗體作為傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物的靶向作用，同時(shí)利用了抗體和抗體偶聯(lián)后的協(xié)同作用。本發(fā)明構(gòu)建的雙特異性融合蛋白抗體既利用了 EGFR單抗阻斷了 EGFR和EGF之間的偶聯(lián)，進(jìn)而抑制一系列由此引發(fā)的信號(hào)通路所導(dǎo)致的血管生成，腫瘤增殖。同時(shí)，也利用了 IgE的特殊的抗腫瘤活性，將效應(yīng)細(xì)胞集聚到腫瘤細(xì)胞組織周?chē)?，有效的利用了效?yīng)細(xì)胞發(fā)揮的ADCC和ADCP這樣的功能，抑制腫瘤的生長(zhǎng)，二者各種行使其功能互不干擾。而實(shí)驗(yàn)證明了當(dāng)把這2個(gè)抗體通過(guò)Linker連接在一起形成融合蛋白抗體后，它們的各自的功能并沒(méi)有因此受到影響。本發(fā)明雙特異性融合蛋白抗體在體內(nèi)外都具有良好的生物活性和穩(wěn)定性，能夠阻斷靶向EGFR陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞，激活免疫細(xì)胞，特異殺傷腫瘤細(xì)胞，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白的IgE-Fc序列為全人源序列，免疫原性低，而且整個(gè)融合蛋白的分子量低于其他抗體類(lèi)藥物，具有很好的應(yīng)用前景。


圖IRT-PCR擴(kuò)增出的IgE-Fc瓊脂糖凝膠電泳M為Marker，第1、2、3、4道均為PCR產(chǎn)物樣品，都在IOOObp處都出現(xiàn)了預(yù)期條帶，
結(jié)果與預(yù)期一致。圖2IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白的設(shè)計(jì)示意3EGFRscFv雙酶切鑒定Xbal和BamHI雙酶切后，電泳顯示第一道只有一條帶，沒(méi)有預(yù)期條帶出現(xiàn)，第2、3、 4、5道出現(xiàn)2條帶，其中大小約900bp的條帶為預(yù)期條帶，結(jié)果與預(yù)期一致。圖4IgE-Fc-EGFRScFV融合蛋白載體的雙酶切鑒定其中1道為融合蛋白質(zhì)粒；2道切下大小約IOOObp的條帶，雙酶切位點(diǎn)為)(bal和 BamHI ；3道切下大小約900bp的條帶，雙酶切位點(diǎn)為BamHI和NheI.圖5融合蛋白瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率及表達(dá)后Wfestern blot驗(yàn)證分析A 通過(guò)相同體系轉(zhuǎn)入pcDNA3. 1 (+)-GFP載體后觀察其轉(zhuǎn)染效率圖。B 第一道為轉(zhuǎn)染后的CHO細(xì)胞樣品，第二道為轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后的上清樣品，第三道為未轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞樣品，第四道為未轉(zhuǎn)染CHO的上清樣品。圖6融合蛋白載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后其穩(wěn)定株的篩選及驗(yàn)證分析6個(gè)克隆在不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)收集的上清作ELISA的檢測(cè)結(jié)果。圖7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面受體EGFR和Fc ε RICHO細(xì)胞、293細(xì)胞和U937單核細(xì)胞EGFR的表達(dá)結(jié)果為陰性，而Α431的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；CHO細(xì)胞，293細(xì)胞和A431細(xì)胞檢測(cè)受體Fc ε RI時(shí)結(jié)果為陰性，而U937單核細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。圖8利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)融合蛋白的IgE-Fc和EGFR scFv的活性檢測(cè)結(jié)果中中A、C、D圖均為陰性結(jié)果，B圖為陽(yáng)性結(jié)果，IgE-Fc和EGFR scFv表現(xiàn)出各自的功能。圖9IgE-Fc-EGFRScFV融合蛋白抗腫瘤功能分析圖中統(tǒng)計(jì)了每組A431細(xì)胞死亡指數(shù)，作統(tǒng)計(jì)分析，其結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)例對(duì)本發(fā)明所涉及的優(yōu)化融合蛋白的構(gòu)建、實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用作了詳細(xì)說(shuō)明。但是本發(fā)明的內(nèi)容和用途并不僅限于實(shí)例的范疇。實(shí)施例1 I gE-Fc基因的克隆采集哮喘病人的新鮮血液15ml，在無(wú)菌環(huán)境中分離出外周血淋巴細(xì)胞，用Trizol 法提取總的RNA。設(shè)計(jì)包括了起始密碼子和終止密碼子的引物做一步法RT-PCR。上游引物5，-CGGGATCCCCCACCGTGAAGATCTTACAGTCGT-3，(SEQID NO. 13)；下游引物5，-GCTCTAGATCATTTACCGGGATTTACAGACACCG-3，(SEQIDN0. 14)。得到的RT-PCR產(chǎn)物通過(guò)DNA電泳鑒定其大小約lOOObp，與預(yù)期中的970bp符合 (見(jiàn)圖1)。再將RT-PCR產(chǎn)物裝載入T-Easy載體后測(cè)序，與NCBI Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的序列進(jìn)行比對(duì)，序列一致。實(shí)施例2 :EGFRscFv的克隆從噬菌體抗體庫(kù)中篩選出的親和力較高的重鏈VH和輕鏈VL，以Linker連接構(gòu)建抗EGFR單鏈抗體(scFv)，并在EGFRscFv的N端添加分泌信號(hào)肽IgK序列，并按哺乳動(dòng)物密碼子對(duì)基因序列進(jìn)行重新設(shè)計(jì)和優(yōu)化，設(shè)計(jì)并合成寡核苷酸片段，通過(guò)重疊PCR法拼接成全長(zhǎng)EGFRscFv，載入PUC57載體中。獲得合成EGFRscFv序列后，將PUC57_EGFRSCFv轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增，將目標(biāo)序列按照設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)OCbaI和BamHI)做雙酶切反應(yīng)從PUC57載體中酶切下來(lái)，DNA 電泳可見(jiàn)第2、3、4、5泳道都切出了兩條帶，其中小條帶約為900bp，與預(yù)期結(jié)果相符，第1 泳道未酶切出預(yù)期條帶。將小片段回收后利用連接反應(yīng)將該片段克隆進(jìn)pcDNA3. 1(+)載體中，測(cè)序驗(yàn)證，與設(shè)計(jì)結(jié)果一致。 實(shí)施例3 JgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白的設(shè)計(jì)和載體構(gòu)建本發(fā)明中的融合蛋白的設(shè)計(jì)模式圖如圖2。NheKBamHiabaI為設(shè)計(jì)的克隆酶切位點(diǎn)。為了保證該融合蛋白能夠分泌到細(xì)胞外，我們選擇了 Ig kappa leader sequence ( BP IgK)作為分泌信號(hào)序列，因其穩(wěn)定性和高效性等優(yōu)勢(shì)常被選作蛋白質(zhì)真核表達(dá)載體的分泌序列，該序列共21個(gè)氨基酸Qlaa，METDTLLLWVLLLWVPGSTCD)，對(duì)應(yīng)的DNA序列為5 ’ -ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGA C-3，。連接EGFRscFv 重鏈(Heavy chain, VH, 354bp)和輕鏈(Light chain, VL,327bp) 的Linker采用(GGGGS) 3，其對(duì)應(yīng)的編碼核苷酸序列為(SEQ ID NO. 9) :GGTGGAGGCGGTTCAG GCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG。以往的研究表明該Linker具有較強(qiáng)的張力和柔性，穩(wěn)定性很強(qiáng)，常被選作scFv的鏈接部件。選擇了IgGl 的鉸鏈區(qū)即 Hinge 區(qū)，Ifea :EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO. 5)，編碼核苷酸序列為45個(gè)堿基GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA(SEQ ID NO. 6)來(lái)作為連接 EGFRscFv和IgE-Fc的中間連接區(qū)(連接肽)，以保證二者都能夠折疊形成各自正確的構(gòu)象。其中IgE-Fc長(zhǎng)度為970bp，EGFRscFv長(zhǎng)度為824bp，最終該IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白總長(zhǎng)度為1794bp，編碼597個(gè)氨基酸(SEQ ID NO. 10)的融合蛋白。本發(fā)明的目的是要構(gòu)建IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白的真核表達(dá)載體，在已經(jīng)分別有針對(duì)性的獲得了 IgE-Fc片段和EGFRscFv片段的前提下，采用分步連接方法將其克隆進(jìn)真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (+)中。載體構(gòu)建后分別做雙酶切驗(yàn)證，分別在第二泳道和第三泳道出現(xiàn)了大小約為IOOObp和850bp的預(yù)期條帶；預(yù)計(jì)分別為雙酶切下的IgE-Fc片段和 EGFRscFv片段條帶。取10 μ 1質(zhì)粒測(cè)序，測(cè)序報(bào)告與設(shè)計(jì)序列一致。實(shí)施例4 基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和融合蛋白表達(dá)的驗(yàn)證將已經(jīng)構(gòu)建好的IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白載體通過(guò)Lipo2000轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。為了檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況，首先將融合蛋白載體做瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，并且設(shè)4個(gè)組，它們分別為 JgE-Fc-EGFRscFv 融合蛋白組(2 μ g Plasmid+6 μ g LIP)、pcDNA3. 1 (+) (2 μ g Plasmid+6 μ gLIP)、GFP_pcDNA3. 1 (+) (2 μ g Plasmid+6 μ g LIP)、未轉(zhuǎn)染組，48 小時(shí)后分別收取已經(jīng)轉(zhuǎn)染了融合蛋白載體的CHO細(xì)胞樣品、轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞上清、未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞樣品和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清，做Western bolt驗(yàn)證該融合蛋白是否表達(dá)并且分泌在上清中，結(jié)果在第一道和第二道都觀察到目的蛋白的表達(dá)，分子量約為62kDa (還原條件下，為單鏈蛋白)，第三道和第四道未檢測(cè)到目的蛋白。同時(shí)，為了觀察該體系的轉(zhuǎn)染效率是否能夠滿足要求，我們于轉(zhuǎn)染48小時(shí)后用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)入pcDNA3. 1 (+)_GFP的CHO細(xì)胞(見(jiàn)圖 5)。獲得高純度編碼IgE-Fc-EGFRscFv的重組質(zhì)粒后，利用Lipofectamine 2000質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒anvitrogen公司)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞(ATCC)，在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)三天后收集CHO細(xì)胞上清液，可以用免疫印跡檢測(cè)IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白的表達(dá)(見(jiàn)圖5)。此方法可用于快速地獲取少量的IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白，其濃度可以用ELISA 法定量檢測(cè)，所用一抗可以為抗人IgE-Fc抗體。實(shí)施例5 JgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白在CHO細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)在驗(yàn)證該融合蛋白能夠在CHO細(xì)胞中表達(dá)的前提下，對(duì)轉(zhuǎn)染后的CHO細(xì)胞用G418 進(jìn)行穩(wěn)定株的篩選，挑選單克隆細(xì)胞，通過(guò)M孔板、6孔板、T25-Flask和T75_Flask中分級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，并保種。用ELISA方法檢測(cè)和篩選更換培養(yǎng)基后0、12、24、36、48、60小時(shí)后上清中融合蛋白的表達(dá)量，以此來(lái)篩選出其中最高效表達(dá)株。結(jié)果顯示4號(hào)克隆在培養(yǎng)基更換后48小時(shí)的時(shí)候表達(dá)量最(大見(jiàn)圖6)。本發(fā)明中融合蛋白是在CHO細(xì)胞中表達(dá)并分泌到培養(yǎng)液中的，并利用葡萄球菌蛋白A親和層析的方法純化所得。包含IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)液可采用葡萄球菌蛋白A親和層析的方法進(jìn)行純化。將蛋白A-kpharose層析柱以PBS緩沖液平衡后，將超濾器濃縮過(guò)的CHO細(xì)胞培養(yǎng)液上清液進(jìn)樣，以A280進(jìn)行監(jiān)測(cè)，用PBS緩沖液沖洗至未結(jié)合的蛋白全部被洗脫，然后用IOOmM的檸檬酸洗脫結(jié)合蛋白，立刻以IM的Tris-HCl進(jìn)行中和。由于加了 Fc片段，融合蛋白會(huì)通過(guò)二硫鍵以二聚體形式存在。純化后的融合蛋白可以用ELISA法檢測(cè)濃度。包含融合蛋白的洗脫液經(jīng)脫鹽純化后可以凍干，凍干后可置于-20°C 長(zhǎng)期保存。實(shí)施例6 JgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白的活性檢測(cè)為了驗(yàn)證融合蛋白是否保持了 IgE-Fc和EGFRscFv各自的免疫學(xué)活性，我們首先通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞株A431是否高表達(dá)EGFR和U937單核細(xì)胞是否高表達(dá) Fc ε RI，選擇了 CHO細(xì)胞和四3細(xì)胞作為對(duì)照。結(jié)果顯示CH0細(xì)胞和四3細(xì)胞均不表達(dá)EGFR 和Fc ε RI，檢測(cè)結(jié)果均為陰性，而Α431細(xì)胞EGFR表達(dá)率約為95.7% (見(jiàn)圖7)，而U937單核細(xì)胞Fc ε RI的表達(dá)率約為77. 1%，檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性(見(jiàn)圖7)。接下來(lái)，進(jìn)一步檢測(cè)和驗(yàn)證IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白的免疫學(xué)活性。的檢測(cè)策略如下將實(shí)施例5制備的I gE-Fc-EGFRscFv作為一抗與A431孵育，然后通過(guò) FITC-anti-IgE顯色。結(jié)果顯示，通過(guò)FITC-anti-IgE的抗體能夠檢測(cè)到該融合蛋白的EGFR scFv能夠與A431細(xì)胞結(jié)合，其結(jié)合率約為68. 3%，其流式細(xì)胞結(jié)果直接說(shuō)明IgE-Fc和 EGFR scFv是表達(dá)在同一個(gè)分子上的，且各自具有活性，這二個(gè)部分既能夠獨(dú)自形成正確的折疊又互不干涉功能(見(jiàn)圖8)。實(shí)施例7 融合蛋白抗腫瘤活性研究采用腫瘤細(xì)胞與單核細(xì)胞混合培養(yǎng)法來(lái)初步檢測(cè)該融合蛋白的抗腫瘤活性。于加入實(shí)施例5制備的融合蛋白后72小時(shí)后，PBS洗去單核細(xì)胞，進(jìn)行碘化丙啶(PI)染色，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核被染色的情況以確定被殺傷的細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果顯示我們構(gòu)建的融合蛋白能夠起到較為明顯的免疫殺傷作用，該體系能夠按照預(yù)計(jì)的設(shè)計(jì)完成腫瘤細(xì)胞的殺傷。并且在熒光顯微鏡下拍照，調(diào)整焦距至每個(gè)視野中約有20個(gè)總細(xì)胞，連續(xù)拍照50張。 計(jì)數(shù)出每組實(shí)驗(yàn)中約1000個(gè)A431細(xì)胞的絕對(duì)死亡數(shù)，做統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示融合蛋白治療組與對(duì)照組具有明顯差異(見(jiàn)圖9)。由于抗體具有特異性的選擇作用，可把效應(yīng)物質(zhì)濃集在腫瘤病灶處或腫瘤細(xì)胞表面，而殺傷靶細(xì)胞。10多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已有多種腫瘤相關(guān)抗原的抗體用于腫瘤的靶向治療，這些抗體基本都是以IgG為基礎(chǔ)改造的，或是嵌合的如Rituximab，或是人源的如 "Trastuzumab，甚至有全人的抗體進(jìn)入了臨床試驗(yàn)如HuMax-⑶4[18]。有關(guān)利用IgE來(lái)具有對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用的研究在1991年的時(shí)候就有所報(bào)道[19]，Sehon和他的搭檔一起用IgE 來(lái)對(duì)抗乳腺癌細(xì)胞在小鼠身上增殖，顯示出IgE的抗腫瘤活性，但是他的這項(xiàng)研究沒(méi)有把 IgE和其他的抗體偶聯(lián)在一起，共同發(fā)揮抗腫瘤功能。IgE能夠在極低濃度的條件下與其效應(yīng)細(xì)胞上的Fc段受體(Fe ε Rs)結(jié)合，刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，速度迅速，提高了治療效率和成本。所以它只需要很低的劑量， 這是和IgG很大的區(qū)別，而實(shí)際上當(dāng)抗體被作為藥物使用時(shí)如果需要很大的劑量的話通常就會(huì)被認(rèn)為這是該抗體的局限，因?yàn)槠溆锌赡墚a(chǎn)生過(guò)于嚴(yán)重的HAMA反應(yīng)。第二，IgE不僅能夠激活大部分的IgG的經(jīng)典途徑來(lái)殺死腫瘤細(xì)胞，而且它還能夠激發(fā)像抗原遞呈細(xì)胞 (antigen-presenting cells,APC)等更加廣泛種類(lèi)的效應(yīng)細(xì)胞釋放大量的細(xì)胞因子，介導(dǎo) ADCC和ADCP作用于腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明將已經(jīng)構(gòu)建好的I gE-Fc-EGFRscFv融合蛋白載體作結(jié)構(gòu)和功能上的改進(jìn)，利用IgG不僅能夠激活效應(yīng)細(xì)胞的介導(dǎo)ADCC功能，同時(shí)又能夠激活補(bǔ)體途徑，通過(guò)Complement-dependent cytotoxicity(CDC)途徑誘導(dǎo)凋亡殺死腫瘤細(xì)胞。正如前面思考的如果我們能夠在一個(gè)抗體分子上同時(shí)偶聯(lián)IgG和IgE的抗腫瘤活性是最理想的，應(yīng)該比單用任何一種抗體的抗腫瘤效果都要好。IgG的Fc段包括二個(gè)部分C γ 2和C γ 3，它可以通過(guò)激活巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞，介導(dǎo)ADCC反應(yīng)的同時(shí)激活補(bǔ)體效應(yīng)，而IgE-Fc 包括C ε 2、C ε 3、C ε 4這3個(gè)部分，它可以激活肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞。其中C ε 4和C γ 3的主要功能都是于低親和力受體結(jié)合，介導(dǎo) ADCC反應(yīng)，因此為將該融合蛋白的結(jié)構(gòu)更為高效化，改造融合蛋白結(jié)構(gòu)的時(shí)候也可以只需要保留IgE-Fc的C ε 2和C ε 3。所以根據(jù)該研究的實(shí)際進(jìn)展，我們?cè)O(shè)計(jì)了以下這些方案來(lái)進(jìn)一步強(qiáng)化該融合蛋白的功能，并且已經(jīng)完成了部分的內(nèi)容，以期待得到更好治療效果。在本發(fā)明中，我們不僅利用了抗體作為傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物的靶向作用，同時(shí)利用了抗體和抗體偶聯(lián)后的協(xié)同作用。這樣構(gòu)建的IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白是一個(gè)雙特異性抗體(BsAb)，也叫雙功能抗體(BfAb)。BsAb可以通過(guò)二個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)分別集合效應(yīng)細(xì)胞 (Τ細(xì)胞，NK細(xì)胞，巨噬細(xì)胞)和靶細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)，使二者彼此靠近并得到募集，從而使二中細(xì)胞發(fā)生相互作用而誘導(dǎo)靶細(xì)胞溶解。BsAb的這種特性可使效應(yīng)細(xì)胞獲得抗體依賴的溶解能力。本發(fā)明構(gòu)建的雙特異性融合蛋白抗體既利用了 EGFR單抗阻斷了 EGFR和EGF之間的偶聯(lián)，進(jìn)而抑制一系列由此引發(fā)的信號(hào)通路所導(dǎo)致的血管生成，腫瘤增殖。同時(shí)，我們也利用了 IgE的特殊的抗腫瘤活性，將效應(yīng)細(xì)胞集聚到腫瘤細(xì)胞組織周?chē)行У睦昧诵?yīng)細(xì)胞發(fā)揮的ADCC和ADCP這樣的功能，抑制腫瘤的生長(zhǎng)，二者各種行使其功能互不干擾。 而我們的也驗(yàn)證了當(dāng)把這2個(gè)抗體通過(guò)Linker連接在一起形成融合蛋白抗體后，它們的各自的功能并沒(méi)有因此受到影響。過(guò)去30年抗體藥物的發(fā)展趨勢(shì)是從鼠源型抗體到嵌合型抗體再到人源型抗體甚至全人抗體，大家都在積極尋找免疫原性更加低的藥物，避免HAMA 反應(yīng)的產(chǎn)生，IgE-Fc-EGFRscFv融合蛋白的IgE-Fc序列為全人序列，免疫原性低，而且整個(gè)融合蛋白的分子量低于其他抗體類(lèi)藥物。參考文獻(xiàn)1.Sly RM(1999)Changing prevalence of allergic rhinitis and asthma. Ann Allergy Asthma I_nol82 :233-482. Karagiannis SN, Bracher MG, Beavil RL, Beavil AJ, Hunt J, McCloskey N, Thompson RG, East N, Burke F, Sutton BJ, Dombrowicz D, Balkwill FR, and Gould HJ(2008)Role of IgE receptors in IgEantibody-dependent cytotoxicity and phagocytosis of ovarian tumor cells by human monocytic cells. Cancer Immunol Immunother 57 :247-633. Namazi MR(2007)Extension of the "Hygiene Hypothesis' to the negative associationbetween acne and atopy, hematological malignancies, and malignant melanoma. Medical Hypotheses 69:960—9614. Christie G,Barton A,Bolognese B,Buckle DR, Cook RM,Hansbury MJ,Harper GP, Marshall LA, McCord ME, Moulder K, Murdock PR, Seal SM, Spackman VM, Weston BJ, Mayer RJ(1997)IgE secretion is attenuated by an inhibitor of proteolytic processing ofCD23(Fe epsilonRII). Eur J Immunol 27:3228-32355.Zhang M, Murphy RF, Agrawal DK (2007)Decoding IgE Fc receptors. ImmunolRes 37 :1-16.6. Karagiannis SN, Bracher MG， Beavil RL, Beavil AJ，Hunt J， McCloskey N， Thompson RG，East N，Burke F，Sutton BJ, Dombrowicz D，Balkwill FR，Gould HJ(2008) Role of IgEreceptors in IgE antibody-dependent cytotoxicity and phagocytosis of ovarian tumor cells by human monocytic cells. Cancer Immunol Immunother 57: 247-2637. Milner JD，Brenchley JM，Laurence A，F(xiàn)reeman AFiHill BJ，Elias KM，Kanno Y，Spalding C，Elloumi HZ, Paulson ML，Davis J，Hsu A，Asher Al，O' Shea J，Holland SM，Paul WE, Douek DC(2008)Impaired T(H)17cell differentiation in subjects with autosomal dominant hyper-IgE syndrome. Nature 452:78. Davis ta, Grillo lopez a j， White c A (2000) Rituximab anti_CD20monoclonal antibody therapy innon-Hodgkins’ lymphoma saftyand ef-ficacy of retreatment. J Clinic On-col· 18 (17) :3135-3143.9. Mason, JO, Albert, MA, Vail, R. (2006)Intravitreal bevacizumab(Avastin) for refractory pseudophakic cystoid macular edema. Retina 26 :356-357.10. Lu W, Zhao Z，Zhao Y，Yu S，Zhao Y，F(xiàn)an B，Kacskovics I，Hammarstrom L， Li N(2007)Over-expression of the bovine FcRn in the mammary gland results in increased IgG levelsin both milk and serum of transgenic mice.Immunology 19 311-31811. Uhrberg, M， Valiante, N， Shum, B， Shilling, G， Lienert-Weidenbach, K， Corliss， B， Tyan, D， Lanier， L， Parham， P(1997)Human diversity in killer cell inhibitory receptor genes. Immunity, 7 :753. Kaisho T，Schwenk F，Rajewsky K(1997) The roles of gamma 1 heavy chain membraneexpression and cytoplasmic tail in IgGl responses.Science 276 :412-41512. Scaltriti M，Baselga J(2006)The epidermal growth factor receptor pathway :a model for targeted therapy. Clin Cancer Res 12:5268-527213.王承興O000)以EGFR及其突變體為靶點(diǎn)的腫瘤治療國(guó)外醫(yī)學(xué)生理病理與臨床分冊(cè)，20 :1372140.14. Sharma SV,Bell Dff,Settleman J(2007)Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer. Nat Rev Cancer 7:169—18115. McKillop D, Partridge EA, Kemp JV, Spence MP, Kendrew J, Barnett S, Wood PG, Giles PB, Patterson AB, Bichat F, Guilbaud N, Stephens TC(2005)Tumor penetration of gefitinib(Iressa), an epidermal growth factor receptor tyrosine kina. Mol Cancer Ther 4 :641-649.16.Yokota T, Milenic DE, Whitlow M(1992)Rapid tumor penetration of a single-chain Fv and comparison with other immunoglobulin forms. Cancer Research 52 :3402-3408.17. Aubrey N, Muzard J, Juste M(2006). Recombinant antibodies :towards a new generation of antivenoms. J Soc Biol, 200 :345-354.
18. Koh ff-P, Yuan J-M, Wang R, Seow A, Lee H-P, Yu MC (2008) Chronic rhinosinusitis and risk of lung cancer in the Singapore Chinese Health Study. Int J Cancer 123:1398-140219. Nagy E, Berczi I, and Sehon AH(1991)Growth mammary carcinoma by monoclonal IgE antibodies specific virus. Cancer Immunol Immunother 34 :63-69。
inhibition of murine for the mammary tumor
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白質(zhì)，其特征在于由抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體EGFR scFv與來(lái)自人免疫球蛋白IgE的Fc段IgE-Fc構(gòu)成，EGFR scFv和IgE-Fc之間由連接肽相連。
2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白質(zhì)，其特征在于所述人免疫球蛋白IgE的Fc段的氨基酸序列為(1)如序列表中SEQ ID NO. 4所述；或者O)在SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸所得功能相同或相似的多肽。
3.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白質(zhì)，其特征在于所述人抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體的氨基酸序列為(1)如序列表中SEQ ID NO. 2所述?；蛘逴)在SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸所得功能相同或相似的多肽。
4.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白質(zhì)，其特征在于所述連接肽為人免疫球蛋白鉸鏈區(qū)。
5.如權(quán)利要求4所述的融合蛋白質(zhì)，其特征在于所述人免疫球蛋白鉸鏈區(qū)的氨基酸序列為:EPKSCDKTHTCPPCP0
6.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白質(zhì)，其特征在于所述抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體EGFR scFv的內(nèi)部有連接輕鏈和重鏈的連接肽，其氨基酸序列為GGGGSGGGGSGGGGS。
7.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白質(zhì)，其特征在于其氨基酸序列為 (1)如序列表中SEQ ID NO. 12所示；或者O)在SEQ ID No. 12所示的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸所得功能相同或相似的蛋白質(zhì)。
8.如權(quán)利要求1 7任一項(xiàng)所述的融合蛋白質(zhì)，其特征在于還在N端連接有信號(hào)肽。
9.如權(quán)利要求8所述的融合蛋白質(zhì)，其特征在于其氨基酸序列為 (1)如序列表中SEQ ID NO. 8所示；或者O)在SEQ ID No. 8所示的蛋白的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸所得的與SEQ ID No. ？所示的融合蛋白質(zhì)的功能相同或相似的蛋白質(zhì)。
10.如權(quán)利要求1 9任一項(xiàng)所述的融合蛋白質(zhì)，其特征在于通過(guò)人免疫球蛋白的Fc 片段形成二聚體蛋白形式。
11.編碼權(quán)利要求1 10任一項(xiàng)融合蛋白質(zhì)的重組DNA。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的重組DNA，其特征在于其核苷酸序列為(1)如序列表中的SEQ ID NO. 7或SEQ ID NO. 11所或者為SEQ ID NO. 7或SEQ ID NO. 11的簡(jiǎn)并序列；或者O)在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且與(1)限定的核苷酸序列編碼功能相同或相似的蛋白質(zhì)。
13.包含權(quán)利要求11或12所述重組DNA的重組載體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的重組載體，其特征在于，所述的重組載體為質(zhì)粒載體或病毒載體。
15.包含權(quán)利要求14所述重組載體的重組體。
16.權(quán)利要求1 10任一項(xiàng)所述的融合蛋白質(zhì)、權(quán)利要求13或14所述的重組載體、或者權(quán)利要求15所述的重組體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
17.一種藥物組合物，包括權(quán)利要求1 10任一項(xiàng)所述的融合蛋白質(zhì)、權(quán)利要求13或 14所述的重組載體、或者權(quán)利要求15所述的重組體及藥學(xué)上的輔料。
18.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其特征在于，還包括至少一種其他的抗腫瘤藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及提供編碼包含IgE Fc段和抗EGFR的單鏈抗體(scFv)重組融合蛋白的DNA、其所編碼的融合蛋白、該融合蛋白的生產(chǎn)方法、該融合蛋白的藥物用途、該融合蛋白的治療方法。本發(fā)明融合蛋白，其在體內(nèi)外都具有良好的生物活性和穩(wěn)定性，能夠阻斷靶向EGFR陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞，激活免疫細(xì)胞，特異殺傷腫瘤細(xì)胞，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)，具有好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/19GK102241774SQ20111014018
公開(kāi)日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2011年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月27日
發(fā)明者勾藍(lán)圖, 楊金亮, 魏于全 申請(qǐng)人:四川大學(xué)