專利名稱：小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體及構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤的基因治療領(lǐng)域，具體涉及到小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤嚴(yán)重威脅到人類的身體健康，已經(jīng)是人類致死的一大原因，除了手術(shù)、化放療外還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有效的治療方法，探索新的治療方法顯得極為重要?；蛑委熓墙陙?lái)興起的一種新手段，在惡性腫瘤治療中成為最有希望的方案之一?；蛑委煼譃椴《据d體和非病毒載體，其中病毒載體的應(yīng)用最廣泛，最引人注目的病毒載體是條件復(fù)制型腺病毒載體(Conditionally Replicating oncolytic Adenoviral Vector, CRAd)。這類載體可以選擇性地在腫瘤組織中擴(kuò)增，大量擴(kuò)增的病毒最終可將腫瘤殺死，因此具有明顯的抗腫瘤活性。CRAd5載體大致可分為三種類型一類是利用腫瘤特異性啟動(dòng)子控制病毒復(fù)制所必需的基因。例如Ad5-hTERT-ElA，是用人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human Telomerase Reverse Transcriptase,hTERT)啟動(dòng)子取代腺病毒 ElA(Early Transcription Units)基因自身的啟動(dòng)子構(gòu)建而成，該腺病毒可特異地在腫瘤細(xì)胞中擴(kuò)增，并殺死腫瘤細(xì)胞。一類是刪除一些特定基因，這些特定基因是病毒在正常細(xì)胞中復(fù)制所必需、而在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制非必需的。 另外是ElB-55kD缺失的溶瘤腺病毒CRAd5-ElBA55KD，可以選擇性地在p53功能異常的腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并破壞腫瘤細(xì)胞，卻不能在正常細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。這是因?yàn)镃RAd5-ElBA55KD喪失了 ElB-55kD的活性而不能結(jié)合并失活宿主細(xì)胞的p53功能，因而在p53功能正常的細(xì)胞(如正常細(xì)胞)內(nèi)不能復(fù)制，而在P53功能異常細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)內(nèi)則可以大量復(fù)制。 另一類是將負(fù)責(zé)編碼Ad5ElA區(qū)的120 127位氨基酸的M個(gè)堿基對(duì)序列(919_94;3bp)去除，構(gòu)建的一種新型溶瘤腺病毒CRAd5-DM。腺病毒的ElA能夠結(jié)合成視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(Retinoblastoma protein, Rb，一種重要的抑癌基因)并使之失活，釋放E2F(細(xì)胞從 Gl期進(jìn)入S期的一種轉(zhuǎn)錄因子)，使細(xì)胞從Gl期進(jìn)入S期，腺病毒因而可以復(fù)制并將宿主細(xì)胞溶解。CRAd5-DM不能結(jié)合Rb使其失活，導(dǎo)致宿主細(xì)胞不能進(jìn)入細(xì)胞分裂周期，因此 CRAd5-D24僅能在Rb異常的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制產(chǎn)生殺傷作用。但由于這類病毒載體自身的一些不足，例如對(duì)腫瘤組織感染效率低及表達(dá)治療基因的數(shù)目有限等，從而導(dǎo)致治療效果并不十分明顯。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題在于克服上述條件復(fù)制型腺病毒載體的缺點(diǎn)，提供一種對(duì)腫瘤組織感染效率高、能增加載體外源基因表達(dá)數(shù)目的小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體。本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題在于提供一種方法簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便的小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體的構(gòu)建方法。本發(fā)明所要解決的還有一個(gè)技術(shù)問(wèn)題在于為小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體提供一種新用途。解決上述技術(shù)問(wèn)題采用的技術(shù)方案是在人腺病毒5型基因組2245bp_3327b之間有1083bp堿基的缺失，在人腺病毒5型基因組2245bp與3327bp之間處插入一個(gè)表達(dá)第一外源基因的表達(dá)元件，在腺病毒5型基因組第3^79bp處即纖維蛋白HI loop處，插入編碼含有一個(gè)小肽序列，在人腺病毒5型基因組32787bp與32788bp之間插入雙表達(dá)第二外源基因與eGFP的表達(dá)元件；上述的小肽序列為RGD、SIKVAV、YGRKKRRQRRR、NGR、pK7序列中的任意一個(gè)。本發(fā)明的在人腺病毒5型基因組2245bp與3327bp之間處插入一個(gè)表達(dá)第一外源基因的表達(dá)元件中的第一外源基因是Arresten、Trail、Endostatin、Canstatin、 tumostatin中的任意一種。本發(fā)明的在人腺病毒5型基因組32787bp與32788bp之間插入雙表達(dá)第二外源基因與eGFP的表達(dá)元件中的第二外源基因是IL-24、Trail, Endostatin、Canstatin、 tumostatin的任意一禾中。上述的小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體的構(gòu)建方法由下述步驟組成1、構(gòu)建pAd5 ElB 55kd缺失的穿梭載體以Ad5基因組質(zhì)粒為PCR反應(yīng)模板，引物)(bal A序列為 GCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATG 與引物 XbaI B 序列為 TCAGATGGGTTTCTTCACTCCATTTATCCT 進(jìn)行第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 0%的瓊脂糖電泳后回片段，該聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物片段大小為719bp。以引物BglII A序列為ATAAAGGATAAATG GAGTGAAGAAACCCATCTGAG 和引物 BglII B 序列為 GAAGATCTATACAGTTAAGCCACCTATACAACA 進(jìn)行第二次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，所得到的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物片段大小為270bp，將上述兩次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物混合作為模板，以引物)(bal A序列為GCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATG與引物BglIIB序列為GAAGATCTATACAGTTAAGCCACCTATACAACA進(jìn)行第三次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 0%的瓊脂糖電泳后得到聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物片段大小為95^p，得到第三次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物，將聚此片段與pGEMT-T easy載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5ci細(xì)胞，涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中，通過(guò)酶切及測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆，所獲得陽(yáng)性克隆經(jīng))(bal和BglII雙酶切，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 0%的瓊脂糖電泳純化后得到的片斷與用)(bal和BglII雙酶切處理的腺病毒El區(qū)穿梭載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物采用同樣的方法轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆，命名為pHElB55D shuttle，獲得 pAd5ElB 55kd缺失的穿梭載體。2、構(gòu)建PHE1B55D-第一外源基因的穿梭載體采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增第一外源基因，經(jīng)電泳純化后與pGEMT-easy載體相連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a，小量提取DNA，經(jīng)酶切鑒定，所獲得陽(yáng)性克隆命名為pGEMT/ 第一外源基因；將第一外源基因的片段從PGEMT/第一外源基因上經(jīng)ClaI和Not I雙酶切下來(lái)，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖電泳純化后與用相同雙酶切處理的pAd5.ElB55kd shuttle進(jìn)行連接，連接與轉(zhuǎn)化采用上述同樣的方法，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆，所獲得的載體為表達(dá)第一外源基因的Ad5El區(qū)穿梭載體，命名為PHE1B55D-第一外源基因 shuttle。3、構(gòu)建PHE1B55D-第一外源基因/SwaI的腺病毒載體骨架將kal線性化的PHE1B55D-第一外源基因shuttle的穿梭載體與ClaI線性化腺病毒骨架載體pTG3602/SwaI按摩爾比3 1共轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BJ5183，將菌液涂布在含有100μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中，經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆，所獲得的陽(yáng)性克隆即為PHE1B55D-第一外源基因/SwaI的腺病毒載體骨架，命名為PHE1B55D_第一外源基因 /SwaI載體。4、構(gòu)建pshuttle Ad5_E4-fiber-小肽序列穿梭載體以pUC19載體為基礎(chǔ)，在氨芐抗性基因的開(kāi)放讀碼框的兩端通過(guò)基因突變的方式產(chǎn)生兩個(gè)單一的酶切位點(diǎn)^CbaI及Sful，然后將卡那抗性基因克隆到^CbaI和SfuI的位點(diǎn)中，所獲得的卡那抗性載體與Ec0RI-HindIII 1 inker連接，獲得的載體命名為pUCKanEHL ； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增位于Ad5E4區(qū)3'端上游2.01Λ的片段，基因片段兩端分別含有 I^cI與SwaI位點(diǎn)，將此片段克隆到pUCKanEHL載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，得到的載體稱為 pshuttle Ad5E4-3'；采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增Ad5纖維蛋白3'端上游2. 01Λ的片段，基因片段兩端分別含有SwaI與SpeI位點(diǎn)；將此片段克隆到pshuttle Ad5E4_3'載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，獲得的新載體稱為pshuttleAd5-E4-fiber，通過(guò)重疊聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，將小肽序列插入以上載體的fiber中，獲得的載體稱為pshuttle Ad5-E4-fiber-小肽序列。5、構(gòu)建表達(dá)eGFP及第二外源基因的穿梭載體pshuttle Ad5_CMVeGFP/第二外源基因-E4-fiber-小肽序列通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增miniCMV-SV40表達(dá)元件，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖電泳后回收聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)片段，將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)片段與 PGEMT-T easy載體連接，通過(guò)酶切及測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆，所獲得陽(yáng)性克隆命名為pGEMT/ miniCMV-SV40,將 miniCMV_SV40 片段從 pGEMT/miniCMV_SV40 上經(jīng) ClaI 和 NotI 雙酶切下來(lái)，與經(jīng)同樣酶切的雙向啟動(dòng)子穿梭載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物采用同樣的方法轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆，命名為ρshu111 e-Bio-PGK-eGFP-miηiCMV-SV40 ；采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增第二外源基因，擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)電泳純化后與pGEMT-easy載體相連接，經(jīng)酶切鑒定，獲得陽(yáng)性克隆命名為pGEMT/第二外源基因，將第二外源基因片段從 pGEMT/第二外源基因上經(jīng)XhoI和XbaI雙酶切下來(lái)，用相同雙酶切處理的pshuttle-Bio-PGK-eGFP-miniCMV-SV40進(jìn)行連接；連接與轉(zhuǎn)化采用上述同樣的方法，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆，所獲得的載體為表達(dá)eGFP及第二外源基因的雙向啟動(dòng)子穿梭載體，命名為 pshuttle-Bio-eGFP-第二外源基因；將 pshuttle-Bio-eGFP-第二外源基因經(jīng) BamHI 及SfuI雙酶切末端補(bǔ)平后與經(jīng)SwaI酶切的腺病毒E4-fiber穿梭載體進(jìn)行連接，獲得的陽(yáng)性克隆為表達(dá)eGFP及第二外源基因的腺病毒E4-fiber穿梭載體，命名為pshuttle Ad5-CMVeGFP/第二外源基因-E4_fiber_小肽序列；6、制備條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-小肽序列.第二外源基因/第一外源基因用XhoI線性化的pshuttle Ad5_CMVeGFP/第二外源基因_E4-fiber_小肽序列的穿梭載體與SwaI線性化的PHE1B55D-第一外源基因/SwaI腺病毒載體骨架按摩爾比3 1 共轉(zhuǎn)化E. coliBJ5183，通過(guò)酶切及測(cè)序獲得陽(yáng)性克隆，所得到的載體命名為PHE1B55D-小肽序列.第二外源基因/第一外源基因；采用磷酸鈣法將I^acI線性化的表達(dá)綠色熒光蛋白的PHE1B55D-小肽序列.第二外源基因/第一外源基因的條件復(fù)制型腺病毒載體轉(zhuǎn)染 HEK 293細(xì)胞系，經(jīng)過(guò)7 10天后，離心收獲病毒原液，經(jīng)2 3輪的病毒擴(kuò)增，通過(guò)兩次氯化銫密度梯度超速離心純化，獲得純化的表達(dá)綠色熒光蛋白的的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒 HE1B55D-小肽序列.第二外源基因/第一外源基因，-80°C冰箱內(nèi)保存。小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療惡性腦膠質(zhì)瘤藥物中的用途。小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療肝癌藥物中的用途。小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療胃癌藥物中的用途。小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療肺癌藥物中的用途。小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療結(jié)腸癌藥物中的用途。小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療乳腺癌藥物中的用途。小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療黑色素瘤藥物中的用途。本發(fā)明在Ad5_ElB55kd條件復(fù)制型腺病毒載體的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)兩方面的改造以提高增加載體外源基因的表達(dá)數(shù)目個(gè))，對(duì)病毒載體進(jìn)行修飾以提高其感染效率。采用本發(fā)明構(gòu)建方法構(gòu)建的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體，經(jīng)藥效試驗(yàn)表明，條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體對(duì)惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用。
圖1是實(shí)施例1條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體的結(jié)構(gòu)圖。圖2是條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體對(duì)惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。圖3是條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。圖4是條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。圖5是條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。
圖6是條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。圖7是條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。圖8是條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體在體外對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。圖9是條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體在體內(nèi)對(duì)黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1本實(shí)施例的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體如下1、在人腺病毒5型基因組2245bp_3327b之間有1083bp堿基的缺失，所缺失的序列如下ATGTTGTACAGGTGGCTGAACTGTATCCAGAACTGAGACGCATTTTGACAATTACAGAGGATGGGCAGG GGCTAAAGGGGGTAAAGAGGGAGCGGGGGGCTTGTGAGGCTACAGAGGAGGCTAGGAATCTAGCTTTTAGCTTAATGACCA GACACCGTCCTGAGTGTATTACTTTTCAACAGATCAAGGATAATTGCGCTAATGAGCTTGATCTGCTGGCGCAGAAGTATT CCATAGAGCAGCTGACCACTTACTGGCTGCAGCCAGGGGATGATTTTGAGGAGGCTATTAGGGTATATGCAAAGGTGGCAC TTAGGCCAGATTGCAAGTACAAGATCAGCAAACTTGTAAATATCAGGAATTGTTGCTACATTTCTGGGAACGGGGCCGAGG TGGAGATAGATACGGAGGATAGGGTGGCCTTTAGATGTAGCATGATAAATATGTGGCCGGGGGTGCTTGGCATGGACGGGG TGGTTATTATGAATGTAAGGTTTACTGGCCCCAATTTTAGCGGTACGGTTTTCCTGGCCAATACCAACCTTATCCTACACG GTGTAAGCTTCTATGGGTTTAACAATACCTGTGTGGAAGCCTGGACCGATGTAAGGGTTCGGGGCTGTGCCTTTTACTGCT GCTGGAAGGGGGTGGTGTGTCGCCCCAAAAGCAGGGCTTCAATTAAGAAATGCCTCTTTGMAGGTGTACCTTGGGTATCC TGTCTGAGGGTAACTCCAGGGTGCGCCACAATGTGGCCTCCGACTGTGGTTGCTTCATGCTAGTGAAAAGCGTGGCTGTGA TTAAGCATAACATGGTATGTGGCAACTGCGAGGACAGGGCCTCTCAGATGCTGACCTGCTCGGACGGCAACTGTCACCTGC TGAAGACCATTCACGTAGCCAGCCACTCTCGCAAGGCCTGGCCAGTGTTTGAGCATAACATACTGACCCGCTGTTCCTTGC ATTTGGGTAACA
GGAGGGGGGTGTTCCTACCTTACCAATGCAATTTGAGTCACACTAAGATATTGCTTGAGCCCGAGAGCA TGTCCAAGGTGAACCTGAACGGGGTGTTTGACATGACCATGA。2、在人腺病毒5型基因組2245bp與3327bp之間處插入一個(gè)表達(dá)Arresten的表達(dá)元件，該表達(dá)元件序列為AGCCTGCAGGTCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCA TTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTA CGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAAT GGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGC TATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTC CACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCC CATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATGGT ACCGTTTAAACTCGAGGTCGACGGTATCGATatgTCTGTTGATCACGGCTTCCTTGTGACCAGGCATAGTCAAACAATA GATGACCCACAGTGTCCTTCTGGGACCAAAATTCTTTACCACGGGTACTCTTTGCTCTACGTGCAAGGCAATGAACGGG CCCATGGACAGGACTTGGGCACGGCCGGCAGCTGCCTGCGCAAGTTCAGCACAATGCCCTTCCTGTTCTGCAATATTAA CAACGTGTGCAACTTTGCATCACGAAATGACTACTCGTACTGGCTGTCCACCCCTGAGCCCATGCCCATGTCAATGGCA CCCATCACGGGGGAAAACATAAGACCATTTATTAGTAGGTGTGCTGTGTGTGAGGCGCCTGCCATGGTGATGGCCGTGC ACAGCCAGACCATTCAGATCCCACCGTGCCCCAGCGGGTGGTCCTCGCTGTGGATCGGCTACTCTTTTGTGATGCACAC CAGCGCTGGTGCAGAAGGCTCTGGCCAAGCCCTGGCGTCCCCCGGCTCCTGCCTGGAGGAGTTTAGAAGTGCGCCATTC ATCGAGTGTCACGGCCGTGGGACCTGCAATTACTACGCAAACGCTTACAGCTTTTGGCTCGCCACCATAGAGAGGAGCG AGATGTTCAAGAAGCCTACGCCGTCCACCTTGAAGGCAGGGGAGCTGCGCACGCACGTCAGCCGCTGCCAAGTCTGTAT GAGAAGAACATAAACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGGGAGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGG ACAAACCACA
ACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATT ATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCASGGGGAGGTGTGGGAGGTTT TTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCCCGGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG TGAAAACCTCTTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCG TCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGAGGTCGACTCTAGTCCCCGCGGTGGC。3、在人腺病毒5型基因組第32679bp處即纖維蛋白HI loop處，插入編碼含有RGD 的序列，該序列為 Tgt gac tgc cgc gga gac tgt ttc tgc。4、在人腺病毒5型基因組32787bp與32788bp之間插入雙表達(dá)IL-M與eGFP的表達(dá)元件。其序列如下CCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGCATGCCTGCTATTGTCTTCCCAATCCTCCCCCTTGCTGTCCTGCC CCACCCCACCCCCCAGAATAGAATGACACCTACTCAGACAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGGAAAGGACAGTG GGAGTGGCACCTTCCAGGGTCAAGGAAGGCACGGGGGAGGGGCAAACAACAGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGtcta gaTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCCCGGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGGACCATGTGATCGCGCTT CTCGTTGGGGTCTTTGCTCAGGGCGGACTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAGCACGGGGCCGTCGCCGATGG GGGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATGTTGTGGCGGATCTTGAAGTTCACCTTGATG CCGTTCTTCTGCTTGTCGGCCATGATATAGACGTTGTGGCTGTTGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGGATGTTGCC GTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATGCGGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTCGGCGCGGGTCT TGTAGTTGCCG TCGTCCTTGAAGAAGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTTCGGGCATGGCGGACTTGAAGAAGTCGTGC TGCTTCATGTGGTCGGGGTAGCGGCTGAAGCACTGCACGCCGTAGGTCAGGGTGGTCACGAGGGTGGGCCAGGGCACGGG CAGCTTGCCGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGACACGCTGA ACTTGTGGCCGTTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACC ATctcgagATACAGCTCCACCGCACATGCCACCCTCCGGATATATTCGTCTCGAGCAAATCACTCGAGTATGTCGAGGTG GCGTGTACGGT
GGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGTTGGCAGTCTAGCGgctagcATACCGGGTAGGGGAGG CGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCT CGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCC CCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGGAGTAGCACGTCTCACTACTA GCTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCMTGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTG CTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGG GCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCA TCTCCGGGCCTTTCGACCTGCAGCCCatcgatATGAATTTTCAACAGAGGCTGCAAAGCCTGTGGACTTTAGCCAGACCC TTCTGCCCTCCTTTGCTGGCGACAGCCTCTCAAATGCAGATGGTTGTGCTCCCTTGCCTGGGTTTTACCCTGCTTCTCTG GAGCCAGGTATCAGGGGCCCAGGGCCAAGAATTCCACTTTGGGCCCTGCCAAGTGAAGGGGGTTGTTCCCCAGAAACTGT GGGAAGCCTTCTGGGCTGTGAAAGACACTATGCAAGCTCAGGATAACATCACGAGTGCCCGGCTGCTGCAGCAGGAGGTT CTGCAGAACGTCTCGGATGCTGAGAGCTGTTACCTTGTCCACACCCTGCTGGAGTTCTACTTGAAAACTGTTTTCAAAAA CTACCACAATAGAACAGTTGAAGTCAGGACTCTGAAGTCATTCTCTACTCTGGCCAACAACTTTGTTCTCATCGTGTCAC AACTGCAACCCAGTCAAGAAAATGAGATGTTTTCCATCAGAGACAGTGCACACAGGCGGTTTCTGCTATTCCGGAGAGCA TTCAAACAGTTGGACGTAGAAGCAGCTCTGACCAAAGCCCTTGGGGAAGTGGACATTCTTCTGACCTGGATGCAGAAATT CTACAAGCTCTGAactagtCACAGCGGGGAGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAG AATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAAC AAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAAC CTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCCGGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATG CAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGAG上述的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體的構(gòu)建方法步驟如下1、構(gòu)建pAd5 ElB 55kd缺失的穿梭載體以Ad5基因組質(zhì)粒為PCR反應(yīng)模板，Ad5基因組質(zhì)粒為市場(chǎng)上銷售的商品，弓丨物 XbaI A 序列為 GCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATG 與 Xl^aI B 序列為 TCAGATGGGTTTCTTCACTCCATTTATCCT,進(jìn)行第一次 PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件為94°C、2 分鐘，94°C、 50秒，55°C、60秒，72°C、45秒，30個(gè)循環(huán)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為1. 0%的瓊脂糖電泳后回片段，該聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物片段大小為719bp。以引物BglIIA序列為ATA AAGGATAAATGGAGTGAAGAAACCCATCTGAG 和引物 BglIIB 序列為 GAAGATCTATACAGTTAAGCCACCT ATACAACA進(jìn)行第二次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，反應(yīng)條件為94°C、2分鐘，94°C、50秒，55°C、60秒， 72°C、20秒，30個(gè)循環(huán)，所得到的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物片段大小為270bp。將上述兩次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物混合作為模板，以引物)(bal A序列為GCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATG與引物BglIIB序列為GAAGATCTATACAGTTAAGCCACCTATACAACA進(jìn)行第三次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖電泳后得到聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物片段大小為95^p，得到第三次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物。將此片段與PGEMT-T eaSy載體連接。連接條件是2μ 1酶切純化片段，1 μ 110 X Τ4連接酶緩沖液，1 μ 1酶切載體，0. 5 μ 1Τ4連接酶，5. 5 μ 1三蒸水，16°C 連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5 α細(xì)胞，并涂布于含有I00 μ g/ml的氨芐青霉素的 LB平板中。挑取菌落接種到含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時(shí)后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過(guò)酶切及測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆，所獲得陽(yáng)性克隆經(jīng)^CbaI和 BglII雙酶切，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 0%的瓊脂糖電泳純化后得到的片斷與用^CbaI和BglII雙酶切處理的腺病毒El區(qū)穿梭載體進(jìn)行連接。連接條件是2μ 1酶切純化片段，1μ 1 10ΧΤ4 連接酶緩沖液，Ιμ 酶切載體，0.5μ1 Τ4連接酶，5.5μ1三蒸水。連接產(chǎn)物采用同樣的方法轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆，命名為pHElB55D shuttle。此載體為獲得的Ad5ElB 55kd缺失的穿梭載體。2、構(gòu)建 pHElB55D_Arresten 的穿梭載體采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增Arresten基因，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增條件94°C、5分鐘，94°C、30秒，55°C、30秒，72°C、1分鐘。使用伯樂(lè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增儀，30個(gè)循環(huán)后收獲DNA，經(jīng)電泳純化后與pGEMT-easy載體相連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Dffia，小量提取DNA，經(jīng)酶切鑒定，所獲得陽(yáng)性克隆命名為pGEMT/Arresten。將Arresten片段從pGEMT/Arresten 上經(jīng)ClaI和NotI雙酶切下來(lái)，經(jīng)質(zhì)量濃度為1.0%的瓊脂糖電泳純化后與用相同雙酶切處理的pAd5. ElB55kdshuttle進(jìn)行連接。連接與轉(zhuǎn)化采用上述同樣的方法，提取質(zhì)粒 DNA，酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆，所獲得的載體為表達(dá)Arresten的Ad5El區(qū)穿梭載體，命名為 pHElB55D_Arresten shuttle。3、構(gòu)建PHE1B55D-Arresten/Swal的腺病毒載體骨架將kal線性化的pHElB55D_Arresten shuttle的穿梭載體與ClaI線性化腺病毒骨架載體pTG3602/SwaI按摩爾比3 1共轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BJ5183，將菌液涂布在含有 100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中，16 M小時(shí)后，挑取菌落，接種到100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時(shí)后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA。經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆，所獲得的陽(yáng)性克隆即為pHElB55D-Arresten/SWaI的腺病毒載體骨架，命名為 pHElB55D-Arresten/SwaI 載體。4、構(gòu)建 pshuttle Ad5_E4-f iber-RGD 穿梭載體以pUC19載體為基礎(chǔ)，在氨芐抗性基因的開(kāi)放讀碼框(ORF)的兩端通過(guò)基因突變的方式產(chǎn)生兩個(gè)單一的酶切位點(diǎn)OCbaI及SfuI)，將卡那抗性基因克隆到^CbaI和SfuI的位點(diǎn)中，所獲得的卡那抗性載體與 EcoRI-HindIII linker (EcoRI PacI SwaI SpeI HindIII) 連接，所獲得的載體命名為pUCKanEHL。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增位于Ad5E4區(qū)3‘端上游約 2. Okb的片段，基因片段兩端分別含有I^cI與SwaI位點(diǎn)，將此片段克隆到pUCKanEHL載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，由此得到的載體稱為pshuttle Ad5E4-3'。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增Ad5纖維蛋白3'端上游約2. 01Λ的片段，基因片段兩端分別含有SwaI與SpeI位點(diǎn)。將此片段克隆到pshuttle Ad5E4-3'載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，所獲得的新載體稱為pshuttle Ad5-E4-fiber，然后通過(guò)重疊聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，將RGD插入以上載體的fiber中，獲得的載體稱為 pshuttle Ad5-E4-fiber-RGD。5、構(gòu)建表達(dá) eGFP 及 IL-24 的穿梭載體 pshuttle Ad5_CMVeGFP/ IL-24-E4-fiber-RGD通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增miniCMV-SV40表達(dá)元件，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增條件是94°C、2分鐘，94°C、50秒，55°C、30秒，72°C、40秒，30個(gè)循環(huán)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為1.0%的瓊脂糖電泳后回收聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)片段。將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)片段與pGEMT-T eaSy載體連接。連接條件是2 μ 1酶切純化片段，1 μ 110XT4連接酶緩沖液，1 μ 1酶切載體，0. 5 μ 1Τ4連接酶，5. 5 μ 1三蒸水，16°C連接12小時(shí)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5ci細(xì)胞，并涂布于含有100yg/ml的氨芐青霉素的LB平板中。挑取菌落接種到含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時(shí)后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒 DNA，通過(guò)酶切及測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆。將所獲得陽(yáng)性克隆命名為pGEMT/miniCMV-SV40。將 miniCMV-SV40片段從pGEMT/miniCMV-SV40上經(jīng)ClaI和NotI雙酶切下來(lái)，與經(jīng)同樣酶切的雙向啟動(dòng)子穿梭載體進(jìn)行連接，連接條件是2μ 1酶切純化片段，Iy 1 10ΧΤ4連接酶緩沖液，1 μ 1酶切載體，0. 5 μ 1 Τ4連接酶，5. 5 μ 1三蒸水。連接與轉(zhuǎn)化采用上述同樣的方法，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆，命名為pshuttle-Bio-PGK-eGFP-miniCMV-SV40穿梭載體。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法擴(kuò)增IL-M基因，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增條件94°C、5分鐘，94°C、30秒，55°C、30秒，72°C、1分鐘。使用伯樂(lè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增儀，30個(gè)循環(huán)后收獲DNA，經(jīng)電泳純化后與pGEMT-easy載體相連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Dffia，小量提取DNA，經(jīng)酶切鑒定，所獲得陽(yáng)性克隆命名為pGEMT/IL-M。將IL-M片段從pGEMT/IL-M上經(jīng)BioI 和^CbaI雙酶切下來(lái)，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 0%的瓊脂糖電泳純化后與用相同雙酶切處理的psh uttle-Bio-PGK-eGFP-miniCMV-SV40進(jìn)行連接。連接與轉(zhuǎn)化采用上述同樣的方法，提取質(zhì)粒DNA、酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆，所獲得的載體為表達(dá)eGFP及IL-24的雙向啟動(dòng)子穿梭載體,命名為 pshuttle-Bio-eGFP-IL-24。將 pshuttle-Bio-eGFP-IL-24 經(jīng) BamHI 及 SfuI 雙酶切末端補(bǔ)平后與經(jīng)SwaI酶切的腺病毒E4-fiber穿梭載體進(jìn)行連接，所獲得的陽(yáng)性克隆為表達(dá)eGFP及IL-24的腺病毒E4_fiber穿梭載體，此載體命名為pshuttleAd5_CMVeGFP/ IL-24E4-fiber-RGDο
6、制備條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten載體XhoI 線性化的 pshuttle Ad5-CMVeGFP/IL-24-E4-fiber-RGD 穿梭載體與 SwaI 線性化的pHElB55D-Arresten/SwaI腺病毒載體骨架按摩爾比3 1共轉(zhuǎn)化E. coliBJ5183, 通過(guò)酶切及測(cè)序獲得陽(yáng)性克隆，所得到的載體稱為PHE1B55D-RGD. IL-24/Arresten見(jiàn)圖1。 采用磷酸鈣法將I^acI線性化的表達(dá)綠色熒光蛋白和Arresten的PHE1B55D_RGD. IL-24/ Arresten條件復(fù)制型腺病毒載體轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞系。經(jīng)過(guò)7 10天后，可見(jiàn)明顯的細(xì)胞病變，然后經(jīng)過(guò)離心收獲病毒原液，經(jīng)過(guò)2 3輪的病毒擴(kuò)增后，進(jìn)一步將所獲得的病毒原液感染10個(gè)150cm的細(xì)胞培養(yǎng)平皿，擴(kuò)增獲得足夠量的病毒原液用于后續(xù)的進(jìn)一步純化。感染的病毒的細(xì)胞經(jīng)37°C /酒精干冰反復(fù)凍融3次，3500轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，通過(guò)兩次氯化銫密度梯度超速離心純化，獲得純化的條件復(fù)制型腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/ Arresten,并于_80°C冰箱內(nèi)保存。實(shí)施例2本實(shí)施例的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Trail載體如下實(shí)施例1中，在腺病毒基因組2245bp與3327bp之間處插入一個(gè)表達(dá)Arresten的表達(dá)元件中的Arresten第一外源基因用Trail替換。其它結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1相同，構(gòu)成條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Trail載體。其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例3本實(shí)施例的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Endostat in載體如下實(shí)施例1中，在腺病毒基因組2245bp與3327bp之間處插入一個(gè)表達(dá)Arresten的表達(dá)元件中的Arresten第一外源基因用Endostatin替換。其它結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1相同，構(gòu)成條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Endostat in載體。其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例4本實(shí)施例的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Canstatin載體如下實(shí)施例1中，在腺病毒基因組2245bp與3327bp之間處插入一個(gè)表達(dá)Arresten的表達(dá)元件中的Arresten第一外源基因用Canstatin替換。其它結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1相同，構(gòu)成條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/Canstatin載體。其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例5本實(shí)施例的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/tumostatin載體如下實(shí)施例1中，在腺病毒基因組2245bp與3327bp之間處插入一個(gè)表達(dá)Arresten的表達(dá)元件中的Arresten第一外源基因用tumostatin替換。其它結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1相同，構(gòu)成條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. IL-24/tumostatin載體。其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例6本實(shí)施例的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. Trail/Arresten載體如下實(shí)施例1中，在腺病毒基因組32787bp與32788bp之間插入雙表達(dá)IL-M與eGFP 的表達(dá)元件中的IL-M第二外源基因Trail替換。其它結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1相同，構(gòu)成條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. Trail/Arresten載體。其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例7本實(shí)施例的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. Endostatin/Arresten載體如下實(shí)施例1中，在腺病毒基因組32787bp與32788bp之間插入雙表達(dá)IL-M與eGFP 的表達(dá)元件中的IL-M第二外源基因Endostatin替換。其它結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1相同，構(gòu)成條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. Endostatin//Arresten載體。其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例8本實(shí)施例的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. Canstatin/Arresten載體如下實(shí)施例1中，在腺病毒基因組32787bp與32788bp之間插入雙表達(dá)IL-M與eGFP 的表達(dá)元件中的IL-M第二外源基因用Canstatin替換。其它結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1相同，構(gòu)成條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. Canstatin/Arresten載體。其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例9本實(shí)施例的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. tumostatin/Arresten載體如下實(shí)施例1中，在腺病毒基因組32787bp與32788bp之間插入雙表達(dá)IL-M與eGFP 的表達(dá)元件中的IL-M第二外源基因用tumostatin替換。其它結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1相同，構(gòu)成條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD. tumostatin/Arresten載體。其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例10以上的實(shí)施例1 9，在腺病毒5型基因組第3^79bp處即纖維蛋白HI loop處， 插入編碼含有RGD的序列中，RGD序列用SIKVAV序列替換。其它結(jié)構(gòu)與相應(yīng)的實(shí)施例相同。其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例11以上的實(shí)施例1 9，在腺病毒5型基因組第3^79bp處即纖維蛋白HI loop處， 插入編碼含有RGD的序列中，RGD序列用YGRKKRRQRRR序列替換。其它結(jié)構(gòu)與相應(yīng)的實(shí)施例相同。其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例12以上的實(shí)施例1 9，在腺病毒5型基因組第3^79bp處即纖維蛋白HI loop處， 插入編碼含有RGD的序列中，RGD序列用NGR序列替換。其它結(jié)構(gòu)與相應(yīng)的實(shí)施例相同。其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例13以上的實(shí)施例1 9，在腺病毒5型基因組第3^79bp處即纖維蛋白HI loop處， 插入編碼含有RGD的序列中，RGD序列用pK7序列替換。其它結(jié)構(gòu)與相應(yīng)的實(shí)施例相同。
其構(gòu)建方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例14有效成分小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療惡性腦膠質(zhì)瘤、肝癌、胃癌、肺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤藥物用常規(guī)藥用制劑的形式來(lái)使用。所述的藥用常規(guī)制劑含作為活性成分的小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體，該活性成分在制劑中與藥學(xué)上可接受的載體如適宜于靜脈注射給藥的有機(jī)或無(wú)機(jī)固體或液體賦形劑混合，在制劑中，活性成分的小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體含量為95%。為了驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果，發(fā)明人采用本發(fā)明實(shí)施例1的條件復(fù)制型腺病毒 HE1B55D-RGD. IL24/Arresten 載體(以下簡(jiǎn)稱 HE1B55D-RGD. IL24/Arresten)進(jìn)行了藥效試驗(yàn)，各種試驗(yàn)情況如下1、HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對(duì)惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用采用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)比色法檢測(cè) HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對(duì)惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87增殖的影響，具體操作如下(1)接種細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 胰酶消化后接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為1 X IO30HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 處理將 10M0I 的 HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 病毒載體及對(duì)照病毒感染惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以磷酸鹽緩沖液 (PBS)處理作為對(duì)照組。分別在M小時(shí)，48小時(shí)及72小時(shí)后檢測(cè)以上病毒載體對(duì)惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87生長(zhǎng)的抑制作用。(2)顯色培養(yǎng)48小時(shí)后加入5g/L的MTT 20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。(3)讀數(shù)去掉培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μ L，置于水平搖床上，室溫作用10分鐘。酶標(biāo)儀570nm處測(cè)得吸光值。取各孔光吸收值，將所得結(jié)果用統(tǒng)計(jì)產(chǎn)品與服務(wù)解決方案軟件(SPSS) 13.0軟件的One Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間差異比較采用方差分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對(duì)惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87增殖具有明顯的抑制作用。2、HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用采用MTT方法檢測(cè)HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對(duì)肝癌細(xì)胞系H印G2增殖的影響，具體操作如下(1)接種細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞系H印G2，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 胰酶消化后接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為1 X 103。HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 處理將 5M0I 的 HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 病毒載體及對(duì)照病毒感染肝癌細(xì)胞系IfepG2，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以磷酸鹽緩沖液處理作為對(duì)照組。分別在M小時(shí)，48小時(shí)及72小時(shí)后檢測(cè)以上病毒載體對(duì)肝癌細(xì)胞系IfepG2生長(zhǎng)的抑制作用。(2)顯色培養(yǎng)48小時(shí)后加入5g/L的MTT 20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。(3)讀數(shù)去掉培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μ L，置于水平搖床上，室溫作用10分鐘。酶標(biāo)儀570nm處測(cè)得吸光值。取各孔光吸收值，將所得結(jié)果用SPSS 13. O軟件的One Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間差異比較采用方差分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對(duì)肝癌細(xì)胞系IfepG2增殖具有明顯的抑制作用。3、HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用采用MTT方法檢測(cè)HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對(duì)胃癌細(xì)胞系BGC-823增殖的影響，具體操作如下(1)接種細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞系BGC-823，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 胰酶消化后接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為1 X 103。HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 處理將 5M0I 的 HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 病毒載體及對(duì)照病毒感染胃癌細(xì)胞系BGC-823，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以磷酸鹽緩沖液處理組作為對(duì)照。分別在M小時(shí)，48小時(shí)及72小時(shí)后檢測(cè)以上病毒載體對(duì)胃癌細(xì)胞系BGC-823生長(zhǎng)的抑制作用。(2)顯色培養(yǎng)48小時(shí)后加入5g/L的MTT 20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。(3)讀數(shù)去掉培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μ L，置于水平搖床上，室溫作用10分鐘。酶標(biāo)儀570nm處測(cè)得吸光值。取各孔光吸收值，將所得結(jié)果用SPSS 13. 0軟件的One Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間差異比較采用方差分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4 可見(jiàn)，HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對(duì)胃癌細(xì)胞系BGC-823增殖具有明顯的抑制作用。4. HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用采用MTT方法檢測(cè)HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對(duì)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549增殖的影響，具體操作如下(1)接種細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 胰酶消化后接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為1 X 103。HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 處理將 5M0I 的 HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 病毒載體及對(duì)照病毒感染肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以磷酸鹽緩沖液處理組作為對(duì)照。分別在M小時(shí)，48小時(shí)及72小時(shí)后檢測(cè)以上病毒載體對(duì)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549生長(zhǎng)的抑制作用。(2)顯色培養(yǎng)48小時(shí)后加入5g/L的MTT 20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。(3)讀數(shù)去掉培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μ L，置于水平搖床上，室溫作用10分鐘。酶標(biāo)儀570nm處測(cè)得吸光值。取各孔光吸收值，將所得結(jié)果用SPSS 13. O軟件的One Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間差異比較采用方差分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5 可見(jiàn)，HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對(duì)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549增殖具有明顯的抑制作用。5、HE1B55D-RGD. IL24/Arresten對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用采用MTT方法檢測(cè)HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco2增殖的影響，具體操作如下(1)接種細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco2，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 胰酶消化后接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為1 X 103。HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 處理將 5M0I 的 HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 病毒載體及對(duì)照病毒感染結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco2，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以磷酸鹽緩沖液處理組作為對(duì)照。分別在M小時(shí)，48小時(shí)及72小時(shí)后檢測(cè)以上病毒載體對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco2生長(zhǎng)的抑制作用。(2)顯色培養(yǎng)48小時(shí)后加入5g/L的MTT 20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。
(3)讀數(shù)去掉培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μ L，置于水平搖床上，室溫作用10分鐘。酶標(biāo)儀570nm處測(cè)得吸光值。取各孔光吸收值，將所得結(jié)果用SPSS 13. 0軟件的One Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間差異比較采用方差分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6 可見(jiàn)，HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco2增殖具有明顯的抑制作用。6、HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用采用MTT 方法檢測(cè) HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 對(duì)乳腺癌細(xì)胞系 MDA-MB-231 增殖的影響，具體操作如下(1)接種細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 胰酶消化后接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為1 X IO30HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 處理將 10M0I 的 HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 病毒載體及對(duì)照病毒感染乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以磷酸鹽緩沖液處理組作為對(duì)照。分別在M小時(shí)，48小時(shí)及72小時(shí)后檢測(cè)以上病毒載體對(duì)乳腺癌細(xì)胞系 MDA-MB-231生長(zhǎng)的抑制作用。(2)顯色培養(yǎng)48小時(shí)后加入5g/L的MTT 20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。(3)讀數(shù)去掉培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μ L，置于水平搖床上，室溫作用10分鐘。酶標(biāo)儀570nm處測(cè)得吸光值。取各孔光吸收值，將所得結(jié)果用SPSS 13. O軟件的One Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間差異比較采用方差分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7 可見(jiàn)，HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231增殖具有明顯的抑制作用。7、HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten在體外對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用采用MTT方法檢測(cè)HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對(duì)黑色素瘤細(xì)胞系 B16F10-G5-luc增殖的影響，具體操作如下(1)接種細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的黑色素瘤細(xì)胞系B16F10-G5-1UC，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0. 胰酶消化后接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為1X103。HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 處理將 10M0I 的 HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 病毒載體及對(duì)照病毒感染黑色素瘤細(xì)胞系B16F10-G5-1UC，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以磷酸鹽緩沖液處理組作為對(duì)照。分別在M小時(shí)，48小時(shí)及72小時(shí)后檢測(cè)以上病毒載體對(duì)黑色素瘤細(xì)胞系B16F10-G5-luc生長(zhǎng)的抑制作用。(2)顯色培養(yǎng)48小時(shí)后加入5g/L的MTT 20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。(3)讀數(shù)去掉培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μ L，置于水平搖床上，室溫作用10分鐘。酶標(biāo)儀570nm處測(cè)得吸光值。取各孔光吸收值，將所得結(jié)果用SPSS 13. O軟件的One Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間差異比較采用方差分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8 可見(jiàn)，HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten對(duì)黑色素瘤細(xì)胞系B16F10-G5_luc增殖具有明顯的抑制作用。8、HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten 在體內(nèi)對(duì) B16F10-G5_luc 黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16F10-G5-1UC黑色素瘤細(xì)胞，用PBS洗滌后經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0. 2%胰酶消化，PBS吹打懸浮細(xì)胞，4°C，2000g離心lOmin，棄上清；用無(wú)血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，制備成6. 6 X IO6VL的細(xì)胞懸液，并按ImL每支分裝至1. 5mL EP管中。取健康純種4-6周齡Balb/c雌性裸鼠49只，在本實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物試驗(yàn)根據(jù)NIH試驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指導(dǎo)說(shuō)明實(shí)施。先用75%酒精在其右后肢消毒，進(jìn)行乙醚吸入麻醉，細(xì)胞懸液搖勻后進(jìn)行皮下注射，按150 μ L(細(xì)胞總數(shù)為 IX IO6)/只進(jìn)行注射。每天觀察皮下成瘤情況。皮下接種4天，裸鼠皮下出現(xiàn)直徑5mm的黑色硬結(jié)，即為種植瘤生長(zhǎng)。49只裸鼠隨機(jī)分成7組，每組7只。重組腺病毒基因治療抗腫瘤實(shí)驗(yàn)方案如下各組均使用瘤體內(nèi)注射，每只裸鼠注射病毒總量均為2X109空斑形成單位 (Plaque Forming Units，PFU)，隔日注射1次，共注射4次，每次劑量為5X IO8PFU。開(kāi)始治療后，每隔一天進(jìn)行移植瘤的體積測(cè)量，根據(jù)移植瘤的長(zhǎng)徑(a)、短徑(b)，按公式計(jì)算瘤體體積(V = aXb2/2)，繪制腫瘤體積-時(shí)間變化曲線。以對(duì)照組裸鼠平均體積超過(guò)3，000mm3 時(shí)，作為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。結(jié)果顯示各組裸鼠皮下種植瘤的體積均有增加，但是在同一個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)比較 (如注射腫瘤細(xì)胞后的第16天時(shí))，HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten組比對(duì)照組Ad5. eGFP的腫瘤生長(zhǎng)緩慢，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖9，由圖9可見(jiàn)，HE1B55D-RGD. IL-24/Arresten具有更強(qiáng)腫瘤抑制作用。
權(quán)利要求
1.一種小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體，其特征在于在人腺病毒5型基因組2245bp-3327b之間有1083bp堿基的缺失，在人腺病毒5型基因組2245bp 與3327bp之間處插入一個(gè)表達(dá)第一外源基因的表達(dá)元件，在腺病毒5型基因組第32679bp 處即纖維蛋白HIloop處，插入編碼含有一個(gè)小肽序列，在人腺病毒5型基因組32787bp 與32788bp之間插入雙表達(dá)第二外源基因與eGFP的表達(dá)元件；上述的小肽序列為RGD、 SIKVAV、YGRKKRRQRRR、NGR、pK7 序列中的任意一個(gè)。
2.按照權(quán)利要求1所述的小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體，其特征在于所說(shuō)的在人腺病毒5型基因組2245bp與3327bp之間處插入一個(gè)表達(dá)第一外源基因的表達(dá)元件中的第一外源基因是Arresten、Trail、Endostatin、Canstatin、 tumostatin中的任意一種。
3.按照權(quán)利要求1所述的小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體， 其特征在于所說(shuō)的在人腺病毒5型基因組32787bp與32788bp之間插入雙表達(dá)第二外源基因與eGFP的表達(dá)元件中的第二外源基因是IL-24、Trail, Endostatin、Canstatin、 tumostatin的任意一禾中。
4.一種權(quán)利要求1小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于由下述步驟組成(1)構(gòu)建pAd5ElB55kd缺失的穿梭載體以Ad5基因組質(zhì)粒為PCR反應(yīng)模板，引物)(bal A序列為 GCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATG 與引物 XbaI B 序列為 TCAGATGGGTTTCTTCACTCCATTTATCCT 進(jìn)行第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 0%的瓊脂糖電泳后回片段，該聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物片段大小為719bp。以引物BglII A序列為ATAAAGGATAAATG GAGTGAAGAAACCCATCTGAG 和引物 BglII B 序列為 GAAGATCTATACAGTTAAGCCACCTATACAACA 進(jìn)行第二次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，所得到的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物片段大小為270bp，將上述兩次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物混合作為模板，以引物)(bal A序列為GCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATG與引物BglIIB序列為GAAGATCTATACAGTTAAGCCACCTATACAACA進(jìn)行第三次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 0%的瓊脂糖電泳后得到聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物片段大小為95^p，得到第三次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物，將聚此片段與pGEMT-T easy載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5ci細(xì)胞，涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中，通過(guò)酶切及測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆，所獲得陽(yáng)性克隆經(jīng))(bal和BglII雙酶切，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖電泳純化后得到的片斷與用)(bal和BglII雙酶切處理的腺病毒El區(qū)穿梭載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物采用同樣的方法轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆，命名為pHElB55D shuttle，獲得 pAd5ElB 55kd缺失的穿梭載體；(2)構(gòu)建PHE1B55D-第一外源基因的穿梭載體采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增第一外源基因，經(jīng)電泳純化后與pGEMT-easy載體相連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a，小量提取DNA，經(jīng)酶切鑒定，所獲得陽(yáng)性克隆命名為pGEMT/第一外源基因；將第一外源基因的片段從pGEMT/第一外源基因上經(jīng)ClaI和NotI雙酶切下來(lái)，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 0%的瓊脂糖電泳純化后與用相同雙酶切處理的pAd5. ElB55kd shuttle進(jìn)行連接，連接與轉(zhuǎn)化采用上述同樣的方法，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆，所獲得的載體為表達(dá)第一外源基因的Ad5El區(qū)穿梭載體，命名為PHE1B55D-第一外源基因shuttle ；(3)構(gòu)建PHE1B55D-第一外源基因/SwaI的腺病毒載體骨架將kal線性化的PHE1B55D-第一外源基因shuttle的穿梭載體與ClaI線性化腺病毒骨架載體pTG3602/SwaI按摩爾比3 1共轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BJ5183，將菌液涂布在含有 100yg/ml的氨芐青霉素的LB平板中，經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆，所獲得的陽(yáng)性克隆即為PHE1B55D-第一外源基因/SwaI的腺病毒載體骨架，命名為PHE1B55D_第一外源基因/ SwaI載體；(4)構(gòu)建pshuttleAd5-E4-fiber-小肽序列穿梭載體以pUC19載體為基礎(chǔ)，在氨芐抗性基因的開(kāi)放讀碼框的兩端通過(guò)基因突變的方式產(chǎn)生兩個(gè)單一的酶切位點(diǎn))(bal及Sful，然后將卡那抗性基因克隆到^CbaI和SfuI的位點(diǎn)中，所獲得的卡那抗性載體與EcoRI-Hindlll linker連接，獲得的載體命名為pUCKanEHL ；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增位于Ad5E4區(qū)3 ’端上游2. Okb的片段，基因片段兩端分別含有I^cI與 SwaI位點(diǎn)，將此片段克隆到pUCKanEHL載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，得到的載體稱為pshuttle Ad5E4-3'；采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增Ad5纖維蛋白3'端上游2. 01Λ的片段，基因片段兩端分別含有SwaI與SpeI位點(diǎn)；將此片段克隆到pshuttle Ad5E4_3'載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，獲得的新載體稱為pshuttle Ad5-E4-fiber，通過(guò)重疊聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，將小肽序列插入以上載體的fiber中，獲得的載體稱為pshuttle Ad5-E4-fiber-小肽序列；(5)構(gòu)建表達(dá)eGFP及第二外源基因的穿梭載體pshuttleAd5_CMVeGFP/第二外源基因-E4-fiber-小肽序列通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增miniCMV-SV40表達(dá)元件，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖電泳后回收聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)片段，將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)片段與 PGEMT-T easy載體連接，通過(guò)酶切及測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆，所獲得陽(yáng)性克隆命名為pGEMT/ miniCMV-SV40,將 miniCMV_SV40 片段從 pGEMT/miniCMV_SV40 上經(jīng) ClaI 和 NotI 雙酶切下來(lái)，與經(jīng)同樣酶切的雙向啟動(dòng)子穿梭載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物采用同樣的方法轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆，命名為pshuttle-Bio-PGK-eGFP-miniCMV-SV40 ；采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增第二外源基因，擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)電泳純化后與pGEMT-easy載體相連接，經(jīng)酶切鑒定，獲得陽(yáng)性克隆命名為pGEMT/第二外源基因，將第二外源基因片段從 pGEMT/第二外源基因上經(jīng)XhoI和XbaI雙酶切下來(lái)，用相同雙酶切處理的pshuttle-Bio-PGK-eGFP-miniCMV-SV40進(jìn)行連接；連接與轉(zhuǎn)化采用上述同樣的方法，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆，所獲得的載體為表達(dá)eGFP及第二外源基因的雙向啟動(dòng)子穿梭載體，命名為 pshuttle-Bio-eGFP-第二外源基因；將 pshuttle-Bio-eGFP-第二外源基因經(jīng) BamHI 及SfuI雙酶切末端補(bǔ)平后與經(jīng)SwaI酶切的腺病毒E4-fiber穿梭載體進(jìn)行連接，獲得的陽(yáng)性克隆為表達(dá)eGFP及第二外源基因的腺病毒E4-fiber穿梭載體，命名為pshuttle Ad5-CMVeGFP/第二外源基因-E4_fiber_小肽序列；(6)制備條件復(fù)制型溶瘤腺病毒HE1B55D-小肽序列.第二外源基因/第一外源基因用XhoI線性化的pshuttle Ad5_CMVeGFP/第二外源基因-E4_fiber_小肽序列的穿梭載體與SwaI線性化的PHE1B55D-第一外源基因/SwaI腺病毒載體骨架按摩爾比3 1 共轉(zhuǎn)化E. coliBJ5183，通過(guò)酶切及測(cè)序獲得陽(yáng)性克隆，所得到的載體命名為PHE1B55D-小肽序列.第二外源基因/第一外源基因；采用磷酸鈣法將I^acI線性化的表達(dá)綠色熒光蛋白的PHE1B55D-小肽序列.第二外源基因/第一外源基因的條件復(fù)制型腺病毒載體轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞系，經(jīng)過(guò)7 10天后，離心收獲病毒原液，經(jīng)2 3輪的病毒擴(kuò)增，通過(guò)兩次氯化銫密度梯度超速離心純化，獲得純化的表達(dá)綠色熒光蛋白的的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒 HE1B55D-小肽序列.第二外源基因/第一外源基因，-80°C冰箱內(nèi)保存。
5.權(quán)利要求1小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療惡性腦膠質(zhì)瘤藥物中的用途。
6.權(quán)利要求1小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療肝癌藥物中的用途。
7.權(quán)利要求1小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療胃癌藥物中的用途。
8.權(quán)利要求1小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療肺癌藥物中的用途。
9.權(quán)利要求1小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療結(jié)腸癌藥物中的用途。
10.權(quán)利要求1小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療乳腺癌藥物中的用途。
11.權(quán)利要求1小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體在制備治療黑色素瘤藥物中的用途。
全文摘要
一種小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體，在人腺病毒5型基因組2245bp-3327b之間有1083bp堿基的缺失，在人腺病毒5型基因組2245bp與3327bp之間處插入一個(gè)表達(dá)第一外源基因的表達(dá)元件，在腺病毒5型基因組第32679bp處即纖維蛋白HI loop處，插入編碼含有一個(gè)小肽序列，在人腺病毒5型基因組32787bp與32788bp之間插入雙表達(dá)第二外源基因與eGFP的表達(dá)元件。其構(gòu)建方法為構(gòu)建pAd5E1B 55kd缺失的shuttle、構(gòu)建pHE1B55D-第一外源基因的shuttle、構(gòu)建pHE1B55D-第一外源基因/SwaI的腺病毒載體骨架、構(gòu)建pshuttleAd5-E4-fiber-小肽序列shuttle、構(gòu)建表達(dá)eGFP及第二外源基因的shuttle、制備小肽修飾表達(dá)兩個(gè)外源基因的條件復(fù)制型溶瘤腺病毒載體。上述的腺病毒載體在制備治療腫瘤藥物中的用途。
文檔編號(hào)C12N15/861GK102229961SQ201110139710
公開(kāi)日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月26日
發(fā)明者劉世海, 夏海濱 申請(qǐng)人:陜西師范大學(xué)