專利名稱：四種食源性致病菌多重pcr檢測法及檢測引物組和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物檢測領(lǐng)域，涉及一種沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌四重快速檢測方法及其檢測引物組和檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
沙門氏菌印/ )是公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重要致病菌，屬革蘭氏染色陰性腸桿菌。據(jù)統(tǒng)計(jì)在世界各國發(fā)生的細(xì)菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首， 我國內(nèi)陸地區(qū)所發(fā)生的細(xì)菌性食物中毒中也以沙門氏菌為首要原因。除引發(fā)食物中毒外， 該屬的細(xì)菌還可以導(dǎo)致胃腸炎、傷寒和副傷寒等疾病。志賀氏菌5^)屬革蘭氏染色陰性腸桿菌，是人類細(xì)菌性痢疾最常見的病原菌。近年來，志賀氏菌I型的細(xì)菌性痢疾已發(fā)展為世界性流行趨勢，我國至少在十余個(gè)省區(qū)發(fā)生了不同規(guī)模流行。金黃色葡萄球菌 {Staphylococcus aareM)隸屬于葡萄球菌屬，革蘭氏染色呈陽性。金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等， 甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。金黃色葡萄球菌腸毒素是個(gè)世界性衛(wèi)生難題，我國每年發(fā)生的此類中毒事件也非常多。單增李斯特菌(Zisteria Mwoatow/ ^)，是一種具有耐熱 (600C )、耐低溫)、耐鹽、耐干燥等性質(zhì)的食源性致病菌，1986年，WHO和FDA將其列為 20世紀(jì)90年代食品四大致病菌之一 ；2000年，被WHO化列為重點(diǎn)監(jiān)測的食源性致病菌之一，目前也是我國重點(diǎn)關(guān)注的標(biāo)準(zhǔn)外微生物風(fēng)險(xiǎn)因子之一。根據(jù)現(xiàn)行的國家風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測體系要求，有多類食品均需對這四種食源性致病菌進(jìn)行檢測以排除其污染。常規(guī)檢測采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，每個(gè)致病菌需應(yīng)用獨(dú)立的檢測方法單獨(dú)進(jìn)行檢測，工作量大，所涉及培養(yǎng)基品種繁多，檢測周期可長達(dá)6d以上，且受到檢測人員專業(yè)背景、檢測經(jīng)驗(yàn)等多種因素影響，容易出現(xiàn)誤判。隨著分子生物學(xué)方法在食品微生物檢測中的逐步應(yīng)用，致病菌的檢測效率也逐步提升，但目前所采用的常規(guī)單重PCR方法不能實(shí)現(xiàn)多種目的菌的同時(shí)檢測，仍存在較大工作量。多重PCR技術(shù)能在同一 PCR反應(yīng)體系內(nèi)實(shí)現(xiàn)對多種目標(biāo)DNA的同步快速擴(kuò)增，為病原微生物的鑒定提供了快速，靈敏，特異的方法。鑒于多重PCR技術(shù)有眾多優(yōu)勢，現(xiàn)已被逐漸應(yīng)用于病原微生物的檢測。二重和三重PCR檢測屢有相關(guān)報(bào)道。但由于多重PCR影響因素復(fù)雜，不同的引物、模板、引物濃度、模板濃度、Mg2+濃度、dNTP濃度及其比例等會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜的綜合效應(yīng)，因此所同時(shí)檢測的目標(biāo)微生物種類越多，PCR體系建立的難度越大。經(jīng)國內(nèi)外文獻(xiàn)查詢，尚未見有多重PCR應(yīng)用于沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌快速檢測的相關(guān)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種四種食源性致病菌多重PCR檢測法及檢測引物組和試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是本發(fā)明沙門氏菌的檢測引物組的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列，下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列。
本發(fā)明志賀氏菌的檢測引物組的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列，下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列。本發(fā)明金黃色葡萄球菌的檢測引物組的上游引物具有如SEQ No. 5所示的序列，下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列。本發(fā)明單增李斯特菌的檢測引物組的上游引物具有如SEQ No. 7所示的序列，下游引物具有如SEQ No. 8所示的序列。本發(fā)明使用引物組對沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌進(jìn)行多重PCR檢測的方法是將沙門氏菌的檢測引物組、志賀氏菌的檢測引物組和金黃色葡萄球菌的檢測引物組與待測樣品的DNA進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后對反應(yīng)液進(jìn)行電泳分析判定，以確定樣品中是否含有沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌中的任一種或任幾種；其中，所述沙門氏菌的檢測引物組中的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列，所述志賀氏菌的檢測引物組中的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列，所述金黃色葡萄球菌的檢測引物組中的上游引物具有如SEQ No. 5所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列，所述單增李斯特菌的檢測引物組中的上游引物具有如SEQ No. 7所示的序列，下游引物具有如SEQ No. 8所示的序列。進(jìn)一步地，本發(fā)明所述多重PCR反應(yīng)按以下步驟進(jìn)行
(1)95 °C 預(yù)變性 5min ；
(2)95°C變性30s，62-64°C退火30s，72°C延伸100s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；
(3)72°C延伸 7min，4°C保存。進(jìn)一步地，本發(fā)明在進(jìn)行所述多重PCR反應(yīng)的反應(yīng)液中，所述沙門氏菌的檢測引物組中的上游引物和下游引物的濃度均為0. 03-0. 05 μ M，所述志賀氏菌的檢測引物組中的上游引物和下游引物的濃度均為0. 03-0. 05 μ Μ，所述金黃色葡萄球菌的檢測引物組中的上游引物和下游引物的濃度均為0. 15-0. 25μΜ，所述單增李斯特菌的檢測引物組中的上游引物和下游引物的濃度均為0.08-0. 12 μ Μ，并且，還包含有濃度為1.8-2. 2mM的Mg2+UO %(體積)的10XPCR緩沖液、濃度為0. 04-0. 06U/ μ L的DNA聚合酶、濃度各為0. 2-0. 3mM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸。本發(fā)明快速檢測試劑盒包括沙門氏菌的檢測引物組、志賀氏菌的檢測引物組、金黃色葡萄球菌的檢測引物組、單增李斯特菌的檢測引物組、四種陽性對照品、DNA聚合酶、 10XPCR緩沖液、Mg2+、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸和無菌超純水；所述沙門氏菌的檢測引物組中的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列，所述志賀氏菌的檢測引物組中的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列，所述金黃色葡萄球菌的檢測引物組中的上游引物具有如SEQ No. 5所示的序列、 下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列，所述單增李斯特菌的檢測引物組中的上游引物具有如SEQ No. 7所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 8所示的序列，所述四種陽性對照品分別為沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA。本發(fā)明快速檢測試劑盒的2XPCR預(yù)混液中，包含有沙門氏菌的檢測引物組、志賀氏菌的檢測引物組、金黃色葡萄球菌的檢測引物組、單增李斯特菌的檢測引物組、DNA聚合酶、PCR緩沖液、Mg2+、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸和無菌超純水，其中，所述沙門氏菌的檢測引物組中的上游引物和下游引物的濃度均為0. 06-0. 1 μ M，所述志賀氏菌的檢測引物組中的上游引物和下游引物的濃度均為0. 06-0. 1 μ Μ，所述金黃色葡萄球菌的檢測引物組中的上游引物和下游引物的濃度均為0. 3-0. 5μΜ，所述金黃色葡萄球菌的檢測引物組中的上游引物和下游引物的濃度均為0. 16-0. 24 μ Μ, Mg2+的濃度為3. 6-4. 4mM，2XPCR緩沖液，DNA聚合酶的濃度為0. 08-0. 12U/μ L，三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸的濃度各為0. 4-0. 6mM且三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸的摩爾比為1:1:1:1。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是
(1)本發(fā)明是根據(jù)已公開的沙門氏菌侵襲蛋白A (invA)基因序列、志賀氏菌侵襲性質(zhì)粒抗原(ipaH)基因序列、金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶(nuc)基因序列和單增李斯特菌溶血素蛋白(hly)基因序列，分析設(shè)計(jì)得到本發(fā)明的四重PCR檢測引物組。本發(fā)明的四重PCR檢測引物組特異性強(qiáng)，能準(zhǔn)確檢測沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌基因組 DNA。(2)本發(fā)明能在同一反應(yīng)體系中同時(shí)實(shí)現(xiàn)對沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的快速檢測，準(zhǔn)確判斷所檢樣品是否被沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌或單增李斯特菌污染，提高實(shí)驗(yàn)室檢測效率。(3)本發(fā)明的快速檢測方法靈敏度較高，其中沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌的陽性擴(kuò)增結(jié)果均僅需IOpg/μ L目的菌基因組DNA，單增李斯特菌的陽性擴(kuò)增結(jié)果僅需 Ipg/μ L目的菌基因組DNA。(4)本發(fā)明的檢測方法能在Id內(nèi)完成對四種食源性致病菌的快速篩選檢測，相對于常規(guī)平板分離檢測法6d的檢測周期，本發(fā)明檢測周期大大縮短。(5)與常規(guī)的平板培養(yǎng)法相比，本發(fā)明的檢測方法可減少檢測環(huán)節(jié)，從而降低因檢測環(huán)節(jié)過多或人員技術(shù)水平和經(jīng)驗(yàn)的差異造成的誤判的幾率，使檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。
圖1顯示了對不同目標(biāo)菌進(jìn)行單重和多重PCR檢測的電泳分析。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但并不對本發(fā)明做任何限定。實(shí)施例1 沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌四重PCR反應(yīng) Mg2+濃度測試
本實(shí)施例的具體檢測方法為 1、樣品DNA的提取
1. 1、將沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種于營養(yǎng)肉湯，單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于腦心浸液肉湯，36°C 士 1°C培養(yǎng)18小時(shí)。
1.2、應(yīng)用QIAGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒分別提取上述培養(yǎng)產(chǎn)物中的細(xì)菌 DNA，備用。2、多重PCR反應(yīng)
2. 1、分別人工合成用于沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌檢測的上下游引物，其中，用于沙門氏菌檢測的上游引物invAF具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列，下游引物invAR具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志賀氏菌檢測的上游引物 ipaHF具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列，下游引物ipaHR具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；用于金黃色葡萄球菌檢測的上游引物nucF具有如SEQ No. 5所示的核苷酸序列，下游引物nucR具有如SEQ No. 6所示的核苷酸序列；用于單增李斯特菌檢測的上游引物hlyF 具有如SEQ No. 7所示的核苷酸序列，下游引物hlyR具有如SEQ No. 8所示的核苷酸序列。2. 2、多重PCR反應(yīng)體系
2. 2. 1、沙門氏菌的多重PCR反應(yīng)體系
應(yīng)用不同的Mg2+濃度分別建立6組沙門氏菌多重PCR反應(yīng)體系，具體如下 各組反應(yīng)體系的體積為25 μ L，分別包括濃度均為0. 04 μ M的所述沙門氏菌檢測的上游引物invAF和下游引物invAR、濃度均為0. 04 μ M的所述志賀氏菌檢測的上游引物ipaHF 和下游引物ipaHR，濃度均為0. 2 μ M的所述金黃色葡萄球菌檢測的上游引物nucF和下游引物nucR，濃度均為0. 1 μ M的所述單增李斯特菌檢測的上游引物hlyF和下游引物hlyR， 10% (體積)的10XPCR緩沖液，濃度為0. 05U/ μ L的DNA聚合酶，濃度各為0. 2mM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸 (dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，沙門氏菌基因組DNA模板IyL;并且在以上6組反應(yīng)體系中，Mg2+濃度分別為1. 4mM、l. 6mM、l. 8mM、2. OmM,2. 2mM、2. 4mM;以上各反應(yīng)體系的剩余體積以無菌超純水補(bǔ)充。2. 2. 2、志賀氏菌的多重PCR反應(yīng)體系
應(yīng)用不同的Mg2+濃度分別建立6組志賀氏菌多重PCR反應(yīng)體系，具體如下 各組反應(yīng)體系的體積為25 μ L，分別包括濃度均為0. 04 μ M的沙門氏菌檢測的上游引物invAF和下游引物invAR、濃度均為0. 04 μ M的志賀氏菌檢測的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，濃度均為0. 2μΜ的金黃色葡萄球菌檢測的上游引物nucF和下游引物nucR， 濃度均為0. 1 μ M的單增李斯特菌檢測的上游引物hlyF和下游引物hlyR，10 % (體積)的 10XPCR緩沖液，濃度為0. 05U/ μ L的DNA聚合酶，濃度各為0. 2mM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，志賀氏菌基因組DNA模板IyL;并且在以上6組反應(yīng)體系中， Mg2+濃度分別為1. 4mM、l. 6mM、l. 8mM、2. OmM,2. 2mM、2. 4mM ；以上各反應(yīng)體系的剩余體積以無菌超純水補(bǔ)充。2. 2. 3、金黃色葡萄球菌的多重PCR反應(yīng)體系
應(yīng)用不同的Mg2+濃度分別建立6組金黃色葡萄球菌多重PCR反應(yīng)體系，具體如下 各組反應(yīng)體系的體積為25 μ L，分別包括濃度均為0. 04 μ M的沙門氏菌檢測的上游引物invAF和下游引物invAR、濃度均為0. 04 μ M的志賀氏菌檢測的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，濃度均為0. 2μΜ的金黃色葡萄球菌檢測的上游引物nucF和下游引物nucR， 濃度均為0. 1 μ M的單增李斯特菌檢測的上游引物hlyF和下游引物hlyR，10 % (體積)的10 X PCR緩沖液，濃度為0. 05U/ μ L的DNA聚合酶，濃度各為0. 2mM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，金黃色葡萄球菌基因組DNA模板1 μ L ；并且在以上6組反應(yīng)體系中，Mg2+濃度分別為1. 4mM、l. 6mM、l. 8mM、2. OmM,2. 2mM、2. 4mM ；以上各反應(yīng)體系的剩余體積以無菌超純水補(bǔ)充。2. 2. 4、單增李斯特菌的多重PCR反應(yīng)體系
應(yīng)用不同的Mg2+濃度分別建立6組單增李斯特菌多重PCR反應(yīng)體系，具體如下 各組反應(yīng)體系的體積為25 μ L，分別包括濃度均為0. 04 μ M的沙門氏菌檢測的上游引物invAF和下游引物invAR、濃度均為0. 04 μ M的志賀氏菌檢測的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，濃度均為0. 2μΜ的金黃色葡萄球菌檢測的上游引物nucF和下游引物nucR， 濃度均為0. ΙμΜ的單增李斯特菌檢測的上游引物hlyF和下游引物hlyR，10 % (體積)的 10XPCR緩沖液，濃度為0. 05U/ μ L的DNA聚合酶，濃度各為0. 2mM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，單增李斯特菌基因組DNA模板1 μ L ；并且在以上6組反應(yīng)體系中，Mg2+濃度分別為1. 4mM、l. 6mM、l. 8mM、2. OmM,2. 2mM、2. 4mM ；以上各反應(yīng)體系的剩余體積以無菌超純水補(bǔ)充。2. 3、多重PCR反應(yīng)條件
應(yīng)用PCR儀，反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min ；95°C變性30s，63 °C退火30s，72 °C延伸 100s，共進(jìn)行；35個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min，4°C保存。2. 4、結(jié)果觀察
將以上反應(yīng)液直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為0. 5XTBE、2. 0%瓊脂糖凝膠、 150V電壓條件下電泳30min，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)下成像觀察結(jié)果。其中沙門氏菌擴(kuò)增時(shí)，當(dāng) Mg2+濃度在1. 6-2. 2mM區(qū)間時(shí)，呈現(xiàn)出明亮的、單一的電泳條帶；志賀氏菌擴(kuò)增時(shí)，當(dāng)Mg2+濃度在1.8-2. 2mM區(qū)間時(shí)，呈現(xiàn)出明亮的、單一的電泳條帶；金黃色葡萄球菌擴(kuò)增時(shí)，當(dāng)Mg2+濃度在1. 6-2. 4mM區(qū)間時(shí)，呈現(xiàn)出明亮的、單一的電泳條帶；單增李斯特菌擴(kuò)增時(shí)，當(dāng)Mg2+濃度在1. 6-2. 2mM區(qū)間時(shí)，呈現(xiàn)出明亮的、單一的電泳條帶。綜合四種目標(biāo)菌檢測時(shí)的Mg2+濃度范圍，確定該四重重檢測方法的最佳Mg2+濃度為1. 8-2. 2mM。實(shí)施例2 沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌四重PCR反應(yīng)退火溫度測試
本實(shí)施例具體檢測方法如下 1、樣品DNA的提取
1.1、將沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種于營養(yǎng)肉湯，單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于腦心浸液肉湯，36°C 士 1°C培養(yǎng)18小時(shí)。1.2、應(yīng)用QIAGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒分別提取以上培養(yǎng)產(chǎn)物中的細(xì)菌 DNA。2、多重PCR反應(yīng)
2.1、分別人工合成用于沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌檢測的上下游引物，其中，用于沙門氏菌檢測的上游引物invAF具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列，下游引物invAR具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志賀氏菌檢測的上游引物ipaHF具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列，下游引物ipaHR具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；用于金黃色葡萄球菌檢測的上游引物nucF具有如SEQ No. 5所示的核苷酸序列，下游引物nucR具有如SEQ No. 6所示的核苷酸序列；用于單增李斯特菌檢測的上游引物hlyF 具有如SEQ No. 7所示的核苷酸序列，下游引物hlyR具有如SEQ No. 8所示的核苷酸序列。2. 2、多重PCR反應(yīng)體系
2. 2. 1、沙門氏菌的多重PCR反應(yīng)體系
應(yīng)用不同的退火溫度分別建立6組沙門氏菌多重PCR反應(yīng)體系，具體如下 各組反應(yīng)體系的體積為25 μ L，分別包括濃度均為0. 04 μ M的沙門氏菌檢測的上游引物invAF和下游引物invAR、濃度均為0. 04 μ M的志賀氏菌檢測的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，濃度均為0. 2 μ M的金黃色葡萄球菌檢測的上游引物nucF和下游引物nucR， 濃度均為0.1 μΜ的單增李斯特菌檢測的上游引物hlyF和下游引物hlyR，10 % (體積)的 10 X PCR緩沖液，濃度為2. OmM的Mg2+，濃度為0. 05U/ μ L的DNA聚合酶，濃度各為0. 2mM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，沙門氏菌基因組DNA模板lyL。2. 2. 2、志賀氏菌的多重PCR反應(yīng)體系
應(yīng)用不同的退火溫度分別建立6組志賀氏菌多重PCR反應(yīng)體系，具體如下 各組反應(yīng)體系的體積為25 μ L，分別包括濃度均為0. 04 μ M的沙門氏菌檢測的上游引物invAF和下游引物invAR、濃度均為0. 04 μ M的志賀氏菌檢測的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，濃度均為0. 2 μ M的金黃色葡萄球菌檢測的上游引物nucF和下游引物nucR， 濃度均為0.1 μΜ的單增李斯特菌檢測的上游引物hlyF和下游引物hlyR，10 % (體積)的 10 X PCR緩沖液，濃度為2. OmM的Mg2+，濃度為0. 05U/ μ L的DNA聚合酶，濃度各為0. 2mM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，志賀氏菌基因組DNA模板lyL。2. 2. 3、金黃色葡萄球菌的多重PCR反應(yīng)體系
應(yīng)用不同的退火溫度分別建立6組金黃色葡萄球菌多重PCR反應(yīng)體系，具體如下 各組反應(yīng)體系的體積為25 μ L，分別包括濃度均為0. 04 μ M的所述沙門氏菌檢測的上游引物invAF和下游引物invAR、濃度均為0. 04 μ M的所述志賀氏菌檢測的上游引物ipaHF 和下游引物ipaHR，濃度均為0. 2 μ M的所述金黃色葡萄球菌檢測的上游引物nucF和下游引物nucR，濃度均為0. 1 μ M的所述單增李斯特菌檢測的上游引物hlyF和下游引物hlyR， 10 % (體積)的10 X PCR緩沖液，濃度為2. OmM的Mg2+，濃度為0. 05U/ μ L的DNA聚合酶，濃度各為0. 2mM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，金黃色葡萄球菌基因組 DNA 模板 1 μ L。2. 2. 4、單增李斯特菌的多重PCR反應(yīng)體系
應(yīng)用不同的退火溫度分別建立6組單增李斯特菌多重PCR反應(yīng)體系，具體如下 各組反應(yīng)體系的體積為25 μ L，分別包括濃度均為0. 04 μ M的所述沙門氏菌檢測的上游引物invAF和下游引物invAR、濃度均為0. 04 μ M的所述志賀氏菌檢測的上游引物ipaHF 和下游引物ipaHR，濃度均為0. 2 μ M的所述金黃色葡萄球菌檢測的上游引物nucF和下游引物nucR，濃度均為0. 1 μ M的所述單增李斯特菌檢測的上游引物hlyF和下游引物hlyR，10%(體積)的10 X PCR緩沖液，濃度為2. OmM的Mg2+，濃度為0. 05U/ μ L的DNA聚合酶，濃度各為0. 2mM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，單增李斯特菌基因組DNA模板 ι μ L02. 3、多重PCR反應(yīng)條件
應(yīng)用PCR儀，將本實(shí)施例的2. 2中所述6組沙門氏菌多重PCR反應(yīng)體系、6組志賀氏菌多重PCR反應(yīng)體系、6組金黃色葡萄球菌多重PCR反應(yīng)體系、6組單增李斯特菌多重PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min ；95°C變性30s，60-65°C退火30s，72°C延伸100s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min，4°C保存。其中，同一種菌的6組反應(yīng)體系分別在6種不同退火溫度下進(jìn)行反應(yīng)，所采用的溫度分別為60°C、61°C、62°C、63°C、64°C、65°C。2. 4、結(jié)果觀察
將以上反應(yīng)液直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為0. 5XTBE、2. 0%瓊脂糖凝膠、 150V電壓條件下電泳30min，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)下成像觀察結(jié)果。其中沙門氏菌擴(kuò)增時(shí)， 當(dāng)反應(yīng)溫度在60-64°C區(qū)間時(shí)，呈現(xiàn)明亮的、單一的電泳條帶；志賀氏菌擴(kuò)增時(shí)，當(dāng)反應(yīng)溫度在62-64°C區(qū)間時(shí)，呈現(xiàn)明亮的、單一的電泳條帶；金黃色葡萄球菌擴(kuò)增時(shí)，當(dāng)反應(yīng)溫度在61-64°C區(qū)間時(shí)，呈現(xiàn)明亮的、單一的電泳條帶；單增李斯特菌擴(kuò)增時(shí)，當(dāng)反應(yīng)溫度在 61-65°C區(qū)間時(shí)，呈現(xiàn)明亮的、單一的電泳條帶。綜合四種目標(biāo)菌檢測時(shí)的溫度范圍，確定該四重檢測體系的最佳反應(yīng)溫度為62-64°C。實(shí)施例3:四重PCR檢測對沙門氏菌的檢測靈敏度本實(shí)施例的具體檢測方法為
1、樣品DNA的提取
1.1、將沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于營養(yǎng)肉湯，36 °C 士 1 °C培養(yǎng)18小時(shí)。1. 2、應(yīng)用QIAGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取以上培養(yǎng)產(chǎn)物中細(xì)菌DNA。2、多重PCR反應(yīng)
2.1、分別人工合成用于沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌檢測的上下游引物，其中，用于沙門氏菌檢測的上游引物invAF具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列，下游引物invAR具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志賀氏菌檢測的上游引物 ipaHF具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列，下游引物ipaH具有如RSEQ No. 4所示的核苷酸序列；用于金黃色葡萄球菌檢測的上游引物nucF具有如SEQ No. 5所示的核苷酸序列，下游引物nucR具有如SEQ No. 6所示的核苷酸序列；用于單增李斯特菌檢測的上游引物hlyF 具有如SEQ No. 7所示的核苷酸序列，下游引物hlyR具有如SEQ No. 8所示的核苷酸序列。2. 2、多重PCR的反應(yīng)體系
建立8個(gè)反應(yīng)管，各反應(yīng)管中反應(yīng)體系的總體積為25 μ L，包括濃度均為0. 04 μ M的所述沙門氏菌檢測的上游引物invAF和下游引物invAR、濃度均為0. 04 μ M的所述志賀氏菌檢測的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，濃度均為0. 2 μ M的所述金黃色葡萄球菌檢測的上游引物nucF和下游引物nucR，濃度均為0. 1 μ M的所述單增李斯特菌檢測的上游引物hlyF 和下游引物hlyR, 10 % (體積)的10XPCR緩沖液，濃度為2. OmM的Mg2+，濃度為0. 05U/ μ L 的DNA聚合酶，濃度各為0. 2mM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)；各反應(yīng)管還需分別加入沙門氏菌基因組DNA模板液1 μ L，所用沙門氏菌基因組DNA模板液的濃度分別為 IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L、IOOfg/ μ L、IOfg/ μ L、lfg/ μ L, 以測試該檢測方法對沙門氏菌的檢測靈敏度；以上各反應(yīng)體系的剩余體積以無菌超純水補(bǔ)充。2. 3、多重PCR反應(yīng)條件
應(yīng)用PCR儀，反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min ；95°C變性30s，63 °C退火30s，72 °C延伸 100s，共進(jìn)行；35個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min，4°C保存。2. 4、結(jié)果觀察
將以上各反應(yīng)液直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為0. 5XTBE、2. 0%瓊脂糖凝膠、 150V電壓條件下電泳30min，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)下成像觀察結(jié)果。通過對反應(yīng)產(chǎn)物的電泳分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)模板DNA液的濃度降至IOpg/ μ L時(shí)，仍可見較為明亮的、單一的電泳條帶。說明本發(fā)明方法對沙門氏菌DNA的檢測靈敏度為10fg/yL。實(shí)施例4 四重PCR檢測對志賀氏菌的檢測靈敏度本實(shí)施例具體檢測方法為
1、樣品DNA的提取
1.1、將志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于營養(yǎng)肉湯，36°C 士 1°C培養(yǎng)18小時(shí)。1. 2、應(yīng)用QIAGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取以上培養(yǎng)產(chǎn)物中細(xì)菌DNA。2、多重PCR反應(yīng)
2.1、分別人工合成用于沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌檢測的上下游引物，其中，用于沙門氏菌檢測的上游引物invAF具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列，下游引物invAR具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志賀氏菌檢測的上游引物 ipaHF具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列，下游引物ipaHR具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；用于金黃色葡萄球菌檢測的上游引物nucF具有如SEQ No. 5所示的核苷酸序列，下游引物nucR具有如SEQ No. 6所示的核苷酸序列；用于單增李斯特菌檢測的上游引物hlyF 具有如SEQ No. 7所示的核苷酸序列，下游引物hlyR具有如SEQ No. 8所示的核苷酸序列。2. 2、多重PCR的反應(yīng)體系
建立8個(gè)反應(yīng)管，各反應(yīng)管中反應(yīng)體系的總體積為25 μ L，包括濃度均為0. 04 μ M的所述沙門氏菌檢測的上游引物invAF和下游引物invAR、濃度均為0. 04 μ M的所述志賀氏菌檢測的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，濃度均為0. 2 μ M的所述金黃色葡萄球菌檢測的上游引物nucF和下游引物nucR，濃度均為0. 1 μ M的所述單增李斯特菌檢測的上游引物hlyF 和下游引物hlyR, 10 % (體積)的10XPCR緩沖液，濃度為2. OmM的Mg2+，濃度為0. 05U/ μ L 的DNA聚合酶，濃度各為0. 2mM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)；各反應(yīng)管還需分別加入志賀氏菌基因組DNA模板液1 μ L，所用志賀氏菌基因組DNA模板液的濃度分別為 IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L、IOOfg/ μ L、IOfg/ μ L、lfg/ μ L, 以測試該檢測方法對志賀氏菌的檢測靈敏度；以上各反應(yīng)體系的剩余體積以無菌超純水補(bǔ)充。2. 3、多重PCR反應(yīng)條件
應(yīng)用PCR儀，反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min ；95°C變性30s，63 °C退火30s，72 °C延伸100s，共進(jìn)行；35個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min，4°C保存。2. 4、結(jié)果觀察
將以上各反應(yīng)液直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為0. 5XTBE、2. 0%瓊脂糖凝膠、 150V電壓條件下電泳30min，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)下成像觀察結(jié)果。通過對反應(yīng)產(chǎn)物的電泳分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)模板DNA液的濃度降至IOpg/ μ L時(shí)，仍可見較為明亮的、單一的電泳條帶。說明本發(fā)明方法對志賀氏菌DNA的檢測靈敏度為10pg/yL。實(shí)施例5 四重PCR檢測對金黃色葡萄球菌的檢測靈敏度本實(shí)施例具體檢測方法為
1、樣品DNA的提取
1.1、將金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種于營養(yǎng)肉湯，36°C 士 1°C培養(yǎng)18小時(shí)。1.2、應(yīng)用QIAGEN細(xì)菌基因組DNA分別提取試劑盒提取以上培養(yǎng)產(chǎn)物中的細(xì)菌 DNA。2、多重PCR反應(yīng)
2.1、分別人工合成用于沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌檢測的上下游引物，其中，用于沙門氏菌檢測的上游引物irwAF具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列，下游引物invAR具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；用于志賀氏菌檢測的上游引物 ipaHF具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列，下游引物ipaHR具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；用于金黃色葡萄球菌檢測的上游引物nucF具有如SEQ No. 5所示的核苷酸序列，下游引物nucR具有如SEQ No. 6所示的核苷酸序列；用于單增李斯特菌檢測的上游引物hlyF 具有如SEQ No. 7所示的核苷酸序列，下游引物hlyR具有如SEQ No. 8所示的核苷酸序列。2. 2、多重PCR的反應(yīng)體系
建立8個(gè)反應(yīng)管，各反應(yīng)管中反應(yīng)體系的總體積為25 μ L，包括濃度均為0. 04 μ M的所述沙門氏菌檢測的上游引物invAF和下游引物invAR、濃度均為0. 04 μ M的所述志賀氏菌檢測的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，濃度均為0. 2 μ M的所述金黃色葡萄球菌檢測的上游引物nucF和下游引物nucR，濃度均為0. 1 μ M的所述單增李斯特菌檢測的上游引物hlyF 和下游引物hlyR, 10 % (體積)的10XPCR緩沖液，濃度為2. OmM的Mg2+，濃度為0. 05U/ μ L 的DNA聚合酶，濃度各為0. 2mM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)；各反應(yīng)管還需分別加入金黃色葡萄球菌基因組DNA模板液1 μ L，所用金黃色葡萄球菌基因組DNA 模板液的濃度分別為 IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L、IOOfg/ μ L、IOfg/ μ LUfg/μ L，以測試該檢測方法對金黃色葡萄球菌的檢測靈敏度；以上各反應(yīng)體系的剩余體積以無菌超純水補(bǔ)充。2. 3、多重PCR反應(yīng)條件
應(yīng)用PCR儀，反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min ；95°C變性30s，63 °C退火30s，72 °C延伸 100s，共進(jìn)行；35個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min，4°C保存。2. 4、結(jié)果觀察
將以上各反應(yīng)液直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為0. 5XTBE、2. 0%瓊脂糖凝膠、 150V電壓條件下電泳30min，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)下成像觀察結(jié)果。通過對反應(yīng)產(chǎn)物的電泳分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)模板DNA液的濃度降至IOpg/ μ L時(shí)，仍可見較為明亮的、單一的電泳條帶。說明本發(fā)明方法對金黃色葡萄球菌DNA的檢測靈敏度為 IOpg/μ L0實(shí)施例6 四重PCR檢測對單增李斯特菌的檢測靈敏度本實(shí)施例具體檢測方法為
1、樣品DNA的提取
1.1、將單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于腦心浸液肉湯，36°C 士 1°C培養(yǎng)18小時(shí)。1.2、應(yīng)用QIAGEN細(xì)菌基因組DNA分別提取試劑盒提取以上培養(yǎng)產(chǎn)物中的細(xì)菌 DNA。2、多重PCR反應(yīng)
2.1、分別人工合成用于沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌檢測的上下游引物，其中，用于沙門氏菌檢測的上游引物invAF具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列，下游引物invAR具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志賀氏菌檢測的上游引物 ipaHF具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列，下游引物ipaHR具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；用于金黃色葡萄球菌檢測的上游引物nucF具有如SEQ No. 5所示的核苷酸序列，下游引物nucR具有如SEQ No. 6所示的核苷酸序列；用于單增李斯特菌檢測的上游引物hlyF 具有如SEQ No. 7所示的核苷酸序列，下游引物hlyR具有如SEQ No. 8所示的核苷酸序列。2. 2、多重PCR的反應(yīng)體系
建立8個(gè)反應(yīng)管，各反應(yīng)管中反應(yīng)體系的總體積為25 μ L，包括濃度均為0. 04 μ M的所述沙門氏菌檢測的上游引物invAF和下游引物invAR、濃度均為0. 04 μ M的所述志賀氏菌檢測的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，濃度均為0. 2 μ M的所述金黃色葡萄球菌檢測的上游引物nucF和下游引物nucR，濃度均為0. 1 μ M的所述單增李斯特菌檢測的上游引物hlyF 和下游引物hlyR, 10 % (體積)的10XPCR緩沖液，濃度為2. OmM的Mg2+，濃度為0. 05U/ μ L 的DNA聚合酶，濃度各為0. 2mM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)；各反應(yīng)管還需分別加入金黃色葡萄球菌基因組DNA模板液1 μ L，所用單增李斯特菌基因組DNA 模板液的濃度分別為 IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L、IOOfg/ μ L、IOfg/ μ LUfg/μ L，以測試該檢測方法對單增李斯特菌的檢測靈敏度；以上各反應(yīng)體系的剩余體積以無菌超純水補(bǔ)充。2. 3、多重PCR反應(yīng)條件
應(yīng)用PCR儀，反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min ；95°C變性30s，63 °C退火30s，72 °C延伸 100s，共進(jìn)行；35個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min，4°C保存。2. 4、結(jié)果觀察
將以上各反應(yīng)液直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為0. 5XTBE、2. 0%瓊脂糖凝膠、 150V電壓條件下電泳30min，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)下成像觀察結(jié)果。通過對反應(yīng)產(chǎn)物的電泳分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)模板DNA液的濃度降至lpg/ μ L時(shí)，仍可見較為明亮的、單一的電泳條帶。說明本發(fā)明方法對單增李斯特菌DNA的檢測靈敏度為lpg/ μ L0實(shí)施例7:四重PCR檢測的特異性分析本實(shí)施例具體檢測方法為1.樣品DNA的提取
1.1、將沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種于營養(yǎng)肉湯，單增李斯特菌接種于腦心浸液肉湯，36°c 士 1°C培養(yǎng)18小時(shí)。1. 2、應(yīng)用QIAGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒分別提取以上培養(yǎng)產(chǎn)物中細(xì)菌DNA。1. 3、將四組DNA提取液按等體積比例混合，作為最終多重PCR檢測模板。2、多重PCR反應(yīng)
2.1、分別人工合成用于沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌檢測的上下游引物，其中，用于沙門氏菌檢測的上游引物invAF具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列，下游引物invAR具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志賀氏菌檢測的上游引物 ipaHF具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列，下游引物ipaHR具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；用于金黃色葡萄球菌檢測的上游引物nucF具有如SEQ No. 5所示的核苷酸序列，下游引物nucR具有如SEQ No. 6所示的核苷酸序列；用于單增李斯特菌檢測的上游引物hlyF 具有如SEQ No. 7所示的核苷酸序列，下游引物hlyR具有如SEQ No. 8所示的核苷酸序列。2. 2、多重PCR的反應(yīng)體系
反應(yīng)體系總體積為100 μ L，包括濃度均為0. 04μ M的所述沙門氏菌檢測的上游引物 invAF和下游引物invAR、濃度均為0. 04 μ M的所述志賀氏菌檢測的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，濃度均為0. 2μ M的所述金黃色葡萄球菌檢測的上游引物nucF和下游引物 nucR，濃度均為0. ΙμΜ的所述單增李斯特菌檢測的上游引物hlyF和下游引物hlyR，10% (體積)的10XPCR緩沖液，濃度為2. OmM的Mg2+，濃度為0. 05U/ μ L的DNA聚合酶，濃度各為0. 2mM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，混合DNA模板16 μ L ；反應(yīng)體系的剩余體積以無菌超純水補(bǔ)充。2. 3、多重PCR反應(yīng)條件
應(yīng)用PCR儀，反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min ；95°C變性30s，63 °C退火30s，72 °C延伸 100s，共進(jìn)行；35個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min，4°C保存。3、產(chǎn)物回收測序驗(yàn)證
3.1、將以上反應(yīng)液直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為0. 5XTBE、2. 0%瓊脂糖凝膠、150V電壓條件下電泳40min，將分子量各異的四條擴(kuò)增產(chǎn)物分別割膠回收，應(yīng)用QIAGEN 瓊脂糖凝膠純化試劑盒進(jìn)行純化，作為測序模板。3. 2、分別對所回收的產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，其中沙門氏菌測序引物序列分別如SEQ No. 1和SEQ No. 2所示，志賀氏菌測序引物序列分別如SEQ No. 3和SEQ No. 4所示，金黃色葡萄球菌測序引物序列分別如SEQ No. 5和SEQ No. 6所示，單增李斯特菌測序引物序列分別如SEQ No. 7和SEQ No. 8所示。3. 3、對沙門氏菌擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果與invA基因序列(GeneBank NC_003198. 1) 的吻合度達(dá)99% ；對志賀氏菌擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果與ipaH基因序列(GeneBank AY206449. 1)吻合度達(dá)99% ；對金黃色葡萄球菌擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果與nuc基因序列 (GeneBank NC_002952. 2)吻合度達(dá)98% ；對單增李斯特菌擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果與hly基因序列(GeneBank NC_003210. 1)吻合度達(dá)98%。由此可見，通過對本實(shí)施例多重PCR產(chǎn)物測序分析，可以驗(yàn)證本發(fā)明方法對沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的檢測特異性強(qiáng)，所擴(kuò)增的產(chǎn)物序列與預(yù)期吻合。實(shí)施例8 沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌四重PCR檢測本實(shí)施例采用乳粉作為檢測樣品，具體檢測步驟為
1、樣品DNA的提取
1.1、分別稱取25g乳粉樣品至225mL緩沖蛋白胨水培養(yǎng)液、225mL GN增菌液、225mL 7. 5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)液和225mL李斯特菌增菌液中，36°C 士 1°C培養(yǎng)18小時(shí)。1. 2、應(yīng)用QIAGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒分別提取以上四種培養(yǎng)產(chǎn)物中的細(xì)菌 DNA。1. 3、將上述四組DNA提取液按等體積比例混合，作為最終多重PCR檢測模板。2、多重PCR反應(yīng)
2.1、分別人工合成用于沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌檢測的上下游引物，其中，用于沙門氏菌檢測的上游引物invAF具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列，下游引物irwAR具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；用于志賀氏菌檢測的上游引物 ipaHF具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列，下游引物ipaHR具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；用于金黃色葡萄球菌檢測的上游引物nucF具有如SEQ No. 5所示的核苷酸序列，下游引物nucR具有如SEQ No. 6所示的核苷酸序列；用于單增李斯特菌檢測的上游引物hlyF 具有如SEQ No. 7所示的核苷酸序列，下游引物hlyR具有如SEQ No. 8所示的核苷酸序列。2. 2、多重PCR的反應(yīng)體系
建立2個(gè)平行反應(yīng)管，各反應(yīng)管的反應(yīng)體系總體積為25 μ L，包括濃度均為0. 03 μ M的所述沙門氏菌檢測的上游引物invAF和下游引物invAR、濃度均為0. 03 μ M的所述志賀氏菌檢測的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，濃度均為0. 15 μ M的所述金黃色葡萄球菌檢測的上游引物nucF和下游引物nucR，濃度均為0. 08 μ M的所述單增李斯特菌檢測的上游引物 hlyF和下游引物hlyR，10 %(體積)的10 XPCR緩沖液，濃度為1. 8mM的Mg2+，濃度為0. 04U/ μ L的DNA聚合酶，濃度各為0. 2mM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，混合DNA模板4 μ L ；反應(yīng)體系的剩余體積以無菌超純水補(bǔ)充。2. 3、多重PCR的反應(yīng)條件
應(yīng)用PCR儀，反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min ；95°C變性30s，62 °C退火30s，72 °C延伸 100s，共進(jìn)行；35個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min，4°C保存。2. 4、結(jié)果觀察
將以上各反應(yīng)液在0. 5 X TBE,2. 0%瓊脂糖凝膠、150V電壓條件下電泳30min，然后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察。圖1顯示了對本實(shí)施例樣品分別進(jìn)行單重和多重PCR的檢測結(jié)果，其中1號和10號泳道為DL2000的DNA maker ；2號和3號泳道為金黃色葡萄球菌檢測結(jié)果， 呈現(xiàn)分子量約為250bp的明亮的、單一的擴(kuò)增條帶，說明樣品中含有金黃色葡萄球菌；4號和5號泳道為志賀氏菌檢測結(jié)果，呈現(xiàn)分子量約為600bp的明亮的、單一的擴(kuò)增條帶，說明樣品中含有志賀氏菌；6號和7號泳道為沙門氏菌檢測結(jié)果，呈現(xiàn)分子量約為430bp的明亮的、單一的擴(kuò)增條帶，說明樣品中含有沙門氏菌；8號和9號泳道為單增李斯特菌檢測結(jié)果， 呈現(xiàn)分子量約為IOOObp的明亮的、單一的擴(kuò)增條帶，說明樣品中含有單增李斯特菌。11號和12號泳道為四重PCR擴(kuò)增結(jié)果，在分子量約為250bp、430bp、600bp和IOOObp處分別呈現(xiàn)明亮目的擴(kuò)增條帶，說明本實(shí)施例的樣品中存在沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌。2. 5、結(jié)果驗(yàn)證
采用GB 4789. 4-2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》、GB/T 4789. 5-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)志賀氏菌檢驗(yàn)》、GB 4789. 10-2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》和GB 4789. 30-2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》對本實(shí)施例樣品進(jìn)行檢測，檢出沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌，與多重PCR 檢測結(jié)果一致。實(shí)施例9 沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌四重PCR檢測本實(shí)施例采用乳粉作為檢測樣品，具體檢測步驟為
1、樣品DNA的提取
1.1、分別稱取25g乳粉樣品至225mL緩沖蛋白胨水培養(yǎng)液、225mL GN增菌液、225mL 7. 5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)液和225mL李斯特菌增菌液中，36°C 士 1°C培養(yǎng)18小時(shí)。1. 2、應(yīng)用QIAGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒分別提取以上四種培養(yǎng)產(chǎn)物中的細(xì)菌 DNA。1. 3、將上述四組DNA提取液按等體積比例混合，作為最終多重PCR檢測模板。2、多重PCR反應(yīng)
2.1、分別人工合成用于沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌檢測的上下游引物，其中，用于沙門氏菌檢測的上游引物invAF具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列，下游引物invAR具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志賀氏菌檢測的上游引物 ipaHF具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列，下游引物ipaHR具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；用于金黃色葡萄球菌檢測的上游引物nucF具有如SEQ No. 5所示的核苷酸序列，下游引物nucR具有如SEQ No. 6所示的核苷酸序列；用于單增李斯特菌檢測的上游引物hlyF 具有如SEQ No. 7所示的核苷酸序列，下游引物hlyR具有如SEQ No. 8所示的核苷酸序列。2. 2、多重PCR的反應(yīng)體系
建立2個(gè)平行反應(yīng)管，各反應(yīng)管的反應(yīng)體系總體積為25 μ L，包括濃度均為0. 04 μ M的所述沙門氏菌檢測的上游引物invAF和下游引物invAR、濃度均為0. 04 μ M的所述志賀氏菌檢測的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，濃度均為0. 2 μ M的所述金黃色葡萄球菌檢測的上游引物nucF和下游引物nucR，濃度均為0. 1 μ M的所述單增李斯特菌檢測的上游引物 hlyF和下游引物hlyR, 10 %(體積)的10XPCR緩沖液，濃度為2. OmM的Mg2+，濃度為0. 05U/ μ L的DNA聚合酶，濃度各為0. 25mM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)， 混合DNA模板4 μ L ；反應(yīng)體系的剩余體積以無菌超純水補(bǔ)充。2. 3、多重PCR的反應(yīng)條件
應(yīng)用PCR儀，反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min ；95°C變性30s，63 °C退火30s，72 °C延伸 100s，共進(jìn)行；35個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min，4°C保存。2. 4、結(jié)果觀察
將以上各反應(yīng)液在0. 5 X TBE,2. 0%瓊脂糖凝膠、150V電壓條件下電泳30min，然后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察，在分子量約為250bp、430bp、600bp和IOOObp處分別呈現(xiàn)明亮目的擴(kuò)增條帶，說明本實(shí)施例的樣品中存在沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌。2. 5、結(jié)果驗(yàn)證
采用GB 4789. 4-2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》、GB/T 4789. 5-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)志賀氏菌檢驗(yàn)》、GB 4789. 10-2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》和GB 4789. 30-2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》對本實(shí)施例樣品進(jìn)行檢測，檢出沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌，與多重PCR 檢測結(jié)果一致。實(shí)施例10 沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌四重PCR檢測本實(shí)施例采用乳粉作為檢測樣品，具體檢測步驟為
1、樣品DNA的提取
1.1、分別稱取25g乳粉樣品至225mL緩沖蛋白胨水培養(yǎng)液、225mL GN增菌液、225mL 7. 5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)液和225mL李斯特菌增菌液中，36°C 士 1°C培養(yǎng)18小時(shí)。1. 2、應(yīng)用QIAGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒分別提取以上四種培養(yǎng)產(chǎn)物中的細(xì)菌 DNA。1. 3、將上述四組DNA提取液按等體積比例混合，作為最終檢測模板。2、多重PCR反應(yīng)
2.1、分別人工合成用于沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌檢測的上下游引物，其中，用于沙門氏菌檢測的上游引物invAF具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列，下游引物invAR具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志賀氏菌檢測的上游引物 ipaHF具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列，下游引物ipaHR具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；用于金黃色葡萄球菌檢測的上游引物nucF具有如SEQ No. 5所示的核苷酸序列，下游引物nucR具有如SEQ No. 6所示的核苷酸序列；用于單增李斯特菌檢測的上游引物hlyF 具有如SEQ No. 7所示的核苷酸序列，下游引物hlyR具有如SEQ No. 8所示的核苷酸序列。2. 2、多重PCR的反應(yīng)體系
建立2個(gè)平行反應(yīng)管，各反應(yīng)管的反應(yīng)體系總體積為25 μ L，包括濃度均為0. 05 μ M的所述沙門氏菌檢測的上游引物invAF和下游引物invAR、濃度均為0. 05 μ M的所述志賀氏菌檢測的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，濃度均為0. 25 μ M的所述金黃色葡萄球菌檢測的上游引物nucF和下游引物nucR，濃度均為0. 12 μ M的所述單增李斯特菌檢測的上游引物 hlyF和下游引物hlyR，10 %(體積)的10 XPCR緩沖液，濃度為2. 2mM的Mg2+，濃度為0. 06U/ μ L的DNA聚合酶，濃度各為0. 3mM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，混合DNA模板4 μ L ；反應(yīng)體系的剩余體積以無菌超純水補(bǔ)充。2. 3、多重PCR的反應(yīng)條件
應(yīng)用PCR儀，反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min ；95°C變性30s，64°C退火30s，72 °C延伸 100s，共進(jìn)行；35個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min，4°C保存。2. 4、結(jié)果觀察
將以上各反應(yīng)液在0. 5 X TBE,2. 0%瓊脂糖凝膠、150V電壓條件下電泳30min，然后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察，在分子量約為250bp、430bp、600bp和IOOObp處分別呈現(xiàn)明亮目的擴(kuò)增條帶，說明本實(shí)施例的樣品中存在沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌。
2. 5、結(jié)果驗(yàn)證
采用GB 4789. 4-2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》、GB/T 4789. 5-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)志賀氏菌檢驗(yàn)》、GB 4789. 10-2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》和GB 4789. 30-2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》對本實(shí)施例樣品進(jìn)行檢測，檢出沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌，與多重PCR 檢測結(jié)果一致。實(shí)施例11 沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌四重PCR檢測試劑盒
本試劑盒由如下試劑組成
1、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌多重PCR檢測引物，包括 用于沙門氏菌多重PCR檢測的上游引物，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；用于沙門氏菌多重PCR檢測的下游引物，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列。用于志賀氏菌多重PCR檢測的上游引物，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；用于志賀氏菌多重PCR檢測的下游引物，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。用于金黃色葡萄球菌多重PCR檢測的上游引物，具有如SEQ No. 5所示的核苷酸序列；用于金黃色葡萄球菌多重PCR檢測的下游引物，具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列。用于單增李斯特菌多重PCR檢測的上游引物，具有如SEQ No. 7所示的核苷酸序列；用于單增李斯特菌多重PCR檢測的下游引物，具有如SEQ No.8所示的核苷酸序列。2、DNA 聚合酶；
3、陽性對照品沙門氏菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組、志賀氏菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA、金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA和單增李斯特菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA。4、空白對照品無菌超純水；
5、10XPCR緩沖液；
6、MgSO4溶液；
7、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸的混合溶液且三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸的摩爾比為1:1:1:1 ；
8、上樣緩沖液。實(shí)施例12 沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌四重PCR檢測試劑盒
本實(shí)施例試劑盒由如下試劑組成
1、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌四重PCR檢測2X預(yù)混液，該預(yù)混液的具體組成及濃度為
包括濃度均為0. 06 μ M的所述沙門氏菌檢測的上游引物和下游引物、濃度均為 0. 06 μ M的所述志賀氏菌檢測的上游引物和下游引物，濃度均為0. 3 μ M的所述金黃色葡萄球菌檢測的上游引物和下游引物，濃度均為0. 16 μ M的所述單增李斯特菌檢測的上游引物和下游引物，2 XPCR緩沖液，濃度為3. 6mM的Mg2+，濃度為0. 08U/ μ L的DNA聚合酶，濃度各為0. 4 mM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)。
用于沙門氏菌多重PCR檢測的上游引物，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；用于沙門氏菌多重PCR檢測的下游引物，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列。用于志賀氏菌多重PCR檢測的上游引物，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；用于志賀氏菌多重PCR檢測的下游引物，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。用于金黃色葡萄球菌多重PCR檢測的上游引物，具有如SEQ No. 5所示的核苷酸序列；用于金黃色葡萄球菌多重PCR檢測的下游引物，具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列。用于單增李斯特菌多重PCR檢測的上游引物，具有如SEQ No. 7所示的核苷酸序列；用于單增李斯特菌多重PCR檢測的下游引物，具有如SEQ No.8所示的核苷酸序列。2、陽性對照品 沙門氏菌基因組DNA; 志賀氏菌基因組DNA;
金黃色葡萄球菌基因組DNA; 單增李斯特菌基因組DNA。3、空白對照品無菌超純水； 4、上樣緩沖液。實(shí)施例13 沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌四重PCR檢測試劑盒
本實(shí)施例試劑盒由如下試劑組成
1、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌四重PCR檢測2X預(yù)混液，該預(yù)混液的具體組成及濃度為
包括濃度均為0. 08 μ M的所述沙門氏菌檢測的上游引物和下游引物、濃度均為 0. 08 μ M的所述志賀氏菌檢測的上游引物和下游引物，濃度均為0. 4 μ M的所述金黃色葡萄球菌檢測的上游引物和下游引物，濃度均為0. 2μ M的所述單增李斯特菌檢測的上游引物和下游引物，2 XPCR緩沖液，濃度為4. OmM的Mg2+，濃度為0. IU/μ L的DNA聚合酶，濃度各為0. 5mM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)。用于沙門氏菌多重PCR檢測的上游引物，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；用于沙門氏菌多重PCR檢測的下游引物，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列。用于志賀氏菌多重PCR檢測的上游引物，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；用于志賀氏菌多重PCR檢測的下游引物，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。用于金黃色葡萄球菌多重PCR檢測的上游引物，具有如SEQ No. 5所示的核苷酸序列；用于金黃色葡萄球菌多重PCR檢測的下游引物，具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列。用于單增李斯特菌多重PCR檢測的上游引物，具有如SEQ No. 7所示的核苷酸序列；用于單增李斯特菌多重PCR檢測的下游引物，具有如SEQ No.8所示的核苷酸序列。2、陽性對照品 沙門氏菌基因組DNA; 志賀氏菌基因組DNA;
金黃色葡萄球菌基因組DNA; 單增李斯特菌基因組DNA。
3、空白對照品無菌超純水； 4、上樣緩沖液。實(shí)施例14 沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌四重PCR檢測試劑盒
本實(shí)施例試劑盒由如下試劑組成
1、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌四重PCR檢測2X預(yù)混液，該預(yù)混液的具體組成及濃度為
包括濃度均為0. 1 μ M的所述沙門氏菌檢測的上游引物和下游引物、濃度均為0. 1 μ M 的所述志賀氏菌檢測的上游引物和下游引物，濃度均為0. 5μ M的所述金黃色葡萄球菌檢測的上游引物和下游引物，濃度均為0. Μμ M的所述單增李斯特菌檢測的上游引物和下游引物，2 XPCR緩沖液，濃度為4. 4mM的Mg2+，濃度為0. 12U/ μ L的DNA聚合酶，濃度各為0. 6mM 的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP )、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP )。用于沙門氏菌多重PCR檢測的上游引物，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；用于沙門氏菌多重PCR檢測的下游引物，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列。用于志賀氏菌多重PCR檢測的上游引物，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；用于志賀氏菌多重PCR檢測的下游引物，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。用于金黃色葡萄球菌多重PCR檢測的上游引物，具有如SEQ No. 5所示的核苷酸序列；用于金黃色葡萄球菌多重PCR檢測的下游引物，具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列。用于單增李斯特菌多重PCR檢測的上游引物，具有如SEQ No. 7所示的核苷酸序列；用于單增李斯特菌多重PCR檢測的下游引物，具有如SEQ No.8所示的核苷酸序列。2、陽性對照品 沙門氏菌基因組DNA; 志賀氏菌基因組DNA;
金黃色葡萄球菌基因組DNA; 單增李斯特菌基因組DNA。3、空白對照品無菌超純水； 4、上樣緩沖液。
20
權(quán)利要求
1.一種沙門氏菌的檢測引物組，其特征是其上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列， 其下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列。
2.一種志賀氏菌的檢測引物組，其特征是其上游引物上游引物具有如SEQ No.3所示的序列，其下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列。
3.一種金黃色葡萄球菌的檢測引物組，其特征是其上游引物具有如SEQ No.5所示的序列，其下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列。
4.一種單增李斯特菌的檢測引物組，其特征是其上游引物具有如SEQ No.7所示的序列，其下游引物具有如SEQ No. 8所示的序列。
5.一種使用引物組對沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌進(jìn)行多重 PCR檢測的方法，其特征是將沙門氏菌的檢測引物組、志賀氏菌的檢測引物組、金黃色葡萄球菌的檢測引物組和單增李斯特菌的檢測引物組組與待測樣品的DNA進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后對反應(yīng)液進(jìn)行電泳分析以確定樣品中是否含有沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌或單增李斯特菌；其中，所述沙門氏菌的檢測引物組中的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列，所述志賀氏菌的檢測引物組中的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列，所述金黃色葡萄球菌的檢測引物組中的上游引物具有如SEQ No. 5所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列，所述單增李斯特菌的檢測引物組中的上游引物具有如SEQ No. 7所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 8所示的序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征是所述多重PCR反應(yīng)按以下步驟進(jìn)行(1)95°C 預(yù)變性 5min ；(2)95°C變性30s，62-64°C退火30s，72°C延伸100s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；(3)72°C延伸7min，4°C保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征是在進(jìn)行所述多重PCR反應(yīng)的反應(yīng)液中， 所述沙門氏菌的檢測引物組中的上游引物和下游引物的濃度均為0. 03-0. 05 μ M，所述志賀氏菌的檢測引物組中的上游引物和下游引物的濃度均為0. 03-0. 05 μ Μ，所述金黃色葡萄球菌的檢測引物組中的上游引物和下游引物的濃度均為0. 15-0. 25μΜ，所述單增李斯特菌的檢測引物組中的上游引物和下游引物的濃度均為0. 08-0. 12 μ M ；并且，在進(jìn)行所述多重 PCR反應(yīng)的反應(yīng)液中，還包含有濃度為1. 8-2. 2mM的Mg2+UO % (體積)的10XPCR緩沖液、 濃度為0. 04-0. 06U/ μ L的DNA聚合酶、濃度各為0. 2-0. 3mM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、 三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸。
8.一種快速檢測試劑盒，其特征在于包括沙門氏菌的檢測引物組、志賀氏菌的檢測引物組、金黃色葡萄球菌的檢測引物組、單增李斯特菌的檢測引物組、四種陽性對照品、DNA 聚合酶、10XPCR緩沖液、Mg2+、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸和無菌超純水；所述沙門氏菌的檢測引物組中的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列，所述志賀氏菌的檢測引物組中的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列，所述金黃色葡萄球菌的檢測引物組中的上游引物具有如SEQ No. 5所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列，所述單增李斯特菌的檢測引物組中的上游引物具有如SEQ No. 7所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 8所示的序列，所述四種陽性對照品分別為沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組 DNA。
9. 一種快速檢測試劑盒，其特征在于包含2 X PCR預(yù)混液，所述2 X PCR預(yù)混液中包含有沙門氏菌的檢測引物組、志賀氏菌的檢測引物組、金黃色葡萄球菌的檢測引物組、單增李斯特菌的檢測引物組、DNA聚合酶、2XPCR緩沖液、Mg2+、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸，所述沙門氏菌的檢測引物組中的上游引物和下游引物的濃度均為0. 06-0. 1 μ M，所述志賀氏菌的檢測引物組中的上游引物和下游引物的濃度均為0. 06-0. 1 μ Μ，所述金黃色葡萄球菌的檢測引物組中的上游引物和下游引物的濃度均為0. 3-0. 5μΜ，所述單增李斯特菌的檢測引物中的上游引物和下游引物的濃度均為0. 16-0. 24 μ Μ, Mg2+的濃度為3. 6-4. 4mM, DNA聚合酶的濃度為0. 08-0. 12 U/μ L，三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸的濃度各為0. 4-0. 6mM且三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸的摩爾比為1:1:1:1。
全文摘要
本發(fā)明公開一種四種食源性致病菌多重PCR檢測法及檢測引物組和試劑盒。本發(fā)明通過利用分析設(shè)計(jì)得到的沙門氏菌、志賀氏菌、萄球菌和單增李斯特菌的快速檢測引物組，對待測樣品中所提取的細(xì)菌的基因組DNA，在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，通過對反應(yīng)產(chǎn)物的電泳分析來判定樣品中是否含有沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌或單增李斯特菌。各檢測引物組特異性強(qiáng)，能在同一反應(yīng)體系中準(zhǔn)確檢測沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌基因組DNA。
文檔編號C12Q1/68GK102220427SQ20111011994
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月10日
發(fā)明者姜侃, 張東雷, 金燕飛, 陳小珍 申請人:浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測研究院