一種豬流感h1n1亞型滅活疫苗及制備方法

專利名稱：一種豬流感h1n1亞型滅活疫苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物病毒學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬流感HlNl亞型滅活疫苗及制備方法。本發(fā)明還涉及由該HlNl亞型豬流感病毒毒株制備的滅活疫苗及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬流感(SI)是一種急性感染的呼吸系統(tǒng)疾病，以突然發(fā)病、咳嗽、呼吸困難、發(fā)熱和衰竭，以及隨后的迅速恢復(fù)或死亡為特征。各品種、性別和年齡的豬均能感染，發(fā)病率高，豬群暴發(fā)流感時，發(fā)病率可高達(dá)100%。豬的呼吸道上皮細(xì)胞同時存在著可與禽流感、人流感、豬流感、馬流感等流感結(jié)合的受體，這些受體的存在使豬可以攜帶禽流感、人流感、豬流感、馬流感病毒，因此，豬可能被人、禽及其他動物流感病毒感染，是流感病毒的“混合器”及病毒基因重配的“溫床”。豬流感傳播迅速，常引起急性呼吸道疾病暴發(fā)。其典型的臨床癥 狀為流鼻涕、咳嗽和呼吸困難，伴有發(fā)熱、嗜睡以及隨之而來的厭食和消瘦等癥狀。因為豬流感在單獨感染的情況下很少引起死亡，所以在國內(nèi)并沒有引起足夠的重視，規(guī)?；i場未將豬流感疫苗免疫提到議事日程。然而，Siv與豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、圓環(huán)病毒及肺炎支原體混合感染時，會顯著增加上述疾病的損害程度和病死率。另外，SIV也是豬呼吸道疾病綜合征的主要病原。SIV與其它病原體共感染或繼發(fā)感染所造成的損害已成為制約當(dāng)前豬場經(jīng)濟(jì)效益的主要原因之一。由于豬流感在禽流感和人流感的流行、傳播和分子變異中的特殊作用，其對公共衛(wèi)生也有著十分重要的意義。2009年甲型HlNl流感的大流行再次給我們這個交流日益頻繁的世界提出了一個大公共衛(wèi)生的問題。2009年4月以來，始發(fā)于墨西哥的甲型HlNl流感波及全球，給人類健康構(gòu)成了巨大威脅。研究表明墨西哥的甲型HlNl流感病毒與以往在豬體內(nèi)分離的流感病毒有明顯的差異，屬于變異后的新毒株，可以人傳染人。美國CDC分析表明，甲型HlNl流感病毒基因來自于北美豬流感、北美禽流感、人流感以及歐洲和亞洲的經(jīng)典豬流感等4個不同病毒，是不同病毒間雜交混合的結(jié)果。由于甲型HlNl流感病毒有五個基因片段來自于豬流感，因此一度被稱為豬流感，再次引發(fā)了人們對豬流感的高度關(guān)注。回顧豬流感流行的百年歷史，可以清楚的看到豬流感給人類帶來的危害。豬流感自1918年在美國首次發(fā)生以來，已造成世界范圍內(nèi)的多次大流行。SIV于1931年由Shope首次分離并鑒定，這就是20世紀(jì)初引起美國豬流感流行的古典型HlNl病毒株，該毒株是古典豬流感病毒的代表株。其分離鑒定開始了豬流感及豬流感病毒研究的新紀(jì)元。與美國不同的是，歐洲大陸豬流感發(fā)生較晚，直到20世紀(jì)70年代末才出現(xiàn)暴發(fā)式流行，其流行的毒株雖然也是H1N1，但是與美國流行的古典型SIV在抗原性和遺傳性上均有顯著差異，而與來自鴨的HlNl有著很高的同源性。為了區(qū)別2種不同的HlNl亞型毒株，通常把后者稱為類禽型H1N1。這2種HlNl亞型毒株隨后都傳入亞洲并在世界各國長期流行。1969年H3N2亞型SIV首次分離于臺灣，1970年在香港也分離到SIV的H3N2亞型毒株。這次流行的H3N2毒株及其變異株在以后的十多年間傳播到了世界各地。1984年，歐洲大陸首次報道了類人H3N2亞型毒株引起的豬流感暴發(fā)，并且整個歐洲大陸的豬群都表現(xiàn)出高水平的抗體。1988年，美國許多接種了 HlNl流感疫苗的豬場暴發(fā)了嚴(yán)重的豬流感，其病原經(jīng)鑒定為H3N2亞型毒株。此后，HlNl和H3N2成為世界各國廣泛流行的2個SIV主要血清型。研究表明，近幾年發(fā)生于日本、韓國、美國的H1N2亞型SIV是HlNl和H3N2的重組產(chǎn)物，迄今在豬群中流行的豬流感主要有古典豬H1N1、類禽HlNl和類人H3N2毒株，古典型HlNl SIV以地方流行性存在于歐美大陸，并于20世紀(jì)70年代傳到了東亞各國，并在這些國家廣泛流行。目前已發(fā)現(xiàn)的流感病毒HA亞型有15個，NA亞型有9個。盡管不同的亞型之間可以組成很多種流感病毒血清型。但目前造成世界性流行SIV血清型只有H1N1，H1N2和H3N2。但也有其它血清型的零星報道，如H1N7、H3N6、H4N6、H9N2和H5N1等。我國豬流感的血清學(xué)和病原學(xué)調(diào)查結(jié)果都表明，在我國橫跨南北的多個省市都有嚴(yán)重的豬流感流行，血清學(xué)和病毒學(xué)監(jiān)測顯示出我國豬群不僅廣泛存在Hl和H3亞型豬流感病毒感染，也出現(xiàn)了 H9亞型豬流感病毒感染?！?006年5月 2008年7月之間，本實驗室對湖南、湖北、江西、河南等地23個規(guī)模化豬場送檢的7790份種公豬、后備和經(jīng)產(chǎn)母豬的血清進(jìn)行了豬流感病毒Hl亞型血凝抑制試驗(HI)檢測。結(jié)果表明，所檢測豬血清中存在Hl亞型SIV抗體，06年、07年、08年HI陽性率分別為 23. 46%,33. 90%,39. 71%02009年4月北美甲型HlNl流感暴發(fā)流行，本實驗室分別用北美甲型HlNl流感病毒的HA表達(dá)蛋白、國內(nèi)分離的HlNl豬流感病毒的HA表達(dá)蛋白包被ELISA板對湖北、河南、江西、安徽等地814份送檢血清進(jìn)行了檢測。ELISA結(jié)果表明(I)國內(nèi)分離的HlNl豬流感HA-ELISA檢測陽性率為27. 5% (224/814)。224份豬流感ELISA檢測陽性樣品進(jìn)一步用甲型HlNl流感病毒HA-ELISA檢測，結(jié)果顯示有65份為陰性，說明了其中有159份血清樣品為兩種HA抗原檢測同為陽性，具有71%的抗原交叉反應(yīng)(159/224)。(2)北美甲型HlNl流感病毒HA-ELISA檢測陽性率為23. 7% (193/814)，193份甲型HlNl流感病毒HA-ELISA檢測為陽性樣品進(jìn)一步用豬流感HA-ELISA檢測，結(jié)果有34份為陰性，說明了其中有159份血清樣品為兩種HA抗原檢測同為陽性，具有82. 4%的抗原交叉反應(yīng)(159/193)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，制備一株HlNl亞型豬流感病毒的滅活疫苗，本發(fā)明還包括該滅活疫苗的制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明通過以下方案實現(xiàn)本發(fā)明的豬流感滅活疫苗株是從某發(fā)病豬場的鼻拭子樣品中分離得到，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，連接T載體進(jìn)行測序檢測鑒定該病毒為HlNl亞型豬流感病毒(H1N1 swineinfluenza virus)。申請人將該病毒株命名為豬流感病毒(swine influenza virus)HlNlSIV TJ，該毒株于2011年3月25日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號為CCTCC N0:V201107。將所述的病毒株接種雞胚培養(yǎng)，收獲感染雞胚液，用甲醛溶液滅活、混合和加常規(guī)油佐劑乳化制成HlNl亞型豬流感病毒滅活疫苗(技術(shù)流程如圖I所示)。本發(fā)明分離株的微生物鑒定
形態(tài)描述流感病毒時負(fù)鏈RNA病毒?；蚪M是分節(jié)段的，每個RNA病毒都由核蛋白包被形成RNP復(fù)合體。RNPs由基質(zhì)蛋白(M1)構(gòu)成完整的膜包裹。脂類來自宿主細(xì)胞膜，而在病毒粒子內(nèi)部是RNA依賴性聚合酶蛋白(PA、PB1和PB2)，兩個重要的跨膜蛋白分別是棒狀的HA和蘑菇狀的NA。典型的流感病毒在電鏡下呈球形(如圖2所示)，直徑為80 120nm，平均為lOOnm。流感病毒具有囊膜，在囊膜表面有許多放射性排列的纖突，病毒粒子的中心有一直徑為40 60nm的電子密度高的錐狀核心。本發(fā)明的優(yōu)點是I、本發(fā)明提供了一種新的豬流感病毒毒株，由該毒株所制備的滅活疫苗能夠有效預(yù)防HlNl亞型豬流感病毒的感染。
2、本發(fā)明制備的疫苗安全性良好，試驗證明具有良好的安全性，免疫保護(hù)效果達(dá)到80%以上。更詳細(xì)的技術(shù)方案見《具體實施方式
》所述。


序列表SEQ ID NO 1是本發(fā)明用于鑒定的豬流感病毒HA和NA基因的部分核苷酸序。圖I :是本發(fā)明的總體技術(shù)流程圖。圖2 :豬流感病毒的電鏡圖。圖3 :HA、NA基因的凝膠電泳圖。圖4 pMD-18T 載體圖譜。圖5 :是本發(fā)明登錄的HA基因序列和NA基因序列的全長。其中圖5a為HA基因的核苷酸序列，圖5b為NA基因的核苷酸序列。圖6 :本發(fā)明的滅活疫苗注射豬的頸部的吸收情況的病理切片。其中圖6a、圖6b是滅活疫苗中的抗原正在逐漸的刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的抵抗力，淋巴細(xì)胞正在逐漸的吞噬這些油脂細(xì)胞；圖6c和圖6d是非免疫對照豬的肌肉組織和脂肪組織間未觀察到明顯的油脂細(xì)胞和淋巴細(xì)胞聚集。圖7 :免疫豬與未免疫對照豬攻毒后剖解的病理變化圖。
具體實施方案實施例I制備實施例I病毒株的分離與鑒定從中國某豬場疑似流感感染的豬群中采集鼻拭子，接種雞胚，收集雞胚尿囊液，經(jīng)RT-PCR方法檢測后鑒定為豬流感病毒HlNl亞型，將該病毒株命名為豬流感病毒HlNl SIVTJ株。具體操作步驟如下提取雞胚尿囊液的RNA，RT-PCR擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄用的引物序列Unil2 :其核苷酸序列(單鏈)如下5’ -AGCAAAAGCAGG-3’豬流感病毒cDNA合成
在20ii L反轉(zhuǎn)錄體系中進(jìn)行，依次加入以下組分AMV Reverse Transcriptase XL (50U/U L) I. 0 U L ；RNase inhibitor (40U/U L)0. 5 U L ；5 X RNA PCR Buffer4. 0 U L ；Unil2prime(IOpmol)rI. 5 u L ；dNTPs(1Ommol)2 U L ；RNA 模板11 U L ;
將上述試劑或酶混勻后置PCR儀上，于42°C下反應(yīng)60min，95°C下反應(yīng)5min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)產(chǎn)物直接用于PCR或于4°C下保存?zhèn)溆?。擴(kuò)增HA基因(基因登錄號登錄號為EU004444. I)部分核苷酸序列。NA基因(基因登錄號登錄號為EU004442. I)部分核苷酸序列的引物對的核苷酸序列如下擴(kuò)增HA 基因上游引物 p 15 ’ -AGCAAAAGCAGGGG-3，，下游引物 P25，-AGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3 ’ ；擴(kuò)增片段大小為1778bp。擴(kuò)增NA 基因上游引物 p 15 ’ -AGCAAAAGCAGGAGT-3 ’，下游引物 P25，-AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT-3 ’ ；擴(kuò)增片段大小為1462bp左右。PCR反應(yīng)體系在25 ii L PCR體系中(依次加入以下組分):Trans-Taq 聚合酶(2U) 0. 5 U L ；IOXBuffer2. 5 U L ；dNTP (2mmol)2 U L ；上游引物IiiL;下游引物IiiL;cDNA3 u L ;ddH2016 u L ;PCR 反應(yīng)參數(shù)95°C 5min ；94°C 30s，55°C 30s, 72 °C 3min，30 個循環(huán)；72°C 延伸IOmin0 HA、NA基因的的擴(kuò)增結(jié)果分別見(圖3a，圖3b)，將PCR產(chǎn)物純化后連接pMD18_T載體(載體圖譜見圖4)，選取陽性病料克隆HA和NA送上海生工生物工程有限公司測序(HA基因序列見圖5a，NA基因序列見圖5b)，經(jīng)過比對確定本發(fā)明的分離株為豬流感病毒(swineinfluenza virus) HlNl亞型。申請人將這毒株命名為豬流感病毒HlNl SIV TJ，于2011年3月25日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號為CCTCC NO V201107o2 HlNl SIV TJ 病毒株特性(I)血凝抑制試驗按“中華人民共和國獸藥典”第三部(中國獸藥典委員會編，中國農(nóng)業(yè)出版社，2005版，以下簡稱“中國獸藥典”)HI試驗方法配制4單位HlNl SIV TJ株病毒液，然后用四種陽性血清進(jìn)行交叉試驗。該病毒凝集紅細(xì)胞的特性能被流感Hl陽性參考血清特異性中和，不能被H3、H9、ND陽性參考血清中和。HlNl SIV TJ株第I代HA效價為51og2,傳至第2代HA為81og2。
(2)回歸試驗將HlNl SIV TJ株病毒用滅菌生理鹽水稀釋至2. Oml含IO6EID5tl病毒，以氣管途徑對28日齡的仔豬進(jìn)行攻毒，每頭接種2. 0ml。逐日觀測豬只的食欲、精神狀態(tài)，是否有流感樣癥狀，并每日測其體溫，采集攻毒豬鼻拭子，按常規(guī)方法進(jìn)行病毒分離。將病毒接種仔豬后12h時由4頭豬開始分別出現(xiàn)包括流鼻涕，咳嗽、厭食、精神萎靡、不愿走動，7天后，豬只癥狀逐漸消失，趨于康復(fù)。在觀察的7天里，有4頭出現(xiàn)過發(fā)燒的現(xiàn)象，鼻拭子的病毒分離結(jié)果顯示5頭豬均能分離到病毒。(3)毒種傳代試驗將經(jīng)過雞胚有限稀釋克隆連續(xù)傳代得到的，具有穩(wěn)定血凝效價的HlNl SIV TJ病毒液作為原始種子液，以原始種子液HlNl SIV TJ (FO)進(jìn)行傳代，第一代為Fl依次傳至F8代，取傳代毒種第2代(F2)、第4代(F4)、第6代(F6)、第8代(F8)用I %的雞紅細(xì)胞進(jìn)行病毒血凝滴度測定。其HA效價彡81og2。
(4)純凈性試驗I)無菌檢驗將上述步驟(3)得到的Fl F8代毒種分別按照“中國獸藥典”規(guī)定的方法進(jìn)行，利用硫乙酸鹽培養(yǎng)基(簡稱T.G，參見中國獸藥典第三部)、酪胨瓊脂斜面(簡稱G. A參見中國獸藥典第三部)和葡萄糖蛋白胨湯(簡稱G. P，參見中國獸藥典第三部)進(jìn)行無菌檢驗。2)支原體檢驗將HlNl SIV TJ株的Fl F8代毒種分別接種改良Frey氏培養(yǎng)基(參見中國獸藥典第三部)，按“中國獸藥典”規(guī)定方法進(jìn)行檢驗。3)外源病毒檢測將HlNl SIV TJ株Fl F8代毒種與豬流感病毒HlNl SIV TJ株高免血清以體積比4 I進(jìn)行中和，取中和后的病毒液按現(xiàn)行中國獸藥典方法進(jìn)行外源病毒檢測。雞胚檢查法選9日齡的SPF雞胚20個，分成2組，第一組10枚雞胚，經(jīng)尿囊腔接種0. 2ml被中和后的病毒，第二組10枚雞胚，經(jīng)絨毛尿囊膜接種0. 2ml被中和后的病毒。37°C培養(yǎng)7日未發(fā)現(xiàn)雞胚死亡，雞胚發(fā)育正常，絨毛尿囊膜無病變，取雞胚尿囊液HA檢驗均為陰性。應(yīng)用分子生物學(xué)檢查法通PCR或者RT-PCR的方法檢測本發(fā)明的HlNl SIV TJ株Fl F8代毒種中是否存在牛病毒性腹瀉病毒(BVDV Oregon C24V株，購自中國獸醫(yī)藥監(jiān)察所)、偽狂犬病毒(龍曉婷等，偽狂犬病毒在潛伏感染豬體內(nèi)的組織分布，畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2008年，第39卷，第5期645-651)、豬細(xì)小病毒(呂建強(qiáng)等，豬細(xì)小病毒_偽狂犬病毒二聯(lián)油乳劑滅活疫苗的研制，中國獸醫(yī)雜志，2005年，第41卷，第6期17-20)、豬瘟病毒(郭東春等，豬瘟病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS2基因不同片段的克隆及在原核系統(tǒng)中的高效表達(dá)，中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2006年，第28卷，第I期6-9)、豬圓環(huán)病毒的污染(宋云峰等，豬2型圓環(huán)病毒Cap蛋白在偽狂犬病病毒中的表達(dá)，中國獸醫(yī)學(xué)報，2007年，第27卷，第2期155-158)。結(jié)果顯示Fl F8代毒種中并沒有這些病毒的污染。結(jié)果表明HlNl SIV TJ株Fl F8代毒種無細(xì)菌、支原體、外源病毒污染。結(jié)果見表1，表明本發(fā)明所涉及的病毒是純凈的。(5)紅細(xì)胞凝集試驗按“中國獸藥典”規(guī)定方法進(jìn)行檢驗，HA效價為8 91og2。結(jié)果見表I。(6) HlNl SIV TJ病毒含量測定將HlNl SIV TJ株Fl F8代毒種用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋后，取10_4、10_5、10' 10' 10' 10_9、6個稀釋度，每個稀釋度經(jīng)尿囊腔分別接種9日齡SPF雞胚各4枚，每胚0. 2ml，置相對濕度60 65 %，溫度33 35 °C繼續(xù)孵育。定時照胚，棄去24小時內(nèi)死亡雞胚，24小時后死胚隨時收獲，至72小時無論死胚活胚均逐個收獲雞胚尿囊液，分別測定紅細(xì)胞凝集(HA)效價> 41og2判定為感染,按照Reed-Muench法計算EID500結(jié)果(見表I)每0. 2ml豬流感HlNl亞型病毒含量為^ IO6.5EID500試驗結(jié)果見表I。表I HlNl SIV TJ株Fl F8代毒種純凈、HA效價及病毒含量檢測結(jié)果
毒種代次無菌檢驗支原體檢驗外源病毒HA病毒含量
Fl---81og2IO'744
F2---81og2IO'706
F3---91og2IO'7 50
F4--- . 91og2IO"750
F5---91og2IO'704
F6---81og2IO'717
F7---91og2IO'744
F8---91og2IO'704說明表I中的HA為血凝素縮寫。(7)免疫原性試驗將F4代毒種用甲醛溶液滅活，按水相油相I : 1.5(V V)的比例制成油乳劑滅活疫苗后，頸部肌肉注射25 30日齡豬流感病毒HlNl血凝抑制抗體陰性(HI ( 31og2)仔豬5頭，每頭注射劑量為2ml。免疫后28日，連同非免疫對照豬5頭，采集血清進(jìn)行HI效價測定并用HlNl SIV TJ株進(jìn)行氣管內(nèi)接種，每頭豬接種2ml (含IO6 tlEID5tl)，觀察10日。
·
發(fā)病判定標(biāo)準(zhǔn)出現(xiàn)上呼吸道癥狀攻毒后I 3日出現(xiàn)咳嗽、流鼻涕、鼻炎、呼吸困難、精神沉郁等流感癥狀；病毒分離陽性攻毒后第3天采集所有攻毒豬的鼻腔棉拭子，每份拭子樣品接種9日齡易感雞胚各5枚，每份接種樣品中有一枚雞胚液HA效價大于或等于41og2，即判為病毒分尚陽性。出現(xiàn)肺臟病理變化攻毒后第10天剖殺所有攻毒仔豬，逐頭觀察肺臟變化，肺臟出現(xiàn)斑點狀或斑塊狀實變、肺出血等病理變化。以上3項出現(xiàn)任意2項者，即判定為發(fā)病。凡免疫組至少4頭獲得免疫保護(hù)，攻毒對照組至少4頭發(fā)病的，說明本發(fā)明制備疫苗具有良好的免疫效力。
攻毒試驗結(jié)果見表2所述。表2 HlNl SIV TJ F4代毒種免疫原性檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種分離的豬流感HlNl亞型滅活疫苗株，其特征在于該疫苗株是HlNl亞型豬流感病毒(swine influenza virus) HlHl SIV TJ，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏號為CCTCC NO V201107o
2.由權(quán)利要求I所述的疫苗株制備的豬流感HlNl亞型病毒滅活疫苗。
3.權(quán)利要求I所述的疫苗株在制備豬流感HlNl亞型病毒滅活疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于動物病毒學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種分離的豬流感H1N1亞型滅活疫苗株，其制備方法與應(yīng)用。所述的疫苗株是H1N1亞型豬流感病毒(swine influenza virus)H1H1 SIVTJ，該病毒株保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏號為CCTCC NOV201107。本發(fā)明制備的滅活疫苗經(jīng)試驗證明具有良好的安全性，免疫保護(hù)效果達(dá)到80％以上。
文檔編號C12N7/00GK102747045SQ20111009788
公開日2012年10月24日 申請日期2011年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月19日
發(fā)明者周紅波, 張安定, 徐高原, 楊影, 郭學(xué)波, 金梅林, 陳煥春, 陳章表 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司