專利名稱:一種用于臨床檢測(cè)的測(cè)序方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及一種結(jié)合熒光定量PCR的基因測(cè)序方法。
背景技術(shù):
測(cè)序技術(shù)是生物技術(shù)領(lǐng)域具有劃時(shí)代意義的發(fā)明,該技術(shù)在基因擴(kuò)增(聚合酶鏈反應(yīng),PCR)的基礎(chǔ)上,直觀的得到目的片段的核酸序列,為突變發(fā)現(xiàn)、疾病分析等提供了可能。測(cè)序技術(shù)是公認(rèn)的序列分析和突變位點(diǎn)檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”,使用測(cè)序技術(shù),不但能檢測(cè)已知的突變位點(diǎn),亦能發(fā)現(xiàn)未知的突變位點(diǎn)。同時(shí),測(cè)序技術(shù)也是病原微生物分型的理論基礎(chǔ),乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等病原微生物的亞型分型原理就是基于病毒的全基因組序列差異或部分基因區(qū)域的序列差異。近年來(lái),臨床診斷領(lǐng)域常遇到的耐藥位點(diǎn)突變、病毒亞型分型等新問(wèn)題,需要新的技術(shù)和產(chǎn)品予以解決。而傳統(tǒng)的測(cè)序技術(shù)使用定性PCR結(jié)合電泳檢測(cè)模式對(duì)目的核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增和擴(kuò)增后的效果檢測(cè),存在一些弊端,不適用于臨床診斷領(lǐng)域。這些弊端包括
(1)反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng),定性PCR結(jié)合電泳檢測(cè),一般需要2 3個(gè)小時(shí)的時(shí)間;
(2)在電泳時(shí),需要打開(kāi)PCR反應(yīng)管,在PCR產(chǎn)物純化過(guò)程中,需要切膠,這些操作時(shí)間長(zhǎng),容易產(chǎn)生大量的PCR產(chǎn)物氣溶膠,引起假陽(yáng)性;
(3)電泳檢測(cè)的靈敏度低,造成低濃度模板漏檢;
(4)切膠過(guò)程中將損失大量PCR產(chǎn)物,影響低濃度模板的測(cè)序效果;
(5)PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量只能通過(guò)電泳圖譜粗略估計(jì),而在測(cè)序反應(yīng)中,過(guò)多的PCR產(chǎn)物將使測(cè)序引物過(guò)快消耗,造成測(cè)序峰圖不正常。熒光定量PCR技術(shù)是完全閉管操作(整個(gè)過(guò)程中,僅有加入樣品一次開(kāi)蓋),直接探測(cè)PCR過(guò)程中熒光信號(hào)的變化以獲得定量的結(jié)果,不需要PCR后電泳處理,一舉克服了定性 PCR技術(shù)的諸多難題,為PCR的臨床應(yīng)用又開(kāi)辟了新的道路。但是熒光定量PCR是將檢測(cè)的目的片段和探針設(shè)計(jì)在目的物的DNA或RNA的保守區(qū)域,單一的熒光定量PCR技術(shù)只能檢測(cè)目的核酸的載量而無(wú)法檢測(cè)目的物的類型和是否具有相關(guān)突變。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題有兩個(gè)方面,一個(gè)是克服現(xiàn)有技術(shù)的弊端,提供一種適用于臨床診斷領(lǐng)域的基因測(cè)序方法,另一個(gè)方面是,提供基于該方法在制備基因檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。為此,本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明第一個(gè)方面,提供了一種結(jié)合熒光定量PCR的基因測(cè)序方法,它包括如下步驟
(1)熒光定量PCR使用目的片段特異性的引物和熒光探針,對(duì)目的片段的核酸模板, 進(jìn)行擴(kuò)增,得到目的片段的定量結(jié)果和PCR產(chǎn)物;
(2)酶解用外切酶(ExoI)和牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)處理步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物,以降解多余的引物和dNTP,避免對(duì)后續(xù)反應(yīng)的干擾;
(3)測(cè)序反應(yīng)使用目的片段特異性的測(cè)序引物,對(duì)步驟(2)得到的酶解產(chǎn)物進(jìn)行延伸反應(yīng),獲得帶熒光標(biāo)記的測(cè)序產(chǎn)物;
(4)測(cè)序產(chǎn)物純化使用醋酸鈉、無(wú)水乙醇、甲酰胺處理步驟(3)得到的測(cè)序產(chǎn)物,以獲得高純的測(cè)序產(chǎn)物;
(5)測(cè)序儀檢測(cè)將步驟(4)得到的測(cè)序產(chǎn)物在測(cè)序儀上進(jìn)行檢測(cè),獲得目的片段的基因序列。在本發(fā)明的另一個(gè)方面,提供了基于上述方法在制備基因檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用, 所述基因檢測(cè)試劑盒至少包含
(1)用于熒光定量PCR的各反應(yīng)試劑,至少包括PCR反應(yīng)液、目的片段特異性的上游 PCR引物、目的片段特異性的下游PCR引物、目的片段特異性的熒光探針、耐高溫的DNA聚合酶;
(2)用于PCR產(chǎn)物酶解的試劑,至少包括外切酶和牛小腸堿性磷酸酶;
(3)用于測(cè)序反應(yīng)的試劑至少包括目的片段特異性的測(cè)序引物、測(cè)序反應(yīng)液。所述基因檢測(cè)試劑盒,還可以包括陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品、定量標(biāo)準(zhǔn)品、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)、醋醋酸鈉、無(wú)水乙醇、甲酰胺等試劑。由于采用了上述的技術(shù)方案,本發(fā)明中的結(jié)合熒光定量PCR的基因測(cè)序方法,克服了傳統(tǒng)的基因測(cè)序方法的弊端
(1)熒光定量PCR反應(yīng)時(shí)間較定性PCR結(jié)合電泳檢測(cè)的模式,能縮短廣2個(gè)小時(shí);
(2)沒(méi)有電泳、切膠純化等長(zhǎng)時(shí)間操作的步驟,避免了大量PCR產(chǎn)物氣溶膠的產(chǎn)生,降低了假陽(yáng)性;
(3)熒光信號(hào)檢測(cè)的靈敏度高于電泳檢測(cè),一般1000拷貝/ml的DNA模板即可被檢測(cè), 并應(yīng)用于測(cè)序,降低了漏檢率;
(4)沒(méi)有切膠純化的步驟,避免了PCR產(chǎn)物大量損失的情況;
(5)PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量可以通過(guò)熒光值予以確定,較電泳圖確認(rèn)的準(zhǔn)確度要高,提高了測(cè)序峰圖的質(zhì)量?;谠摲椒ㄖ苽涞幕驒z測(cè)試劑盒,有效的降低了臨床最關(guān)注的假陽(yáng)性問(wèn)題,能夠廣泛的應(yīng)用于臨床診斷領(lǐng)域。
圖1是本發(fā)明的操作流程圖。圖2是本發(fā)明實(shí)施例3的熒光定量PCR圖。圖3是本發(fā)明實(shí)施例3的熒光定量PCR后的電泳圖。圖4是本發(fā)明實(shí)施例7的測(cè)序圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。需要指出的是,以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法, 通常按照常規(guī)條件,例如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版,科學(xué)出版社2002 [美]J.薩姆布魯克,D.W拉塞爾著,黃培堂等譯)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1 引物、探針設(shè)計(jì)。針對(duì)乙型肝炎病毒的P基因的高突變區(qū),設(shè)計(jì)特異性的PCR引物、探針和測(cè)序引物,序列如下表所示,并委托專業(yè)公司進(jìn)行合成和熒光標(biāo)記。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合熒光定量PCR的基因測(cè)序方法,其特征在于,它包括如下步驟1)熒光定量PCR使用目的片段特異性的引物和熒光探針,對(duì)目的片段的核酸模板,進(jìn)行擴(kuò)增,得到目的片段的定量結(jié)果和PCR產(chǎn)物;2)酶解用外切酶和牛小腸堿性磷酸酶處理步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物,以降解多余的引物和dNTP,避免對(duì)后續(xù)反應(yīng)的干擾;3)測(cè)序反應(yīng)使用目的片段特異性的測(cè)序引物,對(duì)步驟(2)得到的酶解產(chǎn)物進(jìn)行延伸反應(yīng),獲得帶熒光標(biāo)記的測(cè)序產(chǎn)物;4)測(cè)序產(chǎn)物純化使用醋酸鈉、無(wú)水乙醇、甲酰胺處理步驟(3)得到的測(cè)序產(chǎn)物,以獲得高純的測(cè)序產(chǎn)物;5)測(cè)序儀檢測(cè)將步驟(4)得到的測(cè)序產(chǎn)物上測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè),獲得目的片段的基因序列。
2.一種基于權(quán)利要求1所述方法的基因檢測(cè)試劑盒,其特征在于,所述基因檢測(cè)試劑盒至少包含如下部分1)用于熒光定量PCR的各反應(yīng)試劑,至少包括PCR反應(yīng)液、目的片段特異性的上游 PCR引物、目的片段特異性的下游PCR引物、目的片段特異性的熒光探針、耐高溫的DNA聚合酶;2)用于PCR產(chǎn)物酶解的試劑,至少包括外切酶和牛小腸堿性磷酸酶;3)用于測(cè)序反應(yīng)的試劑至少包括目的片段特異性的測(cè)序引物、測(cè)序反應(yīng)液。
3.權(quán)利要求2所述基因檢測(cè)試劑盒,還可以包括陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品、定量標(biāo)準(zhǔn)品、尿嘧啶-N-糖基化酶、醋醋酸鈉、無(wú)水乙醇、甲酰胺等試劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種結(jié)合熒光定量PCR的基因測(cè)序方法,它包括熒光定量PCR、酶解、測(cè)序反應(yīng)、測(cè)序產(chǎn)物純化、測(cè)序儀檢測(cè)等步驟。本發(fā)明還公開(kāi)了基于該方法制備基因檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用。本發(fā)明的方法使用熒光定量PCR代替?zhèn)鹘y(tǒng)的定性PCR加電泳的模式對(duì)目的核酸進(jìn)行擴(kuò)增和擴(kuò)增效果的檢測(cè),既縮短了檢測(cè)時(shí)間,又避免了電泳過(guò)程中開(kāi)蓋帶來(lái)的PCR氣溶膠污染問(wèn)題,降低了假陽(yáng)性,非常適用于臨床檢測(cè)等醫(yī)療領(lǐng)域。同時(shí),根據(jù)熒光定量PCR對(duì)目的片段的定量結(jié)果,可以得知目的片段的起始濃度,并大致判斷PCR產(chǎn)物的濃度,可直接指導(dǎo)后續(xù)的基因測(cè)序,提高了檢測(cè)的靈敏度和基因測(cè)序的效率。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102154502SQ20111009787
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月19日
發(fā)明者劉明坤, 葉鋒, 趙洪斌 申請(qǐng)人:北京鑫諾美迪基因檢測(cè)技術(shù)有限公司