專利名稱：復(fù)合膜修飾的DNA傳感器及其制備方法和在檢測(cè)Lip特定編碼基因片段中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物傳感器領(lǐng)域，尤其涉及一種經(jīng)過(guò)膜修飾后的生物傳感器及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
采用生物傳感技術(shù)檢測(cè)基因片段是基因分析檢測(cè)的一個(gè)趨勢(shì)，其中電化學(xué)傳感器受到廣泛的關(guān)注，因?yàn)槠渚邆漤憫?yīng)快速，高靈敏，高選擇性和可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于DNA 傳感器，常見的工作電極是金電極或者基于納米金的篩網(wǎng)印刷電極，因?yàn)樾揎椨袔€基的基因探針通過(guò)巰基與金的交聯(lián)，很容易裝配在電極表面，進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。不過(guò)，金電極價(jià)格昂貴，而篩網(wǎng)印刷電極是一次性電極，對(duì)于大量檢測(cè)而言，其總花費(fèi)也很可觀。近年，隨著新型納米材料與電化學(xué)傳感技術(shù)迅猛結(jié)合，一類基于順磁性固定技術(shù)的電化學(xué)傳感器得到發(fā)展迅速。這類傳感器將碳糊填充到聚四氟乙烯(PTFE)管中，并把磁體嵌入電極前部的碳糊中，形成在電極前端表面具有固定磁場(chǎng)的碳糊電極，進(jìn)而，再利用順磁性吸引固定功能化的磁性納米顆粒，構(gòu)建不同的傳感器用于相關(guān)目標(biāo)物的特異性檢測(cè)。從運(yùn)行成本角度而言，采用經(jīng)濟(jì)的磁性納米顆粒和碳糊電極代替上述兩類電極進(jìn)行基因片段檢測(cè)，不失為一種可行的辦法。但是有一個(gè)問(wèn)題不容忽視碳糊電極的電子傳導(dǎo)能力明顯低于金電極，會(huì)降低基因傳感技術(shù)的檢測(cè)精度。為了改善碳糊電極的電子傳導(dǎo)能力，在傳感器構(gòu)建策略中，結(jié)合新型材料學(xué)相關(guān)特點(diǎn)，使用一些納米材料和生物分子材料形成復(fù)合膜結(jié)構(gòu)修飾在碳糊電極表面。納米材料， 例如碳納米管、磁性納米粒子和金納米粒子等因?yàn)榫哂懈唠娮觽鲗?dǎo)性，能提供大比表面積， 保持生物活性等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是優(yōu)秀的生物分子載體和信號(hào)傳遞媒介，可以改善電化學(xué)傳感器的靈敏度。除了納米材料，一種生物分子材料，殼聚糖因無(wú)毒、生物適應(yīng)性強(qiáng)、具有成膜能力等特點(diǎn)也被廣泛應(yīng)用于生物傳感器的構(gòu)建中。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種成本低、電子傳導(dǎo)能力強(qiáng)、檢測(cè)精度高的復(fù)合膜修飾的DNA傳感器，還相應(yīng)提供一種該DNA傳感器的制備方法和該DNA傳感器在檢測(cè)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(Lip)特定編碼基因片段中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種復(fù)合膜修飾的DNA傳感器，包括一碳糊電極，所述碳糊電極包括碳棒和PTFE 管，所述碳棒內(nèi)置于所述PTFE管中，所述碳棒一端通過(guò)電線引出所述PTFE管，所述碳棒另一端與一磁體相接觸，所述磁體與所述PTFE管管口間填充有碳糊，所述碳糊電極的感應(yīng)端包覆有敏感物質(zhì)，所述敏感物質(zhì)包括復(fù)合膜和巰基化的DNA捕獲探針，所述復(fù)合膜由依次修飾于所述碳糊電極表面的巰基化的磁性納米顆粒、巰基化的多壁碳納米管-金納米粒子、以及殼聚糖組成，所述DNA捕獲探針修飾于所述多壁碳納米管-金納米粒子表面。
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作為對(duì)上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述磁體設(shè)置于距所述聚四氟乙烯管的管口不大于8mm處。上述技術(shù)方案中，所述DNA捕獲探針的序列優(yōu)選為5' -HS (CH2) JTGTTGACGAAGG ACTGCCA-3‘。作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種上述復(fù)合膜修飾的DNA傳感器的制備方法，包括以下步驟(1)制作碳糊電極在PTFE管中放入碳棒，并在所述碳棒一端置入磁體，形成磁性區(qū)域，所述磁體與PTFE管管口之間用碳糊填充，碳棒另一端通過(guò)電線引出PTFE管，得到碳糊電極的粗坯，再將所述粗坯進(jìn)行表面處理，得到最終的碳糊電極；(2)修飾碳糊電極表面將制備好的磁性納米顆粒和多壁碳納米管-金納米粒子、 以及殼聚糖溶液依次修飾到步驟(1)制得的碳糊電極的感應(yīng)端表面，自然晾干后得到復(fù)合膜修飾的碳糊電極，再將準(zhǔn)備好的巰基化的DNA捕獲探針滴在經(jīng)復(fù)合膜修飾的碳糊電極感應(yīng)端表面，自組裝后，得到復(fù)合膜修飾的DNA傳感器。上述制備磁性納米顆粒的工藝過(guò)程優(yōu)選為在氮?dú)獗Ｗo(hù)下制備!^e3O4膠狀沉淀，然后依次加入聚乙二醇、正硅烷乙酯、甲醇、氨丙基三甲氧基硅烷和半胱氨酸，反應(yīng)后得到巰基化的磁性納米顆粒。上述制備多壁碳納米管-金納米粒子的工藝過(guò)程優(yōu)選為將多壁碳納米管純化， 再與半胱氨酸反應(yīng)，使多壁碳納米管巰基化，然后將巰基化的多壁碳納米管與金納米粒子反應(yīng)，得到巰基化的多壁碳納米管-金納米粒子。本發(fā)明的DNA傳感器的復(fù)合膜的修飾過(guò)程和DNA捕獲探針的自組裝原理如圖2所
7J\ ο作為一個(gè)總的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還提供利用上述的復(fù)合膜修飾的DNA傳感器(DNA 捕獲探針的序列為5 ‘ -HS (CH2) 6TTGTTGACGAAGGACTGCCA-3 ‘)對(duì)Lip特定編碼基因片段進(jìn)行檢測(cè)的方法，包括以下步驟(1)選取目標(biāo)鏈的序列，以及設(shè)計(jì)信號(hào)探針的序列目標(biāo)鏈的序列為5' -TGGCAGTCCTTCGTCAACAA-3‘；根據(jù)目標(biāo)鏈的序列，設(shè)計(jì)信號(hào)探針的序列為 5' -Biotin-TGGCAGTCCTTCGTCAACAA-3‘；(2)競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)將所述的信號(hào)探針和待測(cè)溶液滴入所述復(fù)合膜修飾的DNA傳感器的感應(yīng)端表面，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)不少于60分鐘；(3)信號(hào)酶放大再將PH為中性、含有親和素-辣根過(guò)氧化物酶(SA-HRP)的磷酸鹽緩沖溶液滴在競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)的DNA傳感器表面，生理溫度(例如37°C )下反應(yīng)不少于30 分鐘，形成信號(hào)酶聯(lián)放大體系；(4)酶催化反應(yīng)最后以苯二酚和H2A為底物，以含有所述辣根過(guò)氧化物酶(HRP) 信號(hào)酶聯(lián)放大體系的DNA傳感器為工作電極，建立三電極系統(tǒng)的電解池，采用計(jì)時(shí)電流法測(cè)定酶催化反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的還原電流變化，若還原電流下降幅度不低于6. 9%，判定待測(cè)溶液中含有木質(zhì)素過(guò)氧化物酶特定編碼基因片段，完成檢測(cè)。上述檢測(cè)方法是基于以下原理(如圖3所示)完成信號(hào)探針上標(biāo)記的HRP，可以在H2A存在的條件下催化分解對(duì)苯二酚，當(dāng)在電解池中加入對(duì)苯二酚和H2O2后，HRP使對(duì)苯二酚上的一個(gè)羥基失去H+，變成雙鍵的羰基，再由電極表面提供電子使其還原，這一過(guò)程會(huì)
5產(chǎn)生可檢測(cè)的響應(yīng)信號(hào)達(dá)到識(shí)別目的，并根據(jù)所產(chǎn)生的信號(hào)的強(qiáng)弱對(duì)應(yīng)Lip特定編碼基因片段的含量，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Lip特定編碼基因片段的測(cè)定。上述技術(shù)方案中，所述電解池中進(jìn)行檢測(cè)的還原電位優(yōu)選為-0. 3V -0. 2V，最優(yōu)選為-0. 252V，所述電解池溶液優(yōu)選為pH值中性的磷酸鹽緩沖溶液。上述技術(shù)方案中，如果判定待測(cè)溶液中含有木質(zhì)素過(guò)氧化物酶特定編碼基因片段，則可根據(jù)目標(biāo)鏈基因濃度與電化學(xué)雜交信號(hào)之間的線性關(guān)系，建立線性回歸方程，測(cè)定待測(cè)溶液中含有木質(zhì)素過(guò)氧化物酶特定編碼基因片段的濃度的大小，線性回歸方程可通過(guò)以下方法得到重復(fù)上述檢測(cè)方法的步驟(2) ，檢測(cè)一系列已知不同濃度的Lip特定編碼基因片段的雜交液，并根據(jù)每一特定濃度下的電流響應(yīng)結(jié)果(參見圖4)，可得出目標(biāo)鏈基因濃度與電化學(xué)雜交信號(hào)之間的線性關(guān)系，即可建立線性回歸方程，通過(guò)實(shí)驗(yàn)，得出的線性方程為=DP%= (3. 4908士0. 1725)x+Q9. 8172士0. 6892)(見圖 5)，其中，DP%為電流下降
比，DP% = Li^Ll χ 100%，10為目標(biāo)鏈未參與競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)時(shí)HRP的催化還原電流，Ix為目
標(biāo)鏈參與競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)時(shí)HRP的催化還原電流；χ為目標(biāo)鏈濃度的自然對(duì)數(shù)，濃度的線性范圍為0. 001 μ mol · L—1 1 μ mol · 檢測(cè)下限為Inmol · L—1 ；該線性回歸方程可作為以后 Lip特定編碼基因片段濃度計(jì)算的依據(jù)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明結(jié)合新型生物分子和納米材料，將碳納米管、磁性納米粒子和金納米粒子等納米材料和殼聚糖修飾于碳糊電極表面，構(gòu)建電化學(xué)DNA傳感器，極大增強(qiáng)碳糊電極的電子傳導(dǎo)能力，從而提高檢測(cè)精度；本發(fā)明的制備復(fù)合膜修飾的DNA傳感器方法，成本低廉，工藝簡(jiǎn)單；利用本發(fā)明的復(fù)合膜修飾的DNA傳感器對(duì) Lip特定編碼基因片段進(jìn)行檢測(cè)，能高效、低成本檢測(cè)基因的動(dòng)態(tài)變化情況，從而可為微生物降解木質(zhì)素的監(jiān)測(cè)和控制過(guò)程提供一種有效的分子生物學(xué)工具。
圖1為本發(fā)明的復(fù)合膜修飾的DNA傳感器的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明的復(fù)合膜修飾的DNA傳感器的復(fù)合膜及捕獲探針的裝配示意圖；圖3為本發(fā)明的復(fù)合膜修飾的DNA傳感器的雜交反應(yīng)原理圖；圖4為本發(fā)明構(gòu)建線性方程過(guò)程中用計(jì)時(shí)電流法檢測(cè)不同濃度的Lip特定編碼基因片段得到的電流-時(shí)間變化曲線圖。圖5為本發(fā)明的Lip特定編碼基因片段含量與電流變化的線性回歸圖。圖例說(shuō)明1、電線；2、PTFE管；3、碳棒；4、磁體；5、碳糊；6、敏感物質(zhì)(復(fù)合膜結(jié)構(gòu)及DNA捕獲探針)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。一種如圖1所示的復(fù)合膜修飾的DNA傳感器，包括一碳糊電極，碳糊電極包括碳棒 3和PTFE管2，碳棒3內(nèi)置于PTFE管2中，碳棒3 —端通過(guò)電線1引出PTFE管2，碳棒3另一端與一磁體4相接觸，磁體4設(shè)置于緊鄰碳棒3 —端且距PTFE管2的管口 8mm處，磁體 4與PTFE管2管口間填充有碳糊5，碳糊電極的感應(yīng)端包覆有敏感物質(zhì)6，敏感物質(zhì)6包括復(fù)合膜和巰基化的DNA捕獲探針(序列為5 ‘ -HS (CH2)6TTGTTGACGAAGGACTGCCA_3 ‘)，復(fù)合膜由依次修飾于碳糊電極表面的巰基化的磁性納米顆粒、巰基化的多壁碳納米管-金納米粒子、以及殼聚糖組成，DNA捕獲探針修飾于多壁碳納米管-金納米粒子表面。一種上述復(fù)合膜修飾的DNA傳感器的制備方法，包括以下具體步驟(1)制作碳糊電極在PTFE管中放入碳棒，緊鄰碳棒一端且距PTFE管管口 8mm處放入磁體，形成磁性區(qū)域，磁體與PTFE管管口之間用碳糊填充，碳棒另一端通過(guò)電線引出 PTFE管，得到碳糊電極的粗坯，再將電極粗坯的表面拋光，然后用水沖洗電極表面，再依次用HNO3(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50% )、丙酮、水進(jìn)行超聲清洗，最后再用磷酸鹽緩沖液沖洗，自然晾干，得到最終的碳糊電極；(2)制備磁性納米顆粒和多壁碳納米管-金納米粒子復(fù)合膜制備磁性納米顆粒的工藝過(guò)程為在氮?dú)獗Ｗo(hù)下制備!^e3O4膠狀沉淀，然后依次加入聚乙二醇、正硅烷乙酯、甲醇、氨丙基三甲氧基硅烷和半胱氨酸，反應(yīng)后得到巰基化的磁性納米顆粒；制備多壁碳納米管-金納米粒子的工藝過(guò)程為用H2A與硫酸混合液將多壁碳納米管純化，真空干燥后，將其與半胱氨酸反應(yīng)，修飾上巰基，再將巰基化的多壁碳納米管與金納米粒子反應(yīng)，得到巰基化的多壁碳納米管-金納米粒子(3)修飾碳糊電極表面將制備好的磁性納米顆粒和多壁碳納米管-金納米粒子、 以及殼聚糖溶液依次修飾到步驟(1)制得的碳糊電極的感應(yīng)端表面，自然晾干后得到復(fù)合膜修飾的碳糊電極，再將準(zhǔn)備好的巰基化的DNA捕獲探針(序列為5 ‘ -HS (CH2) 6TTGTTGACG AAGGACTGCCA-3 ‘)滴在經(jīng)復(fù)合膜修飾的碳糊電極感應(yīng)端表面，通過(guò)巰基與金的作用進(jìn)行自組裝，再用緩沖液沖洗，晾干后得到復(fù)合膜修飾的DNA傳感器。利用上述實(shí)施例制得的DNA傳感器，分別對(duì)濃度為0. 012 μ mol · L—1、 0. 59 μ mol · Γ1和0. 22 μ mol · Γ1的Lip特定編碼基因片段待測(cè)樣品進(jìn)行測(cè)定，每一種濃度的Lip特定編碼基因片段待測(cè)樣品的檢測(cè)均以下列步驟進(jìn)行(1)選取目標(biāo)鏈及設(shè)計(jì)信號(hào)探針選取目標(biāo)鏈的序列為5 ‘ -TGGCAGTCCTTCGTCAACAA-3 ‘；根據(jù)目標(biāo)鏈的序列，設(shè)計(jì)信號(hào)探針的序列為 5' -Biotin-TGGCAGTCCTTCGTCAACAA-3‘；(2)競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)將信號(hào)探針和目標(biāo)鏈待測(cè)樣品分別滴入含有捕獲探針的DNA 傳感器的電極表面，37°C下競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)60分鐘；(3)信號(hào)酶放大再將含有SA-HRP的磷酸鹽緩沖溶液(pH 6. 98)滴在經(jīng)競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)的DNA傳感器表面，37°C下反應(yīng)30分鐘，形成信號(hào)酶聯(lián)放大體系；(4)酶催化反應(yīng)在含有Immol · L—1對(duì)苯二酚的磷酸鹽緩沖液(pH 7. 38)中加入 0. 5mmol -L^1H2O2,以對(duì)苯二酚和H2A為底物，以含有HRP信號(hào)酶聯(lián)放大體系的DNA傳感器為工作電極，以飽和甘汞電極優(yōu)選作為參比電極，以鉬片電極優(yōu)選作為對(duì)電極，建立三電極系統(tǒng)的電解池，采用計(jì)時(shí)電流法，測(cè)定DNA傳感器在還原電位-0. 252V下，HRP與底物催化反應(yīng)產(chǎn)生的還原電流變化(電化學(xué)測(cè)定是采用上海辰華儀器公司生產(chǎn)的CHI660B電化學(xué)系統(tǒng)與50mL電解池中的三電極系統(tǒng)相連接，以進(jìn)行控制與監(jiān)測(cè))，測(cè)試結(jié)果如下表1所示，由下
7表1可見，三種待測(cè)溶液的還原電流下降幅度均不低于6. 9%，由此可判定三種待測(cè)溶液中均含有木質(zhì)素過(guò)氧化物酶特定編碼基因片段；(5)定量分析根據(jù)下表1中所測(cè)得的還原電流下降幅度，并結(jié)合已構(gòu)建的線性回歸方程DP%= (3. 4908士0. 1725) χ+(29. 8172士0. 6892)，可測(cè)定出三組待測(cè)樣品中Lip特定編碼基因片段濃度值，檢測(cè)結(jié)果見下表1。表1 三種不同濃度待測(cè)樣品的檢測(cè)結(jié)果
待測(cè)樣品μ mol · L71還原電流下降幅度％測(cè)定濃度μ mol · L/1回收率％0. 01214. 40. 013±0. 001105. 80. 5927. 60. 608±0. 010102. 10. 2224. 70. 212±0. 0197. 4 從上述測(cè)定結(jié)果可以清楚地看出，本方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，選擇性好，能夠高效、低成本在線檢測(cè)Lip特定編碼基因片段含量，為微生物降解木質(zhì)素的監(jiān)測(cè)和控制過(guò)程提供了技術(shù)支持。 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅局限于上述實(shí)施例，凡屬于本發(fā)明思路下的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理前提下的若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，均應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合膜修飾的DNA傳感器，包括一碳糊電極，所述碳糊電極包括碳棒和聚四氟乙烯管，所述碳棒內(nèi)置于所述聚四氟乙烯管中，所述碳棒一端通過(guò)電線引出所述聚四氟乙烯管，所述碳棒另一端與一磁體相接觸，所述磁體與所述聚四氟乙烯管管口間填充有碳糊， 所述碳糊電極的感應(yīng)端包覆有敏感物質(zhì)，其特征在于所述敏感物質(zhì)包括復(fù)合膜和巰基化的DNA捕獲探針，所述復(fù)合膜由依次修飾于所述碳糊電極表面的巰基化的磁性納米顆粒、 巰基化的多壁碳納米管-金納米粒子、以及殼聚糖組成，所述DNA捕獲探針修飾于所述多壁碳納米管-金納米粒子表面。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合膜修飾的DNA傳感器，其特征在于所述磁體設(shè)置于距所述聚四氟乙烯管的管口不大于8mm處。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的復(fù)合膜修飾的DNA傳感器，其特征在于所述DNA捕獲探針的序列為 5 ‘ -HS (CH2) 6TTGTTGACGAAGGACTGCCA-3 ‘。
4.一種如權(quán)利要求1或2或3所述的復(fù)合膜修飾的DNA傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下工藝步驟(1)制作碳糊電極在聚四氟乙烯管中放入碳棒，并在所述碳棒一端置入磁體，形成磁性區(qū)域，所述的磁體與聚四氟乙烯管管口之間用碳糊填充，碳棒另一端通過(guò)電線引出聚四氟乙烯管，得到碳糊電極的粗坯，再將所述粗坯進(jìn)行表面處理，得到碳糊電極；(2)修飾碳糊電極表面將制備好的磁性納米顆粒和多壁碳納米管-金納米粒子、以及殼聚糖溶液依次修飾到步驟(1)制得的碳糊電極的感應(yīng)端表面，自然晾干后得到復(fù)合膜修飾的碳糊電極，再將準(zhǔn)備好的巰基化的DNA捕獲探針滴在經(jīng)復(fù)合膜修飾的碳糊電極感應(yīng)端表面，自組裝后，得到復(fù)合膜修飾的DNA傳感器。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述磁性納米顆粒是通過(guò)以下步驟制備得到在氮?dú)獗Ｗo(hù)下制備!^e3O4膠狀沉淀，然后依次加入聚乙二醇、正硅烷乙酯、甲醇、 氨丙基三甲氧基硅烷和半胱氨酸，反應(yīng)后得到巰基化的磁性納米顆粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述多壁碳納米管-金納米粒子是通過(guò)以下步驟制備得到將多壁碳納米管純化，再與半胱氨酸反應(yīng)，使多壁碳納米管巰基化， 然后將巰基化的多壁碳納米管與金納米粒子反應(yīng)，得到巰基化的多壁碳納米管-金納米粒子。
7.一種利用如權(quán)利要求3所述的復(fù)合膜修飾的DNA傳感器對(duì)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶特定編碼基因片段進(jìn)行檢測(cè)的方法，包括以下步驟(1)選取目標(biāo)鏈及設(shè)計(jì)信號(hào)探針選取目標(biāo)鏈的序列為5' -TGGCAGTCCTTCGTCAACAA-3'；根據(jù)目標(biāo)鏈的序列，設(shè)計(jì)信號(hào)探針的序列為 5' -Biotin-TGGCAGTCCTTCGTCAACAA-3‘；(2)競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)將所述的信號(hào)探針和待測(cè)溶液滴入所述復(fù)合膜修飾的DNA傳感器的感應(yīng)端表面，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)不少于60分鐘；(3)信號(hào)酶放大再將PH為中性、且含有親和素-辣根過(guò)氧化物酶的磷酸鹽緩沖溶液， 滴在競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)后的DNA傳感器的感應(yīng)端表面，生理溫度下反應(yīng)不少于30分鐘，形成辣根過(guò)氧化物酶信號(hào)酶聯(lián)放大體系；(4)酶催化反應(yīng)最后以苯二酚和H2O2為底物，以含有所述辣根過(guò)氧化物酶信號(hào)酶聯(lián)放大體系的DNA傳感器為工作電極，建立三電極系統(tǒng)的電解池，采用計(jì)時(shí)電流法測(cè)定酶催化反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的還原電流變化，若還原電流下降幅度不低于6. 9%，判定待測(cè)溶液中含有木質(zhì)素過(guò)氧化物酶特定編碼基因片段，完成檢測(cè)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征在于，如果判定待測(cè)溶液中含有質(zhì)素過(guò)氧化物酶特定編碼基因片段，再根據(jù)以下的線性回歸方程檢測(cè)待測(cè)溶液中所述木質(zhì)素過(guò)氧化物酶特定編碼基因片段的濃度大??；所述線性回歸方程為=DP%= (3. 4908士0. 1725)x+Q9. 8172士0. 6892)，其中， 電流下降比，χ為所述木質(zhì)素過(guò)氧化物酶特定編碼基因片段濃度的自然對(duì)數(shù)，濃度檢測(cè)的線性范圍為0. 001 μ mol · Γ1 1 μ mol · Γ1，檢測(cè)下限為Inmol · Γ1。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(4)中的三電極系統(tǒng)是以飽和甘汞電極作為參比電極，以鉬片電極作為對(duì)電極。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述電解池中進(jìn)行檢測(cè)的還原電位為-0. 3V -0. 2V，所述電解池溶液為ρΗ值為中性的磷酸鹽緩沖溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種復(fù)合膜修飾的DNA傳感器，包括一碳糊電極，碳糊電極包括碳棒、聚四氟乙烯管、磁體和碳糊，碳糊電極的感應(yīng)端包覆有敏感物質(zhì)，敏感物質(zhì)包括復(fù)合膜和DNA捕獲探針，復(fù)合膜由依次修飾于碳糊電極表面的磁性納米顆粒、多壁碳納米管-金納米粒子、以及殼聚糖組成，DNA捕獲探針修飾于多壁碳納米管-金納米粒子表面；并相應(yīng)公開一種該DNA傳感器的制備方法，包括制作碳糊電極和將敏感物質(zhì)修飾于制得的碳糊電極感應(yīng)端表面等工藝步驟；還公開該DNA傳感器在檢測(cè)Lip特定編碼基因片段中的應(yīng)用。本發(fā)明的DNA傳感器，將敏感物質(zhì)其修飾于碳糊電極表面，電子傳導(dǎo)能力強(qiáng)和檢測(cè)精度高；本發(fā)明的制備方法，成本低廉，工藝簡(jiǎn)單。
文檔編號(hào)C12Q1/28GK102253092SQ201110097748
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月19日
發(fā)明者劉燦, 晏銘, 曾光明, 李貞 , 湯琳, 章毅, 黎媛萍 申請(qǐng)人:湖南大學(xué)