專利名稱：一種利用顯微授精技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因兔的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物生物技術(shù)，特別是家兔的肉質(zhì)定向遺傳改良領(lǐng)域。具體是一種利用顯微授精技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因兔的方法。
背景技術(shù)：
家兔是一種用途廣泛的經(jīng)濟動物和實驗動物，具有體型較小，繁殖速度快、生產(chǎn)周期短等優(yōu)點。然而，我國目前家兔品種的生長速度慢、屠宰率低，直接影響到養(yǎng)兔業(yè)的經(jīng)濟效益，急需應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)對其進行改良，培育肉質(zhì)好、產(chǎn)肉率高的家兔新品種。利用轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因兔，由于兔體細(xì)胞的活力低，通過基因轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)篩選后，再進行核移植很難獲得轉(zhuǎn)基因胚胎。而顯微授精轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是將外源基因與精子在體外通過一定的手段結(jié)合起來，使精子作為一種載體而攜帶標(biāo)記基因或者外源目的基因，再通過與卵母細(xì)胞體外顯微授精方式獲得轉(zhuǎn)基因胚胎，進行胚胎移植后獲得轉(zhuǎn)基因仔兔。該方法具有操作方便簡單等優(yōu)點，所用的精子可以是活的精子，也可以使用凍融后的精子。為此，本發(fā)明通過顯微授精技術(shù)體外生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因兔胚胎，并結(jié)合胚胎移植技術(shù)建立一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因兔的新方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種通過顯微授精技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因兔的方法。本發(fā)明通過采用以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題一種利用顯微授精技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因兔的方法，包括如下步驟(1)精液的采集和保存通過假陰道法采集的家兔精液或者從家兔附睪里收集的精液，用磷酸緩沖液PBS上游半小時后，于2500rpm離心5分鐘進行洗滌，重復(fù)洗滌三次，再用PBS液稀釋濃度為IxlO6個精子/毫升，分裝到冷凍管，直接投入液氮中保存，(2)精子與外源DNA的孵育將裝有精子的冷凍管從液氮中取出，室溫下解凍，加入濃度為lOOng/ul的外源DNA質(zhì)粒與凍融的精子充分混勻，使DNA質(zhì)粒的終濃度為30ng/ ul，置于4°C條件下孵育10分鐘，使精子與DNA充分結(jié)合，獲得孵育了 DNA的精子，(3)顯微授精轉(zhuǎn)基因兔的制備將獲得的孵育了 DNA的精子通過顯微授精技術(shù)注入到兔卵母細(xì)胞胞質(zhì)中，顯微授精后的卵母細(xì)胞經(jīng)離子霉素(Ion)和二甲氨基嘌呤 (6-DMAP)聯(lián)合放線菌酮(CHX)進行激活處理后，放入培養(yǎng)滴中培養(yǎng)2-4天，將獲得的顯微授精胚胎在熒光顯微鏡下檢測GFP表達情況，篩選出有GFP表達的顯微授精轉(zhuǎn)基因胚胎，并移植給受體母兔。本發(fā)明的突出優(yōu)點在于1、用本發(fā)明的方法，成功生產(chǎn)了轉(zhuǎn)基因兔胚胎，胚胎陽性率達到59.65 % (312/523)，經(jīng)過胚胎移植后有3只母兔獲得妊娠并產(chǎn)下活仔兔7只，仔兔經(jīng)過一系列的細(xì)胞和分子生物學(xué)鑒定的檢測工作，結(jié)果顯示4只為陽性轉(zhuǎn)基因兔，陽性率為57. 14%。說明利用該發(fā)明可成功獲得了顯微授精轉(zhuǎn)基因兔。
2、該方法不用添加任何防凍劑，可放在液氮中長期保存，使用時室溫解凍即可用。
圖1是本發(fā)明獲得的表達有GFP的兔4-細(xì)胞期轉(zhuǎn)基因胚胎。圖2是本發(fā)明獲得的表達有GFP的兔囊胚期轉(zhuǎn)基因胚胎。圖3是本發(fā)明獲得的胚胎移植前表達有GFP的兔2、4_細(xì)胞期轉(zhuǎn)基因胚胎。圖4是本發(fā)明獲得的胚胎移植前表達有GFP的兔囊胚期轉(zhuǎn)基因胚胎。圖5是本發(fā)明獲得的2010年12月12日出生的轉(zhuǎn)基因兔的照片。圖6是2本發(fā)明獲得的2011年01月06日出生的轉(zhuǎn)基因兔的照片。圖7是本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因兔的western blotting檢測結(jié)果。圖8是本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因兔的southern blotting檢測結(jié)果。
具體實施例方式以下通過實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步說明。一種利用顯微授精技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因兔的方法，包括如下步驟1、精液的采集和保存通過假陰道法采集的家兔精液或者從家兔附睪里收集的精液，用磷酸緩沖液PBS上游半小時后，2500rpm離心5分鐘進行洗滌，重復(fù)洗滌三次，用PBS 液稀釋濃度為IxlO6個精子/毫升，分裝到200ul的冷凍管，每管50ul，直接投入液氮中保存。2、母兔的超數(shù)排卵處理實驗動物房飼養(yǎng)的家兔單籠飼養(yǎng)20天，讓其自由采食， 自由飲水，然后對其進行超數(shù)排卵處理，采用衡量法三天六次注射FSH共1. 2mg,每次間隔 12小時，最后一次注射FSH 12小時后注射100IU HCG, HCG注射14小時后進行手術(shù)沖卵， 回收輸卵管里的卵母細(xì)胞。3、精子與外源DNA的孵育將裝有精子的冷凍管從液氮中取出，室溫下解凍，加入濃度為lOOng/ul的外源DNA質(zhì)粒與凍融的精子充分混勻，DNA質(zhì)粒的終濃度為30ng/ul，置于4°C條件下孵育10分鐘，使精子與DNA充分結(jié)合。4、顯微授精轉(zhuǎn)基因兔的制備將手術(shù)回收到的兔卵母細(xì)胞放入0. 15%的透明質(zhì)酸酶，輕輕吹打去掉包圍在卵母細(xì)胞透明帶上的顆粒細(xì)胞，去掉顆粒細(xì)胞后的卵母細(xì)胞以每批次20枚左右放入濃度為5ug/ml細(xì)胞松馳素B(CB)的操作液中，在相鄰的另一液滴中放入已孵育DNA的精子與PVP混合液體10微升，然后在倒置顯微鏡(日本尼康TCE300)下將精子注入到卵母細(xì)胞胞質(zhì)中進行顯微授精操作。操作結(jié)束后，將顯微授精后的卵母細(xì)胞移入放有培養(yǎng)液的培養(yǎng)盤中，放入38. 5°C,5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)半小時后將 ICSI胚胎移入濃度為5 μ mol/L離子霉素(Ion)中培養(yǎng)5分鐘，用培養(yǎng)液洗滌三次，再移入濃度為2mmol的二甲氨基嘌呤(6-DMAP)聯(lián)合濃度為5 μ g的放線菌同(CHX)的培養(yǎng)液中培養(yǎng)1. 5小時，進行激活處理，然后再用培養(yǎng)液洗滌三次后移入放有30ul胚胎培養(yǎng)液的培養(yǎng)滴，在38. 5°C,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-4天，將培養(yǎng)獲得的胚胎在熒光顯微鏡下檢測GFP 表達情況，篩選出有GFP表達的轉(zhuǎn)基因胚胎移植給同期發(fā)情的母兔輸卵管或子宮內(nèi)，母兔獲得妊娠，其中有3只受體母兔經(jīng)過一個月左右的妊娠期后產(chǎn)下仔兔共有7只成活，仔兔經(jīng) PCR、冷凍組織切片激光掃描共聚焦檢測、western blotting以及southern blotting法進行轉(zhuǎn)基因鑒定，有4只為陽性轉(zhuǎn)基因兔。實施例12010年11月9日，我們通過顯微授精技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因兔胚胎35枚，其中有 23 (65. 7% )枚2細(xì)胞胚胎期表達GFP，通過手術(shù)將陽性胚胎移植入受體母兔輸卵管內(nèi)，經(jīng)過妊娠后，于2010年12月12日產(chǎn)下3只仔兔均成活，經(jīng)分子生物學(xué)方法檢測2只為陽性轉(zhuǎn)
基因兔。實施例22010年12月7日，我們將38枚分裂至2細(xì)胞的陽性胚胎分別移植入兩只同期發(fā)情的母兔輸卵管內(nèi)，均獲得妊娠，并于2011年1月6日共生下7只仔兔，其中成活4只，然后，對這4只成活的兔子進行一系列的分子生物學(xué)鑒定的檢測工作，結(jié)果證明2只為陽性轉(zhuǎn)基因兔。
權(quán)利要求
1. 一種利用顯微授精技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因兔的方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)精液的采集和保存通過假陰道法采集的家兔精液或者從家兔附睪里收集的精液，用磷酸緩沖液PBS上游半小時后，于2500rpm離心5分鐘進行洗滌，重復(fù)洗滌三次，再用 PBS液稀釋濃度為IxlO6個精子/毫升，分裝到冷凍管，直接投入液氮中保存，(2)精子與外源DNA的孵育將裝有精子的冷凍管從液氮中取出，室溫下解凍，加入濃度為lOOng/ul的外源DNA質(zhì)粒與凍融的精子充分混勻，使DNA質(zhì)粒的終濃度為30ng/ul，置于4°C條件下孵育10分鐘，使精子與DNA充分結(jié)合，獲得孵育了 DNA的精子，(3)顯微授精轉(zhuǎn)基因兔的制備將獲得的孵育了DNA的精子通過顯微授精技術(shù)注入到兔卵母細(xì)胞胞質(zhì)中，顯微授精后的卵母細(xì)胞經(jīng)離子霉素(Ion)和二甲氨基嘌呤(6-DMAP)聯(lián)合放線菌酮(CHX)進行激活處理后，放入培養(yǎng)滴中培養(yǎng)2-4天，將獲得的顯微授精胚胎在熒光顯微鏡下檢測GFP表達情況，篩選出有GFP表達的顯微授精轉(zhuǎn)基因胚胎，并移植給受體母兔ο
全文摘要
一種利用顯微授精技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因兔的方法，通過假陰道法采集精液或從附睪收集的精液用PBS上游，經(jīng)離心洗滌后，分裝到冷凍管中，投入液氮中保存；進行顯微操作之前，從液氮中取出裝有精子的冷凍管，室溫下解凍，加入外源DNA質(zhì)粒與凍融的精子充分混勻，使DNA質(zhì)粒的終濃度為30ng/ul，并置于4℃下孵育10分鐘，使精子與DNA充分結(jié)合，然后，通過顯微授精技術(shù)，將孵育了DNA的精子注入到兔卵母細(xì)胞胞質(zhì)中，顯微授精后的卵母細(xì)胞經(jīng)過化學(xué)激活處理后，放入培養(yǎng)滴中培養(yǎng)2-4天。用本發(fā)明的方法，成功生產(chǎn)了轉(zhuǎn)基因兔胚胎，胚胎陽性率達到59.65％，經(jīng)胚胎移植獲得母兔妊娠并產(chǎn)下活仔兔，仔兔經(jīng)過細(xì)胞和分子生物學(xué)鑒定，證明4只表達有外源基因轉(zhuǎn)基因兔，陽性率為57.14％。
文檔編號C12N15/873GK102242151SQ20111009358
公開日2011年11月16日 申請日期2011年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月14日
發(fā)明者劉慶友, 張順, 李湘萍, 石德順, 羅嬋, 陸鳳花 申請人:廣西大學(xué)