專利名稱：以粘蛋白1和生存素為靶點(diǎn)的腫瘤基因工程疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤DNA疫苗、病毒載體疫苗及蛋白疫苗領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及重組DNA載體CpVR-MS和CpDV-IL2-MS ;重組蛋白疫苗S8和9M以及DNA疫苗、病毒載體疫苗、蛋白疫苗以及這三種形式疫苗之間免疫方式的優(yōu)化組合在制備抗腫瘤疫苗中的用途。
背景技術(shù)：
生存素(survivin)是抑制凋亡蛋白(IAP)家族成員，具有抗凋亡和調(diào)控細(xì)胞分裂的雙重功能，廣泛表達(dá)于各種胚胎組織和癌細(xì)胞中，但在正常終末分化細(xì)胞中不表達(dá)。這些特點(diǎn)使生存素成為腫瘤發(fā)生，發(fā)展和治療等領(lǐng)域中的一個(gè)新靶點(diǎn)。目前的研究表明生存素在腫瘤基因治療中具有潛在價(jià)值它的腫瘤特異性表達(dá)，及其與預(yù)后不良、藥物抗性和病人生存期縮短等呈正相關(guān)。針對(duì)生存素及其突變體等進(jìn)行 的腫瘤免疫治療已成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外策略有(參見(jiàn)Li，F(xiàn)，et al.，2006 ；Li，F(xiàn). ,2003 ；Altieri, D. C.，2008) :(1)利用生存素啟動(dòng)子的腫瘤特異性表達(dá)進(jìn)行的腫瘤靶向基因治療；(2)針對(duì)生存素本身的治療策略a)生存素的反義或全長(zhǎng)的cDNA或反義核苷酸表達(dá)載體策略，比較適合生存素的功能研究和前臨床研究，但用全長(zhǎng)的生存素可能有潛在的危險(xiǎn)；b)生存素功能陰性突變體(dominant negative mutant, DNM)策略,主要是SurvT34A和SurvC84A，但此方案可能不適用于直接的癌癥治療；c)生存素核酶方案，即用生存素mRNA特異性核酶剪切生存素mRNA以降低生存素的表達(dá)，此方案也是一種有效的研究工具，但不適用于癌癥臨床治療；d)生存素RNAi技術(shù)，目前的研究表明RNAi能有效的使哺乳動(dòng)物基因表達(dá)沉默，可用于基因功能研究，但昂貴的費(fèi)用限制其臨床應(yīng)用；e)用小分子有機(jī)物或小肽抑制生存素的表達(dá)或干擾其功能；f)用生存素特異性表位的免疫治療，這是一個(gè)很吸引人的領(lǐng)域，但只用生存素的小肽，免疫原性可能不高。因?yàn)樯嫠鼐哂锌沟蛲龅墓δ埽绻闷淙L(zhǎng)來(lái)設(shè)計(jì)疫苗可能存在安全隱患，根據(jù)國(guó)內(nèi)外策略的優(yōu)點(diǎn)和弊端擬采用生存素抗凋亡功能缺失剪切體來(lái)設(shè)計(jì)疫苗，在保證其抗凋亡功能缺失的情況下盡量保存長(zhǎng)度以提高免疫原性。因此本發(fā)明采用生存素的抗凋亡功能缺失剪切體來(lái)設(shè)計(jì)疫苗。生存素在體內(nèi)是以二聚體形式起作用的，它N-端第6、第7和第10位的三個(gè)氨基酸是形成二聚體的關(guān)鍵氨基酸(參見(jiàn)Shi，Y. et al. ,2000);生存素的第5位至第14位氨基酸是HLA-A2的特異性抗原表位(參見(jiàn)Andersen, M. H. et al.，2001)，基于這兩點(diǎn)本發(fā)明首次設(shè)計(jì)了剪切體S8(即切去生存素N-端7個(gè)氨基酸)，希望可以破環(huán)它的二聚體結(jié)構(gòu)，從而使其缺失抗凋亡的功能。因此以S8為靶點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)疫苗可能會(huì)提高疫苗的安全性。粘蛋白I(MUCl)是粘蛋白家族成員，是跨膜糖蛋白，存在于正常腺管上皮細(xì)胞及其來(lái)源的腫瘤細(xì)胞表面，由多肽核心和側(cè)枝糖鏈構(gòu)成。其核心肽胞外段含有數(shù)目不等的串聯(lián)重復(fù)區(qū)(VNTR)。正常組織中MUCl分布于腺管上皮細(xì)胞分泌極，與免疫細(xì)胞相對(duì)隔離，糖基化豐富；而在腫瘤組織，其廣泛分布并異常豐富地表達(dá)于細(xì)胞表面，糖基化不完全，因此暴露出正常情況下隱蔽的表位，成為免疫細(xì)胞攻擊的靶點(diǎn)，并且表達(dá)增強(qiáng)，可達(dá)正常細(xì)胞的100倍以上，因此MUCl是較理想的抗腫瘤靶分子。MUC1VNTR中的PDTRP序列是B細(xì)胞及T細(xì)胞共同識(shí)別的表位，可與MUCl特異性抗體及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)相結(jié)合，故稱這個(gè)最具免疫原性的部位為免疫顯性結(jié)構(gòu)域，因此，目前大部分利用MUCl研究免疫治療的都是集中在VNTR區(qū)域(參見(jiàn)Singh，R. et al.，2007 ；Persson, J. et al. , 2006 ；Xing, P. X. et al. , 1992 ；Tang, C. K. et al. , 2008 ；Tang,C. K. et al. ,2008)。從發(fā)現(xiàn)MUCl到現(xiàn)在已用其進(jìn)行了很多的疫苗研究工作，并有一些疫苗已經(jīng)進(jìn)入人類臨床研究階段，但大多數(shù)都是傳統(tǒng)的多肽類、蛋白類或樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)類疫苗，這些疫苗大多都存在免疫原性差或制備困難等問(wèn)題；進(jìn)入臨床的基因疫苗主要是重組痘病毒疫苗，雖然沒(méi)有檢測(cè)到毒性，但直接用重組痘病毒疫苗初免-加強(qiáng)還是存在較大的安全隱患，而且產(chǎn)生的臨床效果也不是很理想；DNA載體疫苗由于免疫原性較弱目前還基本處于臨床前研究階段。本發(fā)明發(fā)明人的前期研究表明增加VNTR的數(shù)目可在一定程度上增強(qiáng)MUCl的免疫效果(參見(jiàn)Zhang S et al.，2008)，如33個(gè)拷貝的MUC1VNTR串聯(lián)重復(fù)序列引起的免疫應(yīng) 答明顯強(qiáng)于2個(gè)拷貝的MUCl VNTR串聯(lián)重復(fù)序列引起的免疫應(yīng)答，因此本發(fā)明選用含有33個(gè)的串聯(lián)重復(fù)序列MUCl VNTR作為抗原來(lái)設(shè)計(jì)疫苗，并將其與S8融合表達(dá)來(lái)構(gòu)建融合表達(dá)疫苗以增強(qiáng)疫苗免疫的廣譜性和有效性，目前將生存素和MUC1VNTR聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行腫瘤治療還未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先以S8為靶點(diǎn)進(jìn)行腫瘤基因疫苗的研究，分別構(gòu)建DNA載體疫苗(VR-S8)和腺病毒載體疫苗(Ad-S8)，采用DNA初免-重組腺病毒加強(qiáng)免疫(DNA prime-rAdboost)免疫策略，同時(shí)采用表達(dá)白細(xì)胞介素2 (IL2)的質(zhì)粒(VR-IL2)作為免疫佐劑，通過(guò)免疫小鼠檢測(cè)S8基因疫苗的免疫原性及抗腫瘤活性，結(jié)果表明小鼠可產(chǎn)生針對(duì)S8的特異性抗體(見(jiàn)圖4)和CTL(見(jiàn)圖5);該疫苗具有一定的抗腫瘤活性，在預(yù)防性實(shí)驗(yàn)中，與PBS組比較，VR-S8/VR-IL2/Ad-S8疫苗免疫組模型小鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制率為68. 54%，生存期延長(zhǎng)了 35. 6% (見(jiàn)圖6)。在治療性實(shí)驗(yàn)中，與PBS組比較，VR-S8/VR-IL2/Ad-S8疫苗免疫組模型中小鼠腫瘤生長(zhǎng)受到了明顯的抑制(抑制率為23. 42%)，但并沒(méi)有明顯延長(zhǎng)模型小鼠的生存期(見(jiàn)圖7)。本發(fā)明采用生存素和MUCl為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)融合表達(dá)基因疫苗。由于MUCl基因的多態(tài)性決定了不同個(gè)體間VNTR數(shù)目的不同，最常見(jiàn)的為含有30-90個(gè)連續(xù)重復(fù)序列，根據(jù)自行構(gòu)建MUCl VNTR基因的特點(diǎn)選擇以33個(gè)重復(fù)區(qū)序列(簡(jiǎn)稱為33M，該序列含有33個(gè)VNTR的串聯(lián)重復(fù)序列，每個(gè)重復(fù)序列之間有6個(gè)由于構(gòu)建引入的酶切位點(diǎn)的堿基序列，)來(lái)構(gòu)建MUC1DNA載體疫苗(VR-33M)，同時(shí)構(gòu)建33M與S8融合表達(dá)的DNA載體疫苗(VR-MS)。通過(guò)免疫模型小鼠檢測(cè)融合表達(dá)基因疫苗的免疫效果和抗腫瘤活性與二者單獨(dú)表達(dá)的疫苗相比是否有明顯的提高，結(jié)果表明生存素和MUCl融合表達(dá)基因疫苗的免疫效果明顯強(qiáng)于二者單獨(dú)表達(dá)的疫苗的免疫效果，例如在對(duì)腫瘤的預(yù)防性研究中，融合表達(dá)疫苗免疫組與生存素疫苗單獨(dú)免疫組相比抑瘤率提高了 134%，生存期延長(zhǎng)了 166%;與MUCl單獨(dú)免疫組比較，抑瘤率提高了 25%，生存期延長(zhǎng)了 73% (見(jiàn)圖12)。為了進(jìn)一步加強(qiáng)MS疫苗的免疫效果又構(gòu)建了其病毒載體疫苗(Ad-MS和MVA-MS)，采用DNA初免-重組腺病毒加強(qiáng)免疫的免疫策略，同時(shí)采用表達(dá)IL2的質(zhì)粒作為免疫佐劑，通過(guò)免疫模型小鼠檢測(cè)融合表達(dá)基因疫苗的免疫效果和抗腫瘤活性，結(jié)果表明DNA初免-重組腺病毒加強(qiáng)的免疫策略能明顯抑制模型小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，并有效延長(zhǎng)小鼠的生存期；IL2也顯示出了明顯的佐劑增強(qiáng)作用(見(jiàn)圖 13)。本發(fā)明采用CpG motif作為免疫佐劑進(jìn)一步構(gòu)建DNA載體疫苗。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，選用能同時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)的C型CpGmotif作為免疫佐劑，選取的核心序列為“TCgTCgTCgTTCgAACgACgTTgAT”，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道擬構(gòu)建含有16個(gè)核心序列的重復(fù)序列，然后將其克隆到VR-MS質(zhì)粒骨架的非編碼區(qū)，獲得CpVR-MS疫苗，考察加入CpG是否能提高疫苗的免疫效果及安全性。為了提高腫瘤基因疫苗的安全性、降低制備成本，構(gòu)建含有CpG motif的MS和IL-2共表達(dá)的雙順?lè)醋虞d體疫苗CpDV-IL-2-MS，并與CpVR-MS/VR-IL-2 (參見(jiàn)吉林大學(xué)2008屆碩士畢業(yè)生楊萍的碩士學(xué)位論文《HBV DNA疫苗和重組痘病毒聯(lián)合疫苗的免疫原性研究》中關(guān)于pVR1012-hIL-2的相關(guān)記載)共免疫形式對(duì)比，考察加入CpG的雙順?lè)醋虞d體疫苗的免疫效果，結(jié)果表明CpDV-IL-2-MS的免疫效果略高于CpVR-MS/VR-IL-2的免疫效果(見(jiàn)圖16)。
本發(fā)明除了構(gòu)建了 DNA載體疫苗和病毒載體疫苗外，還制備了重組蛋白疫苗(S8和9M)并對(duì)其免疫效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明采用S8/9M聯(lián)合免疫佐劑DDA+MPL進(jìn)行初免，采用重組腺病毒疫苗AD-MS進(jìn)行加強(qiáng)免疫，可以產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)(見(jiàn)圖19)，同時(shí)具有很好的抑制模型小鼠腫瘤生長(zhǎng)的作用(見(jiàn)圖20)。具體而言，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒CpVR-MS，其特征在于所述重組質(zhì)粒的骨架載體為VR-MS，在所述VR-MS的非編碼區(qū)插入CpG motif序列，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，非編碼區(qū)中的插入位點(diǎn)為Stul位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體DV，其特征在于所述表達(dá)載體的骨架載體為VR1012，在所述VR1012多克隆酶切位點(diǎn)插入了 BGH、CMV-intronA序列，使其在VR1012本身的第一表達(dá)框架之外，含有一個(gè)第二表達(dá)框架。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述表達(dá)框架中的第一表達(dá)框架的多克隆位點(diǎn)包括Pstl、Sail、notl、XbaU池61、8&!11111，第二表達(dá)框架的多克隆酶切位點(diǎn)包括8812、4 &13(301 1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種帶有CpG motif的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體CpDV，其特征在于所述表達(dá)載體的骨架載體上文所述述的DV，在所述DV的非編碼區(qū)插入CpG motif序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，非編碼區(qū)中的插入位點(diǎn)為Stul位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒CpDV-IL2_MS，其特征在于所述重組質(zhì)粒的骨架載體為上文所述的CpDV，在所述CpDV的第一表達(dá)框的多克隆位點(diǎn)插入IL-2序列，在所述CpDV的第二表達(dá)框的多克隆位點(diǎn)插入MS序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一表達(dá)框的多克隆位點(diǎn)為BamHl，第二個(gè)表達(dá)框的多克隆位點(diǎn)為Bgl2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒pRSET B-9M，其特征在于在pRSET B原核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中插入一個(gè)含有9個(gè)拷貝的MUCl VNTR的序列9M。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多克隆位點(diǎn)為BamH I/EcoR I。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒pRSET B-S8，其特征在于在pRSET B原核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中插入一個(gè)SEQ IDNO :8所述的序列S8。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多克隆位點(diǎn)為BamH I/EcoR I。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種疫苗組合物，包括上文所述的重組質(zhì)粒CpVR-MS。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物還包括免疫佐劑。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫佐劑選自細(xì)胞因子白介素2(IL-2)、細(xì)胞因子粒-巨細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和非甲基化的CpG基序免疫刺激DNA序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種疫苗組合物，包括包括上文所述的重組質(zhì)粒CpDV-IL2-MS。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物，還包括免疫佐劑。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫佐劑選自細(xì)胞因子白介素2(IL-2)、細(xì)胞因子粒-巨細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和非甲基化的CpG基序免疫刺激DNA序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種疫苗組合物，包括S8蛋白和/或9M蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物還包括免疫佐劑。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的免疫佐劑選自DDA、MPL、AD11SM。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了所述重組質(zhì)粒CpVR-MS、所述重組質(zhì)粒CpDV-IL2-MS或者S8蛋白和/或9M蛋白在制備用于治療腫瘤的疫苗中的用途。在一個(gè)優(yōu) 選的實(shí)施方案中，所述疫苗中還包含化療藥物。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述疫苗中還包含化療藥物。在一個(gè)甚至更有選的實(shí)施方案中，所述化療藥物選自卡鉬、順鉬、奧沙利波和紫杉醇。
圖I. DNA載體及重組DNA載體疫苗圖譜。A為VR1012載體圖譜；B為重組質(zhì)粒VR-S8圖譜；C為重組質(zhì)粒VR-33M圖譜；D為重組質(zhì)粒VR-MS圖譜；E為重組質(zhì)粒CpVR-MS圖譜；F為重組質(zhì)粒CpDV-IL2-MS圖譜；G為PRSET B載體圖譜；H為重組質(zhì)粒PRSET B-9M圖譜為重組質(zhì)粒PRSET B-S8圖譜。圖2.重組腺病毒載體圖譜及制備流程。A為AdMax 腺病毒載體及重組病毒制備流程；B為穿梭載體PDC316圖譜；C為重組穿梭載體PDC316-S8圖譜；D為重組穿梭載體PDC316-MS 圖譜。圖3. MVA重組原理及相關(guān)載體圖譜。A為MVA重組示意圖；B為穿梭載體pSCll圖譜；C為重組穿梭載體pSCll-MS圖譜，MS結(jié)構(gòu)基因表達(dá)框架重組到MVA的TK基因中，基因表達(dá)的啟動(dòng)子采用P7. 5。圖4.小鼠免疫血清抗S8抗體的檢測(cè)。C57/BL小鼠經(jīng)PBS (2)、VR-IL2 (3)、VR-S8 (4)，VR-S8/VR-IL2 (5)，VR-S8/VR-IL2/Ad_S8 (6)免疫后，以小鼠的血清作為一抗，以表達(dá)S8的C0S-7細(xì)胞裂解上清作為檢測(cè)小鼠血清的抗原，以S8單克隆抗體作為陽(yáng)性對(duì)照(I)，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(Western-blot)檢測(cè)的結(jié)果。圖5.以不同形式S8基因疫苗免疫后，小鼠脾淋巴細(xì)胞的特異性CTL殺傷活性檢測(cè)。從被免疫小鼠脾細(xì)胞中分離的淋巴細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，并用特異性抗原肽(H-2d限制性)標(biāo)記的小鼠肺癌細(xì)胞株B16作為靶細(xì)胞，采用非放射性LDH釋放法檢測(cè)免疫鼠的CTL應(yīng)答。圖6.不同形式S8基因疫苗對(duì)MS/B16 (參見(jiàn)吉林大學(xué)2009屆博士畢業(yè)生張海紅的博士學(xué)位論文《以Survivin和MUCl VNTR為靶點(diǎn)的腫瘤基因疫苗研究》中關(guān)于MS+B16的相關(guān)記載)腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)的免疫預(yù)防作用。C57BL/6小鼠經(jīng)PBS對(duì)照組、VR-IL2、VR-S8、VR-S8/VR-IL2以及VR-S8/VR-IL2/Ad-S8在經(jīng)隔周免疫四次后一周，接種MSf+B16腫瘤細(xì)胞，測(cè)量腫瘤大小(A)至26天，生存情況觀察至腫瘤接種后50天(B)。圖7.不同形式S8基因疫苗對(duì)MS/B16腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)的免疫治療作用。在給C57BL/6小鼠皮下接種MSf+B16腫瘤細(xì)胞后，分別給予PBS對(duì)照組、卡鉬(Carboplatin)、VR-S8/VR-IL2/Ad-S8和VR-S8/VR-IL2/Ad_S8/卡鉬疫苗，測(cè)量腫瘤大小(A)至27天，生存情況觀察至腫瘤接種后50天(B)。圖8.小鼠免疫血清抗S8、33M及MS抗體的檢測(cè)。C57/BL小鼠經(jīng)PBS⑴、VR_S8⑵、VR-33M(3) ,VR-MS (4)免疫后，以小鼠的血清作為一抗，以表達(dá)MS的C0S-7細(xì)胞裂解物作為抗原，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)的結(jié)果。圖9. MS疫苗與單獨(dú)表達(dá)生存素和MUCl的疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性CTL殺傷活性的比較。從被免疫小鼠脾細(xì)胞中分離的淋巴細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，并用生存素(A)和MUCl (B)特異性抗原肽(H-2d限制性)標(biāo)記的小鼠肺癌細(xì)胞B16作為靶細(xì)胞，采用非放射性LDH釋放法檢測(cè)免疫鼠的CTL應(yīng)答。 圖10.小鼠免疫血清抗MS抗體的檢測(cè)。C57/BL小鼠經(jīng)PBS (I)、VR-IL2 (2)、VR-MS (3)、VR-MS/VR-IL2 (4)、VR-MS/VR-IL2/Ad-MS (5)免疫后，以小鼠的血清作為一抗，以表達(dá)MS的C0S-7細(xì)胞裂解物作為抗原，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)的結(jié)果。圖11.基于MS基因疫苗不同形式免疫后，小鼠脾淋巴細(xì)胞的特異性CTL殺傷活性檢測(cè)。從被免疫小鼠脾細(xì)胞中分離的淋巴細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，并用生存素(A)和MUCl (B)特異性抗原肽(H-2d限制性)標(biāo)記的小鼠肺癌細(xì)胞B16作為靶細(xì)胞，采用非放射性LDH釋放法檢測(cè)免疫鼠的CTL應(yīng)答。圖12. MS疫苗與單獨(dú)表達(dá)生存素和MUCl的疫苗對(duì)模型小鼠免疫預(yù)防效果比較。C57BL/6小鼠經(jīng)PBS對(duì)照組、VR-S8、VR-33M以及VR-MS在經(jīng)隔周免疫三次后一周，接種MSf+B16腫瘤細(xì)胞，測(cè)量腫瘤大小(A)至26天，生存情況觀察至腫瘤接種后50天(B)。圖13.不同形式MS基因疫苗對(duì)MS/B16腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)的免疫治療作用。在給C57BL/6小鼠皮下接種MSf+B16腫瘤細(xì)胞后，分別給予PBS對(duì)照組、卡鉬、VR-MS/VR-IL2/Ad-MS, VR-MS/VR-IL2/MVA-MS 以及 VR-MS/VR-IL2/Ad_MS/ 卡鉬組，測(cè)量腫瘤大小(A)至 27天，生存情況觀察至腫瘤接種后50天(B)。圖14.小鼠免疫血清抗MS抗體的檢測(cè)，評(píng)價(jià)免疫佐劑CpG motif對(duì)疫苗體液免疫反應(yīng)的增強(qiáng)作用。C57/BL 小鼠經(jīng) PBS (I)，VR-MS/VR-IL-2/AD-MS (2)，CpVR-MS/VR-IL-2/Ad5-MS(3)免疫后，以小鼠的血清作為一抗，以表達(dá)MS的C0S-7細(xì)胞裂解物作為抗原，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)的結(jié)果。圖15.免疫佐劑CpG motif增強(qiáng)了疫苗免疫小鼠⑶8+T淋巴細(xì)胞分泌IFN- y的能力。從被免疫小鼠脾細(xì)胞中分離的淋巴細(xì)胞，并用生存素蛋白、MUCl蛋白和MUC1VNTR20肽刺激淋巴細(xì)胞，采用Elispot法檢測(cè)免疫鼠產(chǎn)生IFN- y的量。圖16.1^與112共表達(dá)載體疫苗與二者聯(lián)合免疫疫苗免疫效果比較。在給0578176小鼠皮下接種MS/B16腫瘤細(xì)胞后，分別給予PBS、CpDV-IL2-MS和CpVR-MS/VR-IL-2，測(cè)量腫瘤大小(A)至26天，處死小鼠后測(cè)量瘤重(B)。圖17.蛋白疫苗表達(dá)純化及鑒定圖譜。A為pRset B-9M和pRsetB_S8純化后的考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。I為pRset B-9M純化前的全菌蛋白染色結(jié)果，2為pRset B-9M純化后的染色結(jié)果。3為pRset B-S8純化后的染色結(jié)果，4為pRset B-S8純化前的全菌蛋白染色、結(jié)果。B為pRsetB_9M蛋白純化后的Western blot結(jié)果，I為陰性對(duì)照。C為pRset B-S8蛋白純化后的Western blot結(jié)果，I為陰性對(duì)照。圖18.以蛋白疫苗S8為例探討免疫佐劑(DDA+MPL)的免疫增強(qiáng)作用及蛋白疫苗初免-病毒疫苗加強(qiáng)的免疫策略。A為體液免疫，以小鼠血清作為一抗，采用雙抗原夾心法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中生存素抗體B為細(xì)胞免疫，以生存素蛋白，MUCl蛋白分別刺激各實(shí)驗(yàn)組淋巴細(xì)胞，采用Elispot法檢測(cè)免疫鼠產(chǎn)生IFN-Y的量。圖19.為增加蛋白疫苗的廣譜性，將S8和9M聯(lián)合使用并對(duì)其免疫原性進(jìn)行考察。Balb/c小鼠經(jīng)PBS，佐劑，9M+S8，9M+S8+佐劑分別免疫后，采集最后一次免疫10天后小鼠的血清及脾淋巴細(xì)胞對(duì)該疫苗的體液及細(xì)胞免疫進(jìn)行檢測(cè)。A為體液免疫,即以小鼠血清作為一抗，采用雙抗原夾心法檢測(cè)小鼠血清中生存素和MUCl抗體，其中Al為生存素抗體A2為Mucl抗體。B為細(xì)胞免疫，即從被免疫小鼠脾細(xì)胞中分離的淋巴細(xì)胞，采用Elispot法檢測(cè)免疫鼠產(chǎn)生IFN-Y的量。BI刺激物為生存素蛋白，B2刺激物為Mucl蛋白。
圖20. S8與9M蛋白疫苗聯(lián)合佐劑使用及與卡鉬聯(lián)用之后對(duì)MSf+B16腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)的免疫治療作用比較。在給C57BL/6小鼠皮下接種MS/B16腫瘤細(xì)胞后，分別給予PBS、CpDV-IL2-MS和CpVR-MS/VR-IL-2，測(cè)量腫瘤大小(A)至26天，處死小鼠后測(cè)量瘤重(B)。
具體實(shí)施例方式一 .上述片段33M、S8和CpG motif的制備方法和條件I. 33M 的制備MUC1VNTR 為一個(gè)含有 60 個(gè)堿基的重復(fù)片段，GenBank 號(hào)為 NM_002456 (SEQ ID NO:
I)。根據(jù)一個(gè)VNTR的堿基序列設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，采用重疊延伸PCR技術(shù)(SOE PCR)合成I個(gè)VNTR(Im)重復(fù)區(qū)片段，然后利用限制性內(nèi)切酶SalI和XhoI酶切產(chǎn)生相同粘性末端的特性，依次進(jìn)行連接，構(gòu)建33M基因片段。具體方法如下I)重疊延伸PCR技術(shù)PCR 反應(yīng)條件為95°C 20s,55°C 20s、72°C 30s，進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)，利用引物 Pl (SEQID N0:2)和P2(SEQ ID NO :3)擴(kuò)增出無(wú)ATG 的 I 拷貝MUCl VNTR(簡(jiǎn)寫(xiě)為m)，以P2和P3 (SEQID NO 4)為引物擴(kuò)增出含ATG的I拷貝MUCl VNTR(簡(jiǎn)寫(xiě)為Am)片段。2)pGEM-T-33M的構(gòu)建、酶切鑒定及序列分析將上述PCR產(chǎn)物m和Am分別和pGEM-T-easy (Promega公司)載體進(jìn)行連接，分別獲得含有所述m和Am片段的pGEM-T-m和pGEM-T_Am兩個(gè)質(zhì)粒，然后利用限制性內(nèi)切酶SalI和XhoI酶切產(chǎn)生相同粘性末端的特性，依次進(jìn)行連接獲得含有所述33M片段的PGEM-T-33M質(zhì)粒，經(jīng)SalI和XhoI酶切鑒定后進(jìn)行序列分析，測(cè)序結(jié)果正確。具體過(guò)程即先將pGEM-T-m用SalI和XhoI雙酶切得目的片斷m，然后再將其插入pGEM-T_m的XhoI位點(diǎn)，即得到pGEM-T-2m。然后再將pGEM-T_2m用SalI和XhoI雙酶切得目的片斷2m，然后再將其插入pGEM-T-2m的XhoI位點(diǎn)，即得到pGEM-T_4m，同理得pGEM-T_32m，然后再將pGEM-T_Am用SalI和XhoI雙酶切得目的片斷Am，然后再將其插入pGEM-T_32m的SalI位點(diǎn)，即得到了質(zhì)粒 pGEM-T-33m。2. S8 的制備生存素，GenBank號(hào)為NM_001168，根據(jù)生存素的序列設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，采用RT-PCR技術(shù)從293細(xì)胞的總RNA中擴(kuò)增出了 S8的基因片段，序列為SEQ ID NO 8所示的堿基序列。具體方法如下I) RT-PCR 技術(shù)采用TRIzol RNA提取試劑盒(Gibco公司)提取293細(xì)胞的總RNA，采用Super-Script反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Gibco公司)從中獲得293細(xì)胞的cDNA，然后以其為模板，以P4(SEQ ID N0:5)和P5(SEQ ID NO :6)為引物進(jìn)行PCR(反應(yīng)條件為:95°C 30s、55°C 30s、72°C lmin，進(jìn)行30個(gè)循環(huán))擴(kuò)增生存素cDNA。2)pGEM-T-S8的構(gòu)建、酶切鑒定及序列分析將生存素cDNA的PCR產(chǎn)物與pGEM-T-easy載體進(jìn)行連接得到含有生存素cDNA的pGEM-T-Surv質(zhì)粒。經(jīng)序列分析證實(shí)正確后，以pGEM_T_Surv為模板，以P6 (SEQ ID NO 7)和P5為引物通過(guò)PCR擴(kuò)增S8片段(SEQ ID NO :8)，正向引物P6引入EcoRI、XbaI和SalI的酶切位點(diǎn)，反向引物P5引入了 BamHI的酶切位點(diǎn)。將S8 PCR產(chǎn)物連入pGEM-T-easy載 體獲得含有所述S8片段的pGEM-T-S8質(zhì)粒，經(jīng)SalI和BamHI酶切鑒定后進(jìn)行序列分析，測(cè)序結(jié)果正確。3. CpG motif 的制備I)本發(fā)明委托上海生物工程公司合成了一段CpG序列，序列的主要部分是4個(gè)串聯(lián)重復(fù)的 C 型 CpG 代表序列 TCGTCGTCGITCGAACGACGITGAT (SEQ ID NO :10)，序列的 5’ 端引入Stu I和Sal I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，3’端引入Stu I和Xho I兩個(gè)酶切位點(diǎn)。然后利用XhoI和Sal I具有相同粘性末端的性質(zhì)，依次進(jìn)行兩次酶切連接獲得含有16個(gè)C型CpG的序列。二.重組疫苗的獲得方法及相應(yīng)的條件I. DNA載體疫苗1)VR-33M 的構(gòu)建VR1012載體(VR1012是Vieal公司開(kāi)發(fā)的經(jīng)美國(guó)FDA正式批準(zhǔn)的可以用于人體基因疫苗臨床試驗(yàn)的載體，已經(jīng)完成的臨床試驗(yàn)表明其在人體的應(yīng)用是安全的，該載體的構(gòu)建過(guò)程參見(jiàn)文獻(xiàn)(Human Gene Therapy 1996，7 :1205-1217))含有CMV啟動(dòng)子，卡那霉素抗性基因，內(nèi)含子A和BGH PolyA翻譯終止信號(hào)等常規(guī)部件組成，共4913bp，圖譜見(jiàn)圖1A。將上述制得的pGEM-T-33M質(zhì)粒經(jīng)Sall/Xhol雙酶切后用膠回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)回收33M基因片段，將真核表達(dá)載體VR1012載體經(jīng)SalI單酶切后用膠回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)回收載體片段，利用經(jīng)SalI和XhoI酶切后具有相同粘性末端這一性質(zhì)將所回收的目的基因片段和載體片段，以T4DNA連接酶，在16°C下連接3h。用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌ToplO (invitrogen公司)，涂布卡那霉素抗性的LB平板，并于37°C下培養(yǎng)過(guò)夜，挑選陽(yáng)性菌落于5mlLB培養(yǎng)基中37°C下培養(yǎng)16h，l，2000rpm離心收獲菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取質(zhì)粒，用Sall/BamHI進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定，結(jié)果正確，即得到了重組質(zhì)粒VR-33M，圖譜見(jiàn)圖1C。2)VR_S8 的構(gòu)建將pGEM-T-S8和真核表達(dá)載體VR1012載體分別經(jīng)Sall/BamHI雙酶切，用膠回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)回收目的基因片段S8和VR1012載體片段，用T4DNA連接酶，16°C連接3h。用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌ToplO (invitrogen公司)，涂布卡那霉素抗性的LB平板，并于37°C下培養(yǎng)過(guò)夜，挑選陽(yáng)性菌落于5mlLB培養(yǎng)基中37°C下培養(yǎng)16h，I, 2000rpm離心收獲菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取質(zhì)粒，用Sall/BamHI進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定，結(jié)果正確，即得到了重組質(zhì)粒VR-33M，圖譜見(jiàn)圖IB03) VR-MS 的構(gòu)建將pGEM-T-33M經(jīng)Sall/Xhol雙 切后回收目的基因片段33M，將VR-S8載體經(jīng)SalI單酶切后回收載體片段，利用經(jīng)SalI和XhoI酶切后具有相同粘性末端這一性質(zhì)將回收目的基因片段和載體片段用T4DNA連接酶，16度連接3h。獲得VR-33M-S8，簡(jiǎn)稱VR-MS質(zhì)粒，用Sall/BamHI進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定，結(jié)果正確，即得到了重組質(zhì)粒VR-MS，圖譜見(jiàn)圖ID0MS序列為如SEQ ID NO 9所示的堿基序列。4) CpVR-MS 的構(gòu)建將上述獲得的含有串聯(lián)重復(fù)的CpG的序列采用Stu I進(jìn)行單酶雙切，獲得外源片段CpG(Stu I+Stu I)，將其與質(zhì)粒VR-MS (經(jīng)Stu I酶切并膠回收)連接，獲得質(zhì)粒CpVR-MS。5)CpVR-IL2_MS 的構(gòu)建①雙順?lè)醋虞d體DV的構(gòu)建將上述VR1012載體改造成具有兩個(gè)表達(dá)框架的真核表達(dá)載體。具體構(gòu)建方法如下以 VR1012 載體為模板，以 5’ -AGATCTGCTAGCGGATCCGATCTGCTGTGCCTTCTA-3 ' (SEQIDNO 11)和 5' -AGATCTCTATGAITTCTCTCATTACTTC-3' (SEQ ID NO 12)為引物，通過(guò) PCR擴(kuò)增BGH序列，使其5 ’端帶有Bgl II、Nhe I和BamHl，3 ’端帶有Bgl 11酶切位點(diǎn)；以VRlO 12載體為模板，5，-GGATCCATTGGCTATTGGCCATTGC-3' (SEQ ID NO : 13)和 5’ -GGATCCGAATTCGGGCCCAGATCTCTGCAGAAAAGACCCATGG-3' (SEQ ID NO 14)通過(guò) PCR擴(kuò)增 CMV-intronA 序列，使其5’端帶有BamHl，3’端帶有Bgl IKApaUEcoRl和BamHl酶切位點(diǎn)；以上PCR擴(kuò)增條件為預(yù)變性95°C 5min，變性94°C lmin，退火55°C lmin，延伸72°C lmin，30個(gè)循環(huán)后，72°C延IOmin0利用BglII和BamHl具有相同粘性末端的特點(diǎn)，BGH可以通過(guò)Bgl II聯(lián)入VR1012的BamHl位點(diǎn)獲得VR1012-BGH質(zhì)粒，然后再通過(guò)BamHl將CMV-intronA連入VR1012-BGH的Bgl II位點(diǎn)，獲得VR1012-CMV-intronA-BGH質(zhì)粒，簡(jiǎn)稱雙順?lè)醋虞d體DV。②CpDV的構(gòu)建將上述獲得的CpG的序列采用Stu I進(jìn)行單酶雙切，獲得外源片段CpG (Stu I/Stu
I)，將其與質(zhì)粒DV(經(jīng)Stu I酶切并膠回收)連接，獲得質(zhì)粒CpDV。③CpDV-IL2_MS 的構(gòu)建首先采用BamH I和BglII對(duì)質(zhì)粒VR-IL-2進(jìn)行酶切，獲得外源片段IL_2(BamHI/Bgl II)，然后將其與雙順?lè)醋虞d體CpDV(經(jīng)BamH I酶切并膠回收)連接，獲得質(zhì)粒CpDV-IL-2。然后采用Bgl II對(duì)質(zhì)粒VR-MS進(jìn)行單酶雙切，獲得外源片段MS (Bgl II/Bgl
II)，然后將其與質(zhì)粒CpDV-IL-2(經(jīng)BglII酶切并膠回收)連接，獲得質(zhì)粒CpDV-IL-2-MS。2.重組腺病毒疫苗(Ad_S8、Ad-MS)的獲得腺病毒是一種無(wú)外殼的雙鏈DNA病毒，基因組長(zhǎng)約36kb，衣殼呈規(guī)則的20面體結(jié)構(gòu),直徑約80-110nm。腺病毒基因組的兩端各有一段IOObp的反向末端重復(fù)序列(ITR)，是復(fù)制的起始位點(diǎn)。在左端ITR的3'側(cè)有一段長(zhǎng)約300bp的包裝信號(hào)(HO介導(dǎo)腺病毒基因組包裝入病毒衣殼。對(duì)腺病毒而言，只有包括兩端的ITR和包裝信號(hào)(HO的約0.5kb的序列是順式作用元件，即必須由腺病毒載體自身攜帶，而其他的30余種蛋白都可以通過(guò)輔助病毒(或細(xì)胞)反式補(bǔ)足。本實(shí)驗(yàn)中米用的腺病毒系統(tǒng)是AdMax Adenovirus載體系統(tǒng)(Microbix公司)，該系統(tǒng)是位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，位點(diǎn)特異性重組是發(fā)生在兩條DNA鏈特異位點(diǎn)上的重組，重組的發(fā)生需一段同源序列即特異性位點(diǎn)和位點(diǎn)特異性的蛋白因子即重組酶參與催化。重組酶只能催化特異性位點(diǎn)間的重組，不能催化其它任何兩條同源或非同源序列之間的重組，因而重組具有特異性和高度保守性。據(jù)此，位點(diǎn)特異性重組又稱保守重組，該重組過(guò)程不需RecA酶參與。目前應(yīng)用較多的有Cre/loxP、FLP/FRT和BP/attBP系統(tǒng)，其中Cre、FLP和BP均為特異性重組酶，屬重組酶\整合酶家族，它們催化的反應(yīng)類型、靶位點(diǎn)及重組機(jī)制十分相似，loxP、FRT和attBP為特異性位點(diǎn)，也有相似的結(jié)構(gòu)。AdMaxTMAdenovirus載體應(yīng)用的是Cre/loxP系統(tǒng)，Cre基因表達(dá)產(chǎn)物為343個(gè)氨基酸的單聚體蛋白，分子量為38kDa，它是位點(diǎn)特異性重組發(fā)生所需的特異性重組酶，其識(shí)別位點(diǎn)被稱為IoxP (locus ofcrossing-over PI),為一段34bp的DNA序列，由兩個(gè)13bp的反向重復(fù)序列和一個(gè)8bp的不對(duì)稱間隔序列(又稱為核心序列)組成5' -ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3'。 IoxP位點(diǎn)堿基重排后形成十字形的結(jié)構(gòu)，核心序列形成一單鏈環(huán)，它為Cre重組酶切割的底物，也是DNA識(shí)別與重組的位點(diǎn)，對(duì)稱的13bp反向重復(fù)序列是Cre重組酶結(jié)合的序列。AdMaxTM Adenovirus載體系統(tǒng)是由穿梭載體和骨架載體(pBHGlox A El, 3Cre)構(gòu)成，各含有一個(gè)同向排列的LoxP位點(diǎn)，其中骨架載體還含有由CMV啟動(dòng)子調(diào)控的Cre基因。將穿梭載體與骨架載體共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞株293，骨架載體所攜帶的Cre基因開(kāi)始表達(dá)，介導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)之間的重組，剪切掉骨架載體上的細(xì)菌內(nèi)復(fù)制元件、抗性基因以及Cre基因，同時(shí)完成目的基因的插入。由于骨架載體雖然攜帶有大部分的腺病毒基因組DNA卻缺少形成有感染能力腺病毒顆粒所必需的包裝信號(hào)(HO，而穿梭載體則含有V，因此只有在兩個(gè)載體之間發(fā)生了重組，才能完成腺病毒生活周期，形成有感染能力的重組腺病毒顆粒 ’另夕卜，骨架載體缺失El基因，因此需要轉(zhuǎn)染組成型表達(dá)El蛋白的293細(xì)胞。將骨架載體和穿梭載體(本研究選用的穿梭載體為pDC316，圖譜見(jiàn)圖2B)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，利用293細(xì)胞中的El蛋白，10左右天就可以產(chǎn)生出含有外源基因的重組腺病毒噬斑(見(jiàn)圖2A)，挑取噬斑，進(jìn)行PCR(反應(yīng)條件為95°C 30s,53°C 30s,72°C lmin，進(jìn)行30個(gè)循環(huán))鑒定，選取正確的克隆進(jìn)行大量擴(kuò)增、純化和滴度測(cè)定。I)穿梭重組質(zhì)粒pDC316-S8和pDC316_MS的獲得將pGEM-T-S8用EcoRI/BamHI雙酶切后回收得到S8目的片段，將pDC316用EcoRI/BglII雙酶切后回收作為載體，利用BamHI和BglII具有相同粘性末端的性質(zhì)，將回收目的基因片段和載體片段進(jìn)行用T4DNA連接酶，16度連接3h。用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌ToplO (Invitrogen公司)，涂布卡那霉素抗性的LB平板,并于37°C下培養(yǎng)過(guò)夜,挑選陽(yáng)性菌落于5mlLB培養(yǎng)基中37°C下培養(yǎng)16h，I, 2000rpm離心收獲菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取質(zhì)粒，用EcoRI/Bglll進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定，結(jié)果正確，即得到了重組質(zhì)粒pDC316-S8(圖譜見(jiàn)圖2C)質(zhì)粒。將VR-MS用Bgin單酶切后回收得到MS目的片段，將pDC316用Bgl n單酶切后回收作為載體，將回收目的基因片段和載體片段進(jìn)行連接，經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定結(jié)果正確，即獲得pDC316-MS(圖譜見(jiàn)圖2D)質(zhì)粒。
2) Ad-S8和Ad-MS重組病毒的獲得將pBHGlox A El,3Cre 和 pDC316_S8 或 pDC316_MS 共轉(zhuǎn)染 293 細(xì)胞后，經(jīng)過(guò)篩選、擴(kuò)增、純化后，獲得分別含有S8和MS片段的重組腺病毒Ad-S8或Ad-MS。3.重組MVA疫苗(MVA-MS)的獲得改良安卡拉痘苗(MVA，Modified Vaccinia Ankara)具有安全性高、外源基因容量大等優(yōu)點(diǎn)使其得以廣泛應(yīng)用于腫瘤免疫治療中。MVA含有胸苷激酶基因(TK)(參見(jiàn)圖3A)；pSCll(參見(jiàn)圖3B)是它的穿梭質(zhì)粒，具有多克隆酶切位點(diǎn)可以插入外源基因、具有胸苷激酶的左臂和右臂(TKL、TKR)可以與MVA進(jìn)行同源重組，同時(shí)含有IacZ基因，可以用于重組MVA(rMVA)的藍(lán)斑篩選。所述MVA系統(tǒng)(含穿梭質(zhì)粒pSC 11)購(gòu)自ATCC。I)穿梭重組質(zhì)粒pSCl I-MS的獲得
將VR-MS和pSCll經(jīng)Sall/Kpnl雙酶切后回收，將回收目的基因片段MS和PSCll載體片段用T4DNA連接酶，16度連接3h。用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌ToplO (invitrogen公司),涂布卡那霉素抗性的LB平板,并于37°C下培養(yǎng)過(guò)夜,挑選陽(yáng)性菌落于5mlLB培養(yǎng)基中37°C下培養(yǎng)16h，12000rpm離心收獲菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取質(zhì)粒，用Sall/Kpnl進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定，結(jié)果正確，即得到了重組質(zhì)粒pSCll-MS(見(jiàn)圖3C)。2) MVA-MS重組病毒的獲得首先以滴度0. 05pfu/cell 的 MVA 感染 tk_tsl3 細(xì)胞(購(gòu)自 ATCC，ATCC號(hào)為CRL-1632 ，是不含有TK基因的BHK-21的突變株)。感染2小時(shí)后，利用Lipofection2000 (INVITROGEN)的方法將 pSCll-MS 轉(zhuǎn)染到感染了 MVA 的 tk_tsl3 細(xì)胞中。MVA在tk-tsl3細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的過(guò)程中，由于pSClI-MS具有與MVA的TK基因同源的TKL和TKR,所以有一定比例的MVA病毒與pSCll-MS發(fā)生重組，結(jié)果MS和LacZ閱讀框架被重組到MVA病毒基因組中。形成如圖3C所示的MVA-MS重組病毒。以上被感染細(xì)胞培養(yǎng)三天后，收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞，超聲波處理，2000rpm離心IOmin除去細(xì)胞殘?jiān)Ａ羯锨濉Ｈ∫欢可锨?，作為種毒，在6孔板中將病毒依次稀釋成lO'lO'lO'lO'lO—6，感染tk-tsl3細(xì)胞2h。將等體積的在45°C下預(yù)溫的2%低熔點(diǎn)瓊脂糖和2 X DMEM-10/BrdU (BrdU, 5-溴脲嘧啶，可被TK磷酸化，磷酸化的BrdU可摻入到野生型MVA中，產(chǎn)生致死性突變，從而可以使野生型MVA逐漸減少)培養(yǎng)基混勻，每孔加入3ml培養(yǎng)基，在室溫下凝固，在37°C下于含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。鋪上層選擇性培養(yǎng)基，成分比下層瓊脂多了 1/120體積的4%X-gal。培養(yǎng)過(guò)夜，挑選藍(lán)色單斑，反復(fù)凍融三次裂解釋放病毒，進(jìn)行下一輪的篩選，步驟相同，如此進(jìn)行6輪以上篩選，最后直至得到只含重組病毒MVA-MS的克隆株。4.重組蛋白疫苗(S8、9M)的獲得I)重組蛋白疫苗9M的制備在上述制備33M片段的過(guò)程中，我們運(yùn)用同樣的方法獲得了 9M基因片段，通過(guò)PCR擴(kuò)曾使其5’端引入Sal I位點(diǎn)，3’端引入Xho I位點(diǎn)，然后將其克隆到原核表達(dá)載體pRsetB載體(購(gòu)自invitrogen公司)的Sall/Xho I位點(diǎn)，即獲得了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pRsetB-9M。經(jīng)測(cè)序正確后,將pRset B-9M質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (invitrogen公司)，涂布氨芐霉素抗性的LB平板，并于37°C下培養(yǎng)過(guò)夜。次日將菌種以I : 250的比例轉(zhuǎn)接入500ml三角瓶，培養(yǎng)至菌液OD值達(dá)到0. 6 0. 8，加入IPTG使其終濃度為ImM，37°C，230rpm培養(yǎng)5h，4000rpm，20min離心收獲菌體。菌體可于_20°C保存。(每升菌液可收獲3g左右濕菌)。收獲的濕菌以50mM Tris溶液溶解,300M Hz超聲破碎20min, 12000rpm, 30min離心，收獲上清液。此上清液經(jīng)離子交換層析及親和層析(Ni柱)兩步純化，純化得到的蛋白純度可達(dá)85%以上(見(jiàn)圖17)。具體操作參照pRset B蛋白純化操作手冊(cè)進(jìn)行(invitrogen公司)。2)重組蛋白疫苗S8的制備將上述獲得的S8基因片段，通過(guò)PCR擴(kuò)曾使其5’端引入Nde I位點(diǎn)，3’端引入HindIII位點(diǎn)，然后將其克隆到原核表達(dá)載體pRset B載體的Nde I/HindIII位點(diǎn)，即獲得了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pRset B-S8。經(jīng)測(cè)序正確后,將pRset B-S (S8)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (invitrogen公司)，涂布氨芐霉素抗性的LB平板，并于37°C下培養(yǎng)過(guò)夜。次日將菌種以I : 250的比例轉(zhuǎn)接入500ml三角瓶，培養(yǎng)至菌液OD值達(dá)到0. 6 0. 8，加入IPTG使其終濃度為ImM，37°C，230rpm培養(yǎng)5h, 4000rpm, 20min離心收獲菌體。茵體可于_20°C保存。(每升菌液可收獲3g左右濕菌)。收獲的濕菌以50mM Tris,300mM NaCl溶液溶解，300M Hz超聲破碎20min，12000rpm, 30min離心，收獲沉淀。此沉淀經(jīng)8M尿素溶解過(guò)夜，次日以15000rpm, 30min離心，收取上清，此上清液經(jīng)親和層析(Ni柱)純化，純化得到的蛋白純度可達(dá)85%以上(見(jiàn)圖 17)。
三.疫苗免疫效果I. DNA疫苗及病毒載體疫苗免疫效果1.1 S8疫苗免疫效果I. I. I S8疫苗的免疫原性本部分實(shí)驗(yàn)從體液免疫和細(xì)胞免疫兩個(gè)方面探討生存素DNA疫苗和重組腺病毒疫苗，以及其與IL-2質(zhì)粒共免疫誘導(dǎo)小鼠的免疫應(yīng)答。實(shí)驗(yàn)將C57/BL/6小鼠按表I進(jìn)行分組，I組在第0、2、4、6周注射PBS ；2-4組在第0、2、4、6周注射VR-S8疫苗及VR-IL2佐劑；5組在第0、2、4周注射VR-S8DNA疫苗及VR-IL2佐劑，在第6周注射重組腺病毒疫苗?？疾焐嫠谼NA單獨(dú)免疫的免疫效果、IL-2質(zhì)粒的佐劑效果，以及重組腺病毒的免疫增強(qiáng)作用。表I S8疫苗免疫原性
組別__第O、2、4周第6周__第8周
IPBS_ PBS_ PBS取脾、CTL
權(quán)利要求
1.一種重組質(zhì)粒CpVR-MS，其特征在于所述重組質(zhì)粒的骨架載體為VR-MS，在所述VR-MS的非編碼區(qū)插入CpG motif序列，優(yōu)選地，其中非編碼區(qū)中的插入位點(diǎn)為Stul位點(diǎn)。
2.一種雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體DV，其特征在于所述表達(dá)載體的骨架載體為VR1012，在所述VR1012多克隆酶切位點(diǎn)插入了 BGH、CMV-intron A序列，使其在VR1012本身的第一表達(dá)框架之外，含有一個(gè)第二表達(dá)框架；優(yōu)選地，其中所述表達(dá)框架中的第一表達(dá)框架的多克隆位點(diǎn)包括Pstl、Sail、notl、Xbal、Nhel、BamHl，第二表達(dá)框架的多克隆酶切位點(diǎn)包括Bgl2、Apal、EcoRl0
3.一種帶有CpG motif的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體CpDV,其特征在于所述表達(dá)載體的骨架載體為權(quán)利要求2所述的DV，在所述DV的非編碼區(qū)插入CpG motif序列；優(yōu)選地，其中非編 碼區(qū)中的插入位點(diǎn)為Stul位點(diǎn)。
4.一種重組質(zhì)粒CpDV-IL2-MS，其特征在于所述重組質(zhì)粒的骨架載體為權(quán)利要求3所述的CpDV，在所述CpDV的第一表達(dá)框的多克隆位點(diǎn)插入IL-2序列，在所述CpDV的第二表達(dá)框的多克隆位點(diǎn)插入MS序列；優(yōu)選地，其中第一表達(dá)框的插入多克隆位點(diǎn)為BamHl，第二個(gè)表達(dá)框的插入多克隆位點(diǎn)為Bgl2。
5.一種重組質(zhì)粒pRSET B-9M，其特征在于在pRSET B原核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中插入一個(gè)含有9個(gè)拷貝的MUC1VNTR的序列9M ;優(yōu)選地，其中所述插入多克隆位點(diǎn)為BamH I/EcoRIo
6.一種重組質(zhì)粒pRSET B-S8，其特征在于在pRSET B原核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中插入一個(gè)SEQ ID N0:8所述的序列S8 ;優(yōu)選地，其中所述插入多克隆位點(diǎn)為BamH I/EcoR I。
7.一種疫苗組合物，包括權(quán)利要求I的重組質(zhì)粒CpVR-MS ;優(yōu)選地，還包括免疫佐劑；更優(yōu)選地，其中所述免疫佐劑選自細(xì)胞因子白介素2(IL-2)、細(xì)胞因子粒-巨細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和非甲基化的CpG基序免疫刺激DNA序列。
8.一種疫苗組合物，包括權(quán)利要求4的重組質(zhì)粒CpDV-IL2-MS ;優(yōu)選地，還包括免疫佐齊U ;更優(yōu)選地，其中所述免疫佐劑選自細(xì)胞因子白介素2 (IL-2)、細(xì)胞因子粒-巨細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和非甲基化的CpG基序免疫刺激DNA序列。
9.一種疫苗組合物，包括S8蛋白和/或9M蛋白；優(yōu)選地，還包括免疫佐劑；更優(yōu)選地，其中所述的免疫佐劑選自DDA、MPL、AD11SM。
10.權(quán)利要求I所述的重組質(zhì)粒、權(quán)利要求4所述的重組質(zhì)?；蛘逽8蛋白和/或9M蛋白在制備用于治療腫瘤的疫苗中的用途；優(yōu)選地，其中所述疫苗還包含化療藥物；更優(yōu)選地，其中所述化療藥物選自卡鉬、順鉬、奧沙利鉬和紫杉醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及腫瘤DNA疫苗、病毒載體疫苗及蛋白疫苗領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及以粘蛋白1和生存素為靶點(diǎn)的腫瘤基因工程疫苗，包括重組DNA載體CpVR-MS和CpDV-IL2-MS；重組蛋白疫苗S8和9M，以及DNA疫苗、病毒載體疫苗、蛋白疫苗以及這三種形式疫苗之間免疫方式的優(yōu)化組合在制備抗腫瘤疫苗中的用途。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102732543SQ20111008636
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2011年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月7日
發(fā)明者于永慧, 于湘暉, 孔維, 張麗星, 張海紅, 王玉倩 申請(qǐng)人:吉林大學(xué), 長(zhǎng)春百克生物科技股份公司