專(zhuān)利名稱：三重?zé)晒舛縭t-pcr檢測(cè)試劑盒及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，具體涉及一種三重 (三種探針)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢測(cè)胃腸炎腹瀉患者的糞便樣本中札如病毒、星狀病毒和腺病毒核酸及檢測(cè)方法，可應(yīng)用于札如病毒、星狀病毒和腺病毒引起暴發(fā)疫情的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急檢測(cè)。
背景技術(shù)：
腹瀉病是世界范圍內(nèi)影響人類(lèi)健康的常見(jiàn)病和多發(fā)病，特別是引起嬰幼兒發(fā)病和死亡的主要原因之一。研究表明每年超過(guò)200萬(wàn)嬰幼兒死于腹瀉有關(guān)疾病及其并發(fā)癥，其中超過(guò)80%的患者來(lái)于欠發(fā)達(dá)國(guó)家。雖然至少25種不同的細(xì)菌和病原微生物能引起胃腸炎，但是超過(guò)75%的病例是由病毒所引的。隨著分子生物檢測(cè)技術(shù)的提高，由病毒感染引起的腹瀉病越來(lái)越受到人們的關(guān)注。特別是秋冬季節(jié)嬰幼兒腹瀉80%以上由病毒引起。病毒性胃腸炎(又稱病毒性腹瀉)，是一組由多種病毒引起的急性腸道傳染病， 臨床特點(diǎn)是起病急、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉，排水樣便或稀便，也可有發(fā)病或全身不適等癥狀，病程短，死亡率低。病毒性胃腸炎是引起全世界特別是發(fā)展中國(guó)家兒童發(fā)病和死亡的主要原因之一。輪狀病毒(Rotavirus)、諾如病毒(Norovirus)、札如病毒(Human Calicivirus)、腺病毒(Adenovirus)40型和41型以及星狀病毒(Astrovirus)被認(rèn)為是急性胃腸炎的常見(jiàn)病原。輪狀病毒是引起嬰幼兒重癥腹瀉的主要病原。幾乎每個(gè)兒童在5歲以前都感染過(guò)輪狀病毒，初次感染通常引起急性腹瀉，癥狀較重，全世界每年大約有1億多的5歲以下兒童患輪狀病毒腹瀉，其中2500萬(wàn)兒童需要門(mén)診治療，200萬(wàn)兒童需要住院治療，而且每年約有35萬(wàn) 59萬(wàn)兒童死于輪狀病毒腹瀉，82%的死亡兒童發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，目前輪狀病毒的方法學(xué)研究比較成熟，如RT-PCR、ELISA和膠乳凝集分析等方法。人類(lèi)星狀病毒(Astrovirus，AstV)于1975年首次由Appleton等在急性胃腸炎患兒的糞便中用電鏡觀察到，此后，相繼在貓、鴨、羊、豬等動(dòng)物的糞便中也發(fā)現(xiàn)了該類(lèi)病毒。盡管發(fā)現(xiàn)AstV較早，但對(duì)其致病作用及其地位未引起重視，尤其是與腹瀉的關(guān)系在很長(zhǎng)一段時(shí)間里認(rèn)為其只會(huì)引起散發(fā)的、較輕微的腹瀉。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)AstV 的各項(xiàng)研究逐步深入，認(rèn)識(shí)至UAstV的感染率、發(fā)病率均高出預(yù)期結(jié)果，尤其在嬰幼兒人群中。一些國(guó)家的同類(lèi)調(diào)查均發(fā)現(xiàn)AstV感染相當(dāng)普遍，其致病性越來(lái)越不容忽視?，F(xiàn)已證實(shí)， AstV是引起嬰幼兒、老年人及免疫功能低下者腹瀉的重要原因之一，AstV急性胃 腸炎既可散發(fā)感染也可引起暴發(fā)流行，同時(shí)也是醫(yī)源性感染的重要病原。星狀病毒占兒童住院腹瀉病例的2. 5%-9%。20世紀(jì)50年代初，Rowe等在切除的兒童腺體細(xì)胞培養(yǎng)物的自發(fā)性退行性病變中，首次發(fā)現(xiàn)腺病毒(Adenovirus，AdV)，1975年Flewett等首次應(yīng)用電鏡技術(shù)，從急性胃腸炎患兒糞便中發(fā)現(xiàn)與嬰幼兒胃腸炎直接相關(guān)的腺病毒。這些在電鏡下觀察到的大多數(shù)腺病毒，均不能在常規(guī)應(yīng)用的腺病毒細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)，這些腺病毒稱之為腸道腺病毒(Enteric Adenovirus，EAdv)。腸道腺病毒是一種新的導(dǎo)致嬰幼兒腹瀉的主要病原，主要感染5歲以下的嬰幼兒，特別是3歲以下的。腺病毒感染呈全球性分布，世界各地均有報(bào)道， 暴發(fā)流行的報(bào)道亦多見(jiàn)。腸道腺病毒可通過(guò)人與人接觸傳播，也可通過(guò)糞_ 口途徑和呼吸道傳播。腸道腺病40/41型引起超過(guò)7. 9%的兒童腹瀉病例。國(guó)內(nèi)沒(méi)有暴發(fā)流行的報(bào)道，近年來(lái)北京、天津、鄭州等地有少量散發(fā)報(bào)道。隨著對(duì)AstV研究的不斷深入，其流行病學(xué)意義日益受到重視。國(guó)外有關(guān)AstV感染的報(bào)道已經(jīng)有很多，目前我國(guó)相關(guān)報(bào)道還比較少。要全面認(rèn)識(shí)我國(guó)AstV感染的臨床及流行病學(xué)特點(diǎn)，還有待進(jìn)行深入研究。1995年程緒杰等首次在我國(guó)從腹瀉患兒糞便中分離到腸道腺病毒。EAdv感染呈全球性分布，世界各地均有報(bào)道， 暴發(fā)流行的報(bào)道亦多見(jiàn)。國(guó)內(nèi)曹衛(wèi)中等報(bào)道崇明縣一起EAdv弓1起的感染性腹瀉暴發(fā)。 人類(lèi)杯狀病毒包括諾如病毒(Norovirus)和札如病毒(Sapovirus)，是引起非菌性急性胃腸炎暴發(fā)的主要病因，也是僅次于輪狀病毒引起嬰幼兒急性腹瀉的常見(jiàn)病原之一。諾如病毒可在所有年齡段、不同場(chǎng)所(幼兒園、學(xué)校、餐館、夏令營(yíng)、醫(yī)院、護(hù)嬰室、養(yǎng)老院、航海艦隊(duì)和部隊(duì)單位等)引起暴發(fā)。由于該病毒傳染性很強(qiáng)，?？蓪?dǎo)致突發(fā)性公共衛(wèi)生事件，美國(guó)已將其列為乙類(lèi)生物恐怖因子。美國(guó)、日本、法國(guó)等國(guó)都爆發(fā)流行過(guò)諾如病毒，該病毒引起了世界各國(guó)的高度重視，我國(guó)衛(wèi)生部2007年特別制定了關(guān)于諾如病毒感染性腹瀉的防治方案。1995年方肇寅等首次在我國(guó)嬰幼兒腹瀉糞便標(biāo)本中檢測(cè)到杯狀病毒，自此以后我國(guó)北京、廣州等地區(qū)陸續(xù)報(bào)導(dǎo)檢出杯狀病毒。近年來(lái)的研究顯示我國(guó)兒童中不僅有諾如感染，也有札如感染。札如病毒的檢出率雖然低于諾如病毒，但已有的研究顯示它已呈全球性分布，常引起暴發(fā)流行。國(guó)外對(duì)于札如病毒的研究較早，1977年在日本札幌通過(guò)電鏡進(jìn)行檢測(cè)被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，美國(guó)、英國(guó)、加拿大、日本、肯尼亞、南非和我國(guó)等世界大部分國(guó)家和地區(qū)陸續(xù)進(jìn)行了流行病學(xué)研究，證明了札如病毒在世界范圍內(nèi)普遍存在，并提示它已成為腹瀉散發(fā)病例和引起暴發(fā)疫情的重要病原。病毒性腹瀉在世界范圍內(nèi)的影響不容忽視，嬰幼兒病毒性腹瀉給世界各國(guó)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。由于嬰幼兒年齡太小，無(wú)法很好的與醫(yī)生和父母進(jìn)行交流，因此對(duì)腹瀉的嬰幼兒患者進(jìn)行快速的診斷顯得尤為重要。鑒于包括人輪狀病毒、札如病毒、腺病毒、星狀病毒和諾如病毒在公共衛(wèi)生中的重要性與日俱增，所以在腹瀉監(jiān)測(cè)工作中同時(shí)要進(jìn)行多種腹瀉病毒的檢測(cè)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力而且浪費(fèi)臨床標(biāo)本與試劑。病毒培養(yǎng)相對(duì)PCR方法比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力且花費(fèi)較大，且札如病毒和諾如病毒目前世界上還沒(méi)有建立成熟的的培養(yǎng)方法。在目前由于輪狀病毒和諾如病毒的檢測(cè)方法研究的相對(duì)比較多而且比較成熟，而札如病毒、腺病毒、星狀病毒的方法研究比較少，特別是多重?zé)晒舛縋CR的方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展及其在醫(yī)學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用，特別是最近幾年興起的熒光定量PCR技術(shù)，該方法具有準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，已廣泛用于基因表達(dá)研究、病原體檢測(cè)、SNP分析及基因分型等諸多領(lǐng)域。該方法采用完全閉管檢測(cè)，省去了對(duì)PCR 產(chǎn)物后處理，避免了交叉污染，結(jié)果判斷由計(jì)算機(jī)完成，簡(jiǎn)化了操作步驟，并加強(qiáng)了結(jié)果的可靠性。隨著熒光定量技術(shù)、儀器以及材料科學(xué)的發(fā)展，熒光定量技術(shù)不僅僅在定量上發(fā)揮它的優(yōu)勢(shì)，而且運(yùn)用TaqMan或TaqMan — MGB探針的5、末端標(biāo)記上不同的熒光染料(FAM、 HEX等)技術(shù)可以進(jìn)行基因分型、基因突變檢測(cè)和SNP分析等方面研究。因此建立關(guān)于札如病毒、腺病毒、星狀病毒的多重?zé)晒舛縍T-PCR的分子生物學(xué)快速、特異、準(zhǔn)確、靈敏的基因診斷方法與診斷試劑 盒尤為重要。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，包含定量RT-PCR 反應(yīng)液、札如病毒標(biāo)準(zhǔn)品、星狀病毒標(biāo)準(zhǔn)品、腺病毒標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品，盒體7設(shè)有容器孔，分別放置定量RT-PCR反應(yīng)液管、札如病毒標(biāo)準(zhǔn)品管、星狀病毒標(biāo)準(zhǔn)品管、腺病毒標(biāo)準(zhǔn)品管、陽(yáng)性對(duì)照品管、陰性對(duì)照品管。其中熒光定量RT-PCR反應(yīng)液管包含RT-PCR反應(yīng)緩沖液管(含氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物等)、三種病毒通用引物管(上下游引物同管裝)、相應(yīng)的三種熒光探針管和酶混合物管(含RNA酶抑制劑、莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和耐熱DNA聚合酶等)。三重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)用上游引物和下游引物以及相應(yīng)的特異性熒光探針序列如下
上游引物札如病毒-FP: 5，- CAACTATGACCAGGCTCTCGC-3，
下游引物札如病毒-RP: 5，- GCCCTCCATYTCRAACACTA-3‘
特異性探針札如病毒-P: 5，- FAM - CTTGGTTYATAGGYGGTACA -BHQ1-3'
上游引物星狀病毒-FP: 5，-AATACGGACGCAACAAACGTC-3，
下游引物星狀病毒-RP: 5’ -GTCCTGTGACACCCTGTTTCC-3’
特異性探針星狀病毒-P 5’ -VIC -AGTCTAATCAACGTGTCCGTAACATTGTC-BHQ1-3’
上游引物腺病毒-FP: 5' -CCCTGCTTTATCTTCTTTTCGAAG-3’
下游引物腺病毒-RP: 5，-GAGAACGGTGTGCGCAGG-3，
特異性探針腺病毒-P 5，-ROX -CACCAGCCACACCGCGGC-BHQ1-3，
上述標(biāo)準(zhǔn)品包括札如病毒、星狀病毒和腺病毒基因標(biāo)準(zhǔn)品，其序列如下
札如病毒標(biāo)準(zhǔn)品序列為
CAACTATGAC CAGGCTCTCG CCACCTACGA ATCTTGGTTC ATAGGTGGTA CAGGCCTGGT ACAAGGTAGC CCCAGTGAAG AGACCACCAA ATTAGTGTTT GAAATGGAG GGC 星狀病毒標(biāo)準(zhǔn)品序列為
aatacggacg caacaaacgt cagtctaatc aacgtgtccg taacattgtc aataagcaac tcaggaaaca gggtgtcaca ggac 腺病毒標(biāo)準(zhǔn)品序列為
CCCTGCTTTA TCTTCTTTTC GAAGTCTTCG ACGTGGTCAG AGTGCACCAG CCACACCGCG GCGTCATCGA GGCCGTCTAC CTGCGCACAC CGTTCTC
陰性對(duì)照為高溫高壓滅菌的高壓后DEPC (焦碳酸二乙酯)處理水，陽(yáng)性對(duì)照為札如病毒、星狀病毒和腺病毒的陽(yáng)性質(zhì)粒樣品。本發(fā)明提供的定量試劑盒保存于-20°C，盡量減少反復(fù)凍融。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述的三重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)札如病毒、星狀病毒和腸道腺病毒中的應(yīng)用。本發(fā)明試劑盒的使用方法
每次檢測(cè)均應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。標(biāo)準(zhǔn)品用無(wú)菌去離子水稀釋為IXlO2 — IX IO7 拷貝 /ml。
糞便樣品核酸RNA/DNA提取該取0. 2克或200ul糞便樣本加到EP管中，加入 1. 5ml的生理鹽水，震蕩混勻3次，每次10秒，然后靜置10分鐘，以8000轉(zhuǎn)/分鐘離心5 分鐘，吸取200ul-400ul上清加到EP管中，采用德國(guó)QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit或 Geneaid公司的Viral Nucleic Acid Extraction Kit II試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取，取5ul已抽提的待測(cè)樣品核酸RNA/DNA為模板。核酸的檢測(cè)取5ul已抽提的待測(cè)樣品核酸RNA/DNA為模板，RT-PCR緩沖液為一步法RT-PCR (one stepRT-PCR)緩沖液，其終濃度為1 X，是指緩沖液各組分在反應(yīng)體系中的終濃度與IXone step RT-PCR緩沖液中各組分的濃度相同。通常采用反應(yīng)體系1/2體積的2 X one st印RT-PCR緩沖液。IXone step RT-PCR Master Mix緩沖液的組成參見(jiàn)上海輝睿生物科技有限公司的一步法RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)混合液(one step RT-PCR Master Mix)，編號(hào)(Code) :HR-RT04-100。反應(yīng)總體積為 50 μ ，其中 2XOne Step RT-PCR Reaction Buffer 25 ul，Enzyme Mix 5 ul，三種引物(20ymol/L)各 1 μ ,三種探針(20 μ mol/L)各 1 μ ，模板 RNA/DNA 2飛μ , DEPC水補(bǔ)足50 μ )在三色(或以上)熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)參數(shù)為反應(yīng)條件為50°C 30min,95°C 5min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后95°C 10s，55°C 40s，在55°C進(jìn)行三重?zé)晒鈾z測(cè)，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。熒光定量結(jié)果報(bào)告①札如病毒、星狀病毒和腸道腺病毒探針各自CT值 (threshold cycle,每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))均等于 40. 0的標(biāo)本為陰性，②札如病毒、星狀病毒和腸道腺病毒各探針CT值< 35的標(biāo)本，檢測(cè)結(jié)果為該相應(yīng)病毒的核酸為陽(yáng)性，則待測(cè)樣品含有札如病毒、星狀病毒和腺病毒，如其中一個(gè)出現(xiàn)熒光檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，則待檢樣本中含有陽(yáng)性熒光對(duì)應(yīng)的靶病毒。③CT值在35 40 之間為灰值區(qū)域，重做后大于37值為陰性。根據(jù)所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)標(biāo)本各革蘭陰、陽(yáng)性菌量值(拷貝數(shù)/ml)。本發(fā)明的有益之處是運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)，采用三種病毒(札如病毒、 星狀病毒和腺病毒)特異引物和特異熒光探針，開(kāi)發(fā)研制用于札如病毒、星狀病毒和腺病毒三重?zé)晒舛繖z測(cè)試劑盒。該發(fā)明是通過(guò)一個(gè)PCR反應(yīng)，可以從標(biāo)本中檢測(cè)出札如病毒、星狀病毒和腺病毒的存在，比傳統(tǒng)的普通PCR和單重?zé)晒舛縋CR方法更簡(jiǎn)便、快速和準(zhǔn)確， 而且對(duì)檢測(cè)的病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)準(zhǔn)確定量，對(duì)臨床上疑似病毒性感染的患兒提供早期明確診斷，區(qū)分陽(yáng)性病毒感染及感染的滴度數(shù)量水平，以便早期及時(shí)制定治療方案，減少死亡率及后遺癥。
圖1是試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是三個(gè)標(biāo)本混合同時(shí)進(jìn)行三重RT-PCR檢測(cè)的實(shí)例。圖3為熒光RT-PCR法檢測(cè)札如病毒的靈敏度，6至1 (從左到右)依次為10000000、 1000000、100000、10000、1000、lOOcopy。圖4為札如病毒標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5為熒光RT-PCR法檢測(cè)星狀病毒的靈敏度；5至1(從左到右)依次為1000000、 100000、10000、1000、lOOcopy。
圖6為星狀病毒標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖7為熒光RT-PCR法檢測(cè)腺病毒的靈敏度；5至1 (從左到右)依次為1000000、 100000、10000、1000、IOOcopy。圖8為腺病毒標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。實(shí)施例1
參見(jiàn)圖1，一種三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，包含定量RT-PCR反應(yīng)液、札如病毒標(biāo)準(zhǔn)品、星狀病毒標(biāo)準(zhǔn)品、腺病毒標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品，盒體7設(shè)有容器孔，分別放置定量RT-PCR反應(yīng)液管1、札如病毒標(biāo)準(zhǔn)品管2、星狀病毒標(biāo)準(zhǔn)品管3、腺病毒標(biāo)準(zhǔn)品4、陽(yáng)性對(duì)照品管5、陰性對(duì)照品管6，其中定量RT-PCR反應(yīng)液?jiǎn)喂芊盅b，矩陣排列，標(biāo)準(zhǔn)品為札如病毒、星狀病毒和腺病毒基因標(biāo)準(zhǔn)品，其中熒光定量RT-PCR反應(yīng)液包含RT-PCR反應(yīng)緩沖液(含氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物等)3管(標(biāo)記為(g))、三種病毒通用引物(上下游引物同管裝)為3管(標(biāo)記為 )、相應(yīng)的三種熒光探針為3管(標(biāo)記為 )、酶混合物(含RNA酶抑制劑、莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和耐熱DNA聚合酶等)為3管(標(biāo)記為 ◎)。實(shí)施例2
1材料與方法病毒株與臨床標(biāo)本
腸道腺病毒40/41、星狀病毒和札如病毒的陽(yáng)性核酸(均通過(guò)基因測(cè)序鑒定)來(lái)源于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院。臨床樣本來(lái)源于患者的糞便標(biāo)本，樣本采集后帶冰運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。1. 2 引物與探針
從美國(guó)的NCBI基因庫(kù)上下載了世界各地的札如病毒、星狀病毒、腺病毒基因序列。對(duì)其進(jìn)行了同源性比較，在對(duì)應(yīng)病毒基因組的保守基因區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物與Taqman探針，序列如下
上游引物札如病毒-FP: 5，- CAACTATGACCAGGCTCTCGC-3，
下游引物札如病毒-RP: 5，- GCCCTCCATYTCRAACACTA-3‘
特異性探針札如病毒-P: 5，- FAM - CTTGGTTYATAGGYGGTACA -BHQ1-3'
上游引物星狀病毒-FP: 5，-AATACGGACGCAACAAACGTC-3，
下游引物星狀病毒-RP: 5’ -GTCCTGTGACACCCTGTTTCC-3’
特異性探針星狀病毒-P 5’ -VIC -AGTCTAATCAACGTGTCCGTAACATTGTC-BHQ1-3’
上游引物腺病毒-FP: 5' -CCCTGCTTTATCTTCTTTTCGAAG-3’
下游引物腺病毒-RP: 5，-GAGAACGGTGTGCGCAGG-3，
特異性探針腺病毒-P 5，-ROX -CACCAGCCACACCGCGGC-BHQ1-3，
引物和探針委托上海輝睿生物科技有 限公司合成。1. 3病毒定量標(biāo)準(zhǔn)與病毒RNA的提取病毒RNA的提取采用德國(guó)QIAGEN公司的Reansy Mini Kit，按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取，得到病毒 RNA (102ng/μ L)，并根據(jù) TranscriptAidTM Τ7 High Yield Transcription Kit 的操作說(shuō)明書(shū)將RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，利用NanoDrop ND-IOOO Spectrophotometer在260nm測(cè)量逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的濃度，從而確定RNA的拷貝數(shù)以備用。1. 4熒光RT-PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化
試劑盒選用上海輝睿生物科技有限公司的one step RT-PCR Master Mix, Code HR-RT04-100，按說(shuō)明書(shū)操作，反應(yīng)總體積為50 μ 其中2X0ne Step RT-PCR Reaction Buffer 25 ul，Enzyme Mix 5 ul，三種引物(20 μ mol/L)各 1 μ ，三種探針(20 μ mol/L)各 1 μ ,模板 RNA/DNA 2 5 μ ，DEPC 水補(bǔ)足 50 μ 。)反應(yīng)條件為 50°C 30min,95°C 5min 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后95°C 10s,55°C 40s，在55°C進(jìn)行三重?zé)晒鈾z測(cè)，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，結(jié)果判斷選擇熒光檢測(cè)模式FAM、VIC、R0X，熒光基線調(diào)整取3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)平均值，閾值設(shè)定以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照品的最高點(diǎn)，樣本呈典型的擴(kuò)增曲線，判斷為陽(yáng)性。無(wú)典型的擴(kuò)增曲線，判斷為陰性。體系的優(yōu)化試驗(yàn)，在以相同濃度陽(yáng)性核酸為模板的反應(yīng)體系中，引物濃度從0. 10 1. 00 μ Μ,探針濃度從0. 10 0. 50 μ Μ,采用矩陣法優(yōu)選引物和探針的最佳濃度，根據(jù)最低Ct值和最高熒光強(qiáng)度增加值(ARn)選擇最佳引物和探針濃度。1.5熒光RT-PCR特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)
選擇腸道腺病毒、星狀病毒和札如病毒的陽(yáng)性核酸(均通過(guò)基因測(cè)序鑒定)和近期來(lái)源于源于近期浙江省腹瀉患者的臨床糞便標(biāo)本，對(duì)上述臨床樣本提取核酸，用腸道腺病毒、 星狀病毒和札如病毒多重?zé)晒釸T-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證方法的特異性；對(duì)已標(biāo)定拷貝數(shù) (Copies/ml)的腸道腺病毒(2X 108Copies/ml)、星狀病毒(2X 108Copies/ml)和札如病毒 (2X108Copies/ml)分別稀釋后，平行進(jìn)行熒光RT-PCR與RT-PCR反應(yīng)，比較其靈敏度。此夕卜，對(duì)每一個(gè)濃度的病毒稀釋液作5次重復(fù)檢測(cè)，得到的Ct值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，驗(yàn)證方法的重復(fù)性。2 結(jié)果
2. 1熒光RT-PCR反應(yīng)體系及條件
選用上海輝睿生物科技有限公司的one step RT-PCR Master Mix, Code HR-RT04-100，按說(shuō)明書(shū)操作，反應(yīng)總體積為50 μ ，其中2X0ne Step RT-PCR Reaction Buffer 25 ul,Enzyme Mix 5 ul，三種引物(20 μ mol/L)各 1 μ 三種探針(20 μ mol/L)各 1 |ll，模板RNA/DNA 2 5 μ ，DEPC水補(bǔ)足50 μ ) 用Rotor_Gene6000熒光檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)參數(shù)為反應(yīng)條件為50°C 30min,93C 5min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后95°C 10s,55°C 40s，在55°C進(jìn)行三重?zé)晒鈾z測(cè)，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，可獲得最低Ct值和最高熒光強(qiáng)度。2. 2特異性試驗(yàn)
本發(fā)明建立的多重?zé)晒釸T-PCR方法對(duì)腸道腺病毒、星狀病毒和札如病毒具有較好的特異性，近期采集的甲腹瀉患者的糞便標(biāo)本也檢測(cè)出陽(yáng)性反應(yīng)。而與其他腸道病毒如輪狀病毒、諾如病毒(I型和II型)、腸道病毒EV71和CoxAie病毒等均無(wú)交叉反應(yīng)，結(jié)果參見(jiàn)圖 2，圖中A為札如病毒樣品、B為腺病毒樣品、C為星狀病毒樣品。2.3敏感性試驗(yàn)
對(duì)腸道腺病毒、星狀病毒和札如病毒，對(duì)已標(biāo)定拷貝數(shù)(Copies/ml)的腸道腺病毒 (2 X 108Copies/ml )、星狀病毒(2 X 107Copies/ml)和札如病毒(4 X 107Copies/ml)分別稀釋100000、10000、1000、100、10倍后，用熒光RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果熒光RT-PCR方法檢測(cè)敏感性，腸道腺病毒為2X10 Copies/ml，結(jié)果參見(jiàn)圖3，其標(biāo)準(zhǔn)曲線參見(jiàn)圖4 ；星狀病毒為 2X10 Copies/ml，結(jié)果參見(jiàn)圖5，其標(biāo)準(zhǔn)曲線參見(jiàn)圖6 ；札如病毒為4X10 Copies/ml，結(jié)果參見(jiàn)圖7，其標(biāo)準(zhǔn)曲線參見(jiàn)圖8。2. 4重復(fù)性試驗(yàn)
分別取終濃度為腸道腺病毒(2 X 107Copies/ml )、星狀病毒(2 X 107Copies/ml)和札如病毒(2X107CopieS/ml)為混合后按10倍梯度稀釋成3個(gè)不同的濃度，對(duì)每一個(gè)濃度的樣本作5個(gè)重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果不同核酸濃度各自的檢測(cè)Ct值標(biāo)準(zhǔn)差在0. 10 0. 31之間，具有較好的重復(fù)性(表1)。
權(quán)利要求
1.一種三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含定量 RT-PCR反應(yīng)液、札如病毒標(biāo)準(zhǔn)品、星狀病毒標(biāo)準(zhǔn)品、腺病毒標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品，盒體(7)設(shè)有容器孔，分別放置熒光定量RT-PCR反應(yīng)液管(1)、札如病毒標(biāo)準(zhǔn)品管(2)、 星狀病毒標(biāo)準(zhǔn)品管(3)、腺病毒標(biāo)準(zhǔn)品(4)、陽(yáng)性對(duì)照品管(5)、陰性對(duì)照品管(6)，其中熒光定量RT-PCR反應(yīng)液管包含RT-PCR反應(yīng)緩沖液管、上下游引物同管裝的三種病毒通用引物管、相應(yīng)的三種熒光探針管和含RNA酶抑制劑、莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和耐熱DNA 聚合酶的酶混合物管，RT-PCR反應(yīng)緩沖液管內(nèi)含氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物，三重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)用上游引物和下游引物以及相應(yīng)的特異性熒光探針序列如下上游引物札如病毒-FP: 5，- CAACTATGACCAGGCTCTCGC-3，下游引物札如病毒-RP: 5，- GCCCTCCATYTCRAACACTA-3‘特異性探針札如病毒-P: 5，- FAM - CTTGGTTYATAGGYGGTACA -BHQ1-3'上游引物星狀病毒-FP: 5，-AATACGGACGCAACAAACGTC-3，下游引物星狀病毒-RP: 5’ -GTCCTGTGACACCCTGTTTCC-3’特異性探針星狀病毒-P 5’ -VIC -AGTCTAATCAACGTGTCCGTAACATTGTC-BHQ1-3’上游引物腺病毒-FP: 5' -CCCTGCTTTATCTTCTTTTCGAAG-3’下游引物腺病毒-RP: 5，-GAGAACGGTGTGCGCAGG-3，特異性探針腺病毒-P 5，-ROX -CACCAGCCACACCGCGGC-BHQ1-3，所述的札如病毒、星狀病毒和腺病毒基因標(biāo)準(zhǔn)品序列如下札如病毒標(biāo)準(zhǔn)品序列為CAACTATGAC CAGGCTCTCG CCACCTACGA ATCTTGGTTC ATAGGTGGTA CAGGCCTGGT ACAAGGTAGC CCCAGTGAAG AGACCACCAA ATTAGTGTTT GAAATGGAG GGC 星狀病毒標(biāo)準(zhǔn)品序列為aatacggacg caacaaacgt cagtctaatc aacgtgtccg taacattgtc aataagcaac tcaggaaaca gggtgtcaca ggac 腺病毒標(biāo)準(zhǔn)品序列為CCCTGCTTTA TCTTCTTTTC GAAGTCTTCG ACGTGGTCAG AGTGCACCAG CCACACCGCG GCGTCATCGA GGCCGTCTAC CTGCGCACAC CGTTCTC。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述陰性對(duì)照為高溫高壓滅菌的高壓后焦碳酸二乙酯處理水，陽(yáng)性對(duì)照為札如病毒、星狀病毒和腺病毒的陽(yáng)性質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒保存于_20°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)札如病毒、 星狀病毒和腸道腺病毒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，包含定量RT-PCR反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品，盒體設(shè)有容器孔，分別放置定量RT-PCR反應(yīng)液管、札如病毒標(biāo)準(zhǔn)品管、星狀病毒標(biāo)準(zhǔn)品管、腺病毒標(biāo)準(zhǔn)品管、陽(yáng)性對(duì)照品管、陰性對(duì)照品管，其中定量RT-PCR反應(yīng)液?jiǎn)喂芊盅b，矩陣排列，標(biāo)準(zhǔn)品為札如病毒、星狀病毒和腺病毒基因標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)照品為陽(yáng)性和陰性對(duì)照品。本發(fā)明試劑盒運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)，采用三種病毒特異引物和特異熒光探針，設(shè)計(jì)合理，通過(guò)一個(gè)PCR反應(yīng)，可以從標(biāo)本中檢測(cè)出札如病毒、星狀病毒和腺病毒，檢測(cè)方法更簡(jiǎn)便、快速和準(zhǔn)確。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102206713SQ201110085320
公開(kāi)日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2011年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月6日
發(fā)明者崔大偉, 李蘭娟, 陳瑜 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)