專利名稱：一種制備紫色桿菌素的方法及其專用菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備紫色桿菌素的方法及其專用菌。
背景技術(shù)：
I/-NHI /-NH
OO紫色桿菌素(violacein)、脫氧紫色桿菌素是微生物自身產(chǎn)生的一種次級代謝產(chǎn)物，屬于吲哚衍生物，由兩個色氨酸分子氧化縮合而成。自從19世紀(jì)末紫色桿菌素被發(fā)現(xiàn)以來，人們對其生物功能進(jìn)行了大量的探索，因其具有廣譜抗菌性，抗原生動物活性，抗病毒性，抗腫瘤細(xì)胞活性以及獨特的藍(lán)紫色著色能力等功能特性和在醫(yī)藥、衛(wèi)生、食品、印染等領(lǐng)域潛在的應(yīng)用前景而受到越來越多的關(guān)注。甲基扭曲桿菌是一類能夠利用甲醇等一碳化合物作為唯一碳源和能源的微生物，它們在自然界分布廣泛。研究表明，甲基扭曲桿菌能夠直接利用一碳化合物，將其轉(zhuǎn)化成自身代謝的一碳單位，并為生物體提供能源和碳骨架，這作為一種新的代謝模式對于研究其工業(yè)應(yīng)用具有重要意義。同時通過流加培養(yǎng)的方式，已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)甲基扭曲桿菌高密度的連續(xù)培養(yǎng)，這也為進(jìn)一步利用甲基扭曲桿菌獨特的代謝途徑實現(xiàn)高附加值產(chǎn)品的生產(chǎn)提供了廣泛的前景。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種重組甲基扭曲桿菌。本發(fā)明所提供的重組甲基扭曲桿菌，是將紫色桿菌素生物合成相關(guān)基因簇導(dǎo)入宿主甲基扭曲桿菌中得到的。上述重組甲基扭曲桿菌中，所述紫色桿菌素生物合成相關(guān)基因簇是通過載體pCMllO導(dǎo)入的。上述任一所述重組甲基扭曲桿菌中，所述宿主甲基扭曲桿菌為甲基扭曲桿菌(Methylobacterium extorquens),具體為甲基扭曲桿菌(Methylobacteriumextorquens)AMl ATCC 14718。上述任一所述重組甲基扭曲桿菌中，所述紫色桿菌素生物合成相關(guān)基因簇為核苷酸序列如序列表中序列I所示的DNA分子。 其保藏號為CGMCC No. 4704的重組甲基扭曲桿菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該菌株的分類命名為甲基扭曲桿菌(Methylobacterium extorquens),菌株名稱為AMl-pCM110vio。本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備紫色桿菌素的方法。本發(fā)明所提供的制備紫色桿菌素的方法，包括如下步驟發(fā)酵培養(yǎng)上述任一所述重組甲基扭曲桿菌(Methylobacterium extorquens),得到紫色桿菌素。上述過程中，所述發(fā)酵培養(yǎng)中，所用的發(fā)酵培養(yǎng)基由Na2HPO4 · 12H20、(NH4)2SO4,K2HPO4 · 3H20, MgSO4 ·7Η20、CaCl2 · H2O、Na2MoO4'ZnSO4 · 7H20、H3BO3'MnSO4 · H2O, CoCl2 · 6Η20、FeSO4 · 7Η20、CuSO4 · 5Η20、甲醇、色氨酸、四環(huán)素和水組成；其中，Na2HPO4 · 12Η20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為3. 5-4. 5g/L，(NH4)2SO4在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為O. 5-1.0g/L，K2HPO4 · 3H20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為1.3-2. 5g/L， MgSO4 · 7H20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為O. 2-1. 2g/L，CaCl2 · H2O在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為l-5mg/L, Na2MoO4在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為30_50ug/L，ZnSO4 · 7H20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為100-150ug/L，H3BO3在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為10-40 μ g/L，MnSO4 · H2O在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為60-120 μ g/L, CoCl2 · 6H20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為20-50 μ g/L, FeSO4 · 7H20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為O. 6-1. 5mg/L, CuSO4 · 5H20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為20_50ug/L，甲醇在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為O. 5 % -2 % (體積百分含量)，色氨酸在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為O. 2g/L-0. 7g/L,四環(huán)素在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為8 μ g/ml-12 μ g/ml ；優(yōu)選的，所述Na2HPO4 · 12H20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為4. 02g/L，所述(NH4)2SO4在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為I. Og/L，所述K2HPO4 · 3H20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為I. 3g/L，所述MgSO4 · 7H20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為O. 45g/L，所述CaCl2 · H2O在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為
3.3mg/L,所述Na2MoO4在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為40 μ g/L,所述ZnSO4 · 7H20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為130 μ g/L,所述H3BO3在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為30 μ g/L,所述MnSO4 · H2O在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為ΙΟΟμ g/L，所述CoCl2 · 6H20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為40μ g/L，所述FeSO4 · 7H20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為I. 3mg/L,所述CuSO4 · 5H20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為40 μ g/L,甲醇在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為1% (體積百分含量)，所述色氨酸在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為O. 5g/L，所述四環(huán)素在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/ml。上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，L-色氨酸作為合成紫色桿菌素的底物，紫色桿菌素合成酶系可以通過兩分子L-色氨酸縮合生成一分子紫色桿菌素。上述過程中，所述發(fā)酵培養(yǎng)包括如下步驟將所述重組甲基扭曲桿菌接種于所述發(fā)酵培養(yǎng)基，先在30°C條件下培養(yǎng)至發(fā)酵體系的0D_值為O. 6-1. 2，再將發(fā)酵體系在20°C發(fā)酵30-50h，具體為40h ;所述發(fā)酵體系為發(fā)酵容器內(nèi)的所有物質(zhì)；所述OD6tltl值具體為O. 8。30°C是甲基扭曲桿菌的最適生長溫度，而紫色桿菌素合成酶系的催化最適溫度為20°C，所以在發(fā)酵的過程中，先在30°C讓甲基扭曲桿菌生長起來，并表達(dá)一定量的紫色桿菌素合成酶，然后再轉(zhuǎn)至低溫20°C，以便進(jìn)一步的實現(xiàn)紫色桿菌素的合成。上述過程中，在所述發(fā)酵培養(yǎng)后，包括如下提取的步驟將所述發(fā)酵體系離心，收集菌體；將所述菌體與有機溶劑混合，破碎菌體，離心，收集上清液，即為紫色桿菌素的提取液；所述有機溶劑為乙醇、甲醇或乙酸乙酯。上述過程中，在所述提取后，包括將所述紫色桿菌素的提取液進(jìn)行高效液相色譜分離的步驟；所述高效液相色譜分離中，所用的色譜柱為Agilent ZORBAX EclipseXDB-C18液相色譜柱，流動相為甲醇和水的混合溶液，混合溶液中甲醇和水的體積比為7 3，流動相的流速為I. Oml/min，收集保留時間為3. Omin的洗脫峰，即為紫色桿菌素。本發(fā)明的制備紫色桿菌素的方法成本低廉，一方面發(fā)酵生產(chǎn)所使用的培養(yǎng)基成分簡單、價格低廉，另一方面使用本發(fā)明方法實現(xiàn)以甲醇作為碳源，發(fā)酵生產(chǎn)得到紫色桿菌素。甲醇作為一種能夠通過石油、煤或者生物可再生資源實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的工業(yè)產(chǎn)品，價格低廉，因此使用本發(fā)明方法可以為紫色桿菌素的生產(chǎn)提供新的途徑；本發(fā)明方法操作簡單，產(chǎn)率高，可達(dá)O. 15g/l發(fā)酵液。本發(fā)明的重組菌產(chǎn)紫色桿菌素的效果好。因此，本發(fā)明重組菌及紫色桿菌素的制備方法具有廣闊的應(yīng)用前景。
圖I為PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。圖2 為液質(zhì)聯(lián)用 Methylobacterium extorquens AMl-pCM110vio 產(chǎn)紫色桿菌素和 脫氧紫色桿菌素質(zhì)譜結(jié)果。圖3為核磁譜圖結(jié)果。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、重組菌的制備載體pCMllO 在文獻(xiàn)(Marx, C. J. , and Μ. E. Lidstrom. 2001. Developmentofimproved versatile broad—host—range vectors for use in me thylotrophs andotherGram-negative bacteria. Microbiology-Sgm 147 :2065-2075.)中公開過，公眾可從清華大學(xué)獲得；杜搟氏菌B2CGMCC No. 2056(中國專利號 ZL200710120074. 9)；甲基扭曲桿菌Methylobacterium extorquens AMl ATCC 14718,購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection, ATCC)；I)紫色桿菌素合成相關(guān)基因簇的克隆將杜搟氏菌屬(Duganella sp. )B2CGMCC No. 2056轉(zhuǎn)接入液體培養(yǎng)基(淀粉15g/L、硫酸亞鐵O. 03g/L、硝酸鉀lg/L、磷酸氫二鉀O. 7g/L、硫酸鎂O. 5g/L、色氨酸O. 5g/L, pH為7. O)，25°C，200rpm培養(yǎng)36小時，按上海生工基因組DNA提取試劑盒說明書提取杜搟氏菌 B2CGMCC No. 2056 基因組 DNA。以杜搟氏菌B2CGMCC No. 2056基因組DNA為模板，利用高保真Pyrobest DNA聚合酶PCR擴增vio-U片段和vio-L片段，擴增vio-U片段所用引物為Vio-U_280U37和Vio-U-3377L26 ;擴增 vio_L 片段所用弓丨物為 Vio-L_3026U27 和 Vio-L_7289L32，PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖I所示，圖I中，“M”代表分子量標(biāo)準(zhǔn)，“U”代表vio-U片段，“L”代表vio-L片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR純化試劑盒回收。表I.引物序列Vio-U-280U375’ - ACTGGAGCTCCGCACCTTGGTTACCGGTTCTTGATTA-3’
Vio-U-3377L265’- CGTGGACTTGGCGGCCGCTTCGACCT-3’
Vio-L-3026U275’- ATCGCGCCTGTTCCTGAMTACCTGAC -3’
Vio-L-7289L325’ - ATATGGTACCTTATTCCGACACGAAAACGCTG-3’Sac I和NotI雙酶切vio_U片段，NotI和KpnI雙酶切vio_L片段，雙酶切后的片段用回收試劑盒回收。用Sac I和Kpn I雙酶切pCMllO，與酶切后的vio_U和vio_L在16°C過夜連接，連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化入E. coli DH5a中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含四環(huán)素抗性(12.5yg ml—1)的LB平板上，挑取轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)后采用堿裂解法提取質(zhì)粒，篩選含插入片段的陽性克隆，插入片段經(jīng)雙向測序驗證，結(jié)果插入的基因序列如序列表中序列1，表明插入的基因序列及方向均正確(vio-U片段為自序列I的5'末端其第1-3123位核苷酸，vio_L為自序列I的5'末端其第3069-7358位核苷酸)，陽性克隆所含的陽性重組表達(dá)載體命名 pCMllOvio。2)構(gòu)建重組菌將重組表達(dá)載體pCMllOvio通過電擊轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入Methylobacterium extorquensAMl菌株中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含四環(huán)素抗性(10 μ g πιΓ1)的CHOI平板上，挑取轉(zhuǎn)化子單克隆，接種于含四環(huán)素抗性(IOyg ml—1)的CHOI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用堿裂解法提取質(zhì)粒，分別利用表I中引物對進(jìn)行PCR擴增和NotI、KpnI和SacI對質(zhì)粒酶切的方法進(jìn)行篩選驗證，再進(jìn)行測序驗證，測得的序列如序列表中序列I所示，表明轉(zhuǎn)入的重組質(zhì)粒正確、重組菌中含有正確的重組質(zhì)粒pCMllOvio,將含有重組表達(dá)載體pCMllOvio的Methylobacteriumextorquens AMl 菌株，記作甲基扭曲桿菌(Methylobacteriumextorquens) AMl-pCMl IOvio。同時將pCMl 10轉(zhuǎn)入Methylobacterium extorquens AMl中，得到的重組菌記作Methylobacterium extorquens AMl-pCMllO,作為對照。將菌株甲基扭曲桿菌(Methylobacteriumextorquens) AMl-pCMl IOvio 于 2011 年3月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCCNo. 4704,分類命名為甲基扭曲桿菌(Methylobacterium extorquens)。含四環(huán)素抗性(10 μ g ml-1)的CHOI液體培養(yǎng)基的組成=Na2HPO4 · 12H20 4. 02g/L, (NH4)2SO4L Og/L, K2HPO4 · 3H20 I. 3g/L, MgSO4 · 7H20 0. 45g/L, CaCl2 · H2O 3. 3mg/L,Na2Mo0440 μ g/L, ZnSO4 · 7H20 130 μ g/L, H3B0330 μ g/L, MnSO4 · H2O 100 μ g/L, CoCl2 · 6H2040 μ g/L, FeSO4 · 7H20 I. 3mg/L，CuSO4 · 5H20 40 μ g/L,甲醇 1% (v/v)，抗生素四環(huán)素 10 μ gml、含四環(huán)素抗性(10μ g πιΓ1)的 CHOI 平板的組成=Na2HPO4 · 12H20 4. 02g/L, (NH4)2SO4L Og/L, K2HPO4 · 3H20 I. 3g/L, MgSO4 · 7H20 0. 45g/L, CaCl2 · H2O 3. 3mg/L, Na2Mo0440 μ g/L, ZnSO4 · 7H20 130 μ g/L, H3B0330 μ g/L, MnSO4 · H2O 100 μ g/L,CoCl2 ·6Η2040 μ g/L，F(xiàn)eSO4 ·7Η20 I. 3mg/L，CuSO4 ·5Η20 40yg/L，甲醇 1% (v/v)，瓊脂 15g/L0實施例2、制備紫色桿菌素一、發(fā)酵菌
種子培養(yǎng)基為含四環(huán)素抗生素的CHOI液體培養(yǎng)基，組成為Na2HPO4 · 12H204. 02g/L, (NH4)2SO4L Og/L, K2HPO4 · 3H20 I. 3g/L, MgSO4 · 7H20 0. 45g/L, CaCl2 · H203. 3mg/L,Na2Mo0440 μ g/L, ZnSO4 · 7H20 130 μ g/L, H3B0330 μ g/L, MnSO4 · H2O 100 μ g/L, CoCl2 · 6H2040 μ g/L, FeSO4 · 7H20 I. 3mg/L，CuSO4 · 5H20 40 μ g/L,甲醇 1% (v/v)，抗生素四環(huán)素 10 μ gml、發(fā)酵培養(yǎng)基所用的發(fā)酵培養(yǎng)基由Na2HPO4 · 12H20、(NH4) 2S04、K2HPO4 · 3H20、MgSO4 · 7H20、CaCl2 · H2O、Na2MoO4'ZnSO4 · 7H20、H3BO3、MnSO4 · H20、CoCl2 · 6H20、FeSO4 · 7H20、CuSO4 · 5H20、甲醇、L-色氨酸、四環(huán)素和水組成；Na2HPO4 · 12H20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為4. 02g/L, (NH4) 2S04在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為I. Og/L, K2HPO4 · 3H20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為I. 3g/L，MgSO4 · 7H20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為O. 45g/L，CaCl2 · H2O在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為3. 3mg/L, Na2MoO4在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為40 μ g/L, ZnSO4 · 7H20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為130 μ g/L, H3BO3在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為30 μ g/L, MnSO4 · H2O在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為100 μ g/L, CoCl2 · 6H20在發(fā)酵培 養(yǎng)基中的濃度為40 μ g/L, FeSO4 · 7H20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為I. 3mg/L, CuSO4 · 5H20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為40 μ g/L，甲醇在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為1% (v/v)，色氨酸在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為O. 5g/L，抗生素四環(huán)素在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為IOyg πιΓ1.種子培養(yǎng)實驗組將Methylobacterium extorquens AMl-pCMlIOvio 的單菌落接種至5mL種子培養(yǎng)基，3(TC，200rpm振蕩培養(yǎng)10_48h，得到種子培養(yǎng)液。對照組將Methylobacterium extorquens AMl-pCM110 單菌落分別接種至 5mL 種子培養(yǎng)基，30 °C,200rpm振蕩培養(yǎng)10_48h，得到種子培養(yǎng)液。發(fā)酵培養(yǎng)按lml/lOOml的接種量，將實驗組種子培養(yǎng)液和對照組種子培養(yǎng)液分別接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)至發(fā)酵物的0D_為O. 8時，轉(zhuǎn)為20°C培養(yǎng)40h，收集容器內(nèi)的所有物質(zhì)，將容器內(nèi)的所有物質(zhì)記作發(fā)酵物。二、提取取5ml實驗一得到的發(fā)酵物，離心，收集菌體，菌體中加入無水乙醇5mL，用漩渦混合器將其混勻，然后在200W超聲波清洗器中振蕩0. 5h，將振蕩液9000 X g離心5min，收集上清液，即為紫色桿菌素的粗提液。結(jié)果，實驗組(重組菌Methylobacterium extorquens AMl-pCM110vio)得到的上清液中含有藍(lán)紫色物質(zhì)，對照組(重組菌Methylobacterium extorquensAMl-pCMl 10)得到的上清液中不含有藍(lán)紫色物質(zhì)。分別將兩組的上清液減壓蒸餾至干燥，得到固形物質(zhì)。三、高效液相色譜分離純化和結(jié)構(gòu)確認(rèn)I.紫色桿菌素的分離純化將實驗二中實驗組和對照組的固形物質(zhì)分別溶于甲醇中，進(jìn)行高效液相色譜分析。Agilent 1100型液相色譜儀；色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 液相色譜柱(150mmX 4mm, 5 μ m),孔徑5um ;柱溫30 °C ；自動進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣量200ul ;流動相的組成為流動相為甲醇和水的混合溶液，甲醇和水的體積比為7 3;流速為 I. Oml/min ；檢測器為Sro-IOA (V)紫外檢測器，檢測波長570nm ；在如上色譜條件下，紫色桿菌素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間為3. Omin ;脫氧紫色桿菌素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間為4. 9min，收集保留時間為3. Omin的洗脫峰。2.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用由液相色譜分離出來的色素成分，通過液質(zhì)聯(lián)用再分離純化，(質(zhì)譜儀為=LCQDecaXP(美國熱電公司)；質(zhì)譜條件為離子源ESU源；殼氣35arb ;輔助氣0arb ;噴霧電壓3，5kV ;毛細(xì)管溫度300°C ;流速lmL/min ;分流比9 I ;質(zhì)譜速度0. lmL/min。二次質(zhì)譜碎裂能量(1)35% (2)38% )，結(jié)果如圖2 (A脫氧紫色桿菌素ESI-MS圖譜，B紫色桿菌素ESI-MS圖譜)。表明色素的主要成分的為分子量分別為344. 2和327. 2。3、核磁共振由高效液相色譜分離出的保留時間為3min的主要成分按照下述文獻(xiàn)(T.Hoshino, T. Kondo, T. Uchiyama, N. Ogasawara, Biosynthesis of violacein anove!rearrangement in tryptophan metabolism with a I,2-shift of the indole,Agric. Biol. Chem. 51 1987)965-968.)中描述的方法進(jìn)行核磁共振分析，用JNMECA-600 (JE0L公司)核磁共振波譜儀，磁場強度為14. 096T/H共振頻率為600. 17MHz，溶劑為DMS0，在室溫下進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。90度脈沖寬度為11. 3us，采樣點數(shù)為16384，掃描次數(shù)為16次，氘代試劑為d-DMS0，得到了如圖3所示的核磁譜圖結(jié)果。譜圖3比較清晰的給出了色素主要成分各位置的H(式(II))的化學(xué)位移，通過與文獻(xiàn)中紫色桿菌素的化學(xué)位移值比對(表2)，得到相應(yīng)的結(jié)構(gòu)信息。表2、甲基扭曲桿菌產(chǎn)色素主成分核磁氫譜化學(xué)位移值與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的比對
權(quán)利要求
1.一種重組甲基扭曲桿菌，是將紫色桿菌素生物合成相關(guān)基因簇導(dǎo)入宿主甲基扭曲桿菌中得到的。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組甲基扭曲桿菌，其特征在于所述紫色桿菌素生物合成相關(guān)基因簇是通過載體PCMl 10導(dǎo)入的。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的重組甲基扭曲桿菌，其特征在于所述宿主甲基扭曲桿菌為甲基扭曲桿菌(Methylobacterium extorquens),具體為甲基扭曲桿菌(Methylobacterium extorquens)AMl ATCC 14718。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的重組甲基扭曲桿菌，其特征在于所述紫色桿菌素生物合成相關(guān)基因簇為核苷酸序列如序列表中序列I所示的DNA分子。
5.一種重組甲基扭曲桿菌，其保藏號為CGMCC No. 4704，其分類命名為甲基扭曲桿菌(Methylobacterium extorquens)。
6.一種制備紫色桿菌素的方法，包括如下步驟發(fā)酵培養(yǎng)權(quán)利要求1-5中任一所述重組甲基扭曲桿菌，得到紫色桿菌素。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)中，所用的發(fā)酵培養(yǎng)基由Na2HPO4 12H20、(NH4)2SO4' K2HPO4 3H20、MgSO4 7H20、CaCl2 H2O, Na2MoO4' ZnSO4 7H20、H3BO3'MnSO4 H2O, CoCl2 6H20、FeSO4 7H20、CuSO4 5H20、甲醇、色氨酸、四環(huán)素和水組成； Na2HPO4 12H20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為3. 5-4. 5g/L，(NH4)2SO4在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 5-1. Og/L, K2HPO4 3H20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為I. 3-2. 5g/L，MgSO4 7H20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 2-1. 2g/L，CaCl2 *H20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為l_5mg/L，Na2MoO4在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為30-50ug/L，ZnSO4 7H20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為100_150ug/L，H3BO3在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為10-40 u g/L，MnSO4-H2O在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為60-120 u g/L，CoCl2 6H20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為20-50ii g/L，F(xiàn)eSO4 7H20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0.6-1. 5mg/L, CuSO4 5H20在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為20_50ug/L，甲醇在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 5% -2% (體積百分含量)，色氨酸在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 2g/L-0. 7g/L，四環(huán)素在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為8 V- g/ml-12 V- g/mlo
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)包括如下步驟將所述重組甲基扭曲桿菌接種于所述發(fā)酵培養(yǎng)基，先在30°C條件下培養(yǎng)至發(fā)酵體系的0D_值為0.6-1. 2，再將發(fā)酵體系在20°C發(fā)酵30-50h，具體為40h ;所述發(fā)酵體系為發(fā)酵容器內(nèi)的所有物質(zhì)；所述0D_值具體為0. 8。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述發(fā)酵培養(yǎng)后，包括如下提取的步驟將所述發(fā)酵體系離心，收集菌體；將所述菌體與有機溶劑混合，破碎菌體，離心，收集上清液，即為紫色桿菌素的提取液； 所述有機溶劑為乙醇、甲醇或乙酸乙酯。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述提取后，包括將所述紫色桿菌素的提取液進(jìn)行高效液相色譜分離的步驟；所述高效液相色譜分離中，所用的色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C 18液相色譜柱，流動相為甲醇和水的混合溶液，混合溶液中甲醇和水的體積比為7 3，流動相的流速為l.Oml/min，收集保留時間為3. Omin的洗脫峰，即為紫色桿菌素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備紫色桿菌素的方法及其專用菌。該重組甲基扭曲桿菌，是將紫色桿菌素生物合成相關(guān)基因簇導(dǎo)入宿主甲基扭曲桿菌中得到的。本發(fā)明的制備紫色桿菌素的方法成本低廉，一方面發(fā)酵使用的培養(yǎng)基成分簡單、成本低廉，另一方面本發(fā)明方法只需以甲醇作為碳源，就可以發(fā)酵得到紫色桿菌素，甲醇是能夠通過石油或者生物可再生資源合成的，價格低廉，本發(fā)明方法實現(xiàn)了用廉價可再生資源工業(yè)化生產(chǎn)紫色桿菌素；本發(fā)明方法操作簡單，產(chǎn)率高，可達(dá)0.15g/l發(fā)酵液。本發(fā)明的重組菌產(chǎn)紫色桿菌素的效果好。因此，本發(fā)明重組菌及紫色桿菌素的制備方法具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N1/21GK102703367SQ20111007510
公開日2012年10月3日 申請日期2011年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月28日
發(fā)明者張翀, 楊程, 蔣培霞, 邢新會 申請人:清華大學(xué)