與抗白粉病相關(guān)的蛋白TaWRKY2及其編碼基因的制作方法

專利名稱：與抗白粉病相關(guān)的蛋白TaWRKY2及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與抗白粉病相關(guān)的蛋白TaWRKY2及其編碼基因。
背景技術(shù)：
小麥白粉病(Powdery mildew)是由專性寄生真菌禾布氏白粉菌Bgt (Blumeriagraminis f sp. tritici)引起的ー種真菌性病害,屬世界性分布的病害,嚴(yán)重影響了世界小麥的產(chǎn)量。近年來，由于作物種植密度的增高，氮肥施用量的増大，以及作物種植的単一，使小麥白粉病造成的危害日益嚴(yán)重。小麥?zhǔn)芎?，可?dǎo)致葉片早枯，光合作用降低，呼吸作用加強(qiáng)，分蘗數(shù)減少，成穗率降低，干粒重下降，一般可減產(chǎn)5% 10%，重病田減產(chǎn)達(dá)20%以上。由于小麥白粉病菌具有群體大、適應(yīng)范圍廣、生理小種眾多.且變異速度快.使得許多有效抗病基因喪失抗性。目前育種工作者一直以選育和推廣抗病品種作為病害的主要防 治手段，多年來，且頗見成效，但抗性喪失一直是未能解決的問題，抗源多樣化是實現(xiàn)抗病性持久的有效途徑。為此通過生物學(xué)的方法克隆新的抗病基因，利用轉(zhuǎn)基因的方法提高小麥對白粉病的抗性是今后防治白粉病的有效策略之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的ー個目的是提供ー種與白粉病抗性相關(guān)的蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的蛋白，名稱為TaWRKY2，來源于普通小麥京411，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)由SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將SEQ ID NO : I所示的氨基酸序列經(jīng)過ー個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與白粉病抗性相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。所述編碼基因為如下I)或2)或3)所示I)其核苷酸序列是SEQ ID NO 2所示DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與I)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。擴(kuò)增上述任一所述基因全長或其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述引物對中的一條引物序列如SEQ ID NO :3所示，所述引物對中的另一條引物序列如SEQ ID NO 4所示。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組病毒或表達(dá)盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述蛋白或上述任一所述蛋白編碼基因在調(diào)節(jié)植物對白粉病的抗性中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述應(yīng)用中，所述白粉病為大麥白粉病或小麥白粉病；所述植物為大麥或小麥。上述任一所述應(yīng)用中，所述大麥白粉病由大麥白粉病菌弓I起的,所述小麥白粉病由小麥白粉病菌引起的。上述任一所述應(yīng)用中，所述大麥白粉病菌為大麥白粉菌生理小種Kl (AvrMlal,virMla6, virMlal2, virMlg)或大麥白粉病菌生理小種 A6 (virMlal, AvrMla6, AvrMlal2,AvrMlg);所述小麥白粉病菌為小麥白粉病菌15號生理小種E09 ；上述任一所述應(yīng)用中，所述大麥為大麥品種POl (含Mlal);所述小麥為小麥品種揚麥158 (不含Pm21)。
實驗證明，本發(fā)明基因?qū)π←溁虼篼湹目拱追鄄⌒阅苁沁M(jìn)行負(fù)調(diào)控的。本發(fā)明基因在小麥育種方面將有廣闊的應(yīng)用前景，在保證小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)方面具有重要的意義。


圖I為小麥TaWRKY2蛋白亞細(xì)胞定位。圖2為抗病感病細(xì)胞圖示。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、TaWRKY2的獲得I、候選EST與基因全長cDNA的電子延伸以大麥HvWRKY I為種子序列，搜索小麥EST數(shù)據(jù)庫(http: / / co即bio, dfci.harvard. edu/tRi/cRi-bin/tRi)中的EST序列,保存高度同源的EST序列,將搜到的序列進(jìn)行拼接組裝成重疊群(contig),在預(yù)測的開放閱讀框(Open reading frame, 0RF)タト,設(shè)計特異性引物；引物序列如下TaffRKY2 :F2 5，> ATGGAGGAGCAGTGGATGAT > 3，(SEQ ID NO :3)R2 5，> TCAAGCAACAGGGATCCGAC > 3’ (SEQ ID NO :4)2、小麥TaWRKY2基因的cDNA的克隆挑選大小一致小麥品種豫麥66 (高抗白粉病)、京411 (高感白粉病)各40粒種子，播種于苗缽中，長至第一片葉完全展開時(大約一周左右時間)，利用北京地區(qū)流行的小麥白粉病菌15號生理小種(E09菌株)對小麥材料進(jìn)行高密度接菌處理，在接菌后O、I、
2、3、12、24小時，收集小麥葉片，用于總RNA的提取。利用Trizol法提取小麥總RNA，以總RNA 為模板，米用 Invitrogen 公司的 M-MLV Reverse Transcriptase 合成 cDNA 第一鏈，以合成的第一鏈為模板，用上述的引物對F2/R2進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。對京411的擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果表明得到cDNA為SEQ ID NO 2所示的基因，將該基因命名為TaWRKY2，其編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。實施例2、小麥TaWRKY2的分子特性及作用機(jī)制研究轉(zhuǎn)錄因子的特征之ー是定位于細(xì)胞核中，并在細(xì)胞核中執(zhí)行其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。為此，利用基因槍介導(dǎo)的方法在小麥葉片細(xì)胞中對小麥TaWRKY2蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，與大麥HvWRKY2相同，小麥TaWRKY2也定位于細(xì)胞核中(圖I)。圖I中，CFP (青色熒光蛋白)、CFP-HvWRKY2 (CFP在HvWRKY2的N端、TaWRKY2_YFP (黃色熒光蛋白在TaffRKY2 的 C 端)、Overlay 重疊。
實施例3、TaffRKY2在大麥和小麥抗白粉病中的功能研究I、TaWRKY2在大麥抗白粉病中的功能(I) TaffRKY2對大麥小種?；剐缘挠绊戄d體pGY_l 在文獻(xiàn)“Patrick Schweizer et al, A Transient Assay Systemfor tne Functional Assessment of Defense-Related Genes in Wheat. MPMI,1999,12 647-654”中公開過，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。載體p35S_GUS 在文獻(xiàn)“Patrick Schweizer et al, A Transient Assay Systemfor tne Functional Assessment of Defense-Related Genes in Wheat. MPMI,1999,12 647-654”中公開過，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。大麥品種POl (含 Mlal)在文獻(xiàn)“ Shen Q H et al. , Recognition Specificityand RARiVSiafl Dependence m Barley Mla Disease Resistance Genes to the PowaeryMildew Fungus. 2003,15 :732_744”中公開過，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。大麥白粉病菌生理小種Kl(AvrMlal, virMla6, virMlal2, virMlg)在文獻(xiàn)“Shen QHet al. , Recognition Specificity and RAR1/SGT1 Dependence in Barley Mla DiseaseResistance Genes to the Powdery Mildew Fungus. 2003,15 :732-744，，中公開過，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。p D0NR201 購自 Invitrogen 公司；pUbi_GW 購自 Invitrogen 公司。BP 反應(yīng)試劑及LR反應(yīng)試劑均購自Invitrogen公司。載體pUbi_TaWRKY2的構(gòu)建及鑒定方法設(shè)計擴(kuò)增TaWRKY2全長的引物，上游引物的前端加上attBl，下游引物加上 attB2F :5GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT ATGGAGGAGCAGTGGATGAT3R 5GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC TCAAGCAACAGGGATCC3。以人工合成的SEQ ID NO 2所示基因為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收，回收后產(chǎn)物和PD0NR201進(jìn)行BP反應(yīng)生成ENTRY載體。PCR 產(chǎn)物(40ng/ul) 3. 5ulBP重組酶混合物 0. 5ulp D0NR201(100ng/ul) Iul25°C,3hr。酶切鑒定陽性克隆，陽性克性即為ENTRY載體。ENTRY載體再和p Ubi-Gff進(jìn)行LR反應(yīng)。體系如下ENTRY 載體(100ng/ul) IulLR重組酶混合物0. 5ulp Ubi-Gff(100ng/ul) IulTE (PH = 8. 0)2ul25°C,3hr。酶切鑒定陽性克隆，陽性克性即為pUbi_TaWRKY2。將陽性克隆進(jìn)行測序驗證，測序驗證結(jié)果測得pUbi-TaWRKY2中含有SEQ ID NO 2所示基因序列。用于后續(xù)實驗。載體pUbi_HvWRKY2的構(gòu)建及鑒定方法用如下引物對F/R，以人工合成的Genebank號為AJ853838的序列為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到HvWRKY2基因。按照上述方法得到重組載體pUb i-HvffRKY2。F 5GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT ATGGAGGAGCAGTGGATG3R 5GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC TCAAGCAACAGGGATCC3。轉(zhuǎn)化方法基因槍介導(dǎo)的方法大麥種子經(jīng)保濕吹芽種植后，待長至一周左右，剪下第一片葉，葉面朝上，放置于含有培養(yǎng)基(1%的瓊脂，80mg/L苯丙咪唑，其余為水)的培養(yǎng)皿上，恢復(fù)3小時，進(jìn)行基因槍轟擊；將目的質(zhì)粒pUbi-TaWRKY2和質(zhì)粒p35S_GUS按I : I體積充分混合，包裹在直徑為Ium金粉微粒上，采用roS-1000/He (美國Bio-Rad)轟擊靶材料，基因槍轟擊參數(shù)為阻擋網(wǎng)與轟擊材料之間的距離為5. 5cm，可裂膜壓カ為llOOPa，每槍金粉-DNA用量為42/0. 2lug。

接大麥白粉菌生理小種Kl (AvrMlal, virMla6, virMlal2, virMlg)的方法基因槍轟擊完畢后，將大麥葉片放入培養(yǎng)箱中恢復(fù)培養(yǎng)4小時(培養(yǎng)條件20°C 16h光照/18°C 8h黑暗)，4小時后進(jìn)行接菌，將孢子抖落在大麥葉片上，保證I個孢子/mm2，培養(yǎng)40小時(培養(yǎng)條件20°C 16h，光照/18°C 8h，黑暗)，進(jìn)行⑶S染色，37°C過夜染色完畢后進(jìn)行脫色，兩天后利用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞觀察。統(tǒng)計表達(dá)⑶S的細(xì)胞中感病細(xì)胞的比例來計算吸器指數(shù)，根據(jù)吸器指數(shù)來判斷基因TaWRKY2的功能。吸器指數(shù)與抗病性的關(guān)系吸器指數(shù)小于20%為高抗，大于60%為高感、30%-60%之間為(包括30%和60%)中抗或中感?？共〖?xì)胞的判斷標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GUS，且細(xì)胞內(nèi)不含有吸器，而細(xì)胞表面附著有分生孢子的細(xì)胞為抗病細(xì)胞(圖2A)。感病細(xì)胞的判斷標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GUS，且細(xì)胞內(nèi)含有吸器的細(xì)胞為感病細(xì)胞(圖2B)。吸器指數(shù)的計算公式吸器指數(shù)=感病細(xì)胞的個數(shù)パ抗病細(xì)胞的個數(shù)+感病細(xì)胞的個數(shù))X 100%。以轉(zhuǎn)入pGY-1和p35S-GUS的大麥葉片作為空對照，以轉(zhuǎn)入pUbi_HvWRKY2和載體P35S-GUS的大麥葉片作為陽性對照。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入載體pUbi_TaWRKY2和載體p35S_GUS的大麥葉片的吸器指數(shù)為55. 69 % ;轉(zhuǎn)入pGY-1和載體p35S-GUS的大麥葉片的吸器指數(shù)為17. 58% ;轉(zhuǎn)入pUbi-HvffRKY2和載體p35S-GUS的大麥葉片的吸器指數(shù)為58. 65%。結(jié)果顯示，在大麥葉片中過表達(dá)TaWRKY2后，吸器指數(shù)明顯上升，說明TaWRKY2和HvffRKY2的作用相同，在大麥的小種?；剐灾杏胸?fù)調(diào)控作用。(2) TaffRKY2對大麥本底抗性的影響大麥白粉病菌生理小種A6 (virMlal, AvrMla6, AvrMlal2, AvrMlg)在文獻(xiàn)“Shen QH et al. Recognition Specificity and RAR1/SGT1 Dependence in Barley Mla DiseaseResistance Genes to the Powdery Mildew Fungus. 2003,15 :732_744”中公開過，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。方法與實驗(I)中所述基本相同，不同的是接種的致病菌為大麥白粉病菌生理小種 A6 (virMlal, AvrMla6, AvrMlal2, AvrMlg)。
實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入載體pUbi_TaWRKY2和載體p35S_GUS的大麥葉片的吸器指數(shù)為81.40% ;轉(zhuǎn)入pGY-1和載體p35S-GUS的大麥葉片的吸器指數(shù)為54. 60 % ;轉(zhuǎn)入pUbi-HvffRKY2和載體p35S-GUS的大麥葉片的吸器指數(shù)為81. 45%。結(jié)果顯示，在大麥葉片中過表達(dá)TaWRKY2后，吸器指數(shù)明顯上升，說明TaWRKY2和HvffRKY2的作用相同，在大麥的本底抗性中有負(fù)調(diào)控作用。2. TaffRKY2在小麥抗白粉病中的功能(I) TaffRKY2對小麥本底抗性的影響小麥品種揚麥158(不含 Pm2I)在文獻(xiàn)“LIUP et al. Transfer ofdisease resistance oi Triticum aes11tpvum-HaynaIaia villosa DゾS/6AI J trans丄ocationlines in diferent wheat background. Journal of Naming AgriculturalUniversity. 2004,27(2) :1 5”中公開過，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。小麥白粉病菌15號生理小種(菌株E09)在文獻(xiàn)“Hu T Z et al. Identificationand Molecular Mapping Gene in Wheat Cultivar yu mai 66 of the Powdery MildewResistance. ACTA AGRONOMICA SINICA 2008,34(4) :545_55”中公開過，公眾可從中國科學(xué)
院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。方法與實驗I中⑴所述基本相同，不同的是接種的致病菌為小麥白粉病菌15號生理小種(菌株E09)，轉(zhuǎn)化的是小麥品種揚麥158(不含Pm21)的葉片。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入載體pUbi_TaWRKY2和載體p35S_GUS的小麥葉片的吸器指數(shù)為80. 36% ;轉(zhuǎn)入pGY-1和p35S-GUS的小麥葉片的吸器指數(shù)為54. 60% ;轉(zhuǎn)入pUbi_HvWRKY2和p35S-GUS的小麥葉片的吸器指數(shù)為81. 45%。結(jié)果顯示，在小麥葉片中過表達(dá)TaWRKY2后，吸器指數(shù)明顯上升，說明TaWRKY2在小麥的本底抗性中起負(fù)調(diào)控作用。(2) TaffRKY2對小麥廣譜抗性的影響小麥品種小麥一簇毛麥易位系6VS/6AL(含Pm21)在文獻(xiàn)“CaoAZ et al. Cloningand Analysis of an Hv-OxOLP bene induced by Ergsiphe gramims in H. villosa.Journal of Triticeae Crops. 2006, 26 (5) :27 32”中公開過,公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。方法與實驗⑴中所述基本相同，不同的是所用的小麥品種是小麥品種小麥ー簇毛麥易位系6VS/6AL(含Pm21)。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入載體pUbi_TaWRKY2和載體p35S_GUS的小麥葉片的吸器指數(shù)為12. 57% ;轉(zhuǎn)入pGY-1和載體p35S-GUS的小麥葉片的吸器指數(shù)為13. 60% ;轉(zhuǎn)入pUbi-HvffRKY2和載體p35S-GUS的小麥葉片的吸器指數(shù)為12. 62%。結(jié)果顯示，小麥葉片中過表達(dá)TaWRKY2后，吸器指數(shù)幾乎不變，說明Pm21介導(dǎo)的廣譜抗性不依賴于TaWRKY2。說明TaWRKY2的功能在廣譜抗性中沒有作用，可能在小種專化抗性中起作用。
權(quán)利要求
1.一種蛋白，是如下a)或b)的蛋白質(zhì) a)由SEQID NO 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； b)將SEQID NO :I所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與白粉病抗性相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求I所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因為如下I)或2)或3)所示 1)其核苷酸序列是SEQID NO 2所示DNA分子； 2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子； 3)與I)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。
4.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因全長或其任意片段的引物對。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的引物對，其特征在于所述引物對中的一條引物序列如SEQID NO 3所示，所述引物對中的另一條引物序列如SEQ ID NO 4所示。
6.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組病毒或表達(dá)盒。
7.權(quán)利要求I所述蛋白或權(quán)利要求2或3中所述編碼基因在調(diào)節(jié)植物對白粉病的抗性中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述白粉病為大麥白粉病或小麥白粉??；所述植物為大麥或小麥。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于所述大麥白粉病由大麥白粉病菌引起的，所述小麥白粉病由小麥白粉病菌弓I起的。
全文摘要
本發(fā)明公開了與抗白粉病相關(guān)的蛋白TaWRKY2及其編碼基因。該蛋白質(zhì)是如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)由SEQ ID NO1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將SEQ IDNO1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與白粉病抗性相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。實驗證明，實驗證明，本發(fā)明基因?qū)π←溁虼篼湹目拱追鄄⌒阅苁沁M(jìn)行負(fù)調(diào)控的。本發(fā)明基因在小麥育種方面將有廣闊的應(yīng)用前景，在保證小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)方面具有重要的意義。
文檔編號C12N7/01GK102649811SQ20111004497
公開日2012年8月29日 申請日期2011年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月24日
發(fā)明者劉敏, 沈前華, 王秋韞, 韓新運 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所