專利名稱：大麥木糖異構(gòu)酶基因的功能及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大麥木糖異構(gòu)酶基因轉(zhuǎn)化木糖為木酮糖的功能，本發(fā)明還涉及含該基因的重組質(zhì)粒及工程菌株，以及用該工程菌通過(guò)發(fā)酵含有木糖的培養(yǎng)基制備こ醇和其他發(fā)酵產(chǎn)物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物的木質(zhì)纖維素中可發(fā)酵糖主要為葡萄糖和木糖，后者占木質(zhì)纖維素的25%。但是，大部分能夠發(fā)酵葡萄糖以制備こ醇的酵母(如釀酒酵母)不能夠以木糖作為碳源。如果能夠?qū)⒅参锏哪举|(zhì)纖維素中的木糖異構(gòu)化，生成木酮糖，木糖就可以作為碳源進(jìn)行こ醇發(fā)酵。而若能找到高效的木糖異構(gòu)酶(D-xylose isomerase, XI),催化五碳糖D-木糖轉(zhuǎn)化 為D-木酮糖，便可達(dá)到此目的?，F(xiàn)有技術(shù)的木糖異構(gòu)酶基因多來(lái)自于微生物。如Escherichia coli, Bacillussubtilis,Thormotoga species,Thermus species等等。但迄今為止只有少數(shù)幾種且多為嗜熱細(xì)菌的木糖異構(gòu)酶基因在こ醇生產(chǎn)傳統(tǒng)菌株釀酒酵母中得到活性表達(dá)，而且在30°C左右的こ醇發(fā)酵溫度下普遍由于活性太低而成為木糖代謝途徑的限速步驟。因此，發(fā)現(xiàn)新的可在釀酒酵母里高效表達(dá)的木糖異構(gòu)酶，提供能夠轉(zhuǎn)化木糖生成木酮糖的酵母工程菌，井能克服現(xiàn)有技術(shù)的限制，即在30°C左右的こ醇發(fā)酵溫度下具有足夠的酶活，很有必要。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從大麥中篩選出新的木糖異構(gòu)酶基因，并將該基因?qū)脶劸平湍福顾玫降慕湍高z傳工程菌獲得將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的能力。本發(fā)明人通過(guò)分析數(shù)據(jù)庫(kù)大麥基因組序列的方式，首次從大麥基因組序列中發(fā)現(xiàn)了具有木糖異構(gòu)化功能的基因(GenBank NO. X95257)，并將其命名為“大麥木糖異構(gòu)酶基因”。并通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的木糖異構(gòu)酶在宿主細(xì)胞中表達(dá)后，賦予宿主細(xì)胞將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的能力。現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)僅在轉(zhuǎn)錄水平上證實(shí)了基因(GenBank NO. X95257)的存在，但未公開(kāi)過(guò)其所具有的任何功能，以及可利用該基因做何種用途的研發(fā)。本發(fā)明構(gòu)建了具有大麥木糖異構(gòu)酶基因的重組質(zhì)粒，并將該質(zhì)粒導(dǎo)入了釀酒酵母中，獲得了一種新的酵母工程菌。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，原來(lái)不具備轉(zhuǎn)化木糖為木酮糖的能力的釀酒酵母賦予了該轉(zhuǎn)化能力。本發(fā)明進(jìn)行了如下具體工作I.提取大麥mRNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，用保守引物克隆得大麥木糖異構(gòu)酶基因，其大小為1443bp。2.將大麥木糖異構(gòu)酶基因片段連接到PYES2質(zhì)粒載體中，構(gòu)建具有完整木糖異構(gòu)酶基因的重組質(zhì)粒pYES-WXI。
3.將含大麥木糖異構(gòu)酶基因的重組質(zhì)粒pYES-WXI通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入不具將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的能力的釀酒酵母中，獲得能夠?qū)⒛咎寝D(zhuǎn)化為木酮糖的遺傳工程酵母菌株W(詳見(jiàn)實(shí)施例5)。因此本發(fā)明的木糖異構(gòu)酶基因有益效果是大麥木糖異構(gòu)酶基因賦予宿主細(xì)胞將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的能力。且大麥木糖異構(gòu)酶基因工程菌株的木糖利用率可達(dá)51. 78 %，大大高于對(duì)照菌株(詳見(jiàn)實(shí)施例6)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中所舉的質(zhì)粒、菌株只是用于對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)說(shuō)明，并不對(duì)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容加以限制。實(shí)際上，用本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的基因和方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以得到其它多種具有將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖能力的遺傳工程菌株，均不能脫離本發(fā)明的精神和思路。以下實(shí)施例中未作具體說(shuō)明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)J.薩姆布魯克ー書(shū)中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。試驗(yàn)材料和試劑I、菌株及載體釀酒酵母表達(dá)載體pYES2購(gòu)自Invitrogen公司，釀酒酵母菌株CEN.PK113- (表型為MatA ura3_52)及大腸桿菌DH5 a由所在實(shí)驗(yàn)室保存。2、酶類及其它生化試劑內(nèi)切酶及連接酶購(gòu)自NEB公司，其它試劑如未作具體說(shuō)明都為國(guó)產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購(gòu)買(mǎi)得到)。3、培養(yǎng)基(I)大腸桿菌培養(yǎng)基LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl，pH7.0)；(2)酵母培養(yǎng)基YPD(1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖，平板添加2%瓊脂);(3)選擇培養(yǎng)基SC(0. 67% YNB、2%葡萄糖，平板添加2%瓊脂)。實(shí)施例I獲取大麥cDNA(一 )植物總 RNA 提取-Trizol 法I、將組織在液氮中磨成粉末后，取50_100mg組織，加入ImlTrizol液研磨，注意樣品總體積不能超過(guò)所用Trizol體積的10%。2、研磨液室溫放置5min,然后加入0. 2ml氯仿,蓋緊離心管,用手劇烈搖蕩離心管15s03、取上層水相于一新的離心管，加入0. 5ml異丙醇，室溫放置lOmin，12000g離心IOmin04、棄去上清液,加入1111175%こ醇，潤(rùn)旋混勻，4°C下7500g離心5min。5、小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10min，注意不要干燥過(guò)分，否則會(huì)降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時(shí)可55°C _60°C水溶IOmin。RNA可進(jìn)行mRNA分離，或貯存于70 %こ醇并保存于_70°C。(ニ)mRNA 提取由于mRNA末端含有多poly⑷+,當(dāng)總RNA流經(jīng)oligo(dT)纖維素時(shí),在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在OI igo (dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經(jīng)過(guò)兩次oligo (dT)纖維素柱，可得到較純的mRNA。I、用 0. IMNaOH 懸浮 0. 5-1. Og oligo (dT)纖維素。2、將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經(jīng)DEPC處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為0. 5-1. 0ml，用3倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床。3、用IX柱層析加樣緩沖液沖洗柱床，直到流出液的pH值小于8. O。
4、將(一)中提取的RNA液于65°C溫育5min后迅速冷卻至室溫，加入等體積2 X柱層析緩沖液,上樣,立即用滅菌試管收集洗出液,當(dāng)所有RNA溶液進(jìn)入柱床后，加入I倍柱床體積的IX層析柱加樣溶液。5、測(cè)定每一管的OD26tl,當(dāng)洗出液中OD26tl為0時(shí)，加入2_3倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。6、測(cè)定OD26tl,合并含有RNA的洗脫組分。7、加入1/10體積的3MNaAc (pH5. 2)，2. 5倍體積的冰冷こ醇，混勻，_20°C 30min。8、4°C下12000g離心15min,小心棄去上清液,用70%こ醇洗漆沉淀,4°C下12000g離心5min。9、小心棄去上清液,沉淀空氣干燥IOmin,或真空干燥lOmin。10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成(或保存在70 %こ醇中并貯存于-70 0C )。(三)反轉(zhuǎn)錄生成cDNAI、在冰浴的試管中加入如下反應(yīng)混合物模板RNA 1-5 U g 總 RNA (DNase 處理后)引物oligo(dT)無(wú)RNA 酶去離子水(RNase-free ddH20):定容至 12 U I。2、輕輕混勻后離心3_5s。反應(yīng)混合物在70°C水浴5min后，冰浴30s，然后離心3
5s03、將試管冰浴，再加入如下組分5 X Reaction Buffer 4 U IRNasin (20U/U I) 1 U IdNTP mix(IOmM) 2u I4、輕輕混勻后離心3-5s。37°C水浴5min，加入I iilMMLV(20U/yl)，終體積為20 u I。5、反應(yīng)混合物37°C水浴60min。在70°C加熱IOmin結(jié)束反應(yīng)，置冰上進(jìn)行后續(xù)實(shí)
驗(yàn)或冷凍保存。實(shí)施例2木糖異構(gòu)酶基因的序列用保守引物從反轉(zhuǎn)錄得到的大麥cDNA中克隆到ー個(gè)約I. 5kb的片段，測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)含有ー個(gè)1443bp的ORF序列，比對(duì)證實(shí)是大麥的木糖異構(gòu)酶基因(GenBank登錄號(hào)X95257)。DNA測(cè)序由上海生エ生物公司完成，核苷酸和氨基酸分析軟件主要為DNAMAN和美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/, National CenterforBiotechnology Information, NCBI)的 Blast 程序。
實(shí)施例3木糖異構(gòu)酶基因表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建用編碼大麥木糖異構(gòu)酶的基因的5’和3’端序列設(shè)計(jì)引物，包括Mfe I和xba I位點(diǎn)。用Mfe I和xba I酶切PCR產(chǎn)物。終產(chǎn)物被克隆到由pYES2產(chǎn)生的載體上。在該載體中，pYES2上的GAU啟動(dòng)子用TPIl啟動(dòng)子替換來(lái)確保木糖異構(gòu)酶的組成型表達(dá)，從而消除培養(yǎng)基中對(duì)半乳糖的需求。TPIl啟動(dòng)子從釀酒酵母基因組克隆得到。該啟動(dòng)子被酶切成Nhe I-EcoR I片段。TPIl啟動(dòng)子和木糖異構(gòu)酶的編碼基因的PCR產(chǎn)物都被連接到用Spe I和Xba I剪切的pYES2上，最終得到含木糖異構(gòu)酶基因的重組質(zhì)粒pYES-WXI。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化I)感受態(tài)細(xì)胞的制備(氯化鈣轉(zhuǎn)化法)①?gòu)幕罨拇竽c桿菌(E. coli)BL21平板上挑取單菌落接種到含5ml的LB液體培 養(yǎng)基的試管中，37°C振蕩培養(yǎng)2. 5h至3h使菌液的0D_值達(dá)到0. 4至0. 6，冰上冷卻培養(yǎng)物至(TC②將培養(yǎng)物倒入無(wú)菌的I. 5ml的離心管中③4°C, 4000rpm 離心 IOmin④棄上清，收集菌體⑤用預(yù)冷的0. 5ml的0. IM的CaCl2重懸菌體,離心,棄上清⑥用預(yù)冷的0. 5ml的0. IM的CaCl2重懸菌體，冰浴15min，離心，棄上清⑦加入200 U I的預(yù)冷的0. IM的CaCl2重懸菌體，冰浴放置2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞①取0. 5ul質(zhì)粒加于一管感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，冰上放置30min②將離心管置于42°C水浴中熱激90s，不要晃動(dòng)離心管③迅速將離心管置于冰上，冷卻2min④加入800ul的LB液體培養(yǎng)基，37°C，200rpm搖床培養(yǎng)45min⑤取50ul的培養(yǎng)液涂布于含氨芐青霉素(50 u g/ml)的LB固體平板上，37°C培養(yǎng)12至16小時(shí)，檢查轉(zhuǎn)化菌落⑥挑選單菌落，接種到含5ml的LB液體培養(yǎng)基的試管中，37°C振蕩培養(yǎng)提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證為正確的轉(zhuǎn)化子，然后測(cè)序證明含有木糖異構(gòu)酶基因。實(shí)施例4工程菌株的構(gòu)建將含木糖異構(gòu)酶基因的重組質(zhì)粒pYES-WXI經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入不具將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖能力的釀酒酵母CEN. PK113-5D中，在以2%葡萄糖作為碳源的SC培養(yǎng)基平板上篩選轉(zhuǎn)化子。未被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不能在這些平板上生長(zhǎng)。PCR鑒定證明W轉(zhuǎn)化子含有帶大麥木糖異構(gòu)酶基因的質(zhì)粒。釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化I)酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備(電擊轉(zhuǎn)化法)①在含5mlYPD的50ml離心管中，培養(yǎng)釀酒酵母，30°C過(guò)夜②取0. 1-0. 5ml過(guò)夜培養(yǎng)物，接種含500ml新鮮培養(yǎng)基的2L搖瓶，過(guò)夜生長(zhǎng)至OD600 = I- 3-1. 5③在4°C，1500g離心5min收集細(xì)胞，用500ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細(xì)胞④如上離心，用250ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細(xì)胞
⑤如上離心，用20ml預(yù)冷的IM山梨醇懸浮細(xì)胞⑥如上離心，用Iml預(yù)冷的IM山梨醇懸浮細(xì)胞，至終體積約I. 5ml注意可凍存80ul等量的電感受態(tài)細(xì)胞，但轉(zhuǎn)化效率會(huì)下降很多2)質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞①取80ul上述細(xì)胞與5-20ug線性化DNA (溶于5-10ulTE)混合，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0. 2cm電轉(zhuǎn)杯中。②在冰上放置5min③根據(jù)所使用裝置推薦的釀酒酵母參數(shù)進(jìn)行電擊④立即加入Iml預(yù)冷的IM山梨醇至杯中，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至滅菌離心管中 ⑤分成200-600ul等份，涂于SC平板上⑥在30度孵育平板至克隆產(chǎn)生，PCR鑒定證明轉(zhuǎn)化子W含有帶大麥木糖異構(gòu)酶基因的質(zhì)粒pYES-WXI。實(shí)施例5工程菌株木糖異構(gòu)酶酶活的測(cè)定I、實(shí)驗(yàn)對(duì)象實(shí)驗(yàn)菌株含pYES-WXI釀酒酵母重組菌株W ；對(duì)照菌株含pYES2空載體的釀酒酵母菌株。2、實(shí)驗(yàn)方法在以葡萄糖/木糖的混合物為唯一碳源的衡化培養(yǎng)生長(zhǎng)，分別測(cè)定對(duì)照菌株和含PYES-WXI釀酒酵母重組株W的木糖異構(gòu)酶酶活。酶活的測(cè)定按如下方法進(jìn)行適當(dāng)釀酒酵母細(xì)胞破碎后的上清液(通過(guò)OD595測(cè)定調(diào)整為總蛋白量一致)IOOmMTris-HCl pH7. 0 緩沖液，IOmMMgCl2, 2U SDH (山梨醇脫氫酶，Roche 公司)和
0.15mMNADH(還原型煙胺酸腺嘌呤二核苷酸，Roche公司)，混勻，500mM的木糖啟動(dòng)反應(yīng)，30°C、340nm下檢測(cè)NADH被氧化的量(即在340nm做時(shí)間掃描)。木糖異構(gòu)酶(XI)的ー個(gè)酶活單位(U)定義為每分鐘轉(zhuǎn)化I U mo I底物。3、具體操作過(guò)程①分別挑取單菌落接種在20ml的SC培養(yǎng)液中，30°C 200rpm搖培48h ；②1600g 離心 5min,棄上清，沉淀用 IOmM pH7. 5 的 potassium-phosphatebuffer(含 2mM EDTA)洗兩次；③重懸于IOOmM pH 7. 5 的 potassium-phosphate buffer(2mM MgCl2 和ImMdithiothreitoI)；④超聲破碎，4度36000g離心20min，上清用做酶活分析和總蛋白測(cè)定。4、測(cè)定結(jié)果對(duì)照菌株未測(cè)出木糖異構(gòu)酶酶活；含pYES-WXI釀酒酵母重組株木糖異構(gòu)酶酶活測(cè)定為0. 52U/mg總蛋白。5、結(jié)論大麥木糖異構(gòu)酶基因編碼的木糖異構(gòu)酶在釀酒酵母中表達(dá)后，賦予宿主細(xì)胞將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的能力。實(shí)施例6工程菌株木糖利用的測(cè)定I、實(shí)驗(yàn)對(duì)象
實(shí)驗(yàn)菌株含pYES-WXI釀酒酵母重組菌株W ；對(duì)照菌株含pYES2空載體的釀酒酵母菌株。2、實(shí)驗(yàn)方法在以葡萄糖/木糖的混合物(初始濃度分別為5. Og/L和7. 5g/L)為卩隹一碳源的衡化培養(yǎng)生長(zhǎng)，30°C 200rpm搖培48h，高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定上清葡萄糖和木糖含量，推算糖利用效率。3、結(jié)果
測(cè)試結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)48h培養(yǎng)，重組菌株W培養(yǎng)基的葡萄糖幾乎完全利用完，木糖利用率達(dá)到51.78% ;對(duì)照菌株培養(yǎng)基的葡萄糖幾乎完全利用完，木糖利用率僅達(dá)到
3.02%。4、結(jié)論大麥木糖異構(gòu)酶基因工程菌株的木糖利用率大大高于對(duì)照菌株。
權(quán)利要求
1.大麥木糖異構(gòu)酶基因(GenBankNO. X95257)的用途，其編碼的木糖異構(gòu)酶在宿主細(xì)胞中表達(dá)后，賦予宿主細(xì)胞將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的能力。
2.權(quán)利要求I所述的用途，所述宿主細(xì)胞是釀酒酵母。
3.含大麥木糖異構(gòu)酶基因的重組質(zhì)粒，是大麥木糖異構(gòu)酶基因(GenBankNO. X95257)連接到在釀酒酵母中具有表達(dá)特性的質(zhì)粒中。
4.權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒，所述具有表達(dá)特性的質(zhì)粒是釀酒酵母表達(dá)載體PYES2。。
5.ー種酵母工程菌，含有權(quán)利要求3或4所述的重組質(zhì)粒。
6.權(quán)利要求5所述酵母工程菌的用途，是轉(zhuǎn)化木糖生成木酮糖。
7.權(quán)利要求5所述酵母工程菌的用途，是通過(guò)發(fā)酵含有木糖的物質(zhì)制備こ醇和其他發(fā)酵產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了來(lái)自大麥的基因具有木糖異構(gòu)酶功能，可轉(zhuǎn)化木糖為木酮糖。本發(fā)明構(gòu)建了包含該基因的重組質(zhì)粒，并將該質(zhì)粒導(dǎo)入釀酒酵母中，獲得了一種新的酵母工程菌。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，將木糖異構(gòu)酶基因在宿主細(xì)胞及表達(dá)后，原來(lái)不具備轉(zhuǎn)化木糖為木酮糖的能力的釀酒酵母獲得了該轉(zhuǎn)化能力。
文檔編號(hào)C12N15/61GK102643845SQ20111004194
公開(kāi)日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2011年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月21日
發(fā)明者李桂英, 王智, 路明, 頓寶慶 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所