專利名稱：一種動物dna提取的細胞裂解液、試劑盒和方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及DNA提取技術(shù)領域，具體涉及一種動物DNA提取的細胞裂解液、試劑盒 和方法。
背景技術(shù)：
自20世紀50年代Watson和Crick提出DNA雙螺旋模型以來，分子生物學在廣度 和深度上都獲得了空前的發(fā)展。我們對分子領域的研究已經(jīng)滲透到生物學、醫(yī)學、遺傳學和 動物學等各個方面，基因組DNA的提取是分子生物學研究的一項最基礎技術(shù)，是后續(xù)試驗 成功的保證(參見《雞基因組DNA不同提取方法的比較研究》，馬新紅等；江西農(nóng)業(yè)大學學 報，2010. 32(001) :p. 181-184)。同時，采用活體采血繼而從血液中提取DNA，可以在不殺死 動物的前提下對其基因組DNA進行多態(tài)性研究和早期選育，對于遺傳育種工作者來講是很 好的有利工具?，F(xiàn)在伴隨著高通量測序，各種基因芯片的大量上市，對于科研工作來講，需要大規(guī) 模的提取DNA，并且芯片對DNA的質(zhì)量提出了很高的要求，許多常用的基因組DNA提取方法 已經(jīng)不能很好的適應這種要求。目前基因組DNA的提取方法較多，部分提取方法因使用大量的氯仿，對實驗人員 的身心健康埋下了隱患。常用的DNA提取方法有酚-氯仿法、高鹽法、硫氰酸胍/酚法、酚 /SDS(十二烷基硫酸鈉)法、鹽酸胍法、蒸煮法和目前公認DNA提取效果最干凈的試劑盒法。 但是，試劑盒提取DNA兩大缺點為1)價格昂貴不適用于大量提取DNA ；幻提取物中DNA量 少且含量較低，一般不到100 μ 1，DNA濃度在20 50ng/ μ 1，比較適合后續(xù)的PCR擴增實 驗，但難以滿足做芯片的最低要求(至少50ng/y 1，50μ 1)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于動物DNA提取的細胞裂解液、含有該裂解液的試 劑盒及使用該試劑盒提取動物DNA的方法，用以解決現(xiàn)有動物DNA提取方法成本高、提取物 中DNA含量少且品質(zhì)較差的問題。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一種動物DNA提取的細胞裂解液、試劑盒和方法，優(yōu)化了 現(xiàn)有動物DNA提取的細胞裂解液、試劑盒和方法；該方法快速簡便、經(jīng)濟高效且重復性強； 避免使用毒性氣味較高的氯仿，從而減少了操作過程中對操作人員健康的損害。具體地，本 發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種用于動物DNA提取的細胞裂解液，其包括Tris-base20 30g/L、EDTA0. 5 1. 0g/L、SDS 20 30g/L、NaCl 5 10g/L 和尿素 100 150g/L，余量為無菌水，用 NaOH 調(diào) pH 值，pH8. 0 9. 0 ；所述裂解液中優(yōu)選 Tris-base 24g/L, EDTA 0. 7g/L、SDS 24g/L, NaCl 7. 52g/L 和尿素 120g/L。含有上述細胞裂解液的動物DNA提取試劑盒。進一步地，所述試劑盒還包括0. 5g/ml的鹽酸胍緩沖液、20mg/ml的蛋白酶K溶液和CB3吸附柱。使用上述試劑盒提取動物DNA的方法，其包括如下步驟1)取A⑶抗凝的血液樣品或搗碎的組織樣于離心管中，加入45°C預熱的所述裂解 液，反復吹打混勻，加入所述鹽酸胍緩沖液，再加入所述蛋白酶K溶液，顛倒混勻3 5min， 放入56°C水浴或金屬浴2. 5 30h，優(yōu)選16 Mh，期間將離心管中混合液顛倒數(shù)次；2)再向上述離心管中加入0. 8 1. 2倍上述混合液體積的飽和酚，旋轉(zhuǎn)混合5min 使其完全混勻，12000 13000r/min離心5 6min，此時中間層和下層水相被固定，上層水 相即上清液；3)將上述上清液倒入另一干凈離心管中，加入0.8 1.2倍該上清液體積 的-20°C預冷異丙醇，緩慢搖動離心管lmin，可見有白色或淡黃色的絮狀或絲狀物質(zhì)，將該 含絮狀或絲狀物的水相倒入置于另一干凈離心管內(nèi)的CB3吸附柱中，12000 13000r/min 離心3min，倒掉管中廢液，將CB3吸附柱放回管內(nèi)；4)向上述離心管內(nèi)CB3吸附柱中加入0. 8 1. 2ml的_20°C預冷95%乙醇，倒掉 管中廢液，將該吸附柱放回管內(nèi)，換用0. 8 1. 2ml的-20°C預冷72%乙醇加入該吸附柱以 12000 13000r/min離心3min，倒掉管中廢液，將該吸附柱放回管內(nèi)；5)將該離心管置于真空干燥器或35°C烘箱中，干燥其中的DNA沉淀物，向該離心 管內(nèi)CB3吸附柱中加入100 200 μ 1 40°C預熱的洗脫緩沖液TE，充分溶解DNA至少2h，期 間顛倒數(shù)次，12000 13000r/min離心lmin，洗脫含DNA的溶液于離心管中，取出吸附柱， 然后將裝有DNA溶液的離心管于_20°C冰箱中長期保存。根據(jù)本發(fā)明，所述A⑶抗凝的血液樣品樣品與裂解液的體積比為1 35 70，所 述A⑶抗凝的血液樣品與鹽酸胍緩沖液的體積比為1 4 8，所述A⑶抗凝的血液樣品與 所述蛋白酶K溶液的體積比為1 1 2。進一步地，上述A⑶抗凝的血液用量可為10 20 μ 1。根據(jù)本發(fā)明，所述搗碎的組織樣與裂解液的質(zhì)量體積比為Ig 250 300μ 1，所 述搗碎的組織樣與鹽酸胍緩沖液的質(zhì)量體積比為Ig 30 40μ1，所述搗碎的組織樣與蛋 白酶K溶液的質(zhì)量體積比為Ig 5 8μ1。進一步地，上述組織樣可為肌肉組織、肝臟組織或心臟組織。還進一步地，上述述組織樣的用量可為2 3g。本發(fā)明具有如下優(yōu)點1)細胞裂解液中添加適量NaCl、尿素和NaOH，更有利于細胞裂解，提取DNA的效果 更佳，并且縮短提取時間至少半小時；2)簡化操作步驟，本發(fā)明提取方法步驟2、中產(chǎn)生的上清液可直接倒出，避免了用 移液槍吸取上清液，簡單快捷，節(jié)省工時、節(jié)約槍頭費用；3)避免使用毒性氣味較高的氯仿，減小對操作人員的健康傷害；4)提取物中DNA產(chǎn)量高、含量也較高，特別是結(jié)合了 CB3吸附柱的使用，使DNA中 的蛋白質(zhì)和鹽去除得很干凈，提高了所提取DNA的品質(zhì)；5)結(jié)果相當穩(wěn)定，成功率高，適合大規(guī)模提取DNA ；6)成本略高于經(jīng)典的酚-氯仿法，大批量提取DNA時，成本和酚-氯仿法差不多， 但遠遠低于現(xiàn)有的試劑盒法。
圖1為相同樣品以不同提取方法獲得的DNA提取物0. 8%瓊脂糖電泳檢測效果圖； 其中1、2、3孔為酚-氯仿法(比較例1)提取的DNA，4、5、6孔為現(xiàn)有的試劑盒法(比較例 2)提取的DNA，7、8、9孔為本發(fā)明方法(實施例5)提取的DNA，10孔為空白對照。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。實施例1按照以下配方制備提取動物DNA的細胞裂解液Tris-base 24g/L、EDTA 0. 7g/L、SDS 24g/L、NaCl 7. 52g/L、尿素 120g/L，余量為 無菌水，用NaOH調(diào)pH值至8. 0。實施例2按照以下配方制備提取動物DNA的細胞裂解液Tris-base 20g/L、EDTA 1. 0g/L、SDS 30g/L、NaCl 5g/L、尿素 150g/L，余量為無菌 水，用 NaOiHMpH 值至 8. 5。實施例3按照以下配方制備提取動物DNA的細胞裂解液Tris-base 30g/L、EDTA 0. 5g/L、SDS 20g/L、NaCl 10g/L、尿素 100g/L，余量為無 菌水，用NaOH調(diào)pH值至9. 0。實施例4按照以下配方制備動物DNA提取的試劑盒實施例1的細胞裂解液，0. 5g/ml的鹽酸胍緩沖液，20mg/ml的蛋白酶K溶液，飽和 酚，異丙醇，95%乙醇，72%乙醇，洗脫緩沖液TE溶液，2ml離心管和CB3吸附柱。實施例5使用實施例4的試劑盒按照以下步驟提取動物DNA 1)對于200只二郎山山地雞(一個地方品種，生長在四川天全縣二郎山)的200 個血液樣本，分別用微量加樣槍取A⑶抗凝的血液10 μ 1于2ml離心管中，加入45°C預熱的 裂解液690 μ 1，用加樣槍反復吹打混勻，加入0. 5g/ml的鹽酸胍緩沖液70 μ 1，再加入20mg/ ml的蛋白酶K溶液15 μ 1，顛倒混勻3min，放入56°C水浴過夜，期間將離心管顛倒數(shù)次；2)再向上述離心管中加入飽和酚625 μ 1，旋轉(zhuǎn)混合5min使其完全混勻，12500r/ min離心5min，此時中間層和下層水相被固定，短時間如，20min內(nèi)不會流動，所以可直接將 上層水相(500 900 μ 1)即上清液倒出，該上清液可直接用作PCR反應的DNA樣品；3)將上述上清液倒入另一干凈2ml離心管中，加入_20°C預冷的異丙醇1ml，緩慢 搖動離心管lmin，可見有白色或淡黃色的絮狀或絲狀物質(zhì)，將該含絮狀或絲狀物的水相倒 入置于另一干凈2ml離心管內(nèi)的CB3吸附柱中(購自天根生化科技(北京)有限公司)， 12500r/min離心3min，倒掉管中廢液，將CB3吸附柱放回管內(nèi)；
4)向上述離心管內(nèi)CB3吸附柱中加入_20°C預冷的95%乙醇1ml，倒掉管中廢液， 將該吸附柱放回管內(nèi)，換用-20°C預冷的72%乙醇Iml加入該吸附柱以12500r/min離心 3min，倒掉管中廢液，將該吸附柱放回管內(nèi)；5)將該離心管置于真空干燥器或35°C烘箱中，干燥其中的DNA沉淀物，向離心管 內(nèi)CB3吸附柱中加入40°C預熱的洗脫緩沖液TE100 μ 1，充分溶解DNA至少2h，期間顛倒數(shù) 次，12000r/min離心lmin，洗脫含DNA的溶液于離心管中，取出吸附柱，然后將裝有DNA溶 液的離心管于_20°C冰箱中長期保存。實施例6使用實施例4的試劑盒按照以下步驟提取動物DNA 1)對于200只二郎山山地雞的200個胸肌組織樣，分別取2g，加入45°C預熱的裂 解液690 μ 1，盡力搗碎，用加樣槍反復吹打混勻，加入0. 5g/ml的鹽酸胍緩沖液70 μ 1，再加 入20mg/ml的蛋白酶K溶液15 μ 1，顛倒混勻5min，放入56°C金屬浴過夜，期間將離心管顛 倒數(shù)次；2)再向上述離心管中加入飽和酚625 μ 1，旋轉(zhuǎn)混合5min使其完全混勻，13000r/ min離心6min，此時中間層和下層水相被固定，短時間如20min內(nèi)不會流動，所以可直接將 上層水相(500 900 μ 1)即上清液倒出，該上清液可直接用作PCR反應的DNA樣品；3)將上述上清液倒入另一干凈2ml離心管中，加入_20°C預冷的異丙醇1ml，緩慢 搖動離心管lmin，可見有白色或淡黃色的絮狀或絲狀物質(zhì)，將該含絮狀或絲狀物的水相倒 入置于另一干凈2ml離心管內(nèi)的CB3吸附柱中(購自天根生化科技(北京)有限公司)， 12000r/min離心3min，倒掉管中廢液，將CB3吸附柱放回管內(nèi)；4)向上述離心管內(nèi)CB3吸附柱中加入_20°C預冷的95%乙醇1ml，倒掉管中廢液， 將該吸附柱放回管內(nèi)，換用-20°C預冷的72%乙醇Iml加入該吸附柱以13000r/min離心 3min，倒掉管中廢液，將該吸附柱放回管內(nèi)；5)將該離心管置于真空干燥器或35°C烘箱中，干燥其中的DNA沉淀物，向離心管 內(nèi)CB3吸附柱中加入40°C預熱的洗脫緩沖液TE200 μ 1，充分溶解DNA至少2h，期間顛倒數(shù) 次，13000r/min離心lmin，洗脫含DNA的溶液于離心管中，取出吸附柱，然后將裝有DNA溶 液的離心管于_20°C冰箱中長期保存。比較例1對于200只二郎山山地雞的200個血液樣本，分別使用酚-氯仿法提取DNA (參見 《外周血基因組DNA提取方法比較》，閆曉華，高立芬，續(xù)力云；山東醫(yī)學高等?？茖W校學報， 2008. 30(003) :p. 175-177)。比較例2對于200只二郎山山地雞的200個血液樣本，分別使用現(xiàn)有的試劑盒法進行基因 組DNA提取，試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，嚴格按照說明操作。實驗例 對于上述實施例5、比較例1和比較例2所得到的DNA提取物進行DNA質(zhì)量檢測1)紫外分光光度計測定OD值由于DNA在^Onm處有最大的吸收峰，蛋白質(zhì)在^Onm處有最大的吸收峰，鹽和 小分子則集中在230nm處，故可用260nm波長進行分光測定DNA濃度；雙鏈DNA的^OnmOD值為1. 0時所對應的DNA濃度為50 μ g/ml (參見《禽類全血DNA不同提取方法的比較》，柯 柳玉等；福建畜牧獸醫(yī)，2008. 30 (002) :p. 4 6)。DNA純品的0D260/0D280為1. 8，故根據(jù) 0D260/0D280的值可以估計DNA的純度；優(yōu)質(zhì)DNA的0擬60/0擬80比值為1. 70 2. 0 (參見 《雞基因組DNA不同提取方法的比較研究》，馬新紅等；江西農(nóng)業(yè)大學學報，2010. 32 (001) p. 181-184)，若比值較高說明含有RNA，比值小于1. 80，說明存在蛋白質(zhì)或酚等雜質(zhì)(參見 《從雞血中提取高質(zhì)量DNA的研究》，王慧、陳永洪；中國家禽，1997 (002) :p. 5_7)。0D230/ 0D260比值應在0. 4 0. 5之間，若比值較高說明有殘余的鹽存在。根據(jù)所測樣本的OD值計算DNA純度(0D26Q/0D28Q比值)、DNA雜質(zhì)含量(ODaicZOD230 比值)和DNA濃度(50 μ g/ml X OD260 X稀釋倍數(shù)/1000)，并用Excel建立數(shù)據(jù)庫，利用SAS 8. 0對DNA含量做單因素方差分析，結(jié)果如下表1 同一血樣不同提取方法結(jié)果比較
權(quán)利要求
1.一種用于動物DNA提取的細胞裂解液，其包括Tris-base20 30g/L、EDTA0. 5 1. 0g/L、SDS 20 30g/L、NaCl 5 10g/L 和尿素 100 150g/L，余量為無菌水，用 NaOH 調(diào) PH值至8. 0 9. 0。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞裂解液，其特征在于，Tris-base24g/L、EDTA0.7g/L、SDS 24g/L、NaCl 7. 52g/L 和尿素 120g/L。
3.含有權(quán)利要求1或2所述細胞裂解液的動物DNA提取試劑盒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括0.5g/ml的鹽酸胍緩 沖液、20mg/ml的蛋白酶K溶液和CB3吸附柱。
5.使用權(quán)利要求4所述試劑盒提取動物DNA的方法，其特征在于，包括如下步驟1)取ACD抗凝的血液樣品或搗碎的組織樣于離心管中，加入45°C預熱的所述裂解液， 反復吹打混勻，加入所述鹽酸胍緩沖液，再加入所述蛋白酶K溶液，顛倒混勻3 5min，放入 56°C水浴或金屬浴2. 5 30h，期間將離心管中混合液顛倒數(shù)次；2)再向上述離心管中加入0.8 1. 2倍上述混合液體積的飽和酚，旋轉(zhuǎn)混合5min使其 完全混勻，12000 13000r/min離心5 6min ；3)將離心后的上清液直接倒入另一干凈離心管中，加入0.8 1.2倍該上清液體積 的-20°C預冷異丙醇，緩慢搖動離心管lmin，可見有白色或淡黃色的絮狀或絲狀物質(zhì)，將該 含絮狀或絲狀物的水相倒入置于另一干凈離心管內(nèi)的CB3吸附柱中，12000 13000r/min 離心:3min，倒掉管中廢液，將CB3吸附柱放回管內(nèi)；4)向上述離心管內(nèi)CB3吸附柱中加入0.8 1.2ml的_20°C預冷95%乙醇，倒掉管 中廢液，將該吸附柱放回管內(nèi)，換用0. 8 1. 2ml的-20°C預冷72%乙醇加入該吸附柱以 12000 13000r/min離心3min，倒掉管中廢液，將該吸附柱放回管內(nèi)；5)將該離心管置于真空干燥器或35°C烘箱中，干燥其中的DNA沉淀物，向該離心管內(nèi) CB3吸附柱中加入100 200 μ 1 40°C預熱的洗脫緩沖液TE，充分溶解DNA至少2h，期間顛 倒數(shù)次，12000 13000r/min離心lmin，洗脫含DNA的溶液于離心管中，取出吸附柱，然后 將裝有DNA溶液的離心管于_20°C冰箱中長期保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟1)中，裝有混合液的離心管放入 56 °C水浴或金屬浴16 24h。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述ACD抗凝的血液樣品與裂解液的體積 比為1 35 70，所述A⑶抗凝的血液樣品與鹽酸胍緩沖液的體積比為1 4 8，所述 A⑶抗凝的血液樣品與所述蛋白酶K溶液的體積比為1 1 2。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述A⑶抗凝的血液用量為10 20μ 1。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述搗碎的組織樣與裂解液的質(zhì)量體積 比為Ig 250 300 μ 1，所述搗碎的組織樣與鹽酸胍緩沖液的質(zhì)量體積比為Ig 30 40μ1，所述搗碎的組織樣與蛋白酶K溶液的質(zhì)量體積比為Ig 5 8μ1。
10.根據(jù)權(quán)利要求5或9所述的方法，其特征在于，所述組織樣為肌肉組織、肝臟組織或 心臟組織，所述組織樣用量為2 3g。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于動物DNA提取的細胞裂解液、含有該裂解液的試劑盒及使用該試劑盒提取動物DNA的方法。本發(fā)明提供的細胞裂解液中包含Tris-base 20～30g/L、EDTA0.5～1.0g/L、SDS20～30g/L、NaCl 5～10g/L和尿素100～150g/L，余量為無菌水，用NaOH調(diào)pH值至8.0～9.0。本發(fā)明提供的動物DNA提取試劑盒比現(xiàn)有技術(shù)縮短提取時間至少半小時，避免使用毒性氣味較高的氯仿，減少了操作過程中對操作人員健康的損害；而且提取的DNA產(chǎn)量高，純度好。本發(fā)明方法快速簡便、經(jīng)濟高效且重復性強；本發(fā)明結(jié)果相當穩(wěn)定，成功率高，降低了提取成本，適合大規(guī)模提取DNA。
文檔編號C12N15/10GK102146374SQ20111003017
公開日2011年8月10日 申請日期2011年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月27日
發(fā)明者蘭丹, 吳華莉, 朱慶, 胡耀東, 邱芙寒 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學