專利名稱：花器官發(fā)育基因NsAGL6及其植物表達(dá)載體和構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及睡蓮花器官發(fā)育基因NsAGL6及其植物表達(dá)載體和構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
AGL6是參與花分生組織的建成和花器官形成過程中的一類重要轉(zhuǎn)錄因子。目前已經(jīng)從玉米、矮牽牛、風(fēng)信子、水稻等植物中克隆到了 AGL6的同源基因，并對(duì)其功能進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn)，盡管這些植物的親緣關(guān)系不盡相同，但其AGL6基因都參與了花發(fā)育的調(diào)控。 這類基因的功能多集中于使植物提前開花和改變花器官形態(tài)、花部數(shù)目。AGL6類基因均含有高度保守的MADS結(jié)構(gòu)域，并且在表達(dá)模式上具有一定的相似性。但迄今為止對(duì)AGL6基因的功能尚未完全確定。睡蓮(Nymphaea ssp.)為睡蓮屬睡蓮科多年生水生植物，具有很高觀賞價(jià)值。由于花色艷麗，姿態(tài)優(yōu)美，花態(tài)各異、其品種資源十分豐富。通過克隆控制睡蓮花器官發(fā)育的關(guān)鍵基因，構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化其他植物，可培育出新花型、花期提前的植物新品種。在作物的遺傳轉(zhuǎn)化途徑中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是應(yīng)用最為廣泛的方法之一，其中有效的植物表達(dá)載體至關(guān)重要。將控制花發(fā)育的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化，使該轉(zhuǎn)錄因子在CaMV35S啟動(dòng)子的啟動(dòng)下超量表達(dá)，并調(diào)控下游目的基因的表達(dá)，改變植物形態(tài)建成，對(duì)于植物新品種的培育及在生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，具有重要意義。Coen ES, Meyerowitz EM. The war of the whorls :genetic interactions controlling flowerdevelopment. Nat μ re 1991 ；353 :31-37.Fan J, Li W,Dong X,Gu ο W, Sh μ H. Ectopic expression of a hyacinth AGL6 homolog caμ sedearlier lowering and ho meotic conversion in Arabidopsis. Sci China C Life Sci 2007 ；50 :676-689.Hs μ HF, H μ ang CH, Cho μ LT, Yang CH. Ectopic expression of an orchid (Oncidiμ m GowerRamsey)AGL6-1ike gene promotes lowering by activating lowering time genes in Arabidopsisthaliana. Plant Cell Physiol 2003 ；44 :783-794.Lee S，Jeon JS, An K，et al. Alteration of loral organ identity in rice through ectopic expressionof 0SmaDS16. Planta 2003 ；217 :904-911.Moon YH, Kang HG, Jung JY, Jeon JS, Sung SK, An G. Determination of the motifresponsible for interaction between the rice APETALA1/AGAMOMS-LIKE9 family proteins μ singa yeast two-hybrid system. Plant Physiol 1999 ；120 :1193-1204.Ohmori S，Kimiz μ M，S Pgita M，et al. MOSAIC FLORAL 0RGANSl,an AGL6-Like MADSbox gene, regμ lates loral organ identity and meristem fate in rice.Plant Cell 2009 ；21 :3008-3025.
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于為改良植物花型和花期，提供一個(gè)睡蓮花器官發(fā)育基因 NsAGL6，該基因的序列為SEQ ID NO. 1。本發(fā)明的另一目的在于提供睡蓮花器官發(fā)育基因NsAGL6的植物表達(dá)載體。本發(fā)明的又一目的在于提供睡蓮花器官發(fā)育基因NsAGL6植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法。所構(gòu)建的植物表達(dá)載體可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的作物遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)制新花型、花期提前的新種質(zhì)，可用于植物品種改良。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)睡蓮花器官發(fā)育基因NsAGL6，該基因的序列為SEQ ID NO. 1。睡蓮花器官發(fā)育基因NsAGL6的植物表達(dá)載體，由所述的睡蓮花器官發(fā)育基因 NsAGL6 與質(zhì)粒 pCAMBIA 1301-220 構(gòu)成。上述的睡蓮花器官發(fā)育基因NsAGL6的植物表達(dá)載體，該植物表達(dá)載體是由 NsAGL6基因連接到線性化的pCAMBIA 1301-220質(zhì)粒而得到的。睡蓮花器官發(fā)育基因NsAGL6植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟1)睡蓮花器官發(fā)育基因NsAGL6的克隆以睡蓮小花蕾為材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計(jì)引物并用高保真酶擴(kuò)增 NsAGL6 基因，上游引物NsAGL6_F :SEQ ID NO. 2下游引物NsAGL6-R :SEQ ID NO. 3以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)絇CR反應(yīng)，產(chǎn)物連接到pMD19_T Simple 載體，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行序列測定；2)植物表達(dá)載體 pCAMBIA 1301-220_NsAGL6 的構(gòu)建從T0P10 菌株中提取提取 pMD19-T Simple_NsAGL6 重組質(zhì)粒，BamH I 和 Sma I雙酶切后回收NsAGL6片段，再插入到經(jīng)BamH I和Sma I雙酶切得到的線性化的 PCAMBIA1301-220質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒，酶切電泳檢測并測序驗(yàn)證， 植物表達(dá)載體pCAMBIA 1301-220-NsAGL6構(gòu)建成功。將NsAGL6基因的植物表達(dá)載體用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化，方法如下(1) 農(nóng)桿菌菌株EHA105感受態(tài)制備及凍融法轉(zhuǎn)化；(2)擬南芥花序浸染及種子篩選；(3) PCR鑒定及植物形態(tài)觀察。本發(fā)明的有益效果1.本發(fā)明提供的睡蓮花器官發(fā)育基因NsAGL6基因是一個(gè)新的花發(fā)育基因，該基因可調(diào)控植物開花和花器官發(fā)育。2.本發(fā)明構(gòu)建的睡蓮花器官發(fā)育基因NsAGL6基因植物表達(dá)載體為首次報(bào)道，可直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，改良植物花型和花期。
圖1NSAGL6瓊脂糖凝膠電泳分析 M=DNAMarker(2Kb/l. 5Kb/lKb/0. 75Kb/0. 5Kb/0. 3Kb/0. 1Kb)
1 :NsAGL6開放閱讀框擴(kuò)增；2 :pMD 19-T Simple_NsAGL6 質(zhì)粒 Sma I 和 BamH I 雙酶切；3 :pCAMBIA 1301-220_NsAGL6 表達(dá)載體 Sma I 和 BamH I 雙酶切檢測2植物表達(dá)載體pCAMBIA 1301-220_NsAGL6的構(gòu)建過程示意圖。圖3野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR鑒定。圖4植物表達(dá)載體pCAMBIA 1301-220_NsAGL6導(dǎo)致擬南芥提前開花。圖5植物表達(dá)載體pCAMBIA 1301-220_NsAGL6導(dǎo)致擬南芥花瓣排列的改變。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1植物表達(dá)載體pCAMBIA 1301-220_NsAGL6的構(gòu)建1. NsAGL6 的克隆選用睡蓮栽培種‘黃公主，(Nymphaea sp. cv. ‘Yellow Prince')作為材料，提取花蕾總RNA，按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)取1 μ g總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RNase消化cDNA產(chǎn)物，參照睡蓮NsAGL6序列信息(NCBI登錄號(hào)ΑΒ495;Μ0，經(jīng)PrimerPremier 5軟件分析設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增NsAGL6 ；上游引物NsAGL6-F :5' -CGCGGATCCCTTTGAGTGATCATCGCAAGA-3 ‘ (SEQ ID NO. 2)下游引物NsAGL6-R :5' -TCCCCCGGGATGGTATGGATTACAGGACCC-3 ‘ (SEQ ID NO. 3)以花蕾cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，50 μ L反應(yīng)體系10 X RCR Byffer 5. 0 μ L, NsAGL6-F、NsAGL6-R 弓| 物各 1· 0 μ L(20 μ mol · L-1)，dNTP mix 4. 0 μ L(2. 5mmol · L-1)， PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0. 2 μ L, cDNA 模板 1 μ L, ddH20 37. 8 μ L ；反應(yīng)程序:95V 預(yù)變性^iin,然后94°C解鏈30sec，55°C退火30sec，72°C延伸Imin 30sec,反應(yīng)33個(gè)循環(huán)， 72°C延伸IOmin ；PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收純化，用T4DNA連接酶(TaKaRa) 連接到PMD19-T Simple載體(TaKaRa)，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行序列測定，測定序列為 SEQ ID NO. 1。2.植物表達(dá)載體 pCAMBIA 1301-220_Ns4GL6 的構(gòu)建提取含有目的片段的T-載體及表達(dá)載體pCAMBIA 1301-220質(zhì)粒DNA并雙酶切， 酶切體系為10Xby ffer K 2. 5 μ 1，Sma I 2. 0 μ 1，BamH I 2. 0 μ 1，質(zhì)粒 DNA 10 μ 1, ddH20 μ ρ to50 μ 1，37°C過夜充分酶切。將含有NsAGL6完整開放閱讀框的片段和pCAMBIA 1301-220線性化質(zhì)粒片段分別回收，并將兩個(gè)片段連接。連接反應(yīng)體系為T4 Buffer 2.0 μ 1，T4連接酶1.0 μ 1，載體回收液1.0 μ 1，目的基因回收液4.0 μ 1，dd H2O μ ρ to 20 μ 1，4°C過夜連接。將連接好的重組質(zhì)粒pCAMBIA 1301-220_NsAGL6轉(zhuǎn)化T0P10細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒，酶切電泳檢測并測序驗(yàn)證。實(shí)施例2植物表達(dá)載體pCAMBIA 1301-220-NsAGL6轉(zhuǎn)化擬南芥及花發(fā)育特性觀察1、農(nóng)桿菌菌株EHA105感受態(tài)制備及凍融法轉(zhuǎn)化從YEB (50mg/L利福平)平板上挑取EHA105單菌落，接種于50mL含50mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，200rpm，培養(yǎng)至OD值0. 5，而后冰浴菌液30min，離心收集菌體， 懸浮于2mL預(yù)冷的的IOOmM CaCl2 (20%甘油)溶液中，200 μ L/管分裝，待用。取10 μ L pCAMBIA 1301-220_NsAGL6載體質(zhì)粒，加入200 μ L感受態(tài)細(xì)胞，冰浴 30min,液氮冷凍5min，37°C 5min,加入800 μ L YEB液體培養(yǎng)基，28°C 200rpm預(yù)培養(yǎng)4h,菌
5液涂板于YEB (50mg/L利福平+50mg/L卡那霉素)固體培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2天，挑取單克隆檢測，選取陽性克隆搖菌，用于擬南芥花序轉(zhuǎn)化。2、擬南芥花序浸染及種子篩選將陽性單克隆接到50mL的YEB (50mg/L利福平+50mg/L卡那霉素)液體培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)M小時(shí)，5000rpm離心20分鐘，然后用轉(zhuǎn)化液(1/2MS，添加50克/升的蔗糖，調(diào)pH為 5. 8，然后加200 μ L/L的Silwet L-77混合)劇烈懸浮沉淀至完全懸起。將擬南芥地上部分直接浸泡于上述懸浮液中1分鐘，然后用保鮮膜完全包裹植株以保濕，放回培養(yǎng)室培養(yǎng) 12小時(shí)，打開保鮮膜，待種子成熟時(shí)采收。種子消毒與播種將野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子分別放入1. 5mL的離心管中，加入ImL 75%酒精，添加0. l^WTriton X-100搖晃15分鐘，然后在超凈臺(tái)中用95%的酒精洗兩次，而后直接把種子連同酒精倒在滅菌過的濾紙上，以吹干種子(放置30分鐘)，輕輕敲擊濾紙將干種子均勻撒播到篩選培養(yǎng)基上(l/2MS+20mg/L草胺磷+25mg/L氨芐青霉素) 篩選培養(yǎng)10天，然后將抗性苗移栽到土中，用透明的蓋子覆蓋幼苗1周以保濕。3、PCR鑒定及植物形態(tài)觀察。以經(jīng)抗生素篩選的抗性植株總DNA為模板，以未轉(zhuǎn)基因菊花苗為陰性對(duì)照進(jìn)行 PCR反應(yīng)(如圖3)。反應(yīng)體系見實(shí)施例1。將鑒定出的轉(zhuǎn)基因T2代種子和野生型擬南芥種子同時(shí)播到栽培基質(zhì)中，人工培養(yǎng)條件為相對(duì)濕度80%，光照強(qiáng)度80-200μπιΟ1/Μ2Λ，溫光周期為IMi光照，22°C / 黑暗，17°C。記錄每株開花的時(shí)間，并用體式顯微鏡觀察花器官的變化。轉(zhuǎn)基因苗相比野生型擬南芥，開花提前了 6、9、10天(圖4)；花瓣的排列也發(fā)生了變化，野生型的擬南芥花瓣呈輻射對(duì)稱，而轉(zhuǎn)基因的花瓣卻不再是輻射對(duì)稱(圖5)。綜上所述，本發(fā)明構(gòu)建了含有睡蓮花器官發(fā)育基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA 1301-220-NsAGL6，其中NsAGL6首次報(bào)道。所構(gòu)建的植物表達(dá)載體可導(dǎo)入多種植物中，使之提前開花并改變植物花型。
權(quán)利要求
1.睡蓮花器官發(fā)育基因NSAGL6，該基因的序列為SEQID NO. 1。
2.睡蓮花器官發(fā)育基因NsAGL6的植物表達(dá)載體，其特征在于由權(quán)利要求1所述的睡蓮花器官發(fā)育基因NsAGL6與質(zhì)粒pCAMBIA 1301-220構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的睡蓮花器官發(fā)育基因NsAGL6的植物表達(dá)載體，其特征在于所述的植物表達(dá)載體為NsAGL6基因連接到線性化的pCAMBIA 1301-220質(zhì)粒而得到的。
4.權(quán)利要求3所述的睡蓮花器官發(fā)育基因NsAGL6植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟1)睡蓮花器官發(fā)育基因NsAGL6的克隆以睡蓮小花蕾為材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計(jì)引物并用高保真酶擴(kuò)增NsAGL6 基因，上游引物 NsAGL6-F :SEQ ID NO. 2下游引物 NsAGL6-R :SEQ ID NO. 3以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)絇CR反應(yīng)，產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple載體， 轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行序列測定；2)植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-220-NsAGL6的構(gòu)建從T0P10菌株中提取提取pMD19-T Simple-NsAGL6重組質(zhì)粒，Sma I和BamH I雙酶切后回收NsAGL6片段，再插入到線性化的pCAMBIA 1301-220質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞， 提取陽性質(zhì)粒，酶切電泳檢測并測序驗(yàn)證，植物表達(dá)載體pCAMBIA 1301-220-NsAGL6構(gòu)建成功。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了睡蓮花器官發(fā)育基因NsAGL6及其植物表達(dá)載體和構(gòu)建方法。睡蓮花器官發(fā)育基因NsAGL6，序列為SEQ ID NO.1，本發(fā)明所構(gòu)建的表達(dá)載體pCAMBIA 1301-220-NsAGL6是由NsAGL6基因連接到線性化的pCAMBIA 1301-220質(zhì)粒而得到的。將該植物表達(dá)載體用于植物遺傳轉(zhuǎn)化，NsAGL6基因在CaMV35S啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下超量表達(dá)，大量合成AGL6蛋白，調(diào)控下游基因的表達(dá)，使之提前開花，改變植物花型。
文檔編號(hào)C12N15/66GK102154316SQ20111003010
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月27日
發(fā)明者劉兆磊, 管志勇, 羅火林, 陳發(fā)棣, 陳素梅 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)