用于在rna噬菌體的病毒樣顆粒上進(jìn)行肽展示和親和選擇的質(zhì)粒和方法

專利名稱：用于在rna噬菌體的病毒樣顆粒上進(jìn)行肽展示和親和選擇的質(zhì)粒和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在RNA噬菌體，特別是MS2和PP7的病毒樣顆粒(VLPs)上進(jìn)行肽展示的系統(tǒng)和方法。描述的方法和質(zhì)粒載體用于協(xié)助構(gòu)建高復(fù)雜度的隨機(jī)序列和抗原片段文庫，從而由其經(jīng)親和選擇分離具有所需結(jié)合功能的肽。由于肽展示的密度是親和選擇嚴(yán)緊度的一個(gè)重要決定因素，還描述了用于控制VLPs上肽展示效價(jià)的方法和質(zhì)粒。本發(fā)明的方法使得可以在大范圍內(nèi)靈活地調(diào)節(jié)VLPs，特別是MS2VLPS上的展示效價(jià)水平(即從每個(gè)顆粒上平均低于I到多達(dá)90)，從而促進(jìn)免疫原和疫苗的鑒定和生產(chǎn)，包括展現(xiàn)低效價(jià)的VLPs。盡管該系統(tǒng)主要是為了疫苗開發(fā)而建立的，它在許多其他應(yīng)用中也有用途，包括鑒定可用于細(xì)胞型或組織型特異性靶向遞送藥物和造影劑的肽-VLPs，和新材料的模板法合成。本申請(qǐng)描述了協(xié)助實(shí)施VLP展示系統(tǒng)的方法和質(zhì)粒載體。發(fā)明提供了可用于病毒樣顆粒的表達(dá)的核酸構(gòu)建體，所述病毒樣顆粒包含MS2或PP7的外殼多肽，各自經(jīng)插入異源肽進(jìn)行了改造，其中所述異源肽被展示在病毒樣顆粒上，并包裹著特定的RNA(MS2或者PP7的RNA)，后者引導(dǎo)VLP以及其上展示的肽的合成。還提供了相關(guān)的病毒樣顆粒、方法和免疫原性組合物。
背景技術(shù)：
VLPs作為疫苗。近年來重組DNA技術(shù)的發(fā)展引領(lǐng)了疫苗的產(chǎn)生，其中免疫原性蛋白經(jīng)過鑒定、克隆并在合適的宿主中表達(dá)以獲得足夠量的蛋白，從而在動(dòng)物和人中達(dá)到有效的保護(hù)性免疫。最有效的疫苗中有許多是基于毒粒表面強(qiáng)有力引發(fā)中和抗體的能力。這包括已被許可的能夠有效誘發(fā)保護(hù)性抗體反應(yīng)的滅活或減毒病毒疫苗，比如脊髓灰質(zhì)炎、流感和狂犬病疫苗。最近，F(xiàn)ood and Drug Administration批準(zhǔn)的亞基疫苗是基于人乳頭瘤病毒(HPV)和乙肝病毒(HBV)的結(jié)構(gòu)蛋白的自我組裝。所述亞基在合適的宿主中得以表達(dá)，然后自組裝成某種顆粒，其在結(jié)構(gòu)上類似真正的病毒，但因缺少病毒基因組而沒有感染性。這些所謂的病毒樣顆粒(VLPs)大體來說是高度免疫原性的，因?yàn)榻M成它們的結(jié)構(gòu)蛋白在每個(gè)單獨(dú)的顆粒中有多個(gè)拷貝。這種高密度抗原呈遞使得這些顆粒能夠特別有效地激發(fā)強(qiáng)抗體反應(yīng)。HBV和HPV疫苗是基于由相應(yīng)病毒自身的結(jié)構(gòu)蛋白組裝而成的VLPs JSVLPs也可以作為支架用于異源表位的高密度展示。由于VLPs—般代表了高度重復(fù)，因此也是高度免疫原性的結(jié)構(gòu)，它們可以來源于任何數(shù)量的不同病毒類型。發(fā)明所述方法致力于利用RNA噬菌體(尤其是MS2和PP7)VLPs，通過與噬菌體展示[1，2]類似的方法進(jìn)行免疫原展示和表位搜尋。RNA噬菌體。單鏈RNA噬菌體是一組在自然界中廣泛分布的病毒。有多種RNA噬菌體在基因組序列、分子生物學(xué)和衣殼結(jié)構(gòu)與組裝方面已被深入研究過。MS2可能是這組病毒中被最好地研究過的成員，也是發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行過的多數(shù)工作的重點(diǎn)，雖然我們的近期工作也探索了稱為PP7的相關(guān)噬菌體。MS2含有3569個(gè)核苷酸組成的單鏈RNA基因組，其僅編碼四種蛋白成熟酶、外殼、裂解和復(fù)制酶。病毒顆粒由180個(gè)外殼多肽、一個(gè)成熟酶分子和一個(gè)拷貝的RNA基因組構(gòu)成。因?yàn)橥鈿さ鞍鬃约和耆?fù)責(zé)二十面體殼的形成，可以由質(zhì)粒以單個(gè)基因的產(chǎn)物生成MS2VLP。因此，與用于肽展示的其他噬菌體相比，RNAVLPs出奇地簡(jiǎn)單。發(fā)明人近期報(bào)道[1，2] 了對(duì)MS2和PP7VLPS進(jìn)行改造用于肽展示和親和 選擇，本文件后面也將有描述。通過常規(guī)噬菌體展示進(jìn)行的表位鑒定。噬菌體展示是可能呈遞大的隨機(jī)氨基酸序列文庫的幾種技術(shù)中的一種，其目的在于從中挑選具有某些特定功能(例如，結(jié)合特定抗體的能力)的肽。最常用的噬菌體展示方法建立在絲狀噬菌體(例如M 13)的基礎(chǔ)上?；镜南敕ㄊ巧芍亟M噬菌體基因組，所述重組噬菌體基因組含有隨機(jī)化序列文庫，這些隨機(jī)化序列在噬菌體的DNA基因組中與病毒結(jié)構(gòu)蛋白之一進(jìn)行了基因融合。這些重組體被轉(zhuǎn)染到細(xì)菌中時(shí)，每個(gè)生產(chǎn)出的病毒顆粒在其表面展示特定的肽并包裝著編碼所述肽的相同重組基因組。這就建立了對(duì)所述方法很重要的基因型和表現(xiàn)型的聯(lián)系。通過利用親和選擇，然后將選中的經(jīng)過在大腸桿菌中生長(zhǎng)進(jìn)行擴(kuò)增，可以從復(fù)雜的肽展示噬菌體文庫中挑選任意功能(例如能夠結(jié)合受體，免疫原性)。在非常大的肽展示噬菌體文庫中，很小的一部分能夠結(jié)合特定受體(例如單克隆抗體)，可以通過親和純化，然后在大腸桿菌中增殖而對(duì)它們進(jìn)行擴(kuò)增。通常反復(fù)進(jìn)行幾輪選擇和擴(kuò)增即可得到較為簡(jiǎn)單的群體，從中將展示具有所需活性的肽的單個(gè)噬菌體克隆，然后進(jìn)行表征。當(dāng)選擇分子是抗體時(shí)，這樣鑒定到的肽代表該抗體能夠識(shí)別的表位，并且在合適的條件下，可能能夠在接受免疫的患者或動(dòng)物中激發(fā)象該表位在其天然抗原中激發(fā)的特異抗體反應(yīng)。但是絲狀噬菌體展示存在缺陷。最重要的是，絲狀噬菌體分子生物學(xué)的某些怪異之處使得它很難或者不可能以足夠引起真正強(qiáng)的免疫原性的高密度對(duì)肽進(jìn)行展示。這意味著雖然可以通過親和選擇鑒定到肽表位，但要把它們作為免疫原(即疫苗)，還是必須化學(xué)合成，然后偶聯(lián)上免疫原性更強(qiáng)的載體。不幸的是，肽在親和選擇和優(yōu)化過程中，當(dāng)脫離它所處的結(jié)構(gòu)環(huán)境時(shí)經(jīng)常失去活性。相反，本文描述的RNA噬菌體VLP展示系統(tǒng)建立了在單一平臺(tái)上進(jìn)行親和選擇以及免疫原性表位呈遞的能力。這是高密度肽表位展示和親和選擇性能結(jié)合在一起的結(jié)果，意味著在免疫過程中可以維持表位在親和選擇時(shí)的結(jié)構(gòu)制約，從而提高了表位保留激發(fā)預(yù)期抗體反應(yīng)所需的結(jié)構(gòu)的可能性。RNA噬菌體VLP展示方法的概沭。發(fā)明人先前描述過基于RNA噬菌體(包括MS2和PP7)VLPs的肽展示和親和選擇技術(shù)[I. 2]，此處僅作簡(jiǎn)單解釋。VLP展示方法的建立需要滿足兩個(gè)前提條件首先必須鑒定到一種形式的RNA噬菌體外殼蛋白，和它內(nèi)部的一個(gè)位點(diǎn)能夠容忍插入外來肽而不破壞它恰當(dāng)折疊并組裝成VLP的能力。外殼蛋白表面上的AB環(huán)被選中作為肽插入位點(diǎn)。插入這里的肽突出展示在VLP表面。不幸的是，野生型外殼蛋白對(duì)于在AB環(huán)插入肽極其不容忍，絕大多數(shù)(通常>98%)最終不能折疊。外殼蛋白正常情況下折疊成二聚體，90個(gè)二聚體組裝成二十面體VLP。發(fā)明人設(shè)計(jì)制成了新型外殼蛋白使它更穩(wěn)定，并且更容忍AB環(huán)插入。為了這個(gè)目的，發(fā)明人利用了二聚體中兩個(gè)相同多肽鏈N和C末端的接近性(圖I)。通過復(fù)制外殼蛋白編碼序列，然后將兩個(gè)拷貝融合成單個(gè)讀框，發(fā)明人制作了所謂單鏈二聚體。蛋白的這種形式在熱動(dòng)力學(xué)上顯著更穩(wěn)定，其折疊對(duì)插入到單鏈二聚體中下游拷貝的AB環(huán)中的肽明顯更容忍[1，2]。得到的VLPs每個(gè)二聚體展示一個(gè)肽，或者每個(gè)VLP展示90個(gè)肽。肽展示/親和選擇性能的第二個(gè)前提條件是表現(xiàn)型與基因型的關(guān)聯(lián)性，因?yàn)榻o親和選擇到的序列提供一個(gè)擴(kuò)增手段很重要。該項(xiàng)要求的滿足是發(fā)明人證實(shí)RNA噬菌體VLPs包裹著引導(dǎo)其合成的信使RNA[1，2]。這意味著親和選擇到的肽-VLPs可以通過逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來擴(kuò)增。當(dāng)選擇目標(biāo)是單克隆抗體時(shí)，得到 的親和選中的VLPs代表了用于在動(dòng)物或患者中激發(fā)抗體的疫苗候選物，所述激發(fā)的抗體的活性模擬挑選使用的抗體的活性。與肽展示效價(jià)及其控制相關(guān)的考慮。本申請(qǐng)描述了這樣的質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體能夠幫助構(gòu)建位于RNA噬菌體VLPs上的復(fù)雜隨機(jī)序列和抗原片段文庫，以及從所述文庫中親和選擇與特異單克隆抗體(或其他任意受體)結(jié)合的肽。注意正如前面描述過的，因?yàn)閱捂湺垠w的一個(gè)AB環(huán)中插有肽，VLP由90個(gè)二聚體構(gòu)成[I，2]，所以RNA噬菌體VLP展示技術(shù)在每個(gè)VLP上呈遞90個(gè)肽。這些顆粒的多價(jià)性對(duì)于MS2VLP的多數(shù)應(yīng)用是有益的。例如，顆粒的高免疫原性與展示肽的高密度相關(guān)，因此是疫苗的一個(gè)可貴屬性。但是，在親和選擇過程中，多價(jià)性使得很難將顆粒區(qū)分開，比如展示對(duì)選擇目標(biāo)有固有的高結(jié)合親和力的肽的顆粒和只是由于多個(gè)同時(shí)的弱相互作用而緊密結(jié)合的顆粒。這種“親合力(avidity)vs.親和力(affinity) ”的困局是利用絲狀曬菌體展示選擇高親和力肽配體過程中有大量記載的復(fù)雜情況[3-5]。本發(fā)明通過引入一個(gè)在大范圍內(nèi)(即從平均每個(gè)顆粒效價(jià)小于I到多達(dá)90)調(diào)節(jié)肽展示平均效價(jià)水平的手段，解決了 VLP展示系統(tǒng)中的這個(gè)問題。這使得有可能在親和選擇過程中改變肽展示的密度。篩選分幾輪進(jìn)行，第一輪通常利用多價(jià)展示進(jìn)行，這樣得到比較復(fù)雜的群體，包含對(duì)目標(biāo)物有某些最低親和力的所有肽。在隨后的幾輪中，可以降低肽展示效價(jià)，從而提高篩選嚴(yán)緊度，導(dǎo)致分離到對(duì)抗體目標(biāo)物質(zhì)有更高親和力的肽，和更佳的優(yōu)選表位模擬分子。發(fā)明目的發(fā)明的一個(gè)目的是提供展示低效價(jià)異源肽的VLPs。發(fā)明的另一個(gè)目的是提供制備VLPs，包括展示低效價(jià)或高效價(jià)異源肽的VLPs的核酸構(gòu)建體。發(fā)明的再一個(gè)目的是提供制備VLPs，包括可以控制低效價(jià)或高效價(jià)異源肽的展示的VLPs的核酸構(gòu)建體。發(fā)明還有一個(gè)目的是提供制備VLPs，包括可以控制低效價(jià)或高效價(jià)異源肽的展示的VLPs的核酸構(gòu)建體，從而達(dá)到鑒定高親和力免疫原以及將這些免疫原用于醫(yī)療和其他制劑或應(yīng)用的目的。發(fā)明的另一個(gè)目的是提供鑒定免疫原性肽的方法，所述免疫原性肽顯示對(duì)選中的抗體有高親和力。發(fā)明的再一個(gè)目的是將高親和力肽合并到VLPs中。發(fā)明的其他目的是提供利用本發(fā)明的VLPs的免疫原性的方法和組合物。發(fā)明的這些和/或其他目的中的任何一個(gè)或多個(gè)可以容易地從以下的發(fā)明描述中得出。發(fā)明概述本發(fā)明涉及組合物、結(jié)構(gòu)(包括質(zhì)粒)、系統(tǒng)和方法，所述組合物、結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)和方法能夠協(xié)助構(gòu)建高度復(fù)雜的任意序列和抗原片段肽文庫，并且使得可以對(duì)MS2VLPS上展示的肽的效價(jià)(即密度)進(jìn)行調(diào)控，從而提供了更有效的鑒定和提供VLPs的手段，其中所述VLPs選擇性地引入了免疫原性肽。本發(fā)明是美國專利公開US2009/0054246和專利申請(qǐng) PCT/US2007/018614(以W008/024427公開)中公開的方法、組合物、顆粒、單位以及其他公開內(nèi)容的延伸，這兩份專利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過引用并入本文，并且在上文和[1，2，6，7]中進(jìn)行了簡(jiǎn)要描述。本發(fā)明認(rèn)為通過選擇對(duì)給定單克隆抗體親和力最高的肽可以提供天然抗原的最佳分子模擬物，并且這些肽最有可能提供或誘發(fā)出相關(guān)的抗體反應(yīng)。這些肽預(yù)計(jì)特別適合用于在患者中誘發(fā)免疫原性和提供保護(hù)性應(yīng)答。由這些肽制備的和/或引入了這些肽的疫苗更有效，而副作用減少，特別是在沒有佐劑的情況下給予的發(fā)明所述的疫苗。本文描述了質(zhì)粒載體,所述質(zhì)粒載體可以協(xié)助構(gòu)建位于RNA噬菌體MS2的VLPs上(pDSPl和pDSP62)和來源于RNA噬菌體PP7的VLPs上(pET2P7K32和pDSP7)的任意序列或抗原片段肽文庫。這些載體使得有可能制備含有超過IOll-IO12個(gè)獨(dú)立成員的文庫。但是，這些載體產(chǎn)生的VLPs—致以高密度(即每個(gè)VLP展示90個(gè))展示外來肽。正如以上解釋過的，由于這樣賦予了肽高水平的免疫原性，對(duì)于疫苗應(yīng)用是一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)，但經(jīng)常給親和選擇過程帶來問題，因?yàn)楦咝r(jià)會(huì)降低選擇的嚴(yán)緊度，使得難以優(yōu)先挑選到群體中結(jié)合最緊密的種類。本發(fā)明給肽展示效價(jià)調(diào)控問題提供了簡(jiǎn)單的解決方案，即一個(gè)允許由單一 RNA生產(chǎn)大量野生型外殼蛋白和少量含有長(zhǎng)度至少四個(gè)(4)氨基酸的異源肽的單鏈(優(yōu)選二聚體)外殼蛋白的系統(tǒng)。這個(gè)方法包括構(gòu)建比如pDSPl (am)、pDSP62 (am)、pET2P7K32 (am)和pDSP7(am)的質(zhì)粒。這些是上文描述的質(zhì)粒的簡(jiǎn)單變體，它們經(jīng)過改造含有終止密碼子(優(yōu)選琥珀終止密碼子)，代替了例如通常編碼單鏈二聚體中下游外殼蛋白拷貝的第一個(gè)氨基酸的密碼子(丙氨酸)。由于這些質(zhì)粒在單鏈二聚體兩部分的連接處有一個(gè)終止密碼子(參見例如pDSPl)，它們正常情況下只產(chǎn)生單位長(zhǎng)度的野生型外殼蛋白，后者當(dāng)然組裝成VLP。而在本方法中，質(zhì)?；虻诙|(zhì)粒(例如P匪supA)經(jīng)過改造含有插入的tRNA基因[8，9]，比如丙氨酸插入抑制型tRNA基因，其表達(dá)處于啟動(dòng)子(例如位于來自不同不相容群的氯霉素抗性質(zhì)粒上的Iac啟動(dòng)子)的調(diào)控下，這樣抑制型tRNA產(chǎn)生的量導(dǎo)致翻譯外殼序列的核糖體中有小部分通讀過終止密碼子，產(chǎn)生了包含異源肽的單鏈二聚體。得到的蛋白含有的外來異源肽優(yōu)選插入在例如蛋白的第二個(gè)AB環(huán)或者羧基末端或者下游亞基內(nèi)的其他位點(diǎn)，與由相同mRNA表達(dá)的野生型蛋白共同組裝形成鑲嵌的VLPs，表現(xiàn)出低效價(jià)。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以有控制地產(chǎn)生VLPs，使每個(gè)VLP上呈遞少于I個(gè)或者多達(dá)九十個(gè)(90)異源肽，優(yōu)選每個(gè)VLP上呈遞大約一個(gè)至大約十個(gè)(10)異源肽，更優(yōu)選每個(gè)VLP上呈遞大約I至大約5個(gè)異源肽，更優(yōu)選每個(gè)VLP上呈遞大約I至大約3個(gè)異源肽，最優(yōu)選每個(gè)VLP上呈遞大約2至大約4個(gè)異源肽。根據(jù)本發(fā)明，肽密度的降低導(dǎo)致可以提高VLPs的親和選擇嚴(yán)緊度，從而容易鑒定到高親和力肽，之后回到高展示密度平臺(tái)時(shí)，變成強(qiáng)免疫原性。瓊脂糖凝膠電泳和Northern印跡證實(shí)按照本發(fā)明產(chǎn)生的顆粒包裹著相關(guān)的RNA。本發(fā)明的方法還提供了通過控制抑制型tRNA的表達(dá)水平在大范圍內(nèi)調(diào)節(jié)效價(jià)(每個(gè)VLP產(chǎn)生的肽的數(shù)量)，例如通過調(diào)節(jié)抑制型tRNA的合成水平，而實(shí)現(xiàn)所述合成水平的調(diào)節(jié)可以通過例如由啟動(dòng)子(例如proB或其他合適的啟動(dòng)子)引導(dǎo)tRNA的表達(dá),其中所述啟動(dòng)子的活性受到誘導(dǎo)物濃度的調(diào)節(jié)。還可以通過使用具有更高或更低內(nèi)在抑制效率的不同抑制型tRNAs或其突變體來控制效價(jià)水平。人們可能會(huì)想知道是否可以通過將重組蛋白與過量的野生型外殼蛋白共表達(dá)，從而使得產(chǎn)生的鑲嵌殼體中的外來肽含量下降而更簡(jiǎn)單地實(shí)現(xiàn)效價(jià)的控制。不幸的是，這種 方法不現(xiàn)實(shí)，因?yàn)橐研r(jià)降低到合適的水平(例如降到平均每個(gè)VLP有低于I或者少數(shù)幾個(gè)肽)需要表達(dá)的野生型蛋白大大超過重組肽。該共表達(dá)策略將產(chǎn)生過多的無關(guān)(即不是編碼外來肽的)RNA,這些RNA由于極其豐富，會(huì)優(yōu)先于肽編碼RNA被包裝在VLPs中。因?yàn)榫唧w的衣殼化似乎不依賴于RNA中存在的任何簡(jiǎn)單包裝信號(hào)(I)，看上去沒有簡(jiǎn)單的方法可以標(biāo)記占少數(shù)的肽編碼RNA使它們被選擇性地衣殼化。可以想見這種共表達(dá)方法會(huì)有一些變化形式是可行的，但這些變化形式常常太過復(fù)雜。我們的系統(tǒng)通過由單一 mRNA產(chǎn)生兩種形式的蛋白解決了這個(gè)問題。作為例子，可以利用以下實(shí)施方案來進(jìn)一步示范本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出，下文包含的每個(gè)實(shí)施方案中，MS2外殼多肽或PP7外殼多肽可以用于各個(gè)核酸構(gòu)建體，但不應(yīng)當(dāng)看作是只限于MS2或PP7外殼多肽，除非對(duì)于描述語境來說這樣的限制是合適的。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供核酸構(gòu)建體(參見例如pDSPl)，其包含(a)細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子(例如象以下發(fā)明詳述部分描寫的)，其可操縱地連接噬菌體MS2單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列，其中所述外殼多肽二聚體編碼序列經(jīng)過改造限定一個(gè)第一限制性酶切位點(diǎn)(例如SalI或KpnI)，該位點(diǎn)位于序列中限定外殼多肽二聚體AB環(huán)的部分的5’方向；(b)第二限制性酶切位點(diǎn)(例如BamHI)，其位于外殼多肽二聚體編碼序列的3’方向；(c)PCR引物，位于第一限制性酶切位點(diǎn)的5’方向和第二限制性酶切位點(diǎn)的3’方向(發(fā)明詳述中給出了相關(guān)PCR引物的定義和列表)；(d)抗生素(例如卡那霉素)抗性基因，和(e)用于在原核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的復(fù)制原點(diǎn)(例如來自質(zhì)粒ColE I的復(fù)制原點(diǎn))。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中提供核酸構(gòu)建體(參見例如pDSP62)，其包含(a)細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子，其可操縱地連接噬菌體MS2單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列，其中所述單鏈二聚體序列的兩部分之一經(jīng)過多個(gè)沉默核苷酸取代的改造(即“密碼子顛倒(codonjuggled)”)產(chǎn)生改造的二聚體，從而使得致突變寡核苷酸引物可以特異地與所述改造二聚體中被改造的一半或者未被改造的一半退火(優(yōu)選地，AB環(huán)任何一側(cè)20個(gè)核苷酸單元內(nèi)有足夠數(shù)量的突變使兩條序列可以通過與引物的雜交情況區(qū)別開)；(b)第一限制性酶切位點(diǎn)(例如Sail)，其位于外殼序列中限定AB環(huán)的那部分的5’方向；(c)第二限制性酶切位點(diǎn)(例如BamHI)，其位于外殼多肽二聚體編碼序列的3’方向；和(d)PCR引物，位于第一限制性酶切位點(diǎn)的5’方向和第二限制性酶切位點(diǎn)的3’方向(發(fā)明詳述中給出了相關(guān)PCR引物的定義和列表)；(e)第一抗生素抗性基因；(f)用于在原核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的復(fù)制原點(diǎn)；(g)來自單鏈DNA噬菌體(例如M 13或fd)的第二復(fù)制原點(diǎn)；以及(h)輔助性單鏈DNA噬菌體(例如，Ml3、fd)，其經(jīng)過改造含有賦予對(duì)第二抗生素 抗性的基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體，噬菌體MS2(或者PP7)單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列還包含編碼異源肽的核酸序列，并且所述構(gòu)建體任選包含位于第二限制性酶切位點(diǎn)3’方向的轉(zhuǎn)錄終止子。這種核酸構(gòu)建體可用于包含被插入異源肽的MS2 (或PP7)外殼多肽的病毒樣顆粒的表達(dá)，其中所述異源肽被展示在病毒樣顆粒上，并包裹著 MS2(或 PP7)mRNA。另一個(gè)實(shí)施方案中(例如pET2P7K32)，核酸構(gòu)建體包含(a)細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子，其可操縱地連接噬菌體PP7 (或MS2)單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列，其中所述外殼多肽二聚體編碼序列經(jīng)過改造限定一個(gè)第一限制性酶切位點(diǎn)，該限制性酶切位點(diǎn)位于外殼多肽二聚體編碼序列的下游部分并且位于限定外殼多肽二聚體AB環(huán)的序列之內(nèi)或者5’方向；(b)第二限制性酶切位點(diǎn)，其位于外殼多肽二聚體編碼序列的3’方向；(c)PCR引物，位于第一限制性酶切位點(diǎn)的5’方向和第二限制性酶切位點(diǎn)的3’方向(發(fā)明詳述中給出了相關(guān)PCR引物的定義和列表)；(d)抗生素抗性基因，和(e)用于在原核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的復(fù)制原點(diǎn)。在替代的實(shí)施方案中(例如pDSP7)，核酸構(gòu)建體包含(a)細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子，其可操縱地連接噬菌體PP7單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列，其中所述單鏈二聚體序列的一半經(jīng)過多個(gè)沉默核苷酸取代的改造(即“密碼子顛倒”)使得致突變寡核苷酸引物可以特異地與一半或者另一半退火(優(yōu)選地，AB環(huán)任何一側(cè)20個(gè)核苷酸單元內(nèi)有足夠數(shù)量的突變使兩條序列可以通過與引物的雜交情況區(qū)別開)；(b)第一限制性酶切位點(diǎn)，該限制性酶切位點(diǎn)位于外殼多肽二聚體編碼序列的下游部分并且位于限定外殼多肽二聚體AB環(huán)的序列之內(nèi)或者5’方向；(C)位于外殼多肽二聚體編碼序列的3’方向的限制性酶切位點(diǎn)；(d)PCR引物，位于第一限制性酶切位點(diǎn)的5’方向和第二限制性酶切位點(diǎn)的3’方向(發(fā)明詳述中給出了相關(guān)PCR引物的定義和列表)；(e)第一抗生素抗性基因；(f)用于在原核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的復(fù)制原點(diǎn)；(g)來自單鏈DNA噬菌體(例如M 13或fd)的第二復(fù)制原點(diǎn)；(h)輔助性單鏈DNA噬菌體(例如，Ml3、fd)，其經(jīng)過改造含有賦予對(duì)第二抗生素抗性的基因。 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體包含(a)細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子，其可操縱地連接噬菌體MS2或PP7單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列，其中所述外殼多肽二聚體編碼序列經(jīng)過改造(I)限定一個(gè)第一限制性酶切位點(diǎn)，該限制性酶切位點(diǎn)位于外殼多肽二聚體編碼序列的下游部分并且位于限定外殼多肽二聚體AB環(huán)的序列之內(nèi)或者5’方向；和(2)含有核苷酸序列(NNS)X，其中N是任意核苷酸，S是鳥苷核苷酸(G)或者胞嘧啶核苷酸(C)，并且X是從I到500的整數(shù)；(b)第二限制性酶切位點(diǎn)，其位于外殼多肽二聚體編碼序列的3’方向；(c)PCR引物，位于第一限制性酶切位點(diǎn)的5’方向和第二限制性酶切位點(diǎn)的3’方向；(d)抗生素抗性基因；以及 (e)用于在原核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的復(fù)制原點(diǎn)。在本文描述的發(fā)明的某些實(shí)施方案中，以上列舉的元件中的某一些可能是任選的，但優(yōu)選包含在構(gòu)建體中。在其他實(shí)施方案中(例如以上描述的質(zhì)粒的衍生質(zhì)粒，被稱為DSP I (am),pDSP62 (am)、pET2P7K32 (am)和pDSP7 (am))，通過包含以下額外特征賦予了對(duì)展示效價(jià)的調(diào)控(a)無義密碼子(例如本文描述的琥珀密碼子)，其位于單鏈二聚體上游和下游一半的連接處；(b)質(zhì)粒(例如P匪supA)，其產(chǎn)生的抑制型tRNA (例如丙氨酸插入琥珀抑制序列)能夠部分抑制在以上(a)中描述的無義密碼子的地方發(fā)生的翻譯終止。該質(zhì)粒含有來自第二個(gè)不相容群的復(fù)制原點(diǎn)，并且賦予對(duì)第二抗生素的抗性，因此使它能穩(wěn)定維持在細(xì)菌中，所述細(xì)菌還含有以上描述的產(chǎn)生外殼蛋白的質(zhì)粒。關(guān)于疫苗候選物的文庫構(gòu)建和親和選擇的概述。這里以MS2VLP系統(tǒng)作為例子，但應(yīng)該理解類似的方法可以應(yīng)用于本申請(qǐng)中還提出的PP7系統(tǒng)。I.文庫構(gòu)津?？梢酝ㄟ^兩種方法中的任一種產(chǎn)生隨機(jī)序列文庫。這些方法在下文有更詳細(xì)的描述，并在圖9b和15中闡釋。(A)將PCR產(chǎn)物克隆到pDSPl中的SalI和Bam HI之間，隨機(jī)序列的附著方式使它們被導(dǎo)入AB環(huán)。該方法適用于方便地構(gòu)建復(fù)雜度較低的文庫(一般是IO7-IO8個(gè)成員)，但不便于提升到更高的水平。(B.)對(duì)于更高復(fù)雜度的文庫(例如IO9-IO11或以上)，將合成寡核苷酸引物與單鏈形式的pDSP62退火，利用DNA聚合酶延伸產(chǎn)生雙鏈環(huán)形分子，然后利用DNA連接酶將該雙鏈環(huán)形分子共價(jià)閉合(參見

圖12)。通過兩種方法中的任一種產(chǎn)生的重組DNA分子被導(dǎo)入合適的大腸桿菌表達(dá)菌株(例如BL21(DE3))，它們?cè)诰曛泻铣蒝LPs。由pDSPl或pDSP62產(chǎn)生的顆粒以每個(gè)顆粒90的密度(高密度)展示外來肽。2.親和詵擇。通過將VLP文庫經(jīng)過一個(gè)過程(例如生物淘選或者其他快速鑒定和分離對(duì)抗體顯示高親和力的肽的方法)進(jìn)行親和選擇，在所述過程中單克隆抗體被吸附在多孔塑料培養(yǎng)板中一或多個(gè)孔的表面。VLP文庫溶液與固定化抗體一起溫育，然后將未結(jié)合的VLP洗下來丟掉，通常通過降低溶液pH將所有結(jié)合的VLPs洗脫。隨后，洗脫下來的VLPs被熱變性，它們所含的RNA利用與RNA 3’端附近(BamHI位點(diǎn)的很下游)退火的寡核苷酸引物通過逆轉(zhuǎn)錄拷貝為DNA。然后利用與第一限制性酶切位點(diǎn)(例如Sail)上游和第二限制性酶切位點(diǎn)(例如BamHI)下游特異退火的引物經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的cDNA。3.再克降。以上獲得的PCR產(chǎn)物用第一和第二限制性內(nèi)切酶(例如SalI和BamHI)消化，然后再次克隆到合適的表達(dá)載體中。如果第二輪篩選要在低肽效價(jià)進(jìn)行，PCR產(chǎn)物可以克隆到pDSPl(am)或pDSP62(am)中，整個(gè)選中的群體被導(dǎo)入含有P匪supA的大腸桿菌表達(dá)菌株(參見圖7)。這樣產(chǎn)生的VLPs平均來說只會(huì)展示少數(shù)幾個(gè)拷貝的外來肽(即低效價(jià))，而且因?yàn)樗鼈兪且呀?jīng)經(jīng)過親和選擇的，所以呈現(xiàn)的是比初始文庫呈現(xiàn)的簡(jiǎn)單得多的肽群體。4.按照以上描述反復(fù)進(jìn)行額外幾輪親和選擇和再克隆。一般來說，兩到四輪，或者優(yōu)選三到四輪(在高效價(jià)進(jìn)行一或兩輪，然后低效價(jià)進(jìn)行一或兩輪)即足以產(chǎn)生一個(gè)簡(jiǎn)單的展示與篩選使用的單克隆抗體牢牢結(jié)合的肽的VLPs群。當(dāng)認(rèn)為篩選結(jié)束時(shí)，序列再次被克隆到pDSPl或pDSP62中，肽又被高密度(高達(dá)每顆粒90個(gè)肽)展示以達(dá)到最大的免疫 原性。獲得各單獨(dú)克隆并通過DNA序列分析進(jìn)行表征。評(píng)估它們?cè)隗w外對(duì)篩選時(shí)使用的抗體的親和力并確定其引發(fā)所需抗體反應(yīng)的能力。在采用已被充分研究過的單克隆抗體目標(biāo)物進(jìn)行的演示試驗(yàn)中，發(fā)明人回收到一些肽，這些肽的序列模擬先前鑒定到的表位的序列。用得到的VLPs免疫動(dòng)物產(chǎn)生了識(shí)別原來的抗原的表位的抗體。質(zhì)粒和發(fā)明的其他方面在以下發(fā)明詳述中有進(jìn)一步描述。由以下對(duì)發(fā)明的描述可以容易地進(jìn)一步得到符合本發(fā)明的以上實(shí)施方案和/或其他實(shí)施方案中的任何一或多個(gè)。附圖簡(jiǎn)述圖I圖示了 MS2外殼蛋白二聚體的結(jié)構(gòu)。左上圖板強(qiáng)調(diào)了兩個(gè)亞基鏈N和C末端的接近程度。這一特點(diǎn)有助于構(gòu)建對(duì)插入外來肽有高容忍度的單鏈二聚體。還圖示(左下)了 AB環(huán)在二聚體中和在完整VLP中的高可接近性。右側(cè)顯示了 VLP本身的結(jié)構(gòu)。構(gòu)成VLP的外殼蛋白根據(jù)準(zhǔn)等構(gòu)原則處于三種略有不同的構(gòu)象，以紅、藍(lán)和綠色表示。AB環(huán)以黃色表示。注意它們的重復(fù)特點(diǎn)以及暴露在VLP表面的情況。圖2顯示隨機(jī)序列肽庫在VLPs上展示的基本情況。通過重組DNA方法制備隨機(jī)序列肽插入文庫，得到的質(zhì)粒群經(jīng)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌，從而產(chǎn)生VLPs文庫。群體中各個(gè)單獨(dú)的VLP在其表面展示不同的肽并且里面(以mRNA的形式)含有決定其合成的遺傳信息。圖3闡述了親和選擇的過程。將代表隨機(jī)序列肽文庫的一個(gè)VLPs群與固定在表面的單克隆抗體一起溫育。一般來說，絕大多數(shù)的VLPs不能與抗體結(jié)合，而是被洗掉并丟棄。然后將任何其肽表現(xiàn)出對(duì)抗體的結(jié)合的VLPs特異洗脫，通過逆轉(zhuǎn)錄將它們含有的RNA拷貝為DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增，然后再克隆到表達(dá)質(zhì)粒(例如PDSP62或pDSP62 (am))中產(chǎn)生經(jīng)親和選擇而選出的VLP。通常選擇要反復(fù)進(jìn)行幾次(即兩次以上)，優(yōu)選3-5輪。圖4顯示了肽展示效價(jià)的重要性。多價(jià)展示使得很難將內(nèi)在的緊密結(jié)合分子和同時(shí)與多個(gè)受體相互作用的弱結(jié)合分子區(qū)分開。通常第一輪親和選擇在高效價(jià)進(jìn)行，但后續(xù)的輪中效價(jià)被降低到低水平，這樣可以提高選擇嚴(yán)緊度，保證分離到對(duì)選擇使用的抗體有最聞未和力的妝。圖5顯示了質(zhì)粒pDSPl，其中的克隆位點(diǎn)方便進(jìn)行AB環(huán)插入。pDSPl表達(dá)經(jīng)過改造含有例如獨(dú)特的Sail和KpnI限制性酶切位點(diǎn)的單鏈二聚體編碼序列。該二聚體有助于將外來序列簡(jiǎn)單地克隆到AB環(huán)內(nèi)。要保證這些位點(diǎn)是獨(dú)特的，需要破壞掉載體和上游外殼序列中的幾個(gè)SalI和KpnI位點(diǎn)。圖6顯示了質(zhì)粒pDSP62。為了輔助單鏈DNA的產(chǎn)生，在質(zhì)粒中引入M13復(fù)制原點(diǎn)，根據(jù)M13原點(diǎn)的方向命名為PDSP61和pDSP62。該質(zhì)粒在單鏈二聚體上游一般還含有所謂“密碼子顛倒的”外殼序列。密碼子顛倒的一半所編碼的氨基酸序列與下游一半所編碼的序列相同，但區(qū)別在于前者含有最大可能數(shù)量的沉默取代，使這兩部分可以通過與寡核苷酸的退火情況區(qū)分開。圖7顯示的示范 性系統(tǒng)可以由單一 RNA產(chǎn)生大量野生型和少量AB環(huán)重組蛋白。構(gòu)建了 PDSPl的變體一 (pDSPl (am))，該質(zhì)粒中正常情況下編碼單鏈二聚體中下游外殼蛋白拷貝的第一個(gè)氨基酸-丙氨酸被琥珀終止密碼子所取代。此外，合成并克隆了丙氨酸插入抑制型tRNA基因，產(chǎn)生的tRNA的量使得翻譯外殼序列的核糖體的一小部分通讀過琥珀(終止)密碼子并產(chǎn)生單鏈二聚體。得到的蛋白(含有外來肽)與相同mRNA表達(dá)的野生型蛋白共組裝形成鑲嵌殼體，效價(jià)如文中其他部分描述的被降低。圖8呈現(xiàn)的是由以下列舉的質(zhì)粒產(chǎn)生的純化VLPs的SDS凝膠電泳圖。試驗(yàn)的用意是顯示純化VLPs中單鏈“通讀”產(chǎn)物(如以上圖7和本申請(qǐng)實(shí)施例部分中描述)的含量。純化的VLPs由以下質(zhì)粒(由左至右)產(chǎn)生pDSPl產(chǎn)生的VLPs僅含有外殼蛋白單鏈二聚體。pDSPl-Flag產(chǎn)生的VLPs僅含有單鏈二聚體，且第二個(gè)AB環(huán)中插入了 Flag表位。pDSPl (am)在單鏈二聚體中外殼序列連接處有一個(gè)無義突變，導(dǎo)致它產(chǎn)生大量野生型外殼蛋白，在有抑制型tRNA (由P匪supA提供)的情況下，還產(chǎn)生少量單鏈二聚體。因?yàn)檫@種情況的無義抑制效率低，核糖體只有小部分通讀過終止密碼子產(chǎn)生單鏈二聚體。兩種形式的外殼蛋白共組裝成鑲嵌的或者雜合的VLP，主要由野生型外殼蛋白和少量單鏈二聚體(估計(jì)大約是野生型外殼蛋白水平的3%)構(gòu)成。pDSPl(am)_Flag與pDSPl(am) —樣，只是單鏈二聚體的第二個(gè)AB環(huán)中插入了Flag表位。它主要產(chǎn)生野生型蛋白和少量帶有插入在AB環(huán)的Flag肽的單鏈二聚體。圖右邊的兩個(gè)箭頭表示通過抑制pDSPl (am)和pDSPl (am) -Flag的終止密碼子產(chǎn)生的兩種蛋白。圖9a和9b描述了 pDSPl質(zhì)粒(9a)和將編碼異源肽的核酸序列插入質(zhì)粒使用的技術(shù)(9b)。圖10描述了 PDSP62質(zhì)粒并示意了如何設(shè)計(jì)合成寡核苷酸引物從而將序列特異地插入單鏈二聚體下游拷貝的AB環(huán)中。設(shè)計(jì)的寡核苷酸與側(cè)接AB環(huán)的外殼序列完美地退火，將外來序列插在它們之間。圖Ila含有pDSPl質(zhì)粒的核酸序列(SEQ ID NO: I);圖Ilb顯示了 pDSPl (am)的核酸序列(SEQ ID NO: 2);圖Ilc顯示了 pDSP62質(zhì)粒的核酸序列(SEQ ID NO: 3);圖11(1給出了 pDSP62 (am)的核酸序列(SEQ ID NO: 4)。注意pDSPl (am)和pDSP62 (am)質(zhì)粒序列與PDSPl和pDSP62的不同只是引入了琥珀密碼子的核苷酸取代。圖Ile是M13K07的氯霉素抗性衍生物-M13CM1的核酸序列(SEQ ID NO: 5)。圖12描述了利用pDSP62和M13CM1產(chǎn)生隨機(jī)肽序列文庫的方法。M13CM1是一個(gè)使pDSP62從它的M13原點(diǎn)開始復(fù)制的輔助病毒。因此，M13CM1感染含有pDSP62的大腸桿菌細(xì)胞將會(huì)產(chǎn)生單鏈環(huán)形PDSP62。當(dāng)生長(zhǎng)在dut_，ung_細(xì)菌菌株中時(shí)，DNA中通常存在的dTTP中有一些被dUTP取代。通過用DNA聚合酶對(duì)合成寡核苷酸進(jìn)行延伸來實(shí)現(xiàn)肽編碼序列的定點(diǎn)插入，并利用DNA聚合酶將環(huán)閉合。得到的共價(jià)閉合環(huán)形DNA經(jīng)電穿孔導(dǎo)入大腸桿菌的dut+，ung+菌株，在大腸桿菌中dUTP取代的鏈被降解，導(dǎo)致插入片段的高合并率(通常 85-90%)[10]。圖13a和13b描述了 pP7(13a)和p2P7K32 (13b)質(zhì)粒。這些質(zhì)粒只是用于PP7VLP平臺(tái)的建立過程中通過翻譯阻遏和VLP組裝分析法來檢測(cè)PP7外殼蛋白AB環(huán)對(duì)插入的容忍性(參見實(shí)施例部分)。不應(yīng)把它們與PET2P7K32或pDSP7混淆，后兩種質(zhì)粒下文有描述，用于構(gòu)建VLP文庫進(jìn)行親和選擇。圖14提供了 PP7外殼蛋白AB環(huán)附近的核苷酸和氨基酸序列，還提供了用于插入一些特定肽插入片段的引物序列。插入了多種特異和隨機(jī)肽序列來檢測(cè)PP7單鏈二聚體對(duì)AB環(huán)插入的總體容忍性，并確定特異插入肽的免疫原性。 圖15闡述了為了展示PP7單鏈外殼蛋白AB環(huán)對(duì)插入的容忍性，在p2P7K32中構(gòu)建隨機(jī)序列肽文庫所用的方案。這個(gè)方法與圖5b中闡述的插入pDSPl中的MS2單鏈二聚體的方法類似。圖16提供了 24個(gè)克隆的全細(xì)胞裂解物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，所述克隆來自本文描述的各個(gè)不同的文庫。獲得的克隆幾乎100%有翻譯阻遏能力，表明每個(gè)蛋白可能都被適當(dāng)?shù)卣郫B。為了進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白正確折疊，通過給隨機(jī)挑選的幾個(gè)克隆進(jìn)行電泳和Western印跡(如本圖所示)來評(píng)估每個(gè)克隆形成VLP的能力。每組中上半部分是溴化乙錠染色的膠，下半部分是相同膠的Western印跡結(jié)果。每組中最左道是p2P7K32對(duì)照。每個(gè)克隆含有不同的隨機(jī)產(chǎn)生的肽序列。幾乎每一個(gè)克隆都產(chǎn)生了 VLP，這一事實(shí)顯示了 ΡΡ7外殼蛋白單鏈二聚體對(duì)插入片段的高度容忍性。圖17a 闡述了 PETP7K 質(zhì)粒、圖 17b 闡述了 pET2P7K32 質(zhì)粒、圖 17c 闡述了 pDSP7質(zhì)粒。這些質(zhì)粒是為了高水平過表達(dá)PP7外殼蛋白而制備的。pDSP7質(zhì)粒含有PP7外殼蛋白的單鏈二聚體，其中序列的一半在AB環(huán)編碼序列附近含有足夠數(shù)量的核苷酸突變，使得就與致突變寡核苷酸退火的目的來說，這兩半是可以區(qū)分的。在本圖顯示的例子中，整個(gè)上游序列經(jīng)過改造含有最大可能數(shù)量的沉默突變。PET2P7K32和pDSP7應(yīng)當(dāng)被看作是MS2外殼蛋白產(chǎn)生質(zhì)粒一pDSPl和pDSP62的PP7類似物。圖18-提取自在含有pETP7K或pET2P7K32的細(xì)菌中產(chǎn)生的VLPs的RNA在甲醛/瓊脂糖凝膠上的電泳結(jié)果顯示了它們產(chǎn)生的VLPs包裹著指導(dǎo)其合成的mRNAs。這提供了通過逆轉(zhuǎn)錄和PCR回收親和選擇得到的序列的手段。交替泳道含有相同質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNAs。左側(cè)圖板顯示溴化乙錠染色的膠。右側(cè)是用對(duì)PP7外殼蛋白有義鏈特異的寡核苷酸探測(cè)同一凝膠的印跡結(jié)果。該探針未能與相似量來源于MS2或QB外殼蛋白序列體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA反應(yīng)(未顯示)。圖19提供了克隆到PP7外殼蛋白中的幾個(gè)特定肽序列列表。圖20 顯示了抗 L2mAb (RG-1)與 PP7L2_VLPs 結(jié)合，但不與 PP7V3_VLPs 結(jié)合。稀釋的mAb RG-I與500ng/孔的L2_VLPs或V3_VLPs反應(yīng)。利用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠次級(jí)IgG，隨后用ABTS顯影來檢測(cè)結(jié)合情況。通過測(cè)量405nm (0D 405)處的吸光度確定反應(yīng)性。圖21顯示了展示V3肽的PP7VLPs在用于免疫時(shí)誘發(fā)了抗V3IgG反應(yīng)。圖中顯示的是用PP7V3-VLPS或作為對(duì)照的L2-VLPS免疫的小鼠中的抗V3IgG抗體反應(yīng)。小鼠用IOygVLPs和不完全弗氏佐劑免疫三次，然后在最后一個(gè)加強(qiáng)劑后兩周采集血清。通過ELISA測(cè)試來自七只獨(dú)立小鼠(六只用V3-VLPS免疫，一只用L2_VLPs免疫)的稀釋血清與代表來自HIVLAI的V3環(huán)一部分的肽的反應(yīng)性。利用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠次級(jí)IgG，隨后用ABTS顯影來檢查結(jié)合情況。通過測(cè)量405nm(0D 405)處的吸光度確定反應(yīng)性。圖22顯示了利用MS2VLP展示和抗Flag M2抗體進(jìn)行的親和選擇的結(jié)果，其中所述抗體的表位序列已被其他人透徹研究過。顯示了來自四輪中每一輪的幾個(gè)肽的序列來展示選擇的進(jìn)展。第I和第2輪中發(fā)現(xiàn)的肽含有可識(shí)別的天然表位的元件，但是到第3和第4輪相似性很明顯，這些序列與野生型表位非常吻合。事實(shí)上，第4輪得到的序列比以前通過成熟的絲狀卩遼菌體展示方法獲得的序列(參見〃NEB Transcript, Summer, 1006 -在New England Biolabs網(wǎng)站可以找到，www. neb, coni)更接近天然表位。圖 23a-23d 顯示了 pET2P7K32 (SEQ ID NO: 6)、pET2P7K32 (am) (SEQ ID NO: 7)、pDSP7 (SEQ ID NO:8)和pDSP7(am) (SEQ ID N0:9)質(zhì)粒的核苷酸序列。這些是與圖 lla-lld中顯示的MS2VLP產(chǎn)生質(zhì)粒的PP7外殼蛋白產(chǎn)生類似物。發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，可以采用現(xiàn)有技術(shù)范圍內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。文獻(xiàn)中充分解釋了這些技術(shù)。參見例如Sambrook. et al. 2001，"MolecularCloning : A Laboratory Manual" ;Ausubel，ed.，1994，"Current Protocolsin Molecular Biology^Volumes I_111 ; Ce Iis，ed.，1994，"Ce 11 Biology : ALaboratory Handbook^Volumes I-III ；Coligan, ed.，1994，"Current Protocolsin Immunology^Volumes I-III ；Gait ed.，1984，"Oligonucleotide Synthesis"；Hames&Higgins eds. .1985，"Nucleic Acid Hybridization" ;Hames&Higgins，eds.，1984，"Transcription And Translation" ；Freshney.ed.，1986. "Animal Cell Culture";IRLPress，1986,Immobilized Cells And Enzymes" ;Perbal. 1984，"APractical Guide ToMolecular Cloning"。在提供數(shù)值范圍的情況中，應(yīng)當(dāng)理解為在所述范圍的上限和下限之間的每一居間值(至該下限的最小整數(shù)的十分之一，除非文中另有明確規(guī)定)，以及在該申明范圍內(nèi)的任何其他申明的數(shù)值或者居間值都被發(fā)明所涵蓋。這些較小范圍的上限和下限可以獨(dú)立地包括在較小范圍內(nèi)，也涵蓋在發(fā)明內(nèi)，適用該申明的范圍內(nèi)任何特別排除的端值。當(dāng)申明的范圍包括上下限中的一個(gè)或者兩者時(shí)，排除這些被包括在內(nèi)的一個(gè)或兩個(gè)界限的范圍也包含在發(fā)明中。除非另有定義，本文使用的所有科技術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。雖然任何與本文描述的方法和材料類似或等同的也可以用于發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試，這里描述了優(yōu)選方法和材料。必須指出，用于本文和所附權(quán)利要求，單數(shù)形式的“一個(gè)a〃、"an〃和〃the")包括復(fù)數(shù)的指代物，除非上下文明確另有指示。
此外，以下術(shù)語具有如下定義。本文中，術(shù)語“多核苷酸”是指任何長(zhǎng)度的聚合物形式的核苷酸(核糖核苷酸或者脫氧核糖核苷酸)，包括雙鏈和單鏈DNA和RNA。多核苷酸可能包含具有不同功能的核苷酸序列，比如編碼區(qū)和諸如調(diào)控序列(例如啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄終止子)的非編碼區(qū)。多核苷酸可以直接從天然來源獲得，或者可以借助重組、酶學(xué)或化學(xué)技術(shù)制備。多核苷酸在拓?fù)鋵W(xué)上可以是線性或者環(huán)形的。多核苷酸可以是例如質(zhì)?；蚴删w載體(比如表達(dá)或克隆載體)的一部分或者片段。限制性核酸內(nèi)切酶是在確定序列對(duì)DNA進(jìn)行切割的酶。它們被用于重組DNA技術(shù)，產(chǎn)生例如特異的DNA片段，所述DNA片段與利用相同限制性核酸內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的其它DNA片段經(jīng)過DNA連接酶的作用容易地連在一起。本申請(qǐng)中提到的幾個(gè)特異限制性核酸內(nèi)切酶包括Sail、KpnI和BamHI，它們的識(shí)別序列分別是GTCGAC、GGTACC和GGATCC。本文中，術(shù)語“多肽”是泛指通過肽鍵連接在一起的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸聚合物。術(shù) 語“多肽”還包括含有一個(gè)以上通過二硫鍵連接的多肽的分子，或者共價(jià)地或非共價(jià)地連接成多聚體(例如，二聚體、四聚體)的多肽復(fù)合體。因此，術(shù)語肽、寡肽和蛋白質(zhì)都包括在多肽的定義中，這些術(shù)語可以交換使用。應(yīng)當(dāng)理解，這些術(shù)語沒有暗示氨基酸聚合物的具體長(zhǎng)度，也不隱含或者區(qū)分多核苷酸是否是利用重組技術(shù)、化學(xué)或酶法合成制備的，還是天然的。術(shù)語“單鏈二聚體”是指通常處于二聚體形式的蛋白質(zhì)，它的兩個(gè)亞基被基因(通過共價(jià)鍵化學(xué)地)融合為單一的多肽鏈。具體來說，本發(fā)明中構(gòu)建了 MS2和PP7外殼蛋白的單鏈二聚體形式。這些蛋白中每一個(gè)天然是相同多肽鏈的二聚體。在MS2和PP7外殼蛋白二聚體中，一個(gè)亞基的N末端與相伴亞基的C末端在物理學(xué)上很接近(參見圖I)。單鏈外殼蛋白二聚體的產(chǎn)生是利用重組DNA方法通過復(fù)制外殼蛋白的DNA編碼序列，然后將它們頭尾相連地融合在一起。得到的單一多肽鏈中外殼蛋白氨基酸出現(xiàn)兩次，其中上游拷貝的C末端與下游拷貝的N末端共價(jià)融合。正常情況下(野生型)，兩個(gè)亞基僅通過兩條鏈間的非共價(jià)相互作用聯(lián)系在一起。在單鏈二聚體中，這些非共價(jià)相互作用被保留，但兩個(gè)亞基另外還被共價(jià)地連在一起。這極大地穩(wěn)定了蛋白的折疊后結(jié)構(gòu)，賦予它對(duì)肽插入片段的如上所述的高容忍性。本申請(qǐng)經(jīng)常提到外殼蛋白的“AB環(huán)”。RNA噬菌體外殼蛋白具有保守的三級(jí)結(jié)構(gòu)。MS2和PP7外殼蛋白，各自具有例如以圖I顯示的MS2外殼蛋白為例的結(jié)構(gòu)。每個(gè)多肽鏈折疊成多個(gè)β折疊，以字母A到G示意。β折疊A和B形成一個(gè)發(fā)卡,在發(fā)卡頂端有一個(gè)連接兩個(gè)折疊的三氨基酸環(huán)，該環(huán)在這里暴露在VLP的表面。如本申請(qǐng)所示，插入到AB環(huán)中的肽被暴露在VLP表面，具有強(qiáng)免疫原性。優(yōu)選本文描述的氨基酸殘基處于“L”異構(gòu)型。但是，“D”異構(gòu)型的殘基可以取代為任何L型氨基酸殘基，只要多肽保留所需的功能。ΝΗ2是指位于多肽氨基端的游離氨基基團(tuán)。COOH是指位于多肽羧基端的游離羧基基團(tuán)。術(shù)語“編碼序列”在本文中定義為核酸序列中直接決定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的部分。編碼序列的邊界通常由位于開放讀框開始的地方(通?？拷黰RNA的5’端)的核糖體結(jié)合(或者Shine-Dalgarno)位點(diǎn)和翻譯起始密碼子(通常是AUG)(對(duì)于原核生物)或者AUG起始密碼子(對(duì)于真核生物)，以及位于并且確定開放讀框結(jié)束的地方(通?？拷黰RNA的3’端)的翻譯終止序列(無義密碼子之一 UAG、UGA或UAA)確定。編碼序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重組核酸序列。正如上文簡(jiǎn)要提到的終止密碼子”(stop codon或termination codon)是信使RNA中示意翻譯終止的核苷酸三聯(lián)體。蛋白質(zhì)是獨(dú)特的氨基酸序列，信使RNA中的多數(shù)密碼子對(duì)應(yīng)向不斷延長(zhǎng)的蛋白鏈添加氨基酸一終止密碼子示意這一過程的結(jié)束，氨基酸鏈的釋放。在標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼中，有三個(gè)終止密碼子UAG (在RNA中)/TAG (在DNA中)(又稱為“琥珀”終止密碼子)、UAA/TAA (又稱為“赭石”終止密碼子)和UGA/TGA (又稱為“乳白”或“棕土”終止密碼子)。已知這個(gè)主要的密碼子群有多個(gè)變化形式。本發(fā)明中使用的終止密碼子通常會(huì)停止或中斷蛋白的合成。但是，tRNAs中的某些突變使它們能夠識(shí)別終止密碼子，導(dǎo)致核糖體通讀過終止密碼子，使得終止密碼子下游編碼的肽得以合成[11-13]。例如tRNA中的一個(gè)突變能夠識(shí)別琥珀終止密碼子，使翻譯越過該密碼子，產(chǎn)生全長(zhǎng)蛋白，從而重新得到正常形式的蛋白而“阻抑” 了終止密碼子。很多時(shí)候，對(duì)終止密碼子的抑制僅僅部分有效一經(jīng)常只有低百分 比的核糖體通讀過終止密碼子。但是在某些情況中，阻抑可以有效的多。少數(shù)幾個(gè)抑制型tRNAs就是具有更高的內(nèi)在抑制效率。其他情況中，可以通過提高其表達(dá)水平使弱抑制分子更有效。本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，為了控制終止密碼子下游的轉(zhuǎn)錄單元所編碼的肽的合成，在轉(zhuǎn)錄單元中引入了終止密碼子。通過提供能夠識(shí)別終止密碼子并允許終止密碼子下游肽的合成的tRNA的受控合成，可以產(chǎn)生在外殼蛋白群體(大多數(shù)不含有異源肽)中包含異源肽的外殼蛋白。這樣得到的由異源肽混合物組裝而成的VLPs含有野生型(沒有異源肽)外殼蛋白，導(dǎo)致異源呈遞效價(jià)低得多。重組細(xì)胞的“外源”區(qū)域是較大核酸分子內(nèi)的可辨認(rèn)核酸區(qū)段，所述區(qū)段在自然情況下與該較大核酸分子不相關(guān)聯(lián)。“異源”肽是這樣的肽，所述肽是多肽中與較大多肽在自然情況下不相關(guān)聯(lián)的可辨認(rèn)區(qū)段。VLP的效價(jià)是指顆粒上展示的外源肽的拷貝數(shù)。展示“低效價(jià)”異源肽(優(yōu)選至少4個(gè)肽單位的免疫原性肽)的病毒顆粒是這樣的顆粒，所述病毒顆粒在構(gòu)成該病毒顆粒的外殼多肽二聚體中展示小于I個(gè)到最多大約10個(gè)或以上異源肽。展示低效價(jià)的病毒顆粒由復(fù)數(shù)個(gè)不含異源肽的外殼多肽二聚體(優(yōu)選野生型外殼多肽)和少數(shù)包含外源肽(優(yōu)選位于外殼多肽下游亞基的AB環(huán)內(nèi)或者位于單鏈外殼多肽二聚體的羧基末端)的外殼多肽二聚體形成，因此形成的是鑲嵌VLP。用于本文的語境，“復(fù)制原點(diǎn)”一般是指通過指定DNA復(fù)制起始的區(qū)域參與DNA合成的那些DNA序列。在有所需因子(DNA聚合酶等)的情況下，復(fù)制原點(diǎn)導(dǎo)致與它關(guān)聯(lián)的DNA被復(fù)制。例如ColEl復(fù)制原點(diǎn)(用于象pDSPl等質(zhì)粒)使許多常用的質(zhì)?？寺≥d體具有了獨(dú)立于細(xì)菌染色體復(fù)制的能力。另一個(gè)例子是本申請(qǐng)材料中其他地方描述過的質(zhì)粒P匪supA(參見圖7)中使用的pl5A復(fù)制原點(diǎn)。質(zhì)粒上有額外的來自噬菌體M13的復(fù)制原點(diǎn)(例如象PDSP62的情況)賦予質(zhì)粒在大腸桿菌細(xì)胞被所謂輔助噬菌體(例如本申請(qǐng)中描述的M13CM1)感染時(shí)，利用該原點(diǎn)進(jìn)行另外的復(fù)制的能力。M13在胞內(nèi)復(fù)制為雙鏈環(huán)形DNA ;但也可能產(chǎn)生單鏈環(huán)的形式，并包裝在噬菌體顆粒中。這些顆粒給諸如PDSP62和pDSP7 (本申請(qǐng)其他地方描述過，用于利用圖12闡述的方法構(gòu)建文庫)的質(zhì)粒提供了方便的單鏈環(huán)形DNA來源。
“啟動(dòng)子序列”是能夠與細(xì)胞中的RNA聚合酶結(jié)合并啟動(dòng)下游(3’方向)編碼序列的轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)控區(qū)。為了說明本發(fā)明的目的，啟動(dòng)子序列包括以可檢測(cè)的高于背景的水平啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄所需的最小數(shù)量的堿基或元件。在啟動(dòng)子中有負(fù)責(zé)與RNA聚合酶以及轉(zhuǎn)錄起始所需的任何相關(guān)因子結(jié)合的DNA序列。細(xì)菌啟動(dòng)子通常由-35和-10共有序列和或多或少特異的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)構(gòu)成。真核啟動(dòng)子經(jīng)常，但不是總是含有“TATA”盒和“CAT”盒。細(xì)菌表達(dá)載體(通常是質(zhì)?；蚴删w)一般利用來自天然來源的啟動(dòng)子，包括那些來源于大腸桿菌乳糖、阿拉伯糖、色氨酸和ProB操縱子的啟動(dòng)子，以及其他來自噬菌體來源的啟動(dòng)子。例子包括來自λ、T7、Τ3和SP6噬菌體的啟動(dòng)子。在細(xì)菌中，轉(zhuǎn)錄通常止于特異的轉(zhuǎn)錄終止序列，所述轉(zhuǎn)錄終止序列一般根據(jù)它們的活性是否需要細(xì)菌rho因子的作用，而分為rho依賴性和不依賴rho (或者固有)的終止子。這些終止子限定了導(dǎo)致RNA聚合酶停止其轉(zhuǎn)錄活動(dòng)的位點(diǎn)，因此它們大體上限定了RNAs的3’端，盡管有些時(shí)候后續(xù)的核糖核酸酶作用會(huì)對(duì)RNA進(jìn)行進(jìn)一步修剪。“抗生素抗性基因”是指所述基因編碼的蛋白質(zhì)賦予細(xì)菌對(duì)給定抗生素的抗性。例 如卡那霉素抗性基因引導(dǎo)合成磷酸轉(zhuǎn)移酶，后者能夠?qū)⑺鏊幬镄揎椇蜏缁睢Ｙ|(zhì)粒(例如pDSPl)上有卡那霉素抗性基因提供了挑選存在質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化細(xì)菌的一個(gè)機(jī)制。類似地，氯霉素抗性基因通過產(chǎn)生乙?；D(zhuǎn)移酶，使抗生素被乙?；Щ?，從而細(xì)菌能夠在有氯霉素的情況下生長(zhǎng)。在本申請(qǐng)中，利用氯霉素抗性來保證細(xì)菌中保留了 P匪supA和M13CM1。本申請(qǐng)中提出的“逆轉(zhuǎn)錄和PCR”是作為擴(kuò)增親和選擇到的VLPs的核酸序列的手段。“逆轉(zhuǎn)錄”是指通過逆轉(zhuǎn)錄酶的作用產(chǎn)生RNA分子(或cDNA)的DNA拷貝的過程。在本申請(qǐng)中，利用逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生親和選擇到的VLPs內(nèi)包裹的RNA序列的DNA拷貝。逆轉(zhuǎn)錄酶需要引物退火到RNA上(參見下文)。術(shù)語“PCR”是指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，用于體外擴(kuò)增特定DNA序列的技術(shù)。術(shù)語“PCR引物”是指能夠與靶DNA退火，從而使DNA聚合酶(例如Taq DNA聚合酶)能夠啟動(dòng)DNA合成的DNA序列(通常是合成的寡核苷酸)。象例如圖9b和15中顯示的，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中使用PCR引物對(duì)來啟動(dòng)DNA雙鏈中每條鏈的DNA合成，從而擴(kuò)增兩個(gè)引物之間的DNA區(qū)段。這里給出了逆轉(zhuǎn)錄和PCR使用的引物的例子。E2:5，TCA GCG GTG GCA GCA GCC AA 3’ -與包裹在本申請(qǐng)描述的 VLPs 中的 RNAs的3’端附近退火；用于引導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄。E3. 2:5’CGG GCT TTG TTA GCA GCC GG 3’ -與上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的 cDNAs 的 3’端附近退火，退火位點(diǎn)恰好在E2引物位點(diǎn)的上游；作為對(duì)親和選擇得到的序列進(jìn)行擴(kuò)增的PCR反應(yīng)中的3’引物。E2 和 E3.2 引物含有 pDSPl、pDSPl (am)、pDSP62、pDSP62 (am)、pET2P7K32、PET2P7K32 (am)、pDSP7和pDSP7 (am)共有的序列，因此可用于由這些來源中的每一個(gè)對(duì)VLPs包裹的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR。PCR依賴于將E3. 2與以下描述的質(zhì)粒特異的5’引物之一配對(duì)。為了簡(jiǎn)單起見，只顯示了用于PDSPl和pDSPl(am)的引物，但應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)需要還使用了對(duì)其他VLPs中的序列特異的類似引物。J2:5’ACT CCG GCC TCT ACG GCA AC 3’-與 pDSPl 中單鏈二聚體序列連接處的序列特異退火的引物。在用E3. 2進(jìn)行的PCR反應(yīng)中，含有單鏈二聚體下游一半(包括AB環(huán)中插入的肽的序列)的DNA區(qū)段被擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)過SalI和BamHI消化產(chǎn)生的片段可以插入到相關(guān)質(zhì)粒中SalI和BamHI之間(參見例如圖9a)。J2(琥珀)5’AC TCC GGC ATC TAG TAG AAC TTT AC 3’ -該引物與以上 J2 作用方式完全一致，但是是對(duì)pDSPl (am)產(chǎn)生的序列特異?！氨磉_(dá)調(diào)控序列”是控制和調(diào)節(jié)另一個(gè)DNA序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的DNA序列。當(dāng)RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄為mRNA,然后mRNA被翻譯為所述編碼序列編碼的蛋白時(shí),編碼序列“受控于”細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列。轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列是參與編碼序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)的DNA調(diào)控序列，比如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、多腺苷酸化信號(hào)、終止子等。翻譯調(diào)控序列通常通過控制核糖體結(jié)合和翻譯啟始的效率，決定信使RNA的翻譯效率。例如象本申請(qǐng)中其他地方討論過的，RNA噬菌體的外殼蛋白是已知的噬菌體復(fù)制酶的翻譯抑制劑。隨著外殼蛋白在被感染細(xì)胞中積累到足夠高的濃度，它與含有噬菌體復(fù)制酶基因的翻譯起始區(qū)(Shine-Dalgarno和起始密碼子AUG)的RNA發(fā)夾結(jié)合。這阻礙了核糖 體結(jié)合，使復(fù)制酶合成被關(guān)閉，此時(shí)病毒的生命周期發(fā)生從復(fù)制到病毒組裝的轉(zhuǎn)換。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)被導(dǎo)入了外源或異源DNA，細(xì)胞稱為被這些DNA “轉(zhuǎn)化”。轉(zhuǎn)化DNA可能整合或者沒有整合(共價(jià)連接)到構(gòu)成細(xì)胞基因組的染色體DNA中。例如在原核細(xì)胞、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化DNA可能維持在諸如質(zhì)粒的附加型元件上，所述質(zhì)粒通常借助質(zhì)粒上存在的復(fù)制原點(diǎn)，能夠獨(dú)立于細(xì)菌染色體復(fù)制。對(duì)于真核細(xì)胞來說，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞是其中的轉(zhuǎn)化DNA已經(jīng)整合到染色體中，因此可以通過染色體復(fù)制被子細(xì)胞繼承。真核細(xì)胞具有的建立細(xì)胞系或克隆的能力顯示了這一穩(wěn)定性，其中所述細(xì)胞系或克隆包含含有所述轉(zhuǎn)化DNA的子細(xì)胞群。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明范圍還包括編碼發(fā)明所述多肽的核酸序列，所述核酸序列編碼的多肽具有與本文公開的序列相同的氨基酸序列，但是是本文公開的核酸的簡(jiǎn)并序列?！昂?jiǎn)并”意味著用不同的三字母密碼子來限定特定氨基酸。本文中，“表位”是指多肽的抗原決定簇。表位可以包含處于該表位特有的空間構(gòu)象的三個(gè)氨基酸。一般來說，表位由至少5個(gè)這樣的氨基酸，更通常地，由至少8-10個(gè)這樣的氨基酸構(gòu)成。確定氨基酸空間構(gòu)象的方法是本領(lǐng)域已知的，包括例如X-射線晶體分析法和2維核磁共振。本文中，“模擬表位(mimotope) ”是模擬真實(shí)抗原表位的肽。某些情況中，氨基酸序列可能與原來的抗原表位有某些相似性，但也有一些情況沒有或者只有很少的序列相似性。這類情況中，模擬表位利用不同的氨基酸序列模擬表位的3D結(jié)構(gòu)。甚至可以鑒定到模擬非肽表位的模擬表位S，比如模擬碳水化合物的。本文中，術(shù)語“外殼蛋白”是指噬菌體或者RNA噬菌體中能夠被合并到噬菌體或RNA噬菌體的衣殼組裝的蛋白。本文中，“外殼多肽”在文中定義為具有外殼蛋白功能的外殼蛋白的多肽片段，還包括全長(zhǎng)外殼蛋白或其單鏈變體。本文中，術(shù)語“免疫反應(yīng)”是指引發(fā)B-和/或T-淋巴細(xì)胞和/或抗原呈遞細(xì)胞的活化或增殖的體液免疫反應(yīng)和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)，但是在某些情形中，免疫反應(yīng)強(qiáng)度可能很低，只有在使用至少一種根據(jù)發(fā)明的物質(zhì)時(shí)才能檢測(cè)到?！懊庖咴缘摹笔侵冈噭┯糜诖碳せ钌矬w的免疫系統(tǒng)，從而使免疫系統(tǒng)的一或多個(gè)功能得到提高并且針對(duì)該所述免疫原性劑?！懊庖咴远嚯摹笔窃谟谢驔]有佐劑的情況下，能夠單獨(dú)或者與載體相連引發(fā)細(xì)胞和/或體液免疫反應(yīng)的多肽。優(yōu)選地，抗原呈遞細(xì)胞被活化。本文中，術(shù)語“自體抗原”是指宿主DNA編碼的蛋白以及由蛋白產(chǎn)生的產(chǎn)物或者宿主DNA編碼的RNA。此外，由兩個(gè)或多個(gè)自體分子組合產(chǎn)生的蛋白，或者代表自體分子的一個(gè)級(jí)分的蛋白，以及與上述兩種自體分子有高同源性(>95%，優(yōu)選>97%，更優(yōu)選>99%)的蛋白，也可視為自體的。自體抗原的例子包括，但不限于ErbB-2、β淀粉樣蛋白、免疫球蛋白E(IgE)、胃泌素、胃促生長(zhǎng)素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、白介素(IL)-17、IL-23、IL-13、CCR5、CXCR4、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、血管緊張素 II、TRANCE/RANKL 和 MUC-1。本文中，術(shù)語“疫苗”是指含有本發(fā)明的組合物并且處于能夠給予動(dòng)物的形式的制劑。本文中，術(shù)語“噬菌體的病毒樣顆?！笔侵高@樣的病毒樣顆粒(VLP)，所述顆粒與噬菌體結(jié)構(gòu)相似，但不能復(fù)制沒有感染性，并且通常缺少噬菌體作為感染性病毒進(jìn)行繁殖所 需要的一或多個(gè)病毒基因。RNA噬菌體的VLPs —般還缺少編碼負(fù)責(zé)病毒附著或進(jìn)入宿主的蛋白的基因。這個(gè)定義還包括了這樣的噬菌體病毒樣顆粒，所述顆粒中存在上述基因但是已失活，因此也造成噬菌體病毒樣顆粒不能復(fù)制沒有感染性。“RNA噬菌體外殼蛋白的VLP”定義為由RNA噬菌體外殼蛋白的一或多個(gè)亞基自組裝形成的衣殼結(jié)構(gòu)，通常含有自身外殼蛋白的mRNA，任選含有宿主RNA。為了本申請(qǐng)的目的，RNA噬菌體VLPs通常是由180拷貝的野生型外殼蛋白二聚體或者90拷貝的單鏈二聚體外殼蛋白組裝成的；或者組裝成含有不同數(shù)量野生型二聚體和單鏈二聚體外殼蛋白，每個(gè)顆?？偣?0個(gè)分子的鑲嵌VLPs。當(dāng)表達(dá)調(diào)控序列控制并且調(diào)節(jié)著核酸序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯時(shí)，所述核酸分子與所述表達(dá)調(diào)控序列是“可操縱地連接”或者“可操縱地關(guān)聯(lián)”。術(shù)語“可操縱地連接”包括在待表達(dá)的核酸序列前面有合適的起始信號(hào)(例如ATG)，并且維持正確的讀框以允許核酸序列在表達(dá)調(diào)控序列的控制下進(jìn)行表達(dá)并產(chǎn)生由所述核酸序列編碼的所需產(chǎn)物。如果希望插入重組DNA分子的基因不含合適的起始信號(hào)，可以在所述基因前面插入這種起始信號(hào)。術(shù)語“嚴(yán)緊雜交條件”是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的,可以在Current Protocols inMolecular Biology, John ffiley&Sons. N. Y. (1989), 6. 3. 1-6. 3. 6 中找到。嚴(yán)緊雜交條件的優(yōu)選的非限制性例子是于大約45° C在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交；然后于50° C，優(yōu)選55° C，更優(yōu)選60° C或65° C在0. 2. X SSC，0. 1%SDS中清洗I或多次。病毒樣顆粒的產(chǎn)生本發(fā)明涉及病毒樣噬菌體顆粒以及產(chǎn)生這些顆粒的體內(nèi)和體外方法。正常情況下，這些顆粒是在體內(nèi)產(chǎn)生的，但這些顆粒的用途完全可以應(yīng)用在體外情景中，這種做法也在本發(fā)明預(yù)期范圍內(nèi)。本發(fā)明有可能使實(shí)驗(yàn)室復(fù)雜性提高，減少了反復(fù)選擇需要的時(shí)間。方法一般包括體外制備毒粒和回收毒粒。本文中，“體外”產(chǎn)生毒粒是指在細(xì)胞外，例如無細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生毒粒；而“體內(nèi)”產(chǎn)生毒粒是指在細(xì)胞內(nèi)，例如大腸桿菌或銅綠假單胞菌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生毒粒。噬菌體本文設(shè)想的系統(tǒng)基于單鏈RNA卩遼菌體的特性(參見RNA Bacteriophages, in TheBacteriophages. Calendar. RL. ed. Oxford University Press. 2005)。屬于這類的已知病毒攻擊諸如大腸桿菌、假單胞菌和不動(dòng)桿菌等多樣化的細(xì)菌。每個(gè)具有高度相似的基因組組織方式、復(fù)制策略和毒粒結(jié)構(gòu)。具體來說，所述噬菌體含有單鏈(+)義RNA基因組，含有成熟酶、外殼和復(fù)制酶基因，并且有小的(〈300埃)二十面體外殼。這些包括，但不限于MS2、、R17、SP、PP7、GA、Mll、MXl、f4、Cb5、Cbl2r、Cb23r、7s 和 12RNA 噬菌體。PP7是銅綠假單胞菌的單鏈RNA噬菌體，與諸如MS2和Q β的大腸桿菌噬菌體是遠(yuǎn)親。雖然ΡΡ7噬菌體正常情況下感染的是銅綠假單胞菌，當(dāng)在大腸桿菌中由諸如圖9和13中描述的質(zhì)粒表達(dá)ΡΡ7外殼蛋白時(shí)，可以容易地產(chǎn)生病毒樣顆粒。ΡΡ7外殼蛋白經(jīng)確定是特異性RNA結(jié)合蛋白，能夠阻遏與復(fù)制酶翻譯起始區(qū)融合的序列的翻譯。因?yàn)樵撏鈿さ鞍鬃瓒籀宝?的翻譯操縱序列，而不能阻遏MS2或Qi3噬菌體的操縱序列，可以知道它具有特異性的RNA結(jié)合活性。已經(jīng)建立了外殼蛋白的純化條件和由解體的病毒樣顆粒重構(gòu)其RNA結(jié)合活性的條件。體外PP7操縱RNA的解離常數(shù)經(jīng)確定為大約InM。利用一個(gè)外殼蛋白阻遏復(fù)制酶-β_半乳糖苷酶融合蛋白的翻譯的基因系統(tǒng)，鑒定了蛋白中對(duì)結(jié)合 PP7RNA重要的氨基酸殘基(Peabody, et al, Translational repression and specific RNAbinding by the coat protein of the Pseudomonas phage PP72001, J. Biol. Chem. , Jun22;276 (25):22507-13. Epub2001Apr 16)。已知有多個(gè)單鏈RNA噬菌體的外殼蛋白是翻譯阻遏物，能夠通過結(jié)合含有復(fù)制酶核糖體結(jié)合位點(diǎn)的RNA發(fā)夾關(guān)閉病毒的復(fù)制酶合成。對(duì)RNA噬菌體進(jìn)行的X射線結(jié)構(gòu)確定表明從比較外殼蛋白氨基酸序列可以看到的明顯的同源性也反映在三級(jí)結(jié)構(gòu)中。作為阻遏物和病毒顆粒基本構(gòu)成元件的外殼蛋白二聚體由兩個(gè)交織的單體構(gòu)成，這兩個(gè)單體一起形成大的β折疊表面，RNA即結(jié)合其上。每個(gè)外殼蛋白利用共同的結(jié)構(gòu)框架結(jié)合不同RNA，因此提供了機(jī)會(huì)來考察特異性RNA-蛋白識(shí)別的基礎(chǔ)。文中描述了 ΡΡ7 (銅綠假單胞菌的RNA噬菌體，其外殼蛋白和MS2的外殼蛋白只顯示出13%的氨基酸序列同一性)外殼蛋白的RNA結(jié)合特性。還給出了以下發(fā)現(xiàn)(1)ΡΡ7的外殼蛋白是翻譯阻遏物；(2)含有ΡΡ7復(fù)制酶翻譯起始位點(diǎn)的RNA發(fā)夾在體內(nèi)和體外均被ΡΡ7外殼蛋白特異結(jié)合，表明這個(gè)結(jié)構(gòu)代表了翻譯操縱序列；以及(3) RNA結(jié)合位點(diǎn)位于外殼蛋白β折疊上。已提供該位點(diǎn)的圖譜。見上文。為了說明的目的，利用了該群中研究特別透徹的成員一MS2的基因組，所述基因組是3569個(gè)核苷酸長(zhǎng)的單鏈(+)義RNA，僅編碼4個(gè)蛋白質(zhì)，其中兩個(gè)是毒粒的結(jié)構(gòu)成分。構(gòu)成病毒顆粒的二十面體衣殼是由180拷貝的外殼蛋白和一個(gè)分子的成熟酶蛋白以及一個(gè)分子的RNA基因組形成。其外殼蛋白也是特異性RNA結(jié)合蛋白。當(dāng)外殼蛋白與其特異識(shí)別目標(biāo)一靠近復(fù)制酶順反子5’端的RNA發(fā)夾結(jié)合時(shí)，組裝可能被啟動(dòng)(參見圖IB和2009年2月26日出版的US20090054246的SEQ ID NO: 1，該申請(qǐng)通過引用全文并入本文)。然后當(dāng)細(xì)胞在病毒裂解蛋白的影響下破裂時(shí)，病毒顆粒被釋放到培養(yǎng)基中。形成感染性病毒需要至少三個(gè)成分，即外殼蛋白、成熟酶和病毒基因組RNA，但試驗(yàn)顯示二十面體衣殼的組裝所需要的信息完全包含在外殼蛋白本身內(nèi)。例如純化的外殼蛋白在被RNA刺激的過程中可以體外形成衣殼(Beckett et al.，1988，J. Mol Biol 204:939-47)。并且，由質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的外殼蛋白可以體內(nèi)組裝成病毒樣顆粒(Peabody, D. S.，1990. J Biol Chem265:5684-5689)。外殼多肽
由編碼序列編碼的外殼多肽一般長(zhǎng)度至少有120個(gè)，優(yōu)選至少125個(gè)氨基酸，不超過大約135個(gè)氨基酸，優(yōu)選不超過130個(gè)氨基酸。預(yù)計(jì)可以使用來自幾乎任何單鏈RNA噬菌體的外殼多肽。外殼多肽的例子包括，但不限于MS2外殼多肽(參見例如美國專利申請(qǐng)公開 US20090054246 的 SEQ ID NO: 2)、R17 外殼多肽(參見例如 Genbank 登錄號(hào) P03612)、PRR I外殼多肽(參見例如Genbank Accesssion No. ABH03627)、fr噬菌體外殼多肽(參見例如Genbank登錄號(hào)NP 039624)、GA外殼多肽(參見例如Genbank登錄號(hào)P07234)、QP夕卜殼多肽(參見例如Genbank登錄號(hào)P03615)、SP外殼多肽(參見例如Genbank AccessionNo P09673)、f4外殼多肽(參見例如Genbank登錄號(hào)M37979. I)和PP7外殼多肽(參見例如 Genbank 登錄號(hào) P03630)。 PP7外殼多肽的例子包括，但不限于與RNA發(fā)夾形成復(fù)合物的PP7外殼蛋白二聚體的各個(gè)鏈(例如Genbank登錄號(hào)2QUXR、2QUX0、2QUX2QUX C)。還可參見
本文中的實(shí)施例 I 和Peabody, et al, RNA recognition site of PP7coat protein, NucleicAcids Research. 2002，Vol. 30，No. 194138-4144[14，15]。 可用于本發(fā)明的外殼多肽還包括與以上公開的外殼多肽序列中的一或多個(gè)有相似性的那些。所述相似性是指結(jié)構(gòu)相似性。結(jié)果相似性的確定可以通過將兩個(gè)氨基酸序列(即候選氨基酸序列和氨基酸序列)的殘基進(jìn)行比對(duì)使它們沿著序列的相同氨基酸數(shù)量最大化；為了優(yōu)化相同氨基酸的數(shù)量，雖然每個(gè)序列中的氨基酸必須保持正確的順序，但允許在比對(duì)時(shí)在一個(gè)序列或者兩個(gè)序列中存在空位。候選氨基酸序列是與例如美國已公開專利申請(qǐng)US2009/0054246中給出的氨基酸序列進(jìn)行比較的氨基酸序列。候選氨基酸序列可以分離自單鏈RNA病毒，或者可以利用重組技術(shù)產(chǎn)生，或者化學(xué)或酶法合成。優(yōu)選地，兩個(gè)氨基酸序列可以利用GCG軟件包(10. 2版本，Madison WI)中的BESTFIT算法，或者BLAST 2搜索算法中的程序進(jìn)行比較,所述程序在Tatusova. et al. (FEMS Microbial Lett1999, 174:247-250)中有描述，在 http://www. ncbi. nlm. nih. Rov/blast/bl2seq/bl2.html有提供。優(yōu)選地，所有BLAST 2搜索參數(shù)使用缺省值，包括矩陣=BL0SUM62;開放空位罰分=11 ;擴(kuò)展空位罰分=1 ;空位丟棄值=50 ;期望值=10 ;字段長(zhǎng)度=3，任選地，過濾器打開。在利用BLAST搜索算法進(jìn)行的兩個(gè)氨基酸序列的比較中，結(jié)構(gòu)相似性被稱為“同一性”。優(yōu)選地，外殼多肽還包括這樣的多肽，所述多肽具有的氨基酸序列與以上公開的氨基酸序列中的一或多個(gè)有至少80%的氨基酸同一性、至少85%的氨基酸同一性、至少90%的氨基酸同一'I"生或者至少95%的氨基酸同一'丨生。優(yōu)選地,夕卜殼多肽有活性。外殼多肽是否有活性可以通過評(píng)估所述多肽形成衣殼和包裹單鏈RNA分子的能力來確定。利用體內(nèi)或體外系統(tǒng)可以完成這種評(píng)估，這類方法是本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法。替代地，如果多肽與提到的外殼多肽有相似的三維結(jié)構(gòu)和/或功能活性，它可以被認(rèn)為是結(jié)構(gòu)相似的。插入到外殼多肽或多肽的異源肽序列可以是隨機(jī)肽序列。在特定實(shí)施方案中，所述隨機(jī)序列具有Xaan的序列,其中η是至少4、至少6,或者至少8并且不大于20,不大于18或者不大于16，每個(gè)Xaa是獨(dú)立的隨機(jī)氨基酸。替代地，肽片段可能有明確的序列，具有已知的功能(例如抗原性、免疫原性)。異源序列可以位于外殼多肽的氨基末端、外殼多肽的羧基末端或者位于外殼多肽內(nèi)的其他地方。優(yōu)選地，異源序列在外殼多肽中的位置使得插入序列會(huì)被表達(dá)在衣殼的外表面。在特定實(shí)施方案中，并且如下文實(shí)施例中描述的，肽序列可以被插入到以上提到的外殼多肽的AB環(huán)區(qū)域。這類位置的例子包括，例如插入序列被插入到外殼多肽中緊接氨基酸11-17，或者外殼多肽中緊接氨基酸13-17的后面。在非常特定的實(shí)施方案中，異源肽被插入到對(duì)應(yīng)MS-2中氨基酸11-17或者特別是13-17的位點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，異源肽插入的位點(diǎn)對(duì)應(yīng)(a)MS_2、R17和fir外殼多肽的氨基酸11_17或者特別是13_17 ；(b) GA外殼多肽的氨基酸10-16 ;(c) QP和SP外殼多肽的氨基酸10-17;(d)PP7外殼多肽的氨基酸8-11，和(e)PRRl外殼多肽的氨基酸9-17。替代地，異源肽可以被插入到外殼多肽的N-末端或C-末端。 異源肽可以選自下述的肽HIV肽、自體抗原、Flag肽、來源于人16型乳頭瘤(HPV16)次要衣殼蛋白L2的氨基酸序列、HIV-lgpl20的V3環(huán)、炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原、受體、結(jié)合細(xì)胞表面受體的配體、對(duì)絲狀噬菌體顆粒特異肽的任何一端有親和カ的肽、金屬結(jié)合肽或者對(duì)MS2表面有親和カ的肽。異源肽包括，但不限于選自下述的肽HIV肽、自體抗原、Flag肽、來源于人16型乳頭瘤(HPV16)次要衣殼蛋白L2的氨基酸序列、HIV-lgpl20的V3環(huán)、炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原、受體、結(jié)合細(xì)胞表面受體的配體、對(duì)絲狀噬菌體顆粒特異肽的任何一端有親和カ的肽、金屬結(jié)合肽或者對(duì)PP7表面有親和カ的肽。為了確定結(jié)構(gòu)相似外殼多肽中的相應(yīng)位點(diǎn)，將該結(jié)構(gòu)相似外殼多肽的氨基酸序列與上文中限定的外殼多肽的序列進(jìn)行比對(duì)。例如將與M2-2外殼多肽結(jié)構(gòu)相似的外殼多肽的相應(yīng)位點(diǎn)與(已公開的美國專利申請(qǐng)US2009/0054246中的)SEQ ID N0:2(該申請(qǐng)通過引用并入本文)比對(duì)。由這個(gè)比對(duì)，可以確定另ー個(gè)外殼多肽中與SEQ ID NO: I (也是已公開的美國專利申請(qǐng)US2009/0054246中的)中給定位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)。在特定實(shí)施方案中，外殼多肽是含有上游和下游亞基的單鏈ニ聚體。每個(gè)亞基含有有功能的外殼多肽序列?？梢詫愒措脑谝陨咸峒暗奈稽c(diǎn)插入到上游和/或下游亞基中，例如優(yōu)選下游亞基的AB環(huán)區(qū)域。在特定實(shí)施方案中，所述外殼多肽是MS2外殼多肽的單鏈ニ聚體，其可能具有已公開的美國專利申請(qǐng)US2009/0054246(該申請(qǐng)通過引用并入本文)中SEQ ID NO: 12描述的序列。在特定實(shí)施方案中，外殼多肽是含有上游和下游亞基的單鏈ニ聚體。每個(gè)亞基含有有功能的外殼多肽序列。可以將異源肽在以上提及的位點(diǎn)插入到上游和/或下游亞基中，例如優(yōu)選下游亞基的AB環(huán)區(qū)域。在特定實(shí)施方案中，外殼多肽是PP7外殼多肽的單鏈
ニ聚體。轉(zhuǎn)錄單位的產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄單位包含表達(dá)調(diào)控區(qū)(例如，啟動(dòng)子)、編碼外殼多肽的序列和轉(zhuǎn)錄終止子。RNA多核苷酸可以任選地含有外殼識(shí)別位點(diǎn)(又稱為“包裝信號(hào)”、“翻譯操縱序列”、“外殼識(shí)別位點(diǎn)”)。替代地，轉(zhuǎn)錄單位可能不含翻譯操縱序列。啟動(dòng)子、編碼區(qū)、轉(zhuǎn)錄終止子以及可能存在的外殼識(shí)別位點(diǎn)通常是可操縱地連接。“可操縱地連接”或“可操縱地關(guān)聯(lián)”是指排列方式，其中被這樣描述的成分所處的關(guān)系使它們能夠以預(yù)期的方式發(fā)揮作用。當(dāng)調(diào)控序列與編碼區(qū)的連接方式使得編碼區(qū)在適合調(diào)控序列的條件下可以發(fā)生表達(dá)，調(diào)控序列與編碼區(qū)即是“可操縱地連接”或“可操縱地關(guān)聯(lián)”。外殼識(shí)別位點(diǎn)，如果存在的話，只要能夠以預(yù)期方式發(fā)揮作用，可以位于RNA多核苷酸內(nèi)的任何位置。發(fā)明不限于使用任何特定啟動(dòng)子，有許多已知的啟動(dòng)子。用于發(fā)明的啟動(dòng)子可以是組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。優(yōu)選的啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)產(chǎn)生編碼外殼多肽的編碼區(qū)產(chǎn)生高水平RNA。這類啟動(dòng)子的例子是本領(lǐng)域已知的，包括例如Iac啟動(dòng)子T7、T3和SP6啟動(dòng)子。編碼本文描述的外殼多肽之編碼區(qū)的核苷酸序列可以容易地確定。編碼本文描述的一個(gè)外殼多肽的ー類核苷酸序列的例子是(已公開的美國專利申請(qǐng)US2009/0054246中的)SEQ ID NO: 3的核苷酸4080-4470(所述申請(qǐng)通過引用并入本文)。這類核苷酸序列有很多但是是有限的，其中每個(gè)成員的核苷酸序列可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過參照標(biāo)準(zhǔn)的遺傳密碼容易地確定。此外，RNA噬菌體單鏈外殼多肽的編碼序列包含異源肽的插入位點(diǎn)和異源肽本身的編碼序列。在特定實(shí)施方案中，異源肽插入位點(diǎn)是限制性酶切位點(diǎn)。 在特定實(shí)施方案中，編碼區(qū)編碼單鏈外殼多肽ニ聚體。在非常特定的實(shí)施方案中，編碼區(qū)編碼經(jīng)過改造的單鏈外殼多肽ニ聚體，其中所述改造包括在插入位點(diǎn)插入了至少四個(gè)氨基酸的編碼序列。已公開的美國專利申請(qǐng)US2009/0054246中圖3圖解了這類轉(zhuǎn)錄單位的ー個(gè)具體實(shí)施方案。轉(zhuǎn)錄單位可以含有細(xì)菌啟動(dòng)子，比如Iac啟動(dòng)子；或者可以含有噬菌體啟動(dòng)子，比如T7啟動(dòng)子和任選地T7轉(zhuǎn)錄終止子。除了含有啟動(dòng)子和編碼融合蛋白的編碼區(qū)，RNA多核苷酸一般還包含轉(zhuǎn)錄終止子，和任選的外殼識(shí)別位點(diǎn)。外殼識(shí)別位點(diǎn)是處于RNA形式時(shí)形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的核苷酸序列。它在本領(lǐng)域中又被稱為翻譯操縱序列、包裝信號(hào)和RNA結(jié)合位點(diǎn)。在沒有限制意圖的情況下，該結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是作為翻譯阻遏物(例如外殼多肽)識(shí)別的結(jié)合位點(diǎn)，井能啟動(dòng)RNA的包裝。外殼識(shí)別位點(diǎn)的核苷酸序列是本領(lǐng)域已知的，包括例如SEQ ID NO: I (參見已公開的美國專利申請(qǐng)US2009/0054246中的圖1B)的核苷酸。單鏈RNA噬菌體R17、GA、Q β、SP和ΡΡ7中的其他外殼識(shí)別序列也已有研究，技術(shù)人員很容易獲得。只要能夠與啟動(dòng)子一起發(fā)揮作用，幾乎任何轉(zhuǎn)錄終止子都可以用于RNA多核苷酸中。轉(zhuǎn)錄終止子對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，易于獲得并且常規(guī)使用。合成正如以下會(huì)詳細(xì)描述的，通過將轉(zhuǎn)錄單位導(dǎo)入細(xì)菌，特別是如果轉(zhuǎn)錄單位含有細(xì)菌啟動(dòng)子時(shí)，可以體內(nèi)合成本發(fā)明的VLPs。替代地，可以在偶聯(lián)的無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中體外產(chǎn)生VLPs。包裹異源物質(zhì)的VLPs的組裝在VLP的合成過程中，VLP通常與通過翻譯能產(chǎn)生它們的信使RNA關(guān)聯(lián)。這對(duì)于本申請(qǐng)中描述的系統(tǒng)的親和選擇性能很重要。但是，在某些其他應(yīng)用中(例如藥物或顯像劑的靶向遞送)，可能希望向VLP中引入其他物質(zhì)?？梢栽谟兴霎愒次镔|(zhì)的情況下，進(jìn)行體外VLP組裝反應(yīng)來組裝成這些VLP。具體來說，由已經(jīng)用變性劑(通常是醋酸)分解了的VLP獲得純化的外殼蛋白亞基。將蛋白亞基與異源物質(zhì)混合。在特定實(shí)施方案中，所述物質(zhì)對(duì)VLP內(nèi)部有某些親和力，優(yōu)選是帶負(fù)電荷的。另ー種方法涉及將異源物質(zhì)附著到合成RNA形式的翻譯操縱序列上。在體外組裝反應(yīng)過程中，所述RNA會(huì)與它的識(shí)別位點(diǎn)緊密結(jié)合，帶著外來物質(zhì)有效地合并到產(chǎn)生的VLP中。
在另ー個(gè)實(shí)施方案中，物質(zhì)經(jīng)過VLP表面天然存在的孔被動(dòng)擴(kuò)散到VLP內(nèi)。在特定實(shí)施方案中，所述物質(zhì)小到足以經(jīng)由這些孔(在MS2中，直徑大約10埃)透過，并且對(duì)VLP內(nèi)部有高親和力。VLP 群正如以上提到的，發(fā)明涉及VLP群或文庫。術(shù)語“群”和“文庫”在本說明書中可以互換使用，因此被看作是同義詞。在ー個(gè)特定實(shí)施方案中，文庫可以是隨機(jī)文庫；在另ー個(gè)實(shí)施方案中，所述文庫是抗原片段文庫，即來源于抗原性多肽的片段的文庫。隨機(jī)文庫(群)可以制備編碼肽的寡核苷酸。在ー個(gè)特定實(shí)施方案中，編碼特定氨基酸的三聯(lián)密碼子具有NNS的組成，其中N是A、G、C或T;S是G或T ;或者具有NNY的組成，其中N是A、G、C或T ;Y是C或T。將多個(gè)三聯(lián)密碼子插入外殼蛋白基因，導(dǎo)致蛋白產(chǎn)物中被插入相應(yīng)的肽。為了盡量減少存在的終止密碼子，可以利用由定做的三核苷亞磷酰胺混合物(可從 Glen Research, Inc.購買)合成的寡核苷酸來構(gòu)建肽文庫，所述混合物經(jīng)設(shè)計(jì)能更準(zhǔn)確地反映天然的氨基酸組成，并且完全缺乏終止密碼子。在外殼蛋白中插入這類隨機(jī)序列導(dǎo)致合成VLPs群(或文庫)，每個(gè)顆粒在其表面展示不同的肽。這種群可能是極大的，由十幾億個(gè)獨(dú)立成員組成。經(jīng)常觀察到這種文庫中存在幾乎任何受體(例如單克隆抗體)的特異配體，雖然它們通常代表的只是整個(gè)群體的一小部分。親和選擇和之后的擴(kuò)增(對(duì)本發(fā)明，是通過對(duì)被包裹RNA的逆轉(zhuǎn)錄和PCR)使得能對(duì)這些稀少種類進(jìn)行回收、分析和開發(fā)。
實(shí)施例參考以下非限制性實(shí)施例可以更好地理解發(fā)明，這些實(shí)施例僅供作為發(fā)明的范例。提供以下實(shí)施例是為了更全面地闡述發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，而不是對(duì)發(fā)明廣泛范圍的限制。展示低效價(jià)異源肽的VLPs的產(chǎn)生.本申請(qǐng)?jiān)敿?xì)描述了在MS2VLPS上進(jìn)行肽展示的近期技術(shù)發(fā)展，包括用于簡(jiǎn)單地生產(chǎn)隨機(jī)序列肽文庫和控制肽展示效價(jià)的新質(zhì)粒載體。它代表了已公開的美國專利申請(qǐng)US20090054246中描述的方法的進(jìn)展。本發(fā)明涉及建立具有與絲狀噬菌體展示類似的親和選擇性能的MS2病毒樣顆粒(VLP)平臺(tái)。本發(fā)明部分基于RNA噬菌體的外殼蛋白既有展示外來肽又能包裹作為其合成模板的同一 mRNA的能力。這個(gè)過程在形成VLPs的細(xì)菌細(xì)胞中由質(zhì)粒合成外殼蛋白-隨機(jī)肽融合。從細(xì)胞中提取VLPs，根據(jù)與特異抗體的結(jié)合進(jìn)行親和選擇。最后，從選中的VLPs中提取RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR來回收和擴(kuò)增所包裹的序列，然后將所述序列克隆并重新導(dǎo)入細(xì)菌，它們就在細(xì)菌中作為模板進(jìn)行另ー輪的合成、組裝和選擇。按需要將過程反復(fù)進(jìn)行多次，最后，克隆選中的序列以便高水平細(xì)菌表達(dá)選中的VLPs。為協(xié)助疫苗開發(fā)而建立的本發(fā)明的方法，除其他幾個(gè)用途之外，具有以前不能在單一平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)的重要特征。首先，所述方法通過在病毒樣顆粒(VLP)表面展示密集的外來肽重復(fù)陣列保證了高免疫原性。這不僅會(huì)產(chǎn)生對(duì)外來抗原的強(qiáng)勁免疫反應(yīng)，還能克服免疫耐受并誘發(fā)抗自體抗原的抗體。第二，在類似噬菌體展示的過程中，本發(fā)明的平臺(tái)允許從復(fù)雜的隨機(jī)序列文庫中對(duì)親和選擇的序列進(jìn)行回收和擴(kuò)增。因此本發(fā)明在單一平臺(tái)中結(jié)合了通過限制效價(jià)和親和選擇來鑒定相關(guān)表位的能力，和然后將這些表位作為疫苗呈遞給免疫系統(tǒng)的能力。通過針對(duì)抗體目標(biāo)物進(jìn)行親和選擇來鑒定和優(yōu)化表位，然后，在不用換平臺(tái)的情況下，將表位直接作為疫苗呈遞給免疫系統(tǒng)。在無需改變初始選擇過程中呈現(xiàn)的結(jié)構(gòu)限制的情況下，肽被高密度展示，從而提高了分離到忠實(shí)模擬天然表位的分子的可能性，免疫過程中維持最佳結(jié)構(gòu)的可能性，以及誘發(fā)相關(guān)抗體反應(yīng)的可能性。用于在MS2VLPs上構(gòu)建高復(fù)雜度隨機(jī)序列肽文庫的質(zhì)粒載體.利用MS2VLP隨機(jī)序列肽文庫的第一個(gè)試驗(yàn)在pET3d(帶有T7轉(zhuǎn)錄單位的氨芐青霉素抗性質(zhì)粒)的簡(jiǎn)單衍生質(zhì)粒中進(jìn)行。結(jié) 果對(duì)于方便地產(chǎn)生高復(fù)雜度文庫來說，這并非是最佳系統(tǒng)，發(fā)明人之后又制備了一系列結(jié)合了多種看似重要的任選特征的載體。所述特征表殼A.帶有方便插入AB環(huán)的克隆位點(diǎn)的單鏈ニ聚體。pDSPl (圖I)表達(dá)單鏈ニ聚體的編碼序列，所述序列經(jīng)過改造在AB環(huán)編碼序列里面或者附近含有例如獨(dú)特的SalI和KpnI限制性酶切位點(diǎn)。一般在外殼序列的下游包含BamHI位點(diǎn)。這種ニ聚體形式有助于簡(jiǎn)單地將外來序列克隆到AB環(huán)中。為了使這些位點(diǎn)是獨(dú)特的，需要破壞掉載體和上游外殼序列以及質(zhì)粒序列中的多個(gè)SalI和KpnI位點(diǎn)。B.卡那霉素抗性。pDSPl賦予對(duì)卡那霉素的抗體。這使得可以相對(duì)開始的高背景未轉(zhuǎn)化細(xì)胞挑選液體培養(yǎng)物中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，從而極大地促進(jìn)文庫的構(gòu)建。第一代質(zhì)粒載體帶來的氨芐青霉素抗性不適合這個(gè)目的，因?yàn)楸晦D(zhuǎn)化大腸桿菌會(huì)快速降解抗生素，導(dǎo)致驚人短的時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)物中即失去選擇的能力。這樣未轉(zhuǎn)化細(xì)胞就會(huì)過度生長(zhǎng)，而未轉(zhuǎn)化細(xì)胞顯然通常在群體中占絕大多數(shù)，即使使用的轉(zhuǎn)化方法效率高。C.M 13復(fù)制原點(diǎn)。到目前為止，發(fā)明人已經(jīng)通過這樣ー個(gè)步驟構(gòu)建了隨機(jī)序列文庫，所述步驟中利用PCR引物產(chǎn)生一端附著有隨機(jī)化序列的片段。片段然后用合適的限制性核酸內(nèi)切酶消化并克隆到PDSPl中的上述獨(dú)特位點(diǎn)(一般在SalI和BamHI之間，見圖I)。利用這種方法，發(fā)明人已經(jīng)制備了由多達(dá)IO9個(gè)獨(dú)立重組體構(gòu)成的文庫。但是，這種規(guī)模的文庫不方便用這些方法構(gòu)建；要構(gòu)建更大的文庫需要能夠有效產(chǎn)生比典型連接反應(yīng)中產(chǎn)生的重組DNA產(chǎn)量大得多的方法。具體來說，其他人已經(jīng)利用定點(diǎn)突變方法產(chǎn)生了 IO11復(fù)雜度范圍的絲狀噬菌體文庫(3)，發(fā)明人利用了所述方法的變化形式(2)。該方法依賴錯(cuò)配引物在dUTP取代的單鏈環(huán)形模板(通過將模板DNA生長(zhǎng)在諸如CJ236或BW313的dut_、ung_宿主即可實(shí)現(xiàn)dT被dU取代)上的延伸。為了產(chǎn)生隨機(jī)序列肽文庫，引物每邊含有通過與AB環(huán)任意一側(cè)外殼序列的序列互補(bǔ)旁接的隨機(jī)DNA序列。引物用DNA聚合酶進(jìn)行延イ申，利用DNA連接酶產(chǎn)生共價(jià)閉合的雙鏈環(huán)。轉(zhuǎn)化(例如通過電穿孔)ung+菌株導(dǎo)致強(qiáng)選擇性地増殖突變鏈，并且得到高產(chǎn)量的帶有插入序列的重組體。這些插入突變反應(yīng)可以對(duì)相對(duì)大量(例如20ug)的DNA進(jìn)行，通過電穿孔足以容易地產(chǎn)生IO11或以上數(shù)量級(jí)的獨(dú)立重組體。為了協(xié)助產(chǎn)生單鏈DNA，給質(zhì)粒中引入M 13復(fù)制原點(diǎn)，根據(jù)M 13原點(diǎn)的方向命名為pDSP61和pDSP62 (圖2)。還構(gòu)建了被稱為M13CM1的輔助噬菌體。它是M13K07的衍生物，其中的卡那霉素抗性被氯霉素抗性代替，使得能選擇同時(shí)存在輔助M13cml和pDSP6,后者賦予了卡那霉素抗性。M13輔助噬菌體超感染含有質(zhì)粒的dut_、ung_菌株(例如CJ236)很容易地產(chǎn)生dUTP取代的單鏈DNA。P.合成的“密碼子顛倒的”外殼基因。希望利用引物延伸突變來構(gòu)建文庫引起了新的問題，使得有必要給PDSP6引入所謂的“密碼子顛倒的”外殼序列。本發(fā)明的肽展示方法依賴于只給單鏈ニ聚體中兩個(gè)AB環(huán)中的一個(gè)特異引入外來肽的能力。在以上描述的方案中，致突變引物在正常情況下與單鏈ニ聚體的兩半均會(huì)退火，造成雙重插入。但發(fā)生在兩個(gè)AB環(huán)的同時(shí)插入會(huì)導(dǎo)致高頻率的蛋白折疊失敗。因?yàn)檫@個(gè)原因，合成了密碼子顛倒形式的外殼蛋白。所述密碼子顛倒形式在單鏈ニ聚體的上游一半中引入了最大可能數(shù)量的沉默核苷酸取代，因此產(chǎn)生具有野生型外殼蛋白氨基酸序列的多肽。但是大量突變的存在使密碼子顛倒的序列不能有效地與致突變寡核苷酸退火。這樣插入只針對(duì)單鏈ニ聚體下游一半。pDSPl 和 pDSP62 的變體，分別稱為 pDSPl (am)和 pDSP62 (am)保留了 pDSPl 和PDSP62的所有特征，但通過定點(diǎn)突變將丙氨酸密碼子(限定單鏈ニ聚體中下游外殼蛋白拷貝的第一個(gè)氨基酸)轉(zhuǎn)換為UAG(被稱為琥珀密碼子的特異無義或終止密碼子)。該終止密碼子被阻遏時(shí)即可由単一 mRNA合成野生型和單鏈ニ聚體型外殼蛋白。這就能夠如下文更 詳細(xì)描述的控制肽展示的平均效價(jià)。通讀無義密碼子通常需要有被抑制的特定終止密碼子的特異性抑制型tRNA。對(duì)所有三種終止密碼子有活性的抑制型tRNAs已有描述，是分子生物學(xué)家熟知的。本文描述的工作使用了琥珀密碼子，因此需要用到琥珀抑制型tRNA，在這里經(jīng)特別設(shè)計(jì)可以插入丙氨酸。但是應(yīng)當(dāng)明白，可以類似地使用對(duì)其他終止密碼子(UAA和UGA)特異的并且能插入各種氨基酸的抑制型tRNAs。為了在細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生抑制型tRNA，制備了名為pWsupA的質(zhì)粒(見圖3)。該質(zhì)粒是PACYC18的衍生質(zhì)粒，含有來源于pl5A質(zhì)粒不相容群的復(fù)制原點(diǎn)。它還提供對(duì)氯霉素的抗性。這意味著它能穩(wěn)定保持在已含有pDSPl (am)或pDSP62 (am)的細(xì)菌細(xì)胞中，這兩種質(zhì)粒含有ColEl原點(diǎn)并賦予對(duì)卡那霉素的抗性。質(zhì)粒P匪supA還含有Iac啟動(dòng)子和來自pUC18的多接頭位點(diǎn)，所述多接頭位點(diǎn)中插入了合成的抑制型tRNA基因。tRNA基因的轉(zhuǎn)錄處于Iac啟動(dòng)子的控制下，意味著Iac操縱子(例如IPTG)的誘導(dǎo)物可以調(diào)控抑制型tRNA的合成。合成tRNA基因的序列模仿了 Kleina et al. (4)先前描述的，序列如下所示。序列旁側(cè)是協(xié)助它克隆到P匪supA中的EcoRI和Pstl位點(diǎn)。GAATTCGGGGCTATAGCTCAGCTGGGAGAGCGCTTGCATCTAAAGCAAGAGGTC AGCGGTTCGATCCCGCTTAGCTCCACCACTGCAG已知改變抑制型tRNA的水平也會(huì)改變無義抑制的水平。這樣通過改變由pDSPl (am)或pDSP62 (am)合成單鏈ニ聚體的水平，相信有可能控制每個(gè)VLP上展示的肽的平均數(shù)量，從而能在大范圍內(nèi)控制展示效價(jià)。雖然P匪supA使用的是Iac啟動(dòng)子，但應(yīng)當(dāng)清楚有多種啟動(dòng)子可以用于控制抑制型tRNA的合成，其中的ー些(例如丙酸酯操縱子(5)的啟動(dòng)子)實(shí)際上能更好地對(duì)不同濃度的相應(yīng)誘導(dǎo)物提供有控制的漸變的反應(yīng)。III.調(diào)控展示效價(jià)·控制MS2VLP上展示的肽數(shù)量的手段是人們希望擁有的。MS2VLP展示的多效價(jià)性(每顆粒90拷貝的表位)使得很難將展示對(duì)抗體有內(nèi)在高親和カ的肽的VLPs與那些展示的肽的內(nèi)在親和カ低，但通過參與多個(gè)弱相互作用仍能緊密結(jié)合的VLPs區(qū)分開(即親合力vs.親和力)。這是眾所周知的絲狀噬菌體展示存在的問題，在這種展示方法中選擇高親和力相互作用通常要求使用低展示效價(jià)。選擇親和カ最高的肽時(shí)會(huì)提高發(fā)現(xiàn)合適分子模擬物的可能性。以下描述了降低展示效價(jià)，從而提高選擇嚴(yán)緊度的方法。調(diào)控效價(jià)。我們認(rèn)為選擇對(duì)給定單克隆抗體有最高親和カ的肽能夠提供天然抗原的最佳分子模擬物，而這些分子模擬物最有可能誘發(fā)相關(guān)抗體反應(yīng)。理想情況下，策略是利用多效價(jià)展示進(jìn)行第一輪篩選，從而獲得包含所有對(duì)目標(biāo)物有某些低親和力的肽的相對(duì)復(fù)雜群體。然后希望在后續(xù)的輪中降低展示效價(jià)從而提高親和選擇的嚴(yán)緊度。這個(gè)策略中提供了由単一 RNA產(chǎn)生大量野生型和少量AB環(huán)重組蛋白的系統(tǒng)。構(gòu)建了 pDSPl(pDSPl(am))的變體，所述變體含有琥珀終止密碼子代替了通常是編碼單鏈ニ聚體中下游拷貝外殼蛋白的第一個(gè)氨基酸的丙氨酸密碼子(見圖3)。因此pDSPl(am)正常情況下只產(chǎn)生野生型外殼蛋白，自然通常組裝成VLP。此外，發(fā)明人合成并克隆了丙氨酸插入的抑制型tRNA基因。在來自不同相容群的氯霉素抗性質(zhì)粒上的Iac啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)控下，產(chǎn)生的抑制型tRNA量導(dǎo)致翻譯外殼序列的核糖體有小部分通讀過琥珀(終止)密碼子，產(chǎn)生單鏈ニ聚體。這樣得到的蛋白質(zhì)(和它的外來肽)與由相同mRNA表達(dá)的野生型蛋 白共組裝，形成鑲嵌的衣売。由該載體制備了純化的VLPs，據(jù)估計(jì)每個(gè)VLP平均展示大約三個(gè)肽。SDS凝膠電泳(見圖4)顯示了純化VLPs中“通讀”產(chǎn)物的內(nèi)容。這些經(jīng)檢測(cè)證實(shí)親和選擇的嚴(yán)緊度如預(yù)期的得以提高。瓊脂糖凝膠電泳和Northern印跡驗(yàn)證了顆粒包有相關(guān)RNA。如果需要，可以通過降低抑制型tRNA的表達(dá)水平進(jìn)ー步減少效價(jià)。事實(shí)上，通過調(diào)節(jié)抑制型tRNA合成水平是有可能在大范圍內(nèi)調(diào)控通讀產(chǎn)物的表達(dá)(和展示效價(jià))的。實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)可以通過利用啟動(dòng)子(例如proB)引導(dǎo)tRNA的表達(dá)，所述啟動(dòng)子的活性可以作為誘導(dǎo)物濃度的函數(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確地調(diào)整。抗原片段庫替代的策略利用現(xiàn)有的已克隆的抗原基因或病原體基因組來制備隨機(jī)抗原片段文庫。有多種方法可以制備這類文庫。ー種方法涉及對(duì)抗原基因進(jìn)行隨機(jī)片段化，例如通過用DNaseI處理來產(chǎn)生適宜平均大小(例如 30bp)的片段。將它們平末端連接到編碼外殼多肽的基因中的合適位點(diǎn)(例如連接到單鏈外殼蛋白ニ聚體的AB環(huán)中)。然后對(duì)得到的文庫進(jìn)行親和選擇來回收展示抗體識(shí)別的肽的VLPs。在特定實(shí)施方案中，可以在外殼多肽的AB環(huán)或N末端插入限制性酶切位點(diǎn)。合成RNA噬菌體VLPs通常是由質(zhì)粒在活的大腸桿菌細(xì)胞中產(chǎn)生的，大腸桿菌被裂解并提取VLPs。在發(fā)明人到此為止進(jìn)行的和本申請(qǐng)其他地方描述的試驗(yàn)中，MS2和PP7VLPS上的隨機(jī)序列肽文庫正是以這種方式產(chǎn)生的。但是，在特定替代實(shí)施方案中，本發(fā)明的群體可以利用本領(lǐng)域已知的步驟(參見例如美國專利7，008，651 ;Krarner el ah, 1999. Cell-freeしoupled i'ranscription-translation Systems From E.coli,In Protein Expression0APractical Approach, Higgins and Hames (eds.), Oxford University Press),在偶聯(lián)的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中合成。在特定實(shí)施方案中，噬菌體T7 (或相關(guān)的)RNA聚合酶被用于在系統(tǒng)中引導(dǎo)克隆到T7啟動(dòng)子的調(diào)控下的基因的高水平轉(zhuǎn)錄，所述系統(tǒng)經(jīng)優(yōu)化能夠高效地翻譯這樣產(chǎn)生的大量RNA (參見例如Kim et al, 1996，Eur J Biochem 239:881-886; Jewettet al. . 2004, Biotech and Bioeng 86:19-26)。體內(nèi)產(chǎn)生VLPs吋，大腸桿菌細(xì)胞自身提供區(qū)室化確保多拷貝給定外殼蛋白-肽重組體特異地和它的mRNA組裝。除非提供類似形式的區(qū)室化，否則在由模板混合物(即文庫)進(jìn)行體外合成的過程中，特別是在本發(fā)明的群體中，有可能不同(區(qū)別在于它們?nèi)诤狭瞬煌碾?的個(gè)體外殼多肽會(huì)相互包裝mRNAs，從而破壞了有效噬菌體展示所需要的基因型/表現(xiàn)型之間的聯(lián)系。而且，因?yàn)槊總€(gè)VLP是由多個(gè)亞基組裝而成的，可能發(fā)生雜合VLPs的形成。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)制備本發(fā)明的群體或文庫時(shí)，一或多輪轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)在水/油乳劑(Tawfik et al. , 1998, Nat Biotechnol 16:652-6)中進(jìn)行。在這種目前已成熟的方法中，各個(gè)模板被隔離到水/油乳劑的水性區(qū)室內(nèi)。在合適的條件下，可以形成數(shù)量巨大的小水滴，每個(gè)平均含有單個(gè)DNA模板分子和轉(zhuǎn)錄/翻譯機(jī)制。這些區(qū)室由于被油環(huán)繞，相互之間沒有溝通。在這種液滴中合成的外殼多肽會(huì)特異地與編碼它們的相同mRNAs關(guān)聯(lián)，應(yīng)當(dāng)會(huì)組裝成只展示一個(gè)肽的VLPs。合成后，將乳劑破壞，回收VLPs進(jìn)行選擇。在ー個(gè)特定實(shí)施方案中，所有轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)都是在水/油乳劑中進(jìn)行的。在ー個(gè)特定實(shí)施方案中，只分離了每滴僅含ー個(gè)模板的液滴(只展示一個(gè)肽的VLPs)。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，在一或多輪轉(zhuǎn)錄/翻譯中分離含有混合VLPs的液滴，然后分離只展示ー個(gè)肽(每個(gè)液滴ー個(gè)模板)的VLPs。
VLPs和VLP群的用途本發(fā)明的VLPs和VLP群有許多可能的用途。正如以下更詳細(xì)描述的，VLPs可以作為免疫原性組合物，特別是疫苗；作為藥物遞送裝置；作為生物醫(yī)學(xué)顯像劑或者自組裝的納米裝置。本發(fā)明的VLP群可以用于挑選合適的疫苗候選物。疫苗候選物的選擇本發(fā)明的VLP群或文庫可以用于選擇疫苗候選物。所述文庫可以是隨機(jī)文庫或抗原性文庫。隨機(jī)肽序列文庫或者替代的來源于抗原的肽序列文庫展示在VLPs表面，然后利用抗體通過親和選擇分離特異目標(biāo)表位或者可能是模擬表位S。因?yàn)閂LPs包裹著自己的mRNAs，可以通過逆轉(zhuǎn)錄和PCR回收它們(以及它們的外來肽)的編碼序列。隨后可以將各個(gè)親和選擇到的VLP克隆、過表達(dá)和純化。噬菌體展示中的親和選擇技術(shù)已經(jīng)成熟，可以直接應(yīng)用于本發(fā)明的VLP展示系統(tǒng)。簡(jiǎn)單來說，允許抗體(或抗血清)與隨機(jī)序列展示文庫或抗原片段展示文庫中的VLPs上的肽形成復(fù)合體。一般抗體已用生物素進(jìn)行了標(biāo)記，這樣通過與包被鏈霉親和素的表面、磁珠或其他合適的固定基質(zhì)的結(jié)合即可捕獲到復(fù)合體。清洗后，將結(jié)合的VLPs洗脫，從親和選擇到的群中提取RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR來回收外殼編碼序列，然后將所述序列再克隆，進(jìn)行更多輪的表達(dá)和親和選擇，直至獲得結(jié)合最佳的變體。可以想到多種從VLPs回收RNA的方案。一個(gè)令人感興趣的可能是簡(jiǎn)單地將生物素-mAb-VLP復(fù)合體捕獲在包被鏈霉親和素的PCR管中，然后將VLPs熱變性，直接對(duì)其RNA成分進(jìn)行RT-PCR。存在許多顯然的替代方法，根據(jù)諸如各種固定基質(zhì)的結(jié)合容量的一些考慮，可能需要調(diào)整。選中的序列一旦經(jīng)RT-PCR回收了，它們的克隆和向大腸桿菌中的再次引入就很簡(jiǎn)單，每個(gè)階段需要注意保持必要的文庫多樣性，當(dāng)然這隨著每輪篩選而逐漸減少。但選擇結(jié)束時(shí)，可以將每個(gè)克隆過表達(dá)產(chǎn)生VLP疫苗候選物。為了確立在MS2VLP平臺(tái)上進(jìn)行的親和選擇的效率，利用單克隆抗體靶通過以上描述的方法進(jìn)行了選擇，所述抗體的表位已被很好地研究過。M2抗Flag單克隆抗體，和在pDSPl中構(gòu)建的文庫含有插入到氨基酸13和16的密碼子之間的十個(gè)NNS三聯(lián)密碼子(即13/16插入模式)。該特定文庫含有大約10個(gè)獨(dú)立克隆，高效價(jià)展示外來肽。自此，利用PDSP62已構(gòu)建了更復(fù)雜的文庫(見上文)，但pDSPl文庫被認(rèn)為足夠復(fù)雜，可以提供合理的可能性碰到Flag表位。第一輪選擇是對(duì)250ng通過吸附固定在塑料孔上的抗體進(jìn)行的，估計(jì)VLPs超過抗體分子10倍。充分洗滌后，將結(jié)合的VLPs洗脫，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)SalI和BamUI消化，被克隆到pDSP62中產(chǎn)生VLPs，用于第二輪。在這ー步和所有的后續(xù)輪中，被選中的分子的克隆產(chǎn)生了至少5x IO6個(gè)獨(dú)立克隆。第二輪在和第一輪相同的條件下進(jìn)行。第二輪和第三輪的產(chǎn)物被克隆到pDSP62(am)中，如上所述在有琥珀抑制序列(P匪supA)的情況下產(chǎn)生VLPs，意味著在第3和4輪中肽以低效價(jià)展示。第四輪中，抗體的量減少到50ng，這樣VLPs比抗體大約多50倍。第四輪后，估計(jì)到VLPs的過度產(chǎn)生和純化，將產(chǎn)物克隆到PDSP62中以便高效價(jià)展示。來自每輪的幾個(gè)選中序列如圖22所示。早期幾輪中獲得的序列與已知的Flag表位(DYKDDDDKL)只有有限的相似性，但某些關(guān)鍵元件已很明顯，包括特別是YK ニ肽。到第三輪，所有序列顯示出DYK元件和至少ー個(gè)下游的D。到第四輪，由接受序列分析的7個(gè)克隆只得到ー個(gè)序列。它與野生型Flag表位序列的相似性很明顯。Flag表位之前利用傳統(tǒng)的絲狀噬菌體展示方法進(jìn)行過鑒定，結(jié)果報(bào)道于NEB Transcript, Summer 1996 (NEB Transcript是卩遼菌體展不文庫和親和選擇試劑盒的供 應(yīng)商N(yùn)ewEngland Biolabs的出版物(其網(wǎng)站www. Neb. com有提供)。圖22報(bào)道的序列事實(shí)上比NEB試驗(yàn)中獲得的序列與實(shí)際表位更吻合，這表明在通過親和選擇進(jìn)行表位鑒定方面，MS2VLP展示系統(tǒng)至少與絲狀噬菌體展示ー樣有效。免疫原性組合物正如以上提到的，通過本發(fā)明的篩選過程鑒定到的VLPs可以用于配制免疫原性組合物，特別是疫苗。所述疫苗應(yīng)當(dāng)處于能夠被給予動(dòng)物的形式。一般來說，疫苗包含常規(guī)的鹽或緩沖水溶液基質(zhì)，其中懸浮或者溶解有本發(fā)明的組合物。以這種形式，本發(fā)明的組合物可以方便地用于預(yù)防、緩解或者其他方式地處置狀況或紊亂。被引入宿主后，疫苗能夠激發(fā)免疫反應(yīng)，包括但不限于產(chǎn)生抗體和/或細(xì)胞因子和/或激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、樹突細(xì)胞和/或其他細(xì)胞反應(yīng)。任選地，本發(fā)明的疫苗還包含與本發(fā)明的組合物相比處于次要或主要部分的佐齊U。術(shù)語“佐劑”用于本文是指非特異性免疫反應(yīng)刺激劑；或者是在宿主中形成儲(chǔ)庫，與本發(fā)明的疫苗組合起來可以提供進(jìn)ー步加強(qiáng)的免疫反應(yīng)的物質(zhì)。有多種佐劑可以使用。例子包括完全和不完全弗氏佐劑、氧化鋁和經(jīng)過修飾的胞壁酰ニ肽。任選地，本發(fā)明的疫苗還包含與本發(fā)明的組合物相比處于次要或主要部分的佐齊 。靶向的藥物遞送親和選擇可以用于鑒定與特異細(xì)胞受體結(jié)合的肽，從而產(chǎn)生能夠結(jié)合并(例如通過胞吞)進(jìn)入靶細(xì)胞的顆粒。MS2VLP是內(nèi)直徑在20nm數(shù)量級(jí)的空心球。在特定實(shí)施方案中，VLP包含待遞送的藥物(例如蛋白毒素)和任選的與細(xì)胞型特異的受體結(jié)合的配體。這種顆粒的內(nèi)部組成可以通過特異加載例如蛋白質(zhì)(比如蓖麻毒素)或者通過將它與合成的翻譯操縱序列模擬物偶聯(lián)來調(diào)控。通過賦予這些顆粒外表面與細(xì)胞型特異受體結(jié)合的能力，有可能將毒素(或其他藥物)靶向遞送到選定的細(xì)胞類型。在相關(guān)方面中，包含外殼多肽ニ聚體的VLP可能實(shí)際上包裹著諸如細(xì)菌毒素、佐劑或免疫刺激性核酸的異源物質(zhì)。
生物醫(yī)學(xué)顯像劑正如可以將藥物靶向到特異細(xì)胞類型，以同樣的方式也可以將磁共振成像使用的顯影劑遞送到特異細(xì)胞或組織，從而可能極大地提高M(jìn)RI的診斷威力。事實(shí)上，已用釓標(biāo)記MS2 顆粒來大大提高M(jìn)RI 的顯影(Anderson et al. , 2006, Nano Letters 6 (6)，1160-1164)。因此，在特定實(shí)施方案中，通過在顆粒表面展示合適的受體特異性肽，可以將它們靶向到特定部位。在相關(guān)方面中，包含外殼多肽ニ聚體的VLP可能實(shí)際上包裹著顯像劑。自組裝的納米裝置本發(fā)明的VLPs可能包含對(duì)絲狀噬菌體顆粒任一末端有親和カ的肽，其中所述噬菌體顆粒展示金屬結(jié)合蛋白。VLP對(duì)絲狀噬菌體顆粒任一端有親和カ就有可能將這些球(以及它們的任何內(nèi)容)連接到絲狀噬菌體納米絲的末端。替代地，VLPs可以展示金屬(例如金和鋅)結(jié)合肽，這樣有可能獲得具有特別的電學(xué)和光學(xué)特性的陣列。替代地，通過展示對(duì)特定表面有親和カ的肽，可能產(chǎn)生的VLPs自組裝成這些陣列的能力提高，或者可能改變 VLPs自身的自締合特性。實(shí)驗(yàn)綜述描述了兩個(gè)協(xié)助在噬菌體MS2的病毒樣顆粒(VLPs)上構(gòu)建隨機(jī)序列肽文庫的質(zhì)粒載體。第一個(gè)是pDSPl，構(gòu)建用于將PCR產(chǎn)生的或者其他的雙鏈DNA片段方便地克隆到外殼蛋白單鏈ニ聚體下游拷貝的AB環(huán)中。第二個(gè)稱為PDSP62，是特別構(gòu)建用于將肽序列通過Kunkel et al. [16]的定點(diǎn)突變方法引入單鏈ニ聚體的幾乎任何位點(diǎn)(通常是AB環(huán))。下文中給出了質(zhì)粒的一般特征。實(shí)施例IpDSPl-單鏈ニ聚體的表達(dá)質(zhì)粒,帶有方便插入AB環(huán)的克隆位點(diǎn)。質(zhì)粒pDSPl (見圖5a和7a)含有pET3d中的T7轉(zhuǎn)錄信號(hào)和pET9d中的卡那霉素抗性基因和復(fù)制原點(diǎn)(關(guān)于pET3d和pET9d的信息可見New England Biolabs的載體數(shù)據(jù)庫 https: //www. lablife. orR/ct f = v&a=listvecinfo)。該質(zhì)粒表達(dá) MS2 單鏈夕卜殼蛋白ニ聚體的編碼序列出)，所述序列經(jīng)過改造含有獨(dú)特的SalI和KpnI限制性酶切位點(diǎn)。這有助于簡(jiǎn)單地將外來序列克隆到AB環(huán)中。為了使這些位點(diǎn)是獨(dú)特的，需要破壞掉載體和上游外殼序列中的其他SalI和KpnI位點(diǎn)。用于pDSPl的AB環(huán)插入位點(diǎn)附近的MS2外殼序列如下所示。注意其中的SalI和KpnI位點(diǎn)。—6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22...…GlnPheValLeuValAspAsnGlyGlyThrGlyAspValThrValAlaPro…...CAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGTACCGGCGACGTGACTGTCGCCCA· · ·Sail KpnI如下所示是pDSPl中的隨機(jī)7聚體文庫的例子，其中隨機(jī)序列以所謂13/16模式插入。—6 7 8 9 10 11 12 1316 17 18 19 20 21 22...··· GlnPheValLeuValAspAsnGly x xx x xx xGlyAspValThrValAlaPro…· · ·CAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSGGCGACGTGACTGTCGCCCCA.
Sail編碼AB環(huán)的序列里面或者附近存在獨(dú)特的限制性酶切位點(diǎn)，這樣就可能在外來序列旁側(cè)有那些切割能夠產(chǎn)生相客“粘末端”的位點(diǎn)時(shí)，簡(jiǎn)單地將外來序列插入。但是，有時(shí)將PCR和圖5b中顯示的重組DNA方法聯(lián)用可以更方便地附著外來序列。例如，以下顯示的5’ -PCR引物可以與3’引物(與BamHI位點(diǎn)下游的質(zhì)粒載體序列退火)一起使用產(chǎn)生外殼蛋白編碼序列的ー個(gè)片段，其中在氨基酸13和16之間插入了隨機(jī)序列。N=A、C、G_T，S=G或C。片段用SalI和BamHI消化后，插入pDSPl的SalI和BamHI之間。如下所示是可用于制備這類文庫的5’引物的例子5’-CGCGTCGACAATGGC(NNS)7GGCGACGTGACTGTCGCCCCA-3"利用pDSPl，隨機(jī)序列肽文庫通常是通過將PCR片段克隆到AB環(huán)中構(gòu)建的，其中所述PCR片段是用單體外殼蛋白序列作為模板(例如pMCT)產(chǎn)生的。合成寡核苷酸5”引物經(jīng)設(shè)計(jì)可以給AB環(huán)緊鄰的上游位點(diǎn)加上SalI (或KpnI)位點(diǎn)和隨機(jī)密碼子序列(例如6_10 個(gè)拷貝的NNY)。3’引物與質(zhì)粒載體中緊鄰BamHI的下游的序列退火。這樣得到的PCR產(chǎn)物用SalI (或KpnI)和BamHI消化，克隆到pDSPl中的相應(yīng)位點(diǎn)。這使肽被插入AB環(huán)中，插入的準(zhǔn)確位點(diǎn)取決于5’引物的具體設(shè)計(jì)。對(duì)于多數(shù)插入，優(yōu)選使用SalI位點(diǎn)，因?yàn)樵谶x擇插入位點(diǎn)方面，它比KpnI靈活性更大。利用這些方法，可以比較簡(jiǎn)單直接地制備含有多達(dá)IO8-IO9個(gè)獨(dú)立成員的肽VLP文庫。為了引入ー個(gè)調(diào)控肽展示效價(jià)的手段，通過在單鏈ニ聚體兩部分相接處引入無義密碼子構(gòu)建了 PDSPl的衍生質(zhì)粒(稱為pDSPl (am))。在有無義抑制型tRNA(比如p匪supA產(chǎn)生的)的情況下被表達(dá)時(shí)，產(chǎn)生了少量的單鏈ニ聚體(以及它的外來肽)。但是由pDSPl (am)產(chǎn)生的外殼蛋白中大部分被合成為野生型的單位長(zhǎng)度的形式。兩種形式的外殼蛋白共組裝成雜合顆粒，平均只展示大約3個(gè)肽。通過改變抑制型tRNA的表達(dá)水平或者通過采用表現(xiàn)更強(qiáng)或更弱抑制效カ的抑制序列，可以上調(diào)或者下調(diào)展示效價(jià)的平均水平。實(shí)施例2pDSP62 -適合用于利用有效的定點(diǎn)突變法進(jìn)行文庫構(gòu)建的質(zhì)粒M 13復(fù)制原點(diǎn)的引入。象以上描述的用pDSPl構(gòu)建文庫的方法很難加大規(guī)模，因?yàn)榧兓匾康腄NA限制酶切片段不方便。而且，在連接反應(yīng)過程中，某些DNA不可避免地被轉(zhuǎn)化成沒有用處的副產(chǎn)品，因此減少了所需質(zhì)粒的產(chǎn)量。復(fù)雜文庫的構(gòu)建會(huì)得益于能夠有效產(chǎn)生比典型的連接反應(yīng)產(chǎn)量更大的正確重組DNA的方法。具體來說，優(yōu)選使用舊的定點(diǎn)突變方法的變化形式，該變化形式的方法已被其他人用于在絲狀噬菌體上產(chǎn)生IO11復(fù)雜度范圍的肽文庫(2，6)。該方法被應(yīng)用于由含有M 13復(fù)制原點(diǎn)的特定類型的質(zhì)粒(又稱為噬粒)產(chǎn)生的單鏈環(huán)形DNA。用Ml3輔助噬菌體(例如M13K07)感染含有質(zhì)粒的dut' ung—菌株(例如BW313)容易地產(chǎn)生dUTP取代的單鏈DNA。在實(shí)際的突變反應(yīng)中，錯(cuò)配的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板退火，并用DNA聚合酶(例如T7噬菌體的)使之延伸。將DNA連接產(chǎn)生閉合的環(huán)形DNA，通過轉(zhuǎn)化引入ung+菌株，在這里突變鏈被完美地復(fù)制。制備肽-VLP文庫的經(jīng)驗(yàn)表明大約90%的轉(zhuǎn)化子含有希望的肽插入片段。引物延伸突變反應(yīng)可以在較大量的DNA(例如20ug)上進(jìn)行，通過電穿孔足以容易地產(chǎn)生IO11數(shù)量級(jí)的獨(dú)立重組體。為了協(xié)助單鏈DNA的產(chǎn)生，將M 13復(fù)制原點(diǎn)引入pDSPl。為此，pUC119中存在的M 13原點(diǎn)經(jīng)PCR擴(kuò)增并克隆到pDSPl中獨(dú)特的AlwNI位點(diǎn)中。該質(zhì)粒(稱為pDSPl -IG)是PDSP62的來源。因?yàn)樗皇菢?gòu)建PDSP62I的一個(gè)中間體，其序列未顯示。利用合成的“密碼子顛倒”外殼基因?qū)⒉迦肫伟邢虻絾捂湧司垠w的兩半之一。利用引物延伸突變來有效地構(gòu)建肽文庫的愿望帶來了新的問題。本發(fā)明的展示方法依賴于只向單鏈ニ聚體兩個(gè)AB環(huán)中的一個(gè)特異引入外來肽的能力。利用pDSPl中的單鏈ニ聚體序列，致突變引物會(huì)與兩半的序列都退火，造成雙重插入，但已經(jīng)知道發(fā)生在兩個(gè)AB環(huán)的插入會(huì)導(dǎo)致高頻率的蛋白折疊失敗。而且，即使插入被容忍了，不能只靶向單鏈ニ聚體兩部分中的ー個(gè)的定點(diǎn)突變會(huì)造成每個(gè)VLP上展示兩個(gè)不同的肽。因?yàn)檫@些原因，合成了“密碼子顛倒”形式的外殼蛋白，并替換了單鏈ニ聚體中正常的上游一半。密碼子顛倒的序列含有最大可能數(shù)量的沉默核苷酸取代，因此產(chǎn)生具有野生型外殼蛋白氨基酸序列的多肽。但是，大量突變的存在使得顛倒的序列不能有效地與致突變寡核苷酸退火，因此致突變引物被特異地引導(dǎo)到下游AB環(huán)序列。質(zhì)粒pDSP62如圖6 所示，圖7b提供了它的序列。用于產(chǎn)生單鏈PDSP62的氯霉素抗性M 13輔助噬菌體。質(zhì)粒PDSP62賦予卡那霉素抗性。通常用于產(chǎn)生單鏈?zhǔn)闪NA的輔助噬菌體(例如M13K07)也可賦予卡那霉素抗性，因此不適合與本文描述的質(zhì)粒一起使用。為此，構(gòu)建了 M13K07的氯霉素抗性衍生質(zhì)粒M13CM1。用能夠添加XhoI和SacI的識(shí)別序列的引物經(jīng)PCR擴(kuò)增pAC YC184(7)中的氯霉素抗性基因，將片段插入M13K07，借助基本側(cè)接卡那霉素抗性決定基因的XhoI和SacI位點(diǎn)代替它的卡那霉素抗性基因。在有卡那霉素(維持PDSP62)和氯霉素(用于選擇輔助噬菌體)的情況下，細(xì)胞在感染M 13CM I后產(chǎn)生大量單鏈質(zhì)粒DNA0利用這些單鏈模板和Kunkel et al.的方法(2)，容易地給[NNS]6、[NNS]7、[NNS]8和[NNSL。制備了含有IOltl個(gè)以上獨(dú)立成員的隨機(jī)序列肽文庫。通過擴(kuò)展規(guī)模，有可能達(dá)到顯著更高的復(fù)雜度。為了引入ー個(gè)調(diào)控肽展示效價(jià)的手段，通過在單鏈ニ聚體兩部分相接處引入無義密碼子構(gòu)建了 PDSP62的衍生質(zhì)粒(稱為pDSP62(am))。在有無義抑制型tRNA(比如P匪supA產(chǎn)生的)的情況下被表達(dá)時(shí)，產(chǎn)生了少量的單鏈ニ聚體(以及它的外來肽)。但是由pDSPl(am)產(chǎn)生的外殼蛋白中大部分被合成為野生型的單位長(zhǎng)度的形式。兩種形式的外殼蛋白共組裝成雜合顆粒，平均只展示大約3個(gè)肽。通過改變抑制型tRNA的表達(dá)水平或者通過采用表現(xiàn)更強(qiáng)或更弱抑制效カ的抑制序列，可以上調(diào)或者下調(diào)展示效價(jià)的平均水平。正如以上描述的，噬菌體MS2的病毒樣顆粒被用于肽展示，確認(rèn)MS2外殼蛋白單鏈ニ聚體能夠高度容忍肽插入，它們產(chǎn)生正確組裝的VLPs，所述VLPs特異地包裹著編碼其合成的mRNA[2])。但是MS2只是具有相似分子生物學(xué)的病毒大家族中的ー個(gè)成員。上文描述的質(zhì)粒和方法代表了對(duì)先前描述的MS2VLP展示系統(tǒng)的細(xì)微改良，發(fā)明人在之前的描述中展示了 MS2外殼蛋白單鏈ニ聚體對(duì)插入的容忍和MS2VLP包裹引導(dǎo)其合成的mRNA的能力。下面的實(shí)施例記錄了近期在PP7VLPS中獲得的類似結(jié)果，特別顯示了 PP7單鏈外殼蛋白ニ聚體的折疊和組裝也表現(xiàn)出對(duì)外來肽插入的高度容忍和這樣獲得的VLPs含有mRNA形式的決定其合成的遺傳信息。因此這里描述了為了肽展示，銅綠假單胞菌的噬菌體PP7的VLPs的制造。PP7VLPS相比MS2VLP具有幾個(gè)潛在的優(yōu)勢(shì)和改進(jìn)。首先，因?yàn)榇嬖谄鸱€(wěn)定作用的亞基間ニ硫鍵，顆粒在熱動(dòng)力學(xué)上顯著地更穩(wěn)定(8)。對(duì)于許多實(shí)際應(yīng)用，包括疫苗，穩(wěn)定性提高是人們所希望的特點(diǎn)。其次，PP7VLPS與MS2的VLPs沒有免疫學(xué)上的交叉反應(yīng)性(9)。這對(duì)需要連續(xù)給予VLPs的疫苗或靶向藥物遞送應(yīng)用可能很重要。第三，預(yù)計(jì)PP7VLP的正確折疊和組裝可能更能抵抗肽插入的失穩(wěn)效應(yīng)，或者可能至少對(duì)某些MS2VLPS不能容忍的肽能夠容忍。實(shí)施例3PP7肽展示載體的設(shè)計(jì)。為了在大腸桿菌中合成PP7外殼蛋白，構(gòu)建了兩種一般質(zhì)粒(見圖9和13)。第一種從Iac啟動(dòng)子表達(dá)外殼蛋白，用于(與pRZP7組合-見下文)利用翻譯抑制序列和VLP組裝分析來檢驗(yàn)外殼蛋白對(duì)肽插入的容忍性。第二種質(zhì)粒類型從T7啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子表達(dá)外殼蛋白。這些質(zhì)粒產(chǎn)生大量能夠正確組裝成VLP的外殼蛋白。它們還產(chǎn)生帶有各別5’和3’末端的外殼特異的mRNA被包裹到VLPs中。 肽插入位點(diǎn)的設(shè)計(jì)。PP7衣殼的三維結(jié)構(gòu)顯示它是由外殼蛋白構(gòu)成的，所述外殼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)與MS2的高度相似，盡管這兩個(gè)蛋白的氨基酸序列只表現(xiàn)出大約12%的序列同一性(10) [17]。PP7蛋白具有ー個(gè)AB環(huán)，可以按照與先前描述的用于MS2的方案[2]類似的方案插入肽。如MS2的情況一祥，開始是對(duì)PP7外殼序列進(jìn)行突變使其含有限制性核酸內(nèi)切酶KpnI的位點(diǎn)，從而協(xié)助在稱為PP7K的質(zhì)粒中插入外來序列(圖9a)。這個(gè)改造導(dǎo)致的氨基酸取代(EllT)如圖10所示。該取代被很好地容忍，因?yàn)橥蛔凅w外殼蛋白阻遏了翻譯并正確組裝成VLP。同樣遵循MS2的例子，假設(shè)單鏈ニ聚體形式的PP7外殼蛋白的折疊比常規(guī)ニ聚體更容忍AB環(huán)插入。先前描述過它的構(gòu)建(8)，但這里第一次描述了它在肽展示中的用途。單鏈ニ聚體經(jīng)過改造只在編碼序列的下游拷貝含有KpnI位點(diǎn)，形成p2P7K32(圖％)。在這個(gè)設(shè)計(jì)中，肽被插入到氨基酸11，但應(yīng)當(dāng)指出可以使用其他特定插入位點(diǎn)，可能AB環(huán)中任何位點(diǎn)都可以。事實(shí)上，以下檢測(cè)中描述了兩種替代的插入模式(圖10和11)。第一種稱為11/11模式，因?yàn)榈?1個(gè)氨基酸出現(xiàn)了兩次一插入肽N端ー側(cè)的thr，和C端ー側(cè)的野生型glu 11。在所謂11/12模式中,插入的一側(cè)鄰接thrll,另ー側(cè)鄰接ala 12。為了測(cè)試PP7外殼蛋白對(duì)AB環(huán)插入的一般容忍性,利用圖11顯不的方案制備了插入到PP7外殼蛋白AB環(huán)中的隨機(jī)序列肽的文庫。所述隨機(jī)序列由6、8或10個(gè)拷貝的NNY序列(其中N是任意核苷酸，Y是嘧啶)構(gòu)成。這些文庫含有20種可能的氨基酸中的15種，因此可能呈現(xiàn)極大的多祥性。但是，通過避開終止密碼子可以大大地協(xié)助后續(xù)分析。實(shí)施例4檢驗(yàn)隨機(jī)序列肽文庫中個(gè)體成員保持外殼蛋白功能的方法。PP7外殼和MS2外殼蛋白一樣是翻譯阻遏物。pRZP7的構(gòu)建之前已有描述，該質(zhì)粒將PP7翻譯操縱序列與大腸桿菌IacZ基因融合在一起，使β -半乳糖苷酶的合成處于外殼蛋白的翻譯阻遏物活性的控制下(11)。因?yàn)樵撡|(zhì)粒賦予對(duì)不同抗生素(氯霉素)的抗性，并且來自不同的相容群(即它使用的是Ρ15Α復(fù)制原點(diǎn))，可以容易地將它與ΡΡ7Κ或ρ2Ρ7Κ32(這兩個(gè)質(zhì)粒賦予對(duì)氨芐青霉素的抗性，使用colEl原點(diǎn))保持在相同的大腸桿菌菌株中。兩個(gè)質(zhì)粒均來源于PUCl 19，以較低的水平從Iac啟動(dòng)子表達(dá)外殼蛋白。由pP7K或Ρ2Ρ7Κ32表達(dá)的ΡΡ7外殼蛋白阻遏pRZP7表達(dá)的β -半乳糖苷酶的翻譯。這使得很容易確定某個(gè)給定肽插入是否會(huì)干擾外殼蛋白正確折疊的能力，因?yàn)槿毕萃鈿さ鞍自诤笑?半乳糖苷酶產(chǎn)色物質(zhì)(稱為xgal)的平板上產(chǎn)生藍(lán)色菌落，而功能正常的外殼蛋白生成白色菌落。對(duì)功能的維持情況更嚴(yán)格的檢驗(yàn)是直接分析表達(dá)肽-外殼蛋白重組體的細(xì)胞的裂解物中是否存在VLPs。這可以通過將超聲破碎的細(xì)胞在瓊脂糖凝膠上電泳來實(shí)現(xiàn)。溴化こ錠染色檢測(cè)含有RNA的VLP，然后用抗PP7血清經(jīng)Western印跡分析來證實(shí)VLP的存在。然后想法是通過制備隨機(jī)序列肽文庫以及確定克隆中維持翻譯阻遏物功能(即產(chǎn)生白色菌落)并產(chǎn)生VLP的部分來測(cè)試PP7外殼蛋白和組裝對(duì)肽插入的容忍性。注意發(fā)明人先前已報(bào)道過關(guān)于MS2外殼蛋白單鏈ニ聚體對(duì)肽插入容忍性的類似測(cè)試[2]。實(shí)施例5PP7外殼蛋白的折疊和組裝能夠容忍多數(shù)隨機(jī)6聚體、8聚體和10聚體肽插入。 在pP7K和ρ2Ρ7Κ32中構(gòu)建(NNY)8文庫，并通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌菌株CSH41F-/PRZP7。轉(zhuǎn)化子鋪含有xgal的固體培養(yǎng)基平板。絕大多數(shù)是真正的重組體，因?yàn)椴缓迦肫蔚膶?duì)照連接反應(yīng)產(chǎn)生少IOOOx的菌落。只檢驗(yàn)了少數(shù)幾個(gè)ρΡ7Κ重組體，但發(fā)現(xiàn)全部是蛋白折疊缺陷的，不能產(chǎn)生VLPs。這證實(shí)了根據(jù)以前用MS2進(jìn)行的試驗(yàn)[2]產(chǎn)生的預(yù)期，即AB環(huán)中的肽插入通常會(huì)破壞常規(guī)ニ聚體的穩(wěn)定性。而在p2P7K32的單鏈ニ聚體中，幾乎100%的菌落是白色的。從每個(gè)文庫取24個(gè)白色菌落轉(zhuǎn)移到一式兩份的Iml培養(yǎng)物中。由一組培養(yǎng)物制備粗細(xì)胞裂解物進(jìn)行VLPs的瓊脂糖凝膠分析。由另ー組培養(yǎng)物，分離質(zhì)粒進(jìn)行限制性酶消化和凝膠電泳，驗(yàn)證全部含有預(yù)期長(zhǎng)度的插入片段。來自少數(shù)幾個(gè)藍(lán)色菌落的質(zhì)粒也進(jìn)行了分離。結(jié)果全部都含有異常連接反應(yīng)造成的質(zhì)粒，一般不含完整的外殼序列。Virtually100%的肽插入與外殼蛋白的翻譯抑制功能相符。就是說，它們產(chǎn)生了折疊足夠正確的外殼蛋白，象野生型蛋白一祥抑制翻譯。所有NNY文庫-6聚體、8聚體和10聚體都得到這樣的結(jié)果，無論它們是以11/11還是11/12模式克隆的。為了直接檢驗(yàn)VLPs是否存在，從一式兩份的培養(yǎng)物中的每ー份制備粗細(xì)胞裂解物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。凝膠用溴化こ錠染色，一個(gè)拷貝轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上并用小鼠抗PP7血清和辣根過氧化物酶標(biāo)記的ニ抗探測(cè)。當(dāng)克隆在染色膠和Western印跡中都含有條帶時(shí)，該克隆被認(rèn)為是VLP合成陽性的。結(jié)果如圖13所示，表明幾乎所有6聚體克隆都產(chǎn)生了一定水平的VLP，盡管少數(shù)幾個(gè)顯示出下降的產(chǎn)量。11/11和11/12插入模式都是這樣的。絕大多數(shù)8聚體克隆也產(chǎn)生了容易識(shí)別的VLP。但是，隨著插入片段長(zhǎng)度增加到10聚體，效率似乎有所下降，但明顯多數(shù)克隆能夠產(chǎn)生VLP。注意各個(gè)顆粒的遷移率不同，這與預(yù)期的某些肽通過引入帶電荷的氨基酸改變了 VLP的表面電荷一致。實(shí)施例6PP7VLP包裹外殼特異性mRNA為了進(jìn)行高水平表達(dá)和RNA衣殼化測(cè)試，將pP7K和ρ2Ρ7Κ32中的ΡΡ7外殼序列克隆到含有Τ7啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子的質(zhì)粒中，產(chǎn)生的質(zhì)粒稱為ρΕΤΡ7Κ和ρΕΤ2Ρ7Κ32。質(zhì)粒在大腸桿菌菌株BL21(DE3)中合成大量外殼蛋白。按照以前的描述(11，12)，通過在Sepharose CL4B上層析將得到的VLPs純化。通過酚/氯仿抽提從VLPs中純化RNA，在一式兩份含有甲醛的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。ー份膠用溴化こ錠染色，另ー份轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜(Northern印跡)，在膜上用對(duì)外殼有義鏈特異的帶標(biāo)記合成寡核苷酸檢測(cè)PP7序列。用T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄pETP7K和pET2P732產(chǎn)生的RNAs作為標(biāo)準(zhǔn)。每個(gè)VLP含有優(yōu)勢(shì)種類，其遷移率與體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的相同，并且與PP7外殼特異探針特異地雜交。確認(rèn)PP7VLPS包裹著它們的mRNAs，建立了親和選擇所需要的基因型-表現(xiàn)型關(guān)聯(lián)。注意發(fā)明人先前報(bào)道過關(guān)于MS2外殼蛋白包裹其mRNA的能力的類似檢驗(yàn)。實(shí)施例7PP7VLPS上展示的肽被呈遞給免疫系統(tǒng)并且是免疫原性的。構(gòu)建了展示如圖10和15顯示的特定肽序列的PP7VLPS。所述肽序列包括被稱為Flag肽和來源于人16型乳頭瘤(HPV16)次要衣殼蛋白L2的序列、HIV_lgpl20的V3環(huán)以及炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原。為了說明這些插入肽的確展示在VLPs的表面，通過ELISA評(píng)估了抗HPV16L2的單克隆抗體(稱為RG-1)結(jié)合PP7L2_VLPs的能力。如圖16所示，RG-I與L2-VLPS結(jié)合，但不能結(jié)合展示V3肽的PP7VLPS。為了演示VLPs的免疫原性，按照以前 的描述[2]用V3-VLPS經(jīng)肌內(nèi)注射免疫小鼠。如圖17所示，來自小鼠的血清經(jīng)ELISA檢驗(yàn)，顯示具有高滴度IgG抗體能夠與合成形式的V3肽特異反應(yīng)。注意發(fā)明人先前報(bào)道過關(guān)于MS2VLPs上展示的肽的免疫原性的類似檢驗(yàn)。實(shí)施例8質(zhì)粒pET2P7K32和pDSP7是以上描述的MS2外殼蛋白產(chǎn)生者質(zhì)粒pDSPl和pDSP62的PP7類似物。為了控制PP7VLPs上的肽展示效價(jià)，還構(gòu)建了 pET2P7K32 (am)和pDSP7(am)。它們分別是pDSPl(am)和pDSP7 (am)的類似物。本文引用的所有專利、專利申請(qǐng)和出版物以及電子材料(包括例如提交到例如GenBank和RefSeq的核苷酸序列；和提交到例如SwissProt、PIR、PRF、PDB的氨基酸序列，以及由GenBank和RefSeq中的注釋編碼區(qū)翻譯得到的氨基酸序列)的全部公開內(nèi)容通過引用并入本文。如果通過引用并入的材料和原始提交的說明書中給出的材料之間存在任何不一致，以原始提交的說明書為準(zhǔn)。提供以上詳細(xì)描述和實(shí)施例僅是為了更清楚地理解發(fā)明。不應(yīng)理解為不必要的限制。發(fā)明不限于顯示和描述的確切細(xì)節(jié)，因?yàn)槟切?duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的變化也包括在權(quán)利要求所限定的發(fā)明范圍內(nèi)。所有標(biāo)題均是為了方便讀者，除非具體規(guī)定，否則不應(yīng)用來限制標(biāo)題后面的文字的含義。弓丨用文獻(xiàn)(第一組參考文獻(xiàn))I. Peabody, DSj Jordan, SKj Caldeiraj JCj Manifold-Wheeler, B，Medford, A andChackerian，B(2007)Immunogenic display of diverse peptides on virus-1 ikeparticles of RNA phage MS2. J. Mol. Biol. 380:252-263.2. KunkeI TA，Bebenek，McClary J. (1991) Eff icient Site-DirectedMutagenesis Using Uracil-Containing DNA. Methods Enzymol. 204:125-139.3. Sidhu SSj Lowman HB，Cunningham BCj Wells JA. (2000)Phage display forselection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328:333-363.4. Kleina LGj Masson J-Mj Normanly J，Abelson J，and Miller JH. (1990)Construction of Escherichia coli Amber Suppressor tRNA Genes.J.Mol.Biol. 213:705-717.
5. Lee SK and Deasling JD. (2005)A propionate-inducible expression systemfor enteric bacteria. Appl. Env. Microbiol. 71:6856-6862.6. Peabody, D. S. , and Limj F. (1996) Nucleic Acids Res 24，2352—2359.7. Chang，A. C.，and Cohen, S. N. (1978) J Bacteriol 134，1141-1156.8. Caldeiraj J. C.，and Peabody, D. S. (2007) J Nanobiotechnology 5，109. Olsthoornj R. C.，Garde, G.，Dayhuff，T.，Atkins, J. F.，and Van Duinj J.(1995)Virology206, 611-625.
10. Tars Kj F. K. ,Bundule M，Liljas L (2000) Virology 272, 331-33711. Lim，F(xiàn).，Downey，T. D.，and Peabody, D. S. (2001) Journal of BiologicalChemistry 276，22507-22512.12. Peabody, D. S. (1990) J Biol Chem 265，5684-5689.引用文獻(xiàn)(第二組參考文獻(xiàn))I. Caldeira Jdo C，Medford A, Kines RC, Lino CA，Schiller .IT, ChackerianB，Peabody Db: Immunogenic display of diverse peptides，including a broadlycross-type neutralizing human papillomavirus L2epitope，on virus—like particlesof the RNA bacteriophage PP7. Vaccine，28 (27):4384-4393.2.Peabody DS，Manifold-Wheeler B，Medford A，Jordan SK,do Carmo CaldeiraJ，しhackerian B:Immunogenic display of diverse peptides on virus-like particlesof RNA phage MS2. T Mol Biol2008. 380(1) :252-263.3. Lowman HB, Bass SH，Simpson N，Wells .TA: Selecting hiRh-affinity bindingproteins by monovalent phage display. Biochemistry 1991，30 (45):10832-10838.4. Sidhu SS，Lowman HB，Cunningham BC，Wells JAiPhaRe display for selectionof novel binding peptides. Methods in Ezymology 2000,328:333-363.5. Wells .TA:Hormone mimicry. Science 1996，273 (5274) : 449-450.6. Peabody PS:Subunit fusion confers tolerance to peptide insertions ina virus coat protein.Arch Biochem Biophysl997，347 (I):85-92.7. Peabody DS，Chakerian A : Asymme tr i c contributions to RNAbinding by the Thr (45)residues of the MS2coat protein dimer. .I Biol Chem1999，274(36):25403-25410.8. Lim F，Peabody DS:RNA recognition site of PP7coat protein. NucleicAcids Res2002，30(19):4138-4144.9. Lim F，Downey TP，Peabody DS: Translational repression and specificRNA binding by the coat protein of the Pseudomonas phage PP7.JBiolChem2001，276(25) :22507-22513.10. Kunkel TA，Bebenek K，Mcclary J:Efficient Site-Directed MutagenesisUsinR Uracil-ContaininR DNA. Methods in EnzymoloRy 1991,204:125-139.11· Tars K FK，Bundule M，Lilias L:The Three-Dimensional Structure ofBacteriophaRe PP7from Pseudomonas aeruRinosa at 3. 7A Resolution. Virology2000，272:331-337.
12. Kleina LG，Masson JM，Normanly J，Abelson J，Miller .TH:Construction ofEscherichia coll amber suppressor tRNA genes. II. Synthesis of additional tRNAgenes and improvement ofsuppressor efficiency. J Mol Biol1990,213 (4):705-717.13. Normanly J，Kleina LG，Masson JM，Abelson J，Miller .TH:Constructionof Escherichia coli amber suppressor tRNA genes. III. Determination of tRNAspecificity. T Mol Bioll990.213(4):719-726.14. Kunkel TA:Rapid and efficient site-specific mutagenesis withoutphenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A1985，82 (2):488-492.15. Maruyama IN，Maruyama HI， Brenner S: Lambda foo: a lambda phagevector for the expression of foreign proteins. Proc Natl Acad Sci U SA1994. 91 (17) :8273-8277.16. Mikawa YG，Maruyama IN，Brenner S: Surface display of proteins onbacteriophage lambda heads. J Mol Biol1996,262 (I):21~30.17.Dunn IS: Assembly of functional bacteriophage lambda virionsincorporating C—terminal peptide or protein fusions with the maior tailprotein. T Mol Bioll995. 248(3) :497-506.
權(quán)利要求
1.病毒樣顆粒(VLPs)群，其中每個(gè)VLP是(a)RNA噬菌體的VLP，其中所述VLP的一部分包含(b)所述RNA噬菌體的外殼多肽的單鏈二聚體，所述二聚體通過插入異源肽而被改造，所述二聚體包含上游和下游亞基，其中所述異源肽展示在所述VLP上并且(c)包裹所述噬菌體的mRNA，所述VLP展示低效價(jià)。
2.如權(quán)利要求I所述的群，其中所述異源肽至少有四個(gè)氨基酸長(zhǎng)。
3.如權(quán)利要求I所述的群，其中復(fù)數(shù)個(gè)所述噬菌體的所述外殼多肽是野生型外殼多肽，其余的外殼多肽包含含有異源肽的所述外殼多肽的單鏈二聚體，所述噬菌體選自MS2和 PP7。
4.如權(quán)利要求I所述的群，其中所述異源肽被插入在所述外殼多肽下游亞基的AB環(huán)內(nèi)或者所述RNA噬菌體外殼多肽的羧基末端內(nèi)。
5.如權(quán)利要求4所述的群，其中所述異源肽被插入在與所述RNA噬菌體外殼多肽羧基末端對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)。
6.如權(quán)利要求I所述的群，其中所述RNA噬菌體選自MS2或PP7、、R17、SP、PP7、GA、Mll、MXl、AP205、PRRl、f4、Cb5、Cbl2r、Cb23r、7s 和 f2。
7.如權(quán)利要求I所述的群，其中所述外殼多肽是單鏈二聚體，所述外殼多肽的下游拷貝在AB環(huán)被插入有至少4個(gè)氨基酸長(zhǎng)的異源肽而改造。
8.如權(quán)利要求I所述的群，其中所述VLP上展示了I到10個(gè)拷貝的所述異源肽。
9.如權(quán)利要求I所述的群，其中所述VLP上展示了I到5個(gè)拷貝的所述異源肽。
10.如權(quán)利要求I所述的群，其中所述VLP上展示了少于I個(gè)拷貝的所述異源肽。
11.如權(quán)利要求4所述的群，其中所述異源肽被插入在所述二聚體蛋白的羧基端，或者插入在所述外殼蛋白AB環(huán)中與下述對(duì)應(yīng)的位點(diǎn) (a)MS-2、R17和fr外殼多肽中的氨基酸11-17; (b)GA外殼多肽中的氨基酸10-16; (c)Q^和SP外殼多肽中的氨基酸10-17; (d)PP7外殼多肽中的氨基酸8-11，和 (e)PRRl外殼多肽中的氨基酸9-17。
12.分離的轉(zhuǎn)錄單位，其包含 細(xì)菌或噬菌體的啟動(dòng)子； RNA噬菌體單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列，包含上游亞基和下游亞基，用于插入異源肽的位于下游亞基中的位點(diǎn)； 終止密碼子，其代替了編碼所述外殼蛋白下游亞基的第一個(gè)氨基酸的密碼子；和 細(xì)菌或噬菌體的終止子。
13.如權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)錄單位，還包含丙氨酸插入性抑制型tRNA基因。
14.如權(quán)利要求12或13所述的分離的轉(zhuǎn)錄單位，其中所述啟動(dòng)子是噬菌體啟動(dòng)子，終止子是噬菌體終止子。
15.如權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)所述的分離的轉(zhuǎn)錄單位，其中異源肽的插入位點(diǎn)是限制性酶切位點(diǎn)。
16.如權(quán)利要求12-15中任一項(xiàng)所述的分離的轉(zhuǎn)錄單位，其中單鏈二聚體是改造過的單鏈外殼多肽二聚體，其中所述改造包括異源肽序列至少四個(gè)氨基酸插入在所述插入位點(diǎn)。
17.如權(quán)利要求12所述的分離的轉(zhuǎn)錄單位，其中所述轉(zhuǎn)錄單位不含翻譯操縱序列。
18.如權(quán)利要求12所述的分離的轉(zhuǎn)錄單位，其中所述轉(zhuǎn)錄單位包含翻譯操縱序列。
19.如權(quán)利要求12-18中任一項(xiàng)所述的分離的轉(zhuǎn)錄單位，其中所述終止密碼子是琥珀(UAG)^LS (UGA)或赭石(UAA)終止密碼子。
20.分離的轉(zhuǎn)錄單位，其包含噬菌體啟動(dòng)子，RNA噬菌體單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列，所述編碼序列中具有在所述二聚體下游一半中插入異源肽的位點(diǎn)，其中所述編碼序列包含位于所述二聚體上游一半中的密碼子顛倒的序列和任選的，噬菌體終止子。
21.如權(quán)利要求20所述的分離的轉(zhuǎn)錄單位，其中所述密碼子顛倒的編碼序列包含插入在所述二聚體上游一半中的復(fù)數(shù)個(gè)沉默核苷酸取代。
22.如權(quán)利要求19或20所述的分離的轉(zhuǎn)錄單位，其中所述單鏈外殼多肽二聚體的所述編碼序列包含終止密碼子，所述終止密碼子代替了編碼所述外殼蛋白下游亞基第一個(gè)氨基酸的密碼子。
23.如權(quán)利要求21所述的分離的轉(zhuǎn)錄單位，其中所述終止密碼子是琥珀(UAG)、乳白(UGA)或赭石(UAA)終止密碼子。
24.構(gòu)建病毒樣顆粒的文庫的方法，所述病毒樣顆粒展示低效價(jià)，其中每個(gè)病毒樣顆粒在所述病毒樣顆粒的至少一個(gè)單鏈二聚體但不是所有噬菌體外殼多肽二聚體的下游單鏈RNA中包含異源肽，所述方法包括 (a)提供復(fù)數(shù)個(gè)按照權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)錄單位； (b)用限制性酶處理(a)中的所述轉(zhuǎn)錄單位； (c)將異源肽的編碼序列插入所述轉(zhuǎn)錄單位，獲得轉(zhuǎn)錄單位群； ⑷表達(dá)(C)中的所述轉(zhuǎn)錄單位；和 (e)分離所述文庫。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄單位在偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)中表達(dá)。
26.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述異源肽至少四個(gè)核苷酸長(zhǎng)。
27.如權(quán)利要求24-26中任一項(xiàng)所述的方法，還包括在偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)中表達(dá)所述轉(zhuǎn)錄單位，并在區(qū)室化的水/油乳劑中進(jìn)行至少一輪偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯。
28.鑒定具有目標(biāo)性能的肽的方法，其包括 (a)提供權(quán)利要求I所述的低效價(jià)VLPs群；和 (b)對(duì)權(quán)利要求I所述群中的VLPs上表達(dá)的異源肽進(jìn)行目標(biāo)性能檢測(cè)，從而鑒定到具有目標(biāo)性能的肽。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中(a)中的VLPs群是通過在區(qū)室化的水/油乳劑中，在轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中由核酸模板表達(dá)轉(zhuǎn)錄單位而獲得的，所述轉(zhuǎn)錄單位包含噬菌體啟動(dòng)子和3’終止子；包含上游亞基和下游亞基的RNA噬菌體單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列；位于二聚體下游亞基的至少4個(gè)氨基酸單位的異源肽的插入位點(diǎn)；終止密碼子，其代替了編碼所述外殼蛋白下游亞基的第一個(gè)氨基酸的密碼子或者位于所述下游亞基的羧基端之后。
30.如權(quán)利要求28或29所述的方法，其中所述具有目標(biāo)性能的肽是免疫原性肽。
31.如權(quán)利要求28-30中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述具有目標(biāo)性能的肽是自體抗原的免疫原性片段。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述免疫原性片段是免疫原性HIV肽的片段。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述具有目標(biāo)性能的肽是模擬表位。
34.分離免疫原性蛋白的方法，其包括 (a)從按照權(quán)利要求24所述的方法構(gòu)建的VLPs群中鑒定所述免疫原性肽； (b)擴(kuò)增鑒定到的所述免疫原性肽；和 (c)分離所述免疫原性肽。
35.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述免疫原性肽是通過親和選擇分離到的。
36.分離的低效價(jià)展示RNA噬菌體VLP，其包含所述噬菌體的外殼多肽單鏈二聚體，通過在所述多肽的下游亞基插入異源肽而被修飾，其中所述異源肽展示在所述VLP上并且其中所述異源肽選自HIV肽、自體抗原、受體和結(jié)合細(xì)胞表面受體的配體、對(duì)絲狀噬菌體顆粒特異肽的任何一端有親和力的肽、金屬結(jié)合肽或者對(duì)所述噬菌體表面有親和力的肽，并且其中所述VLP上展示的異源肽不超過大約1-10個(gè)。
37.如權(quán)利要求36所述的分離的VLP，其中所述VLP偶聯(lián)有可檢測(cè)標(biāo)記。
38.分離的低效價(jià)展示RNA噬菌體VLP，其包含所述噬菌體的外殼多肽單鏈二聚體，通過插入異源肽而被修飾，其中所述異源肽展示在所述VLP上并且所述異源肽是藥學(xué)有效的異源多肽，所述異源多肽偶聯(lián)了配體以便與細(xì)胞受體結(jié)合，并且其中所述VLP上展示的異源肽不超過大約1-10個(gè)。
39.組合物，其包含權(quán)利要求36-38中任一項(xiàng)所述的VLP。
40.免疫原性組合物，其包含一或多個(gè)低效價(jià)RNA噬菌體VLPs并且包含所述噬菌體的外殼多肽單鏈二聚體，所述外殼多肽包含上游亞基和下游亞基，其中所述下游亞基通過插入免疫原性異源肽而被改造，其中所述VLP上展示的異源肽不超過大約1-10個(gè)。
41.如權(quán)利要求40所述的免疫原性組合物，其中所述異源肽被插入在下游亞基的羧基端。
42.如權(quán)利要求40所述的免疫原性組合物，其中所述異源肽被插入到下游亞基的AB環(huán)內(nèi)。
43.如權(quán)利要求40-42中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其中所述異源肽是自體抗原或其免疫原性片段。
44.如權(quán)利要求43所述的免疫原性組合物，其中所述自體抗原選自來源于下述的肽構(gòu)成的組ErbB-2、β淀粉樣蛋白、免疫球蛋白E(IgE)、胃泌素、胃促生長(zhǎng)素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、白介素(IL)-17、IL-23、IL-13、CCR5、CXCR4、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、血管緊張素11、TRANCE/RANKL和 MUC-1。
45.如權(quán)利要求40所述的免疫原性組合物，其中所述異源肽是HIV免疫原性肽。
46.如權(quán)利要求40所述的免疫原性組合物，其中所述異源肽被插入到所述外殼多肽的所述下游亞基N末端。
47.核酸構(gòu)建體，其包含 (a)細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子與噬菌體MS2單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列可操縱地關(guān)聯(lián)，其中所述外殼多肽二聚體編碼序列經(jīng)過改造限定一個(gè)第一限制性酶切位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于序列中限定外殼多肽二聚體AB環(huán)的那部分的5’方向； (b)第二限制性酶切位點(diǎn)，其位于外殼多肽二聚體編碼序列的3’方向；(C)抗生素抗性基因；和 (d)用于在原核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的復(fù)制原點(diǎn)，其中所述構(gòu)建體任選包含PCR引物，位于第一限制性酶切位點(diǎn)的5’方向和第二限制性酶切位點(diǎn)的3’方向。
48.如權(quán)利要求47所述的核酸構(gòu)建體，其包含的第一引物位于第一限制性酶切位點(diǎn)的5’方向，第二引物位于第二限制性酶切位點(diǎn)的3’方向。
49.如權(quán)利要求47所述的核酸構(gòu)建體，其中所述細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子是T7啟動(dòng)子，第一限制性酶切位點(diǎn)是SalI或KpnI限制性酶切位點(diǎn)，第二限制性酶切位點(diǎn)是BamHI位點(diǎn)，PCR引物是TP7，抗生素抗性基因是卡那霉素抗性基因，復(fù)制原點(diǎn)是col El ori。
50.如權(quán)利要求47、48或49所述的核酸構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體還包含位于第二限制性酶切位點(diǎn)5’方向的轉(zhuǎn)錄終止子。
51.如權(quán)利要求47、48或49所述的核酸構(gòu)建體，其中 (1)噬菌體MS2單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列包含編碼異源肽的核酸序列；和 (2)所述構(gòu)建體任選包含位于第二限制性酶切位點(diǎn)3’方向的轉(zhuǎn)錄終止子。
52.如權(quán)利要求51所述的核酸構(gòu)建體,其中所述異源肽選自HIV肽、自體抗原、Flag肽、來源于人16型乳頭瘤(HPV16)次要衣殼蛋白L2的氨基酸序列、HIV_lgpl20的V3環(huán)、炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原、受體、結(jié)合細(xì)胞表面受體的配體、對(duì)絲狀噬菌體顆粒特異肽的任何一端有親和力的肽、金屬結(jié)合肽或者對(duì)MS2表面有親和力的肽。
53.核酸構(gòu)建體，其包含 (a)細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子，其與噬菌體MS2單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列可操縱地關(guān)聯(lián)，其中所述單鏈二聚體序列的兩部分之一經(jīng)過多個(gè)沉默核苷酸取代的改造產(chǎn)生改造的二聚體，從而使得致突變寡核苷酸引物可以特異地與所述改造二聚體中被改造的一半或者未被改造的一半退火； (b)任選的限制性酶切位點(diǎn)，其位于外殼多肽二聚體編碼序列的3’方向； (c)PCR引物，位于第一限制性酶切位點(diǎn)的5’方向和第二限制性酶切位點(diǎn)的3’方向； (d)第一抗生素抗性基因； (e)用于在原核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的復(fù)制原點(diǎn)； (f)來自單鏈DNA噬菌體的第二復(fù)制原點(diǎn)；以及 (g)輔助單鏈DNA噬菌體，其經(jīng)過改造含有賦予對(duì)第二抗生素抗性的基因。
54.如權(quán)利要求53所述的核酸構(gòu)建體，其中所述編碼序列在AB環(huán)任意一側(cè)20個(gè)核苷酸單位內(nèi)有足夠數(shù)量的沉默核苷酸取代。
55.如權(quán)利要求53或54所述的核酸構(gòu)建體，其中針對(duì)第一抗生素抗性的抑制者是卡那霉素抗性基因，且輔助噬菌體經(jīng)改造含有賦予對(duì)氯霉素的抗性的基因。
56.如權(quán)利要求53或54所述的核酸構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體含包含位于第二限制性酶切位點(diǎn)3’方向的轉(zhuǎn)錄終止子。
57.如權(quán)利要求53或54所述的核酸構(gòu)建體，其中所述細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子是T7啟動(dòng)子，RNA噬菌體單鏈外殼多肽二聚體是MS2外殼蛋白單鏈二聚體，編碼序列含有最大可能數(shù)量的沉默核苷酸取代，限制性酶切位點(diǎn)是BamHI位點(diǎn)，PCR引物是TP7，對(duì)第一抗生素抗性的基因是卡那霉素抗性基因，輔助噬菌體基因經(jīng)過改造含有賦予對(duì)氯霉素的抗性的基因，復(fù)制原點(diǎn)是col El orio
58.如權(quán)利要求53或54所述的核酸構(gòu)建體，其中 (1)噬菌體MS2單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列還包含編碼異源肽的核酸序列；和 (2)所述構(gòu)建體任選包含位于第二限制性酶切位點(diǎn)3’方向的轉(zhuǎn)錄終止子。
59.如權(quán)利要求53或54所述的核酸構(gòu)建體，其中 (1)噬菌體MS2單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列還包含編碼異源肽的核酸序列； (2)所述構(gòu)建體任選包含位于第二限制性酶切位點(diǎn)3’方向的轉(zhuǎn)錄終止子；和 (3)第一抗生素的抗性基因是卡那霉素抗性基因，輔助噬菌體基因經(jīng)過改造含有賦予對(duì)氯霉素的抗性的基因。
60.如權(quán)利要求58所述的核酸構(gòu)建體,其中所述異源肽選自HIV肽、自體抗原、Flag肽、來源于人16型乳頭瘤(HPV16)次要衣殼蛋白L2的氨基酸序列、HIV_lgpl20的V3環(huán)、炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原、受體、結(jié)合細(xì)胞表面受體的配體、對(duì)絲狀噬菌體顆粒特異肽的任何一端有親和力的肽、金屬結(jié)合肽或者對(duì)MS2表面有親和力的肽。
61.如權(quán)利要求59所述的核酸構(gòu)建體,其中所述異源肽選自HIV肽、自體抗原、Flag肽、來源于人16型乳頭瘤(HPV16)次要衣殼蛋白L2的氨基酸序列、HIV_lgpl20的V3環(huán)、炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原、受體、結(jié)合細(xì)胞表面受體的配體、對(duì)絲狀噬菌體顆粒特異肽的任何一端有親和力的肽、金屬結(jié)合肽或者對(duì)MS2表面有親和力的肽。
62.如SEQID NOs 1-3所示的核酸構(gòu)建體。
63.原核細(xì)胞，所述原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求47-62所述的核酸構(gòu)建體。
64.如權(quán)利要求63所述的原核細(xì)胞，其中所述原核細(xì)胞是大腸桿菌菌株。
65.病毒樣顆粒，所述顆粒由轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求51所述的核酸構(gòu)建體的原核細(xì)胞表達(dá)。
66.病毒樣顆粒，所述顆粒由轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求52所述的核酸構(gòu)建體的原核細(xì)胞表達(dá)。
67.病毒樣顆粒，所述顆粒由轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求58所述的核酸構(gòu)建體的原核細(xì)胞表達(dá)。
68.病毒樣顆粒，所述顆粒由轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求59所述的核酸構(gòu)建體的原核細(xì)胞表達(dá)。
69.病毒樣顆粒，所述顆粒由轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求60所述的核酸構(gòu)建體的原核細(xì)胞表達(dá)。
70.病毒樣顆粒，所述顆粒由轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求61所述的核酸構(gòu)建體的原核細(xì)胞表達(dá)。
71.如權(quán)利要求65-70所述的病毒樣顆粒的群，其中 (1)每個(gè)顆粒包含通過異源肽插入被改造的MS2外殼多肽；并且其中 (2)異源肽被展示在病毒樣顆粒上且包裹MS2mRNA。
72.如權(quán)利要求71所述的病毒樣顆粒群，其中所述異源肽選自HIV肽、自體抗原、Flag肽、來源于人16型乳頭瘤(HPV16)次要衣殼蛋白L2的氨基酸序列、HIV_lgpl20的V3環(huán)、炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原、受體、結(jié)合細(xì)胞表面受體的配體、對(duì)絲狀噬菌體顆粒特異肽的任何一端有親和力的肽、金屬結(jié)合肽或者對(duì)MS2表面有親和力的肽。
73.構(gòu)建病毒樣顆粒文庫的方法，所述方法包括 (a)提供復(fù)數(shù)個(gè)權(quán)利要求47-62所述的核酸構(gòu)建體； (b)用限制性酶處理所述核酸構(gòu)建體； (c)將異源肽的編碼序列插入所述核酸構(gòu)建體獲得轉(zhuǎn)錄單位群；和 (d)表達(dá)所述轉(zhuǎn)錄單位；以及任選地分離文庫，其中每個(gè)顆粒包含通過異源肽插入被改造的MS2外殼多肽；并且其中所述異源肽被展示在病毒樣顆粒上且包裹MS2mRNA。
74.鑒定具有目標(biāo)性能的肽的方法，所述方法包括(a)提供權(quán)利要求19-24所述的病毒樣顆粒群，其中 (1)每個(gè)顆粒包含通過異源肽插入被改造的MS2外殼多肽；并且其中 (2)異源肽被展示在病毒樣顆粒上且包裹MS2mRNA;和 (b)對(duì)病毒樣顆粒上表達(dá)的異源肽進(jìn)行目標(biāo)性能檢測(cè)。
75.分離免疫原性蛋白的方法，所述方法包括 (a)從按照權(quán)利要求73所述的方法構(gòu)建的病毒樣顆粒群中鑒定免疫原性肽； (b)擴(kuò)增鑒定到的免疫原性肽；和任選地 (C)分離所述免疫原性肽。
76.免疫原性組合物，其包含一或多個(gè)權(quán)利要求65-70所述的病毒樣顆粒，其中 (1)每個(gè)顆粒包含通過異源肽插入被改造的MS2外殼多肽；并且其中 (2)異源肽被展示在病毒樣顆粒上且包裹MS2mRNA。
77.核酸構(gòu)建體，其包含 (a)細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子與噬菌體PP7單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列可操縱地關(guān)聯(lián)，其中所述外殼多肽二聚體編碼序列經(jīng)過改造限定一個(gè)第一限制性酶切位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于序列中限定外殼多肽二聚體AB環(huán)的那部分的5’方向或者之中； (b)位于外殼多肽二聚體編碼序列3’方向的第二限制性酶切位點(diǎn)； (c)抗生素抗性基因；和 (d)用于在原核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的復(fù)制原點(diǎn)，其中所述構(gòu)建體任選包含PCR引物，位于第一限制性酶切位點(diǎn)的5’方向和第二限制性酶切位點(diǎn)的3’方向。
78.如權(quán)利要求77所述的核酸構(gòu)建體，其中所述細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子是Iac啟動(dòng)子，第一限制性酶切位點(diǎn)是KpnI限制性酶切位點(diǎn)，第二限制性酶切位點(diǎn)是BamHI位點(diǎn)，抗生素抗性基因是卡那霉素抗性基因，復(fù)制原點(diǎn)是col El ori。
79.如權(quán)利要求77或78所述的核酸構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體還包含位于第二限制性酶切位點(diǎn)3’方向的轉(zhuǎn)錄終止子。
80.如權(quán)利要求77或78所述的核酸構(gòu)建體，其中 (1)噬菌體PP7單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列還包含編碼異源肽的核酸序列；和 (2)所述構(gòu)建體任選含有位于第二限制性酶切位點(diǎn)3’方向的轉(zhuǎn)錄終止子。
81.如權(quán)利要求80所述的核酸構(gòu)建體,其中所述異源肽選自HIV肽、自體抗原、Flag肽、來源于人16型乳頭瘤(HPV16)次要衣殼蛋白L2的氨基酸序列、HIV_lgpl20的V3環(huán)、炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原、受體、結(jié)合細(xì)胞表面受體的配體、對(duì)絲狀噬菌體顆粒特異肽的任何一端有親和力的肽、金屬結(jié)合肽或者對(duì)PP7表面有親和力的肽。
82.核酸構(gòu)建體，其包含 (a)細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子與噬菌體MS2或PP7單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列可操縱地關(guān)聯(lián)，其中所述外殼多肽二聚體編碼序列經(jīng)過改造限定一個(gè)第一限制性酶切位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于序列中限定外殼多肽二聚體AB環(huán)的那部分的5’方向或者之內(nèi)； (b)第二限制性酶切位點(diǎn)，其位于外殼多肽二聚體編碼序列的3’方向； (c)PCR引物，其位于第一限制性酶切位點(diǎn)的5’方向和第二限制性酶切位點(diǎn)的3’方向； (d)抗生素抗性基因；和 (e)用于在原核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的復(fù)制原點(diǎn)。
83.如權(quán)利要求82所述的核酸構(gòu)建體，其中所述細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子是Iac啟動(dòng)子，第一限制性酶切位點(diǎn)是KpnI限制性酶切位點(diǎn)，第二限制性酶切位點(diǎn)是BamHI位點(diǎn)，抗生素抗性基因是卡那霉素抗性基因，復(fù)制原點(diǎn)是col El ori。
84.如權(quán)利要求82或83所述的核酸構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體還包含位于第二限制性酶切位點(diǎn)3’方向的轉(zhuǎn)錄終止子。
85.如權(quán)利要求82或83所述的核酸構(gòu)建體，其中 (1)噬菌體MS2或PP7單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列還包含編碼異源肽的核酸序列；和 (2)所述構(gòu)建體任選含有位于第二限制性酶切位點(diǎn)3’方向的轉(zhuǎn)錄終止子。
86.如權(quán)利要求85所述的核酸構(gòu)建體,其中所述異源肽選自HIV肽、自體抗原、Flag 肽、來源于人16型乳頭瘤(HPV16)次要衣殼蛋白L2的氨基酸序列、HIV_lgpl20的V3環(huán)、炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原、受體、結(jié)合細(xì)胞表面受體的配體、對(duì)絲狀噬菌體顆粒特異肽的任何一端有親和力的肽、金屬結(jié)合肽或者對(duì)PP7表面有親和力的肽。
87.核酸構(gòu)建體，其包含 (a)細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子與噬菌體PP7單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列可操縱地關(guān)聯(lián)，其中所述外殼多肽二聚體編碼序列經(jīng)過改造限定一個(gè)第一限制性酶切位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于外殼多肽二聚體編碼序列的下游部分并且處于限定外殼多肽二聚體AB環(huán)的那部分序列之內(nèi)或者5’方向； (b)第二限制性酶切位點(diǎn)，其位于外殼多肽二聚體編碼序列的3’方向； (c)PCR引物，其位于第一限制性酶切位點(diǎn)的5’方向和第二限制性酶切位點(diǎn)的3’方向； (d)抗生素抗性基因； (e)用于在原核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的復(fù)制原點(diǎn)； (f)來自單鏈DNA噬菌體的第二復(fù)制原點(diǎn)；以及 (g)輔助單鏈DNA噬菌體，其經(jīng)過改造含有賦予對(duì)第二抗生素抗性的基因。
88.如權(quán)利要求87所述的核酸構(gòu)建體，其中所述細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子是T7啟動(dòng)子，第一限制性酶切位點(diǎn)是KpnI限制性酶切位點(diǎn)，第二限制性酶切位點(diǎn)是BamHI位點(diǎn)，PCR引物是TP7，抗生素抗性基因是卡那霉素抗性基因，復(fù)制原點(diǎn)是col El ori。
89.如權(quán)利要求87或88所述的核酸構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體還包含位于第二限制性酶切位點(diǎn)3’方向的轉(zhuǎn)錄終止子。
90.如權(quán)利要求87或88所述的核酸構(gòu)建體，其中 (1)噬菌體PP7單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列還包含編碼異源肽的核酸序列；和 (2)所述構(gòu)建體任選含有位于第二限制性酶切位點(diǎn)3’方向的轉(zhuǎn)錄終止子。
91.如權(quán)利要求90所述的核酸構(gòu)建體,其中所述異源肽選自HIV肽、自體抗原、Flag肽、來源于人16型乳頭瘤(HPV16)次要衣殼蛋白L2的氨基酸序列、HIV_lgpl20的V3環(huán)、炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原、受體、結(jié)合細(xì)胞表面受體的配體、對(duì)絲狀噬菌體顆粒特異肽的任何一端有親和力的肽、金屬結(jié)合肽或者對(duì)PP7表面有親和力的肽。
92.核酸構(gòu)建體，其包含 (a)細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子與噬菌體MS2或PP7單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列可操縱地關(guān)聯(lián)，其中所述外殼多肽二聚體編碼序列經(jīng)過改造(I)限定一個(gè)第一限制性酶切位點(diǎn)，該限制性酶切位點(diǎn)位于外殼多肽二聚體編碼序列的下游部分并且處于限定外殼多肽二聚體AB環(huán)的序列之內(nèi)或者5’方向；和⑵含有核苷酸序列(NNS)x，其中N是任意核苷酸，S是鳥苷核苷酸(G)或者胞嘧啶核苷酸(C)，X是從I到500的整數(shù)； (b)第二限制性酶切位點(diǎn)，其位于外殼多肽二聚體編碼序列的3’方向； (c)PCR引物，位于第一限制性酶切位點(diǎn)的5’方向和第二限制性酶切位點(diǎn)的3’方向； (d)抗生素抗性基因；以及 (e)用于在原核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的復(fù)制原點(diǎn)。
93.如權(quán)利要求92所述的核酸構(gòu)建體，其中所述細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子是Iac啟動(dòng)子，第一限制性酶切位點(diǎn)是KpnI限制性酶切位點(diǎn)，第二限制性酶切位點(diǎn)是BamHI位點(diǎn)，抗生素抗性基因是氨芐青霉素抗性基因，復(fù)制原點(diǎn)是col El ori。
94.如權(quán)利要求92或93所述的核酸構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體還包含位于第二限制性酶切位點(diǎn)3’方向的轉(zhuǎn)錄終止子。
95.如權(quán)利要求92或93所述的核酸構(gòu)建體，其中 (1)噬菌體MS2或PP7單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列還包含編碼異源肽的核酸序列；和 (2)所述構(gòu)建體任選含有位于第二限制性酶切位點(diǎn)3’方向的轉(zhuǎn)錄終止子。
96.如權(quán)利要求95所述的核酸構(gòu)建體,其中所述異源肽選自HIV肽、自體抗原、Flag肽、來源于人16型乳頭瘤(HPV16)次要衣殼蛋白L2的氨基酸序列、HIV_lgpl20的V3環(huán)、炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原、受體、結(jié)合細(xì)胞表面受體的配體、對(duì)絲狀噬菌體顆粒特異肽的任何一端有親和力的肽、金屬結(jié)合肽或者對(duì)PP7表面有親和力的肽。
97.原核細(xì)胞，轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求77-96所述的核酸構(gòu)建體。
98.如權(quán)利要求97所述的原核細(xì)胞，其中所述原核細(xì)胞是大腸桿菌菌株。
99.病毒樣顆粒，所述顆粒由轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求85所述的核酸構(gòu)建體的原核細(xì)胞表達(dá)。
100.病毒樣顆粒，所述顆粒由轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求86所述的核酸構(gòu)建體的原核細(xì)胞表達(dá)。
101.病毒樣顆粒，所述顆粒由轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求90所述的核酸構(gòu)建體的原核細(xì)胞表達(dá)。
102.病毒樣顆粒，所述顆粒由轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求91所述的核酸構(gòu)建體的原核細(xì)胞表達(dá)。
103.病毒樣顆粒，所述顆粒由轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求95所述的核酸構(gòu)建體的原核細(xì)胞表達(dá)。
104.病毒樣顆粒，所述顆粒由轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求76所述的核酸構(gòu)建體的原核細(xì)胞表達(dá)。
105.如權(quán)利要求99-104所述的病毒樣顆粒的群，其中 (1)每個(gè)顆粒包含通過異源肽插入被改造的PP7的外殼多肽，并且其中 (2)異源肽展示在病毒樣顆粒上并包裹PP7mRNA。
106.如權(quán)利要求47-62和77-96中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建體，其包含位于單鏈二聚體上游和下游亞基連接處的無義密碼子。
107.如權(quán)利要求106所述的構(gòu)建體，其產(chǎn)生的抑制型tRNA能夠至少部分地抑制在所述無義密碼子發(fā)生的翻譯終止。
108.如權(quán)利要求106所述的構(gòu)建體，與質(zhì)粒關(guān)聯(lián)，所述質(zhì)粒產(chǎn)生的抑制型tRNA能夠至少部分地抑制在所述無義密碼子發(fā)生的翻譯終止。
109.如權(quán)利要求106-108中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建體，其中所述無義密碼子是琥珀(UAG)、乳白(UGA)或赭石(UAA)終止密碼子。
109.如權(quán)利要求107或108所述的構(gòu)建體，其中所述抑制型tRNA是丙氨酸插入琥珀抑制序列。
110.如權(quán)利要求108所述的構(gòu)建體，其中所述質(zhì)粒含有來自第二個(gè)不相容群的復(fù)制原點(diǎn)，并且賦予對(duì)第二抗生素的抗性。
111.構(gòu)建病毒樣顆粒文庫的方法，所述方法包括 (a)提供復(fù)數(shù)個(gè)權(quán)利要求77-96所述的核酸構(gòu)建體； (b)用限制性酶處理所述核酸構(gòu)建體； (c)將異源肽的編碼序列插入所述核酸構(gòu)建體獲得轉(zhuǎn)錄單位群；和(d)表達(dá)所述轉(zhuǎn)錄單位；和任選地分離文庫，其中每個(gè)顆粒包含通過異源肽插入被改造的PP7的外殼多肽，并且其中異源肽展示在病毒樣顆粒上且包裹PP7的mRNA。
112.鑒定具有目標(biāo)性能的肽的方法，所述方法包括 (a)提供權(quán)利要求99-104所述的病毒樣顆粒的群，其中(I)每個(gè)顆粒包含通過異源肽插入被改造的PP7的外殼多肽，并且其中(2)異源肽展示在病毒樣顆粒上并分別包裹PP7mRNA ； (b)對(duì)病毒樣顆粒上表達(dá)的異源肽進(jìn)行目標(biāo)性能檢測(cè)。
113.分離免疫原性蛋白的方法，所述方法包括 (a)從按照權(quán)利要求112所述的方法構(gòu)建的病毒樣顆粒群中鑒定免疫原性肽； (b)擴(kuò)增鑒定到的免疫原性肽；和任選地 (c)分離所述免疫原性肽。
114.分離免疫原性蛋白的方法，所述方法包括 (a)從按照權(quán)利要求112所述的方法構(gòu)建的病毒樣顆粒群中鑒定免疫原性肽； (b)擴(kuò)增鑒定到的免疫原性肽；和任選地 (c)分離所述免疫原性肽，其中所述異源肽選自HIV肽、自體抗原、Flag肽、來源于人16型乳頭瘤(HPV16)次要衣殼蛋白L2的氨基酸序列、HIV_lgpl20的V3環(huán)、炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原、受體、結(jié)合細(xì)胞表面受體的配體、對(duì)絲狀噬菌體顆粒特異肽的任何一端有親和力的肽、金屬結(jié)合肽或者對(duì)PP7表面有親和力的肽。
115.免疫原性組合物，其包含一或多個(gè)權(quán)利要求99-104所述的病毒樣顆粒，其中 (1)每個(gè)顆粒包含通過異源肽插入被改造的PP7的外殼多肽，并且其中 (2)異源肽展示在病毒樣顆粒上且包裹PP7mRNA。
115.免疫原性組合物，其包含一或多個(gè)權(quán)利要求99-104所述的病毒樣顆粒，其中 (1)每個(gè)顆粒包含通過異源肽插入被改造的PP7的外殼多肽，并且其中 (2)異源肽(i)展示在病毒樣顆粒上且包裹PP7mRNA，和(ii)選自HIV肽、自體抗原、Flag肽、來源于人16型乳頭瘤(HPV16)次要衣殼蛋白L2的氨基酸序列、HIV_lgpl20的V3環(huán)、炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原、受體、結(jié)合細(xì)胞表面受體的配體、對(duì)絲狀噬菌體顆粒特異肽的任何一端有親和力的肽、金屬結(jié)合肽或者對(duì)PP7表面有親和力的肽。
116.核酸構(gòu)建體，其包含 (a)細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子，其與噬菌體MS2單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列可操縱地關(guān)聯(lián)，其中所述單鏈二聚體序列的兩部分之一經(jīng)過多個(gè)沉默核苷酸取代的改造產(chǎn)生改造的二聚體，從而使得致突變寡核苷酸引物可以特異地與所述改造二聚體中被改造的一半或者未被改造的一半退火； (b)第一限制性酶切位點(diǎn)，其位于外殼序列中限定AB環(huán)的那部分的5’方向； (c)第二限制性酶切位點(diǎn)，其位于外殼多肽二聚體編碼序列的3’方向； (d)PCR引物，位于第一限制性酶切位點(diǎn)的5’方向和第二限制性酶切位點(diǎn)的3’方向； (e)第一抗生素抗性基因； (f)用于在原核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的復(fù)制原點(diǎn)； (g)來自單鏈DNA噬菌體的第二復(fù)制原點(diǎn)；以及 (h)輔助單鏈DNA噬菌體，其經(jīng)過改造含有賦予對(duì)第二抗生素抗性的基因。
117.如權(quán)利要求116所述的核酸構(gòu)建體，其中所述第二復(fù)制原點(diǎn)來自M13。
118.如權(quán)利要求116或117所述的核酸構(gòu)建體，其中所述輔助噬菌體是M13。
119.如權(quán)利要求116所述的核酸構(gòu)建體，其中所述細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子是T7啟動(dòng)子，第一限制性酶切位點(diǎn)是KpnI限制性酶切位點(diǎn)，第二限制性酶切位點(diǎn)是BamHI位點(diǎn)，PCR引物是TP7，抗生素抗性基因是卡那霉素抗性基因，復(fù)制原點(diǎn)是col El ori。
120.如權(quán)利要求116或117所述的核酸構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體還包含位于第二限制性酶切位點(diǎn)3’方向的轉(zhuǎn)錄終止子。
121.如權(quán)利要求116或117所述的核酸構(gòu)建體，其中 (1)噬菌體MS2單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列還包含編碼異源肽的核酸序列；和 (2)所述構(gòu)建體任選含有位于第二限制性酶切位點(diǎn)3’方向的轉(zhuǎn)錄終止子。
122.如權(quán)利要求121所述的核酸構(gòu)建體，其中所述異源肽選自HIV肽、自體抗原、Flag肽、來源于人16型乳頭瘤(HPV16)次要衣殼蛋白L2的氨基酸序列、HIV_lgpl20的V3環(huán)、炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原、受體、結(jié)合細(xì)胞表面受體的配體、對(duì)絲狀噬菌體顆粒特異肽的任何一端有親和力的肽、金屬結(jié)合肽或者對(duì)PP7表面有親和力的肽。
123.核酸構(gòu)建體，其包含 (a)細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子，其與噬菌體PP7單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列可操縱地關(guān)聯(lián)，其中所述單鏈二聚體序列的兩部分之一經(jīng)過多個(gè)沉默核苷酸取代的改造產(chǎn)生改造的二聚體，從而使得致突變寡核苷酸引物可以特異地與所述改造二聚體中被改造的一半或者未被改造的一半退火； (b)第一限制性酶切位點(diǎn)，其位于外殼序列中限定AB環(huán)的那部分的5’方向； (c)第二限制性酶切位點(diǎn)，其位于外殼多肽二聚體編碼序列的3’方向； (d)PCR引物，位于第一限制性酶切位點(diǎn)的5’方向和第二限制性酶切位點(diǎn)的3’方向； (e)第一抗生素抗性基因； (f)用于在原核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的復(fù)制原點(diǎn)； (g)來自單鏈DNA噬菌體的第二復(fù)制原點(diǎn)；以及 (h)輔助單鏈DNA噬菌體，其經(jīng)過改造含有賦予對(duì)第二抗生素抗性的基因。
124.
125.如權(quán)利要求124所述的核酸構(gòu)建體，其中所述第二復(fù)制原點(diǎn)來自M13。
126.如權(quán)利要求124或125所述的核酸構(gòu)建體，其中所述輔助噬菌體是M13。
127.如權(quán)利要求124所述的核酸構(gòu)建體，其中所述細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子是T7啟動(dòng)子，第一限制性酶切位點(diǎn)是KpnI限制性酶切位點(diǎn)，第二限制性酶切位點(diǎn)是BamHI位點(diǎn)，PCR引物是TP7，抗生素抗性基因是卡那霉素抗性基因，復(fù)制原點(diǎn)是col El ori。
127.如權(quán)利要求124或125所述的核酸構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體還包含位于第二限制性酶切位點(diǎn)3’方向的轉(zhuǎn)錄終止子。
128.如權(quán)利要求124或125所述的核酸構(gòu)建體，其中 (1)噬菌體PP7單鏈外殼多肽二聚體的編碼序列還包含編碼異源肽的核酸序列；和 (2)所述構(gòu)建體任選含有位于第二限制性酶切位點(diǎn)3’方向的轉(zhuǎn)錄終止子。
129.如權(quán)利要求128所述的核酸構(gòu)建體，其中所述異源肽選自HIV肽、自體抗原、Flag肽、來源于人16型乳頭瘤(HPV16)次要衣殼蛋白L2的氨基酸序列、HIV_lgpl20的V3環(huán)、炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原、受體、結(jié)合細(xì)胞表面受體的配體、對(duì)絲狀噬菌體顆粒特異肽的任何一端有親和力的肽、金屬結(jié)合肽或者對(duì)PP7表面有親和力的肽。
130.原核細(xì)胞，轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求116-129所述的核酸構(gòu)建體。
131.如權(quán)利要求130所述的原核細(xì)胞，其中所述原核細(xì)胞是大腸桿菌菌株。
132.病毒樣顆粒，所述顆粒由轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求116-122中任一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體的原核細(xì)胞表達(dá)。
133.病毒樣顆粒，所述顆粒由轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求123-129中任一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體的原核細(xì)胞表達(dá)。
134.如權(quán)利要求132所述的病毒樣顆粒的群，其中 (1)每個(gè)顆粒包含通過異源肽插入被改造的MS2的外殼多肽，并且其中 (2)異源肽展示在病毒樣顆粒上并分別包裹MS2mRNA。
135.如權(quán)利要求133所述的病毒樣顆粒的群，其中 (1)每個(gè)顆粒包含通過異源肽插入被改造的PP7的外殼多肽，并且其中 (2)異源肽展示在病毒樣顆粒上并分別包裹PP7mRNA。.140.如權(quán)利要求116-129中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建體，其包含位于單鏈二聚體上游和下游亞基連接處的無義密碼子。 .141.如權(quán)利要求140所述的構(gòu)建體，其產(chǎn)生的抑制型tRNA能夠至少部分地抑制在所述無義密碼子發(fā)生的翻譯終止。.142.如權(quán)利要求140所述的構(gòu)建體，與質(zhì)粒關(guān)聯(lián)，所述質(zhì)粒產(chǎn)生的抑制型tRNA能夠至少部分地抑制在所述無義密碼子發(fā)生的翻譯終止。. 143.如權(quán)利要求140-142中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建體，其中所述無義密碼子是琥珀(UAG)、乳白(UGA)或赭石(UAA)終止密碼子。. 144.如權(quán)利要求141或142所述的構(gòu)建體，其中所述抑制型tRNA是丙氨酸插入琥珀抑制序列。.145.如權(quán)利要求116-144中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建體，其中所述質(zhì)粒含有來自第二個(gè)不相容群的復(fù)制原點(diǎn)，并且賦予對(duì)另一個(gè)抗生素的抗性。
.146.構(gòu)建病毒樣顆粒文庫的方法，所述方法包括 (a)提供復(fù)數(shù)個(gè)權(quán)利要求116-129所述的核酸構(gòu)建體； (b)用限制性酶處理所述核酸構(gòu)建體； (c)將異源肽的編碼序列插入所述核酸構(gòu)建體獲得轉(zhuǎn)錄單位群；和 (d)表達(dá)所述轉(zhuǎn)錄單位；和任選地分離文庫，其中每個(gè)顆粒包含通過異源肽插入被改造的MS2或PP7的外殼多肽，并且其中(2)異源肽展示在病毒樣顆粒上且分別包裹MS2或PP7的mRNA。
147.鑒定具有目標(biāo)性能的肽的方法，所述方法包括 (a)提供權(quán)利要求132-133所述的病毒樣顆粒的群，其中(I)每個(gè)顆粒包含通過異源肽插入被改造的MS2或PP7的外殼多肽，并且其中 (2)異源肽展示在病毒樣顆粒上并分別包裹MS2或PP7的mRNA ； (b)對(duì)病毒樣顆粒上表達(dá)的異源肽進(jìn)行目標(biāo)性能檢測(cè)。
148.分離免疫原性蛋白的方法，所述方法包括 (a)從按照權(quán)利要求147所述的方法構(gòu)建的病毒樣顆粒群中鑒定免疫原性肽； (b)擴(kuò)增鑒定到的免疫原性肽；和任選地 (c)分離所述免疫原性肽。
149.分離免疫原性蛋白的方法，所述方法包括 (a)從按照權(quán)利要求148所述的方法構(gòu)建的病毒樣顆粒群中鑒定免疫原性肽； (b)擴(kuò)增鑒定到的免疫原性肽；和任選地 (c)分離所述免疫原性肽，其中所述異源肽選自HIV肽、自體抗原、Flag肽、來源于人.16型乳頭瘤(HPV16)次要衣殼蛋白L2的氨基酸序列、HIV_lgpl20的V3環(huán)、炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原、受體、結(jié)合細(xì)胞表面受體的配體、對(duì)絲狀噬菌體顆粒特異肽的任何一端有親和力的肽、金屬結(jié)合肽或者對(duì)PP7表面有親和力的肽。
150.免疫原性組合物，其包含一或多個(gè)權(quán)利要求132-133所述的病毒樣顆粒，其中 (1)每個(gè)顆粒包含通過異源肽插入被改造的MS2或PP7的外殼多肽，并且其中 (2)異源肽展示在病毒樣顆粒上并分別包裹MS2或PP7的mRNA。
151.免疫原性組合物，其包含一或多個(gè)權(quán)利要求132-133所述的病毒樣顆粒，其中 (1)每個(gè)顆粒包含通過異源肽插入被改造的MS2或PP7的外殼多肽，并且其中 (2)異源肽是(i)展示在病毒樣顆粒上并分別包裹MS2或PP7的mRNA，以及(ii)選自HIV肽、自體抗原、Flag肽、來源于人16型乳頭瘤(HPV16)次要衣殼蛋白L2的氨基酸序列、HIV-lgpl20的V3環(huán)、炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原、受體、結(jié)合細(xì)胞表面受體的配體、對(duì)絲狀噬菌體顆粒特異肽的任何一端有親和力的肽、金屬結(jié)合肽或者對(duì)PP7表面有親和力的肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及調(diào)控病毒樣顆粒(VLPs)，尤其是包括MS2VLPs上的肽展示效價(jià)的系統(tǒng)和方法。在該方法中，可以由單一RNA產(chǎn)生大量野生型和少量單鏈二聚體外殼蛋白。通過提供這樣的系統(tǒng)來調(diào)控免疫原(疫苗)生產(chǎn)中的效價(jià)，所述系統(tǒng)使得可以由單一RNA產(chǎn)生大量野生型和少量單鏈二聚體外殼蛋白，從而能夠在大范圍內(nèi)(從每個(gè)顆粒平均小于1到多達(dá)90個(gè))靈活地調(diào)節(jié)VLPs，特別是MS2VLPS上的展示效價(jià)水平。這將有助于免疫原和疫苗，包括呈現(xiàn)低效價(jià)的VLPs的產(chǎn)生。本文公開了可用于表達(dá)病毒樣顆粒的核酸構(gòu)建體，所述顆粒由通過插入異源肽被改造的MS2外殼多肽構(gòu)成，其中所述異源肽被展示在病毒樣顆粒上并包裹MS2mRNA。還公開了可用于表達(dá)病毒樣顆粒的核酸構(gòu)建體，所述顆粒由通過插入異源肽被改造的PP7外殼多肽構(gòu)成，其中所述異源肽被展示在病毒樣顆粒上并包裹PP7mRNA。
文檔編號(hào)C12N7/01GK102858960SQ201080065079
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日
發(fā)明者D.S.皮博迪, B.查克里安 申請(qǐng)人:Stc.Unm公司