專利名稱：鑒定抗藥性分枝桿菌的方法
CN 102947465 A書明說1/33 頁鑒定抗藥性分枝桿菌的方法
介紹
這里所公開的是確定未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)存在的方法。例如，這里所公開的方法通過確定分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)是否包含突變，從而允許確定分枝桿菌是否是利福平抗性的。根據(jù)此類的方法，可以鑒定多重耐藥性的分枝桿菌菌株。
背景技術(shù)：
結(jié)核是一種由分枝桿菌引起的，常見的、通常是致死性的感染性疾病。在人類中， 結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的主要病因，而其他的結(jié)核分枝桿菌復合群成員同樣也是病因，例如牛型分支桿菌，非洲分枝桿菌以及田鼠分枝桿菌。
結(jié)核病的治療通常很困難，需要長期施用抗微生物制劑，尤其是一線抗微生物制劑利福平和異煙肼，通常兩者聯(lián)合使用。盡管如此，由于不同的環(huán)境因素(例如，不合適的治療方案，低質(zhì)量的藥物)，通常會出現(xiàn)耐藥性分枝桿菌。耐藥性分枝桿菌，尤其是多重耐藥性分枝桿菌(以同時對利福平和異煙肼的耐藥性為特征)是一個主要的公共健康問題，需要更加長期的治療，在治療中使用更大范圍和更加昂貴的藥物，以及施用會導致/具有更大副作用的二、三線藥物。
分枝桿菌rpoB基因編碼分枝桿菌RNA聚合酶的beta-亞基。利福平能結(jié)合RNA 聚合酶的beta-亞基，抑制聚合酶催化DNA向RNA的轉(zhuǎn)錄，這將會導致RNA向蛋白質(zhì)的后續(xù)翻譯過程的抑制。分枝桿菌rpoB基因特定區(qū)域的突變導致具有不同beta-亞基結(jié)構(gòu)的RNA 聚合酶的產(chǎn)生，而這種聚合酶不再容易被利福平所抑制，因此產(chǎn)生了利福平抗性的菌株。此外，對利福平的耐藥性同時也會導致對異煙肼的耐藥性(例如,見Riska et al. ,2000, Int. J. Tuberc Lung Dis. ,4(2) :S4_S10)，因此，這使得鑒定突變分枝桿菌rpoB基因成為鑒定多重耐藥性分枝桿菌的一個可能的機制。
如今，鑒定在rpoB基因中含有突變的分枝桿菌菌株，從而鑒定利福平耐藥性的分枝桿菌的方法需要很長的時間和/或復雜和昂貴的機器。就這點而言，本領(lǐng)域中仍然需要一種快速和簡單的方法來鑒定分枝桿菌的rpoB基因突變。
發(fā)明概述
在一個方面，這里公開了一種利用可檢測標記的探針來快速檢測在rpoB基因核心區(qū)含有突變的分枝桿菌的方法。這里公開的方法減少了用于確定分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)突變存在的可檢測標記的數(shù)量，因此，降低了分析系統(tǒng)的復雜性，所述分析系統(tǒng)檢測在 rpoB基因核心區(qū)突變的分枝桿菌菌株。由于rpoB基因核心區(qū)的突變意味著對抗微生物制劑利福平的抗性，因此，對含有rpoB基因核心區(qū)突變的分枝桿菌菌株的檢測能夠提供這樣的信息，該信息能夠為患者，例如結(jié)核病患者選擇合適的治療方法。除了檢測在rpoB基因核心區(qū)的突變存在之外，這里所公開的方法還可以用于檢測特定的分枝桿菌菌株或種系的存在以及檢測除rpoB基因之外其他的可能與耐藥性有關(guān)的分枝桿菌基因突變的存在。
在一個具體實施方式
中，這里公開了一種確定未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)存在的方法，包括5
(a)將核酸樣品與包含一組探針的組合物接觸，其中至少四個探針是rpoB探針， 其在允許rpoB探針與核心區(qū)雜交的條件下對未突變的rpoB基因核心區(qū)具有特異性，其中第一和第三rpoB探針用熒光供體基團進行標記，第二和第四rpoB探針用不同的熒光受體基團進行標記，其中rpoB探針與未突變的rpoB基因核心區(qū)雜交，以便熒光受體基團能夠接收來自于熒光供體基團的能量的轉(zhuǎn)移；以及(b)分析熒光發(fā)射的存在，所述熒光是當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團基團時產(chǎn)生的，其中產(chǎn)生于當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團基團時的熒光發(fā)射的存在意味著未突變rpoB基因核心區(qū)的存在，而產(chǎn)生于當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團基團時的熒光發(fā)射不存在或者減少意味著并不存在未突變rpoB基因核心區(qū)。
在另一個具體實施方式
中，這里公開了一種確定分枝桿菌存在以及未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)存在的方法，包括
(a)將核酸樣品與組合物接觸，所述組合物包括(i)至少一個分枝桿菌檢測探針， 和(ii) 一組探針，其中至少四個探針是rpoB探針，其在允許rpoB探針與核心區(qū)雜交以及檢測探針與分枝桿菌核酸互補序列雜交的條件下，對未突變的rpoB基因核心區(qū)具有特異性，其中第一和第三rpoB探針用熒光供體基團進行標記，第二和第四rpoB探針用不同的熒光受體基團進行標記，其中rpoB探針與未突變的rpoB基因核心區(qū)雜交，以便熒光受體基團能夠接收來自于熒光供體基團的能量的轉(zhuǎn)移；
以及(b)分析雜交的檢測探針和熒光發(fā)射的存在，所述熒光是當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團基團時產(chǎn)生的，其中(i)雜交的檢測探針的存在和產(chǎn)生于當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時的熒光發(fā)射的存在意味著分枝桿菌的存在和未突變rpoB基因核心區(qū)的存在；(ii)不存在雜交的檢測探針和產(chǎn)生于當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團基團時的熒光發(fā)射不存在或者減少意味著不存在分枝桿菌；以及(iii)雜交的檢測探針存在，而產(chǎn)生于當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團基團時的熒光發(fā)射不存在或者減少意味著存在分枝桿菌但并不存在未突變rpoB基因核心區(qū)。
可以這么理解，在這里所公開的每一種方法中，每一個rpoB探針雜交于rpoB基因核心區(qū)的不同部位。舉個例子，當根據(jù)這里公開的其中一個方法使用與rpoB基因核心區(qū)雜交的四個rpoB探針時，四個rpoB探針中的每一個都雜交于核心區(qū)的不同部位。同樣的，當根據(jù)這里公開的其中一個方法使用與rpoB基因核心區(qū)雜交的三個rpoB探針時,三個rpoB 探針中的每一個都雜交于核心區(qū)的不同部位。在一些具體實施方式
中，當在rpoB基因核心區(qū)中沒有突變的時候，與rpoB基因核心區(qū)進行雜交的rpoB探針能夠雜交到整個rpoB基因核心區(qū)。舉個例子，如果rpoB基因核心區(qū)包含81個堿基對，那么當rpoB基因核心區(qū)沒有突變的時候，rpoB核心區(qū)的全部81個堿基對都與rpoB探針進行雜交。在其他具體實施方式
中，當rpoB基因核心區(qū)中沒有突變的時候，與rpoB基因核心區(qū)進行雜交的探針并沒有雜交到全部的rpoB基因核心區(qū)，即，當雜交的時候，rpoB探針并沒有覆蓋全部的rpoB基因核心區(qū)。舉個例子，如果rpoB基因核心區(qū)包含81個堿基對，當rpoB基因核心區(qū)中沒有突變的時候，與rpoB探針雜交的rpoB基因核心區(qū)的堿基對數(shù)目可能少于81,例如，當rpoB基因核心區(qū)中沒有突變的時候，80或更少、79或更少、78或更少、77或更少、76或更少、75或更少、74或更少、73或更少、72或更少、71或更少、70或更少、65或更少、60或更少、50或更少的堿基對雜交到rpoB探針。
根據(jù)這里所公開的方法，未突變rpoB基因核心區(qū)的存在表明分枝桿菌對抗微生物制劑利福平是敏感的，而不存在為突變rpoB基因核心區(qū)表明分枝桿菌對抗微生物制劑利福平是敏感的。在特定的具體實施方式
中，確定分枝桿菌對抗微生物制劑利福平的耐藥性表明分枝桿菌是多重耐藥性分枝桿菌。
在這里所描述的方法的一些具體實施方式
中，一個或多個rpoB探針可以包含自身互補區(qū)域，因此，在不存在包含能與探針雜交的核酸的核酸樣品的情況下，探針形成發(fā)夾環(huán)。在特定的具體實施方式
中，探針包含淬滅基團，當探針形成發(fā)夾環(huán)時，該淬滅基團能夠淬滅探針上的熒光基團(例如，熒光供體基團)。根據(jù)此類具體實施方式
，只有當探針結(jié)合到一個互補核酸序列的時候，才能夠檢測到探針上的熒光基團發(fā)射出來的熒光，因此這能夠降低對探針上的熒光基團所發(fā)射出來熒光的非特異性檢測。
在這里所描述的方法的一些具體實施方式
中，這一組探針還包含封閉探針，該封閉探針能夠提高方法的特異性。在特定的具體實施方式
中，封閉探針至少和與rpoB基因核心區(qū)雜交的rpoB探針部分互補，因此，當不存在包含能與探針雜交的核酸的核酸樣品時， 封閉探針雜交到rpoB探針。在一些具體實施方式
中，封閉探針用淬滅基團標記，所述淬滅基團能夠淬滅與rpoB基因核心區(qū)雜交的rpoB探針上的熒光基團(例如，熒光供體基團)。 在其他的具體實施方式
中，封閉探針至少與未突變的rpoB基因核心區(qū)的核酸序列部分互補，當不存在一個或多個能與rpoB基因核心區(qū)雜交的rpoB探針時，封閉探針與未突變的 rpoB基因核心區(qū)雜交，而當未突變的rpoB基因核心區(qū)存在的時候，未突變的rpoB基因核心區(qū)與rpoB探針而不是封閉探針進行雜交。
在特定的具體實施方式
中，在用于這里描述的方法之前，先裂解核酸樣品。在其他的具體方式中，這里所描述的方法包括裂解核酸樣品的步驟，該步驟作為方法的一部分，例如，裂解劑包括在方法的步驟(a)中。
在特定的具體實施方式
中，這里所描述的方法中使用的核酸樣品包括擴增的核酸。在特定的具體實施方式
中，擴增的核酸包括對應(yīng)于分枝桿菌的rpoB基因或分枝桿菌 rpoB基因的區(qū)域的核酸。在一些具體實施方式
中，擴增的核酸包括對應(yīng)于除rpoB基因之外的其他基因或除rpoB基因之外的其他基因的區(qū)域的核酸，例如，擴增的核酸是分枝桿菌的 inhA基因、katG基因、ahpC基因、mabA基因、oxyR基因、pncA基因、rrs基因、rpsL基因、 embA基因、embB基因、embC基因、gyrA基因、gyrB基因或nor基因、或者這些基因的區(qū)域。
在一些具體實施方式
中，在用于這里所描述的方法之前，先擴增核酸樣品中的核酸。在其他的具體實施方式
中，核酸樣品中的核酸的擴增作為這里所描述的方法的一個部分，例如，擴增步驟包括在本方法的步驟(a)中。在特定的具體實施方式
中，擴增分枝桿菌的rpoB基因或者rpoB基因的區(qū)域。在一些具體實施方式
中，擴增除rpoB基因之外的基因或者除rpoB基因之外的其他基因的區(qū)域，例如，擴增的核酸是分枝桿菌的inhA基因、katG 基因、ahpC基因、mabA基因、oxyR基因、pncA基因、rrs基因、rpsL基因、embA基因、embB 基因、embC基因、gyrA基因、gyrB基因或nor基因、或者這些基因的區(qū)域。
這里所描述的方法進一步包括檢測除了 rpoB之外的分枝桿菌其他基因的突變， 其中所述突變與除利福平外的其他抗微生物制劑抗性有關(guān)。舉個例子，可以使用能與這些基因的未突變區(qū)域雜交的探針，其中熒光標記的探針與之雜交的這些區(qū)域中的突變與對特定的抗微生物制劑的抗性相關(guān)。根據(jù)此類方法，如果檢測到了從探針發(fā)射出來的熒光，那么這些基因中就不存在突變，表明分枝桿菌對被測抗微生物制劑并沒有抗性，而如果檢測不到從探針發(fā)射出來的熒光，那么在基因中就存在著突變，表明分枝桿菌對被測抗微生物制劑有耐藥性。另外，探針可以用來與除了 rpoB之外的其他分枝桿菌基因的突變區(qū)域進行雜交，其中該突變與對除利福平之外的其他抗微生物制劑的耐藥性有關(guān)。根據(jù)此類方法，如果檢測到了從探針發(fā)射出來的熒光，那么這些基因中就存在著突變，表明分枝桿菌對被測抗微生物制劑有耐藥性，而如果檢測不到從探針發(fā)射出來的熒光，那么在基因中就不存在突變，表明分枝桿菌對被測抗微生物制劑沒有耐藥性。
賦予分枝桿菌對抗微生物制劑耐藥性的分枝桿菌基因的突變在本領(lǐng)域是已知的例如，katG、inhA、mabA、ahpC和oxyR基因的突變帶來對于異煙肼的耐藥性；pncA基因的突變帶來對于卩比嗪酰胺的耐藥性；rrs和rpsL基因的突變帶來對鏈霉素的耐藥性；embA、 embB、embC基因的突變帶來對乙胺丁醇的耐藥性；inhA基因的突變還帶來對乙硫異煙胺 (ethioamide)的耐藥性；gyrA、gyrB和nor基因的突變帶來對環(huán)丙沙星的耐藥性(見,例如 Drobniewski 和 Wilson, 1998, J. Med. Microbiol.，47 189-196)。
在另一個方面，這里公開了用于根據(jù)這里所描述的一個或多個方法來確定未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)存在的試劑盒。
術(shù)語
這里所使用的術(shù)語“大約”和“大概”，除非特別指明，是指該術(shù)語修飾的數(shù)值上下不超過20 %的值。
這里所使用的術(shù)語“來源”是指任何可以提供一個核酸的物質(zhì)，例如，一個受試者 (例如人類或非人類的動物)。
這里所使用的術(shù)語“核酸樣品”是指包含或者懷疑包含核酸，例如分枝桿菌的核酸的樣品。核酸樣品可以包含除核酸之外的其他組分，例如受試者(例如人類或非人類的動物)的宿主細胞，和/或能被純化、分離或富集的核酸樣品。核酸的純化、分離和富集的方法在本領(lǐng)域是已知的。在特定的具體實施方式
中，核酸樣品中的核酸是易于被探針所雜交的。在特定的具體實施方式
中，核酸樣品被裂解?？梢杂帽绢I(lǐng)域中已知的方法來實施裂解， 例如加熱、酶解、去污劑、緩沖液、酸、堿、離液劑、在珠子或顆粒的存在下進行物理剪切、和/ 或使用壓力。在一些具體實施方式
中，對核酸樣品施以一個或多個變性步驟，以使得含有內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的雙鏈核酸或核酸變性。核酸變性的方法在本領(lǐng)域是已知的。在一些具體實施方式
中，核酸樣品包括擴增的核酸，例如，擴增的rpoB基因核心區(qū)。在其他的具體實施方式
中，擴增核酸樣品是作為這里所描述的一個或多個方法的一個部分。擴增核酸的方法在本領(lǐng)域是已知的，例如PCR、SDA、TMA, NASBA、滾環(huán)擴增、螺旋位移擴增或者LAMP。
這里所使用的術(shù)語“分枝桿菌”是指包含rpoB基因的分枝桿菌菌株，其中rpoB基因包含一個核心區(qū)，而該rpoB核心區(qū)的突變與利福平耐藥性有關(guān)。在特定的具體實施方式
中，分枝桿菌是指結(jié)核分枝桿菌復合群的成員，例如，結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌、牛型分枝桿菌、牛型分枝桿菌卡介苗(牛型分枝桿菌BCG,Mycobacterium bovis BCG)和田鼠分枝桿菌。許多分枝桿菌的rpoB基因的核酸序列被指定了 GenBank登錄號，例如，L27989 (結(jié)核分枝桿菌的rpoB基因)；AY544894 (牛型分枝桿菌的rpoB基因)；AF057453 (牛型分枝桿菌BCG的rpoB基因)；AY544944 (田鼠分枝桿菌的rpoB基因)；以及AY544880 (非洲分枝桿菌的rpoB基因)。
這里所使用的術(shù)語“分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)”是指分枝桿菌的rpoB基因的這樣的區(qū)域，即當該區(qū)域包含突變時，其與利福平耐藥性相關(guān)。在一些具體實施方式
中，分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)對應(yīng)于結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌、牛型分枝桿菌、牛型分枝桿菌 BCG、田鼠分枝桿菌或鳥分枝桿菌的rpoB基因的分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)。在特定的具體實施方式
中，分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)對應(yīng)于結(jié)核分枝桿菌的rpoB基因的分枝桿菌rpoB 基因核心區(qū)，例如，該核心區(qū)包含81個堿基對，對應(yīng)于結(jié)核分枝桿菌rpoB基因的密碼子 507-533 (例如，見 Hauck et al. , 2009, J. Antimic. Chemother. ,64:259-262)。
這里所使用的術(shù)語“未突變的分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)”以及“未突變的rpoB基因核心區(qū)”是指不包含突變的分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)，所述突變與抗微生物制劑利福平耐藥性相關(guān)。
這里所使用的術(shù)語“生長培養(yǎng)基”一般而言涉及能使分枝桿菌生長的營養(yǎng)源。生長培養(yǎng)基可以提供分枝桿菌維持生命以及促進其復制/繁殖所必需或有益的維生素、氨基酸、微量元素、鹽、化合物以及其他物質(zhì)，無論是有機的還是無機的。示例性的生長培養(yǎng)基包括Middlebrook培養(yǎng)基、Lowenstein-Jensen斜面培養(yǎng)基、Ogawa卵黃培養(yǎng)基、MGIT管 (Becton Dickinson)以及 BACTEC12B (Becton Dickinson)。
這里所使用的術(shù)語“核酸”是指脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核酸、核糖核苷酸以及核糖核酸，以及它們的聚合物形式，也包括單鏈或雙鏈形式。核酸包括天然發(fā)生的核酸，例如脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)以及核酸類似物。核酸類似物包括那些含有非天然發(fā)生的堿基的核酸、包含與其他核苷酸之間連鎖(linkages)而不是通過天然發(fā)生的磷酸二酯鍵連接的核苷酸的核酸，或者包括通過連鎖(linkages)而不是通過磷酸二酯鍵連接的堿基的核苷酸的核酸。因此，核酸類似物包括，例如但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硼磷酸酯、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸酯、2-0-甲基核糖核苷酸、 多肽-核酸(PNAs)、鎖核酸(LNAs)等。
這里所使用的術(shù)語“rpoB探針”是指與分枝桿菌rpoB基因的一個部位特異性結(jié)合的探針。
這里所使用的術(shù)語“分枝桿菌檢測探針”是指包含一個可檢測標記的探針，該探針與分枝桿菌的除rpoB基因核酸序列之外的其他核酸序列互補。在一個特定的具體實施方式
中，分枝桿菌檢測探針特異性結(jié)合分枝桿菌的核酸序列，該核酸序列在所有或者多個分枝桿菌品種或菌株中是保守的。在另外的具體實施方式
中，分枝桿菌檢測探針特異性結(jié)合一個特定分枝桿菌品種或菌株的核酸序列。
這里所使用的術(shù)語“熒光發(fā)射不存在或減少”是指一種觀察到的現(xiàn)象，其中熒光基團發(fā)射的熒光沒有被檢測到(即，熒光信號不存在)或檢測到相對于在一個給定條件下、例如當熒光基團發(fā)射的熒光未被淬滅或者當熒光基團處于一個能夠使得熒光從熒光基團轉(zhuǎn)移到熒光受體基團的位置時，熒光基團發(fā)射的熒光減少。舉個例子，當一個熒光供體基團和熒光受體基團所處的位置并不能夠使得熒光可以從熒光供體基團轉(zhuǎn)移到熒光受體基團時， 將會發(fā)生熒光發(fā)射的缺失或者減少，即，F(xiàn)RET并不會發(fā)生。在另外的例子中，當用淬滅基團將熒光基團發(fā)射的熒光淬滅之后，熒光基團發(fā)射的熒光可能缺失或者減少。
這里所使用的，在核酸的相關(guān)內(nèi)容中出現(xiàn)的術(shù)語“純化的”是指從其他成分(例如蛋白質(zhì)，脂類鹽，其他類型的核酸分子)中分離出來的核酸，而這些成分存在于核酸的天然來源中，或者該術(shù)語也可以指基于給定的核酸序列而合成的、并在合成探針中所使用的過量的核酸中純化出來的探針。在特定的具體實施方式
中，純化的核酸按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)評估至少60 %純度，至少65 %純度，至少70 %純度，至少75 %純度，至少80 %純度，至少85 %純度，至少90 %純度，至少99 %純度或至少99. 9 %純度。
這里所使用的術(shù)語“熒光共振能量轉(zhuǎn)移”或“FRET”是指一種發(fā)生于兩種熒光分子之間的能量轉(zhuǎn)移機制，兩種熒光分子是熒光供體基團和熒光受體基團或淬滅基團(即， FRET對)，其中FRET對中的一個成員(熒光供體基團)在它的特定熒光激發(fā)波長下被激發(fā)并將熒光能量轉(zhuǎn)移到第二個分子(熒光受體基團或淬滅基團)，然后供體返回到電子基態(tài)。
這里所使用的“熒光基團”是指發(fā)射能夠被檢測到的熒光的熒光化合物。
這里所使用的“熒光供體基團”是指能夠吸收能量，也能夠?qū)⒛芰哭D(zhuǎn)移至熒光受體基團或淬滅基團的熒光化合物。
這里所使用的“熒光受體基團”是指能夠吸收來自于熒光供體基團的能量，并能夠?qū)⑥D(zhuǎn)移的能量重新以熒光的形式發(fā)射出去的熒光化合物。在FRET中，熒光受體基團與熒光供體基團有足夠的光譜重疊，以致于當FRET對的成員(即熒光供體基團和熒光受體基團) 處于發(fā)生FRET的特征距離的位置時，其能夠接收發(fā)射自熒光受體基團的能量。
這里所使用的術(shù)語“淬滅基團”是指能夠減少熒光基團(例如，熒光供體基團)發(fā)射熒光的分子或者化合物的一個部分。這種減少包括減少當一個光子從熒光基團正常發(fā)射后產(chǎn)生的光。在FRET中，淬滅基團與熒光基團具有足夠的空間重疊，以使得當FRET對的成員(即熒光基團和淬滅基團)處于FRET的特征距離時，其能夠接收熒光基團發(fā)射的能量。 其他類型的非FRET淬滅機制也同樣存在，這些機制不依賴供體和受體基團之間的光譜重疊(見，例如 Tyagi et al.，1998, Nature Biotechnol. 16 :49_53)。
示例性的熒光供體基團、熒光受體基團以及淬滅基團包括但不限于香豆素類及相關(guān)的染料、氧雜蒽染料(例如熒光素類、對甲氨基酚類和若丹明類)、試鹵靈、花青染料 (cyanine dyes)、bimanes、吖唳類、異H引哚類、丹酰染料、氨基鄰苯二甲酰肼類(例如魯米諾和異魯米諾衍生物)、氨基苯鄰二甲酰亞胺類、氨基萘二酰亞胺(aminonaphthalimides)、 氨基苯并呋喃類、氨基喹啉類、雙氰基氫醌、熒光銪、鋱復合物及相關(guān)化合物。淬滅基團的特定示例包括但不限于DABCYL和黑洞淬滅子1-111。熒光供體基團、熒光受體基團和淬滅基團的特定示例包括但不限于 FITC、ROX、GFP、Cy5、Cy5. 5、Cy3、Cy3B、GFP, YFP, RFP, CFP、 若丹明紅、德克薩斯紅(Texas Red)、氟硼突、IDR700、LightCycler610、LightCycler640、 LightCycler670> LightCycler705 以及 TAMRA。
這里所使用的術(shù)語“淬滅”和“被淬滅”是指能量被熒光受體基團或淬滅基團部分或全部吸收。淬滅現(xiàn)象會發(fā)生在兩個相同或者實質(zhì)上相同的熒光組分(例如單一的青色素 (cyanine dye))之間，或者兩個不同的熒光組分之間(例如青色素和方酸菁染料)，或者一個熒光組分和一個非熒光受體(例如熒光染料和DABCYL基團)之間。
這里所使用的術(shù)語“預(yù)先確定的參考范圍”是指一個特定分析的讀數(shù)的參考范圍。
這里所使用的術(shù)語“可檢測標記”是指可直接或間接提供可檢測信號的任何標記。在一些具體實施方式
中，可檢測標記包含一個生物或化學分子，例如，酶類、放射性分子、熒光分子、熒光團(例如 FITC、ROX、GFP、Cy5、Cy5. 5、Cy3、Cy3B、GFP、YFP、RFP、CFP、若丹明紅、德克薩斯紅、氟硼突、IDR700、LightCycler610、LightCycler640、LightCycler670、LightCycler705以及TAMRA)、粒子、化學發(fā)光子、酶的底物或協(xié)同因子、酶抑制劑或磁性顆粒。在其他的具體實施方式
中，可檢測標記包括其物理特性，例如，大小、形狀、電泳遷移率、 疏水性、親水性、可溶性和/或色譜表型。
這里所使用的“雜交”(“hybridize”、“hybridizes”和 “hybridization”)是指相互之間具有至少 60% (優(yōu)選的，70%，75%，80%，85%，90%，95%，98%，99% 或 99. 5%) 互補性的兩個或多個核酸序列的結(jié)合。核酸雜交技術(shù)和條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的， 例如描述在如 Sambrook et al. Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Lab. Press，12 月，1989 ;US 專利 4563419 和 4851330，以及在 Dunn，et al. ,Cell 12 pp. 23-26(1978)和許多其他公開文獻中。雜交反應(yīng)的各種改進方式在本領(lǐng)域中是已知的， 包括溶液雜交或在一個或多個反應(yīng)步驟中與固定在固相支持物上的探針進行的雜交。
這里所描述的術(shù)語“受試者”或“患者”可以互相替換使用，是指一個動物受試者。 在一個具體實施方式
中，受試者是哺乳動物。在另外的具體實施方式
中，受試者是非人類動物。在另外的具體實施中，受試者是人類。
圖I :示例性的圖示，說明rpoB探針如何雜交到分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)中。 PlD :包含供體基團的探針I(yè) ;P2A :包含受體基團的探針2 ；P3D :包含供體基團的探針3 ； P4A :包含受體基團的探針4。IA :包含供體基團的探針結(jié)合的rpoB基因核心區(qū)中的突變的效果。IB :包含受體基團的探針結(jié)合的rpoB基因核心區(qū)中的突變的效果。1C:包含供體基團的探針結(jié)合的rpoB基因核心區(qū)中的突變的效果。ID :包含受體基團的探針結(jié)合的rpoB 基因核心區(qū)中的突變的效果。圖2展示了圖I中所描述的分析是如何進行的。
圖2 :如何執(zhí)行這里所描述的分析的示例性模型，該分析能夠確定分枝桿菌rpoB 基因核心區(qū)是否包含突變并因此對抗微生物制劑，如利福平產(chǎn)生了耐藥性。
發(fā)明詳述
確定是否存在未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)的方法
在一個方面，這里所展示的是用可檢測標記的探針快速檢測在rpoB基因核心區(qū)含有突變的分枝桿菌菌株的方法。這里所展示的方法減少了用于檢測分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)突變存在而所需的可檢測標記的數(shù)量，因此，降低了檢測在rpoB基因核心區(qū)含有突變的分枝桿菌菌株的復雜性。由于在rpoB基因核心區(qū)中的突變表明對抗微生物制劑利福平的耐藥性，因此檢測在rpoB基因核心區(qū)含有突變的分枝桿菌菌株為選擇合適的方案以治療肺結(jié)核患者提供了信息。除了檢測rpoB基因核心區(qū)突變的存在之外，這里展示的方法可以用于檢測特定的分枝桿菌菌株或品種，以及除rpoB基因之外其他的與耐藥性有關(guān)的分枝桿菌基因。
在一些具體實施方式
中，這里所展示的方法允許使用能雜交到整個分枝桿菌rpoB 基因核心區(qū)的探針群，只是需要檢測兩個不同的可檢測信號，例如，通過使用FRET。因此，在不需要檢測多于兩種可檢測標記的情況下，這些方法允許鑒定分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)是否含有突變。
在特定的具體實施方式
中，當在檢測分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)突變時使用封閉探針，這里所展示的方法可以使特異性增強。根據(jù)此類的方法，封閉探針的使用確保了只有當分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)中沒有突變的時候，rpoB探針才會雜交到分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)上。
在一個具體實施方式
中，這里展示了確定是否存在未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)的方法，包括
(a)將核酸樣品與含有一組探針的組合物接觸，其中有至少5個探針是在允許 rpoB探針與核心區(qū)雜交的條件下，特異性結(jié)合未突變rpoB基因核心區(qū)的rpoB探針，其中 (i)第一和第三rpoB探針用熒光供體基團標記，(ii)第二和第四rpoB探針用不同的熒光受體基團標記，(iii)第五探針用熒光基團標記；其中rpoB探針與未突變rpoB基因核心區(qū)雜交以使得熒光受體基團能夠接受來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移；以及
(b)分析(i)當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的熒光發(fā)射是否存在以及(ii)來自于第五rpoB探針的熒光，其中存在當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的突光發(fā)射以及存在來自于第五rpoB探針的突光表明存在未突變的 rpoB基因核心區(qū)，而如果當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的熒光發(fā)射不存在或減少，或者來自于第五rpoB探針的熒光不存在表明不存在未突變的rpoB基因核心區(qū)。
在一個方面，該方法進一步包括將核酸樣品與分枝桿菌檢測探針相接觸，分析是否存在雜交的檢測探針，其中如果存在雜交的檢測探針意味著存在分枝桿菌，而不存在雜交的檢測探針意味著不存在分枝桿菌。在另外的方面，第一、第二、第三和/或第四rpoB探針進一步包括淬滅基團。
在一個具體實施方式
中，這里展示了確定是否存在未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)的方法，包括
(a)將核酸樣品與含有一組探針的組合物接觸，其中有至少5個探針是在允許 rpoB探針與核心區(qū)雜交的條件下，特異性結(jié)合未突變rpoB基因核心區(qū)的rpoB探針，其中(i)第一和第三rpoB探針用熒光供體基團標記，(ii)第二和第四rpoB探針用不同的熒光受體基團標記，(iii)第五探針用熒光基團和淬滅基團標記，其中，如果不存在第五探針特異性雜交的未突變rpoB基因核心區(qū)時，第五探針會形成發(fā)夾環(huán)，這樣熒光基團的熒光就被淬滅了 ；rpoB探針雜交到未突變的rpoB基因核心區(qū)，以便熒光受體基團能夠接受來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移；以及
(b)分析(i)當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的熒光發(fā)射是否存在以及(ii)來自于標記有熒光基團的第五rpoB探針的熒光，其中存在當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的熒光發(fā)射以及存在來自于熒光基團的熒光表明存在未突變的rpoB基因核心區(qū)，而如果當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的熒光發(fā)射不存在或減少，或者來自于熒光基團的熒光不存在表明不存在未突變的 rpoB基因核心區(qū)。
在一個方面，該方法進一步包括將核酸樣品與分枝桿菌檢測探針相接觸，分析是否存在雜交的檢測探針，其中如果存在雜交的檢測探針意味著分枝桿菌存在，而不存在雜交的檢測探針意味著不存在分枝桿菌。在另外的方面，第一、第二、第三和/或第四rpoB探針進一步包括淬滅基團。
在另外的具體實施方式
中，這里展示了確定是否存在未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)的方法，包括
(a)將核酸樣品與含有一組探針的組合物接觸，其中有至少四個探針是在允許 rpoB探針與核心區(qū)雜交的條件下，特異性結(jié)合未突變rpoB基因核心區(qū)的rpoB探針，其中第一和第三rpoB探針用熒光供體基團標記，第二和第四rpoB探針用不同的熒光受體基團標記；其中rpoB探針與未突變rpoB基因核心區(qū)雜交以使得熒光受體基團能夠接受來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移；以及
(b)分析當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的熒光發(fā)射是否存在，其中存在當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的熒光發(fā)射時，表明存在未突變的rpoB基因核心區(qū)，而如果當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的熒光發(fā)射不存在或減少時，表明不存在未突變的rpoB基因核心區(qū)。
在一個方面，第一、第二、第三和/或第四rpoB探針進一步包括淬滅基團。
在另外的具體實施方式
中，這里所展示的是確定是否存在分枝桿菌以及是否存在未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)的方法，包括
(a)將核酸樣品與含有(i)分枝桿菌檢測探針，和(ii) 一組探針的組合物接觸，其中有至少四個探針是在允許rpoB探針與核心區(qū)雜交以及檢測探針與互補分枝桿菌核酸序列雜交的條件下，特異性結(jié)合未突變rpoB基因核心區(qū)的rpoB探針,其中第一和第三rpoB 探針用熒光供體基團標記，第二和第四rpoB探針用不同的熒光受體基團標記；其中rpoB探針與未突變rpoB基因核心區(qū)雜交以使得熒光受體基團能夠接受來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移；以及
(b)分析雜交的檢測探針和當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的熒光發(fā)射是否存在，其中(i)存在雜交的檢測探針和存在當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的熒光發(fā)射，意味著存在分枝桿菌和存在未突變的rpoB基因核心區(qū)；(ii)雜交的檢測探針不存在，以及當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的熒光發(fā)射不存在或減少時，意味著不存在分枝桿菌；(iii)雜交的檢測探針存在，以及當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的熒光發(fā)射不存在或減少時，意味著存在分枝桿菌，但不存在未突變的rpoB基因核心區(qū)。
在另外的方面，第一、第二、第三和/或第四rpoB探針進一步包括淬滅基團。
在另外的具體實施方式
中，這里所展示的是確定是否存在未突變分枝桿菌rpoB 基因核心區(qū)的方法，包括
(a)將核酸樣品與含有一組探針的組合物接觸，其中有至少四個探針是在允許該探針與核心區(qū)雜交的條件下，特異性結(jié)合未突變rpoB基因核心區(qū)的rpoB探針，其中第一和第二 rpoB探針用不同的熒光基團標記，第三rpoB探針用熒光供體基團標記，第四rpoB探針用熒光受體基團標記；其中第三和第四rpoB探針與未突變rpoB基因核心區(qū)雜交以使得熒光受體基團能夠接受來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移；以及
(b)分析(i)當供體基團將能量轉(zhuǎn)移到受體基團時所導致的熒光發(fā)射是否存在以及(ii)來自于標記有熒光基團的雜交rpoB探針的熒光是否存在，其中存在當供體基團將能量轉(zhuǎn)移到受體基團時所導致的熒光發(fā)射以及存在來自于熒光基團的熒光表明存在未突變的rpoB基因核心區(qū)，而如果當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的熒光發(fā)射不存在或減少，或者來自于熒光基團之一的熒光不存在表明不存在未突變的rpoB基因核心區(qū)。
在一個方面，該方法進一步包括將核酸樣品與分枝桿菌檢測探針相接觸，分析是否存在雜交的檢測探針，其中如果存在雜交的檢測探針意味著分枝桿菌存在，而不存在雜交的檢測探針意味著不存在分枝桿菌。在另外的方面，第一、第二、第三和/或第四rpoB探針進一步包括淬滅基團。
在另外的具體實施方式
中，這里所展示的是確定是否存在未突變分枝桿菌rpoB 基因核心區(qū)的方法，包括
(a)將核酸樣品與含有一組探針的組合物接觸，其中有至少四個探針是在允許該探針與核心區(qū)雜交的條件下，特異性結(jié)合未突變rpoB基因核心區(qū)的rpoB探針，其中(i)第一和第二 rpoB探針包含熒光基團和淬滅基團，其中，當不存在第一和第二探針特異性的未突變rpoB基因核心區(qū)時，第一和第二 rpoB探針形成發(fā)夾環(huán)，因此熒光基團的熒光就被淬滅，(ii)第三rpoB探針用熒光供體基團標記，(iii)第四rpoB探針用熒光受體基團標記， 其中第三和第四rpoB探針與未突變rpoB基因核心區(qū)雜交以使得熒光受體基團能夠接受來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移；以及
(b)分析(i)當供體基團將能量轉(zhuǎn)移到受體基團時所導致的熒光發(fā)射是否存在以及(ii)來自于標記有熒光基團的雜交的rpoB探針的熒光是否存在，其中存在當供體基團將能量轉(zhuǎn)移到受體基團時所導致的熒光發(fā)射以及存在來自于熒光基團的熒光表明存在未突變的rpoB基因核心區(qū)，而如果當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的熒光發(fā)射不存在或減少，或者來自于熒光基團的熒光不存在表明不存在未突變的rpoB基因核心區(qū)。
在一個方面，該方法進一步包括將核酸樣品與分枝桿菌檢測探針相接觸并分析是否存在雜交的檢測探針，其中如果存在雜交的檢測探針意味著分枝桿菌存在，而不存在雜交的檢測探針意味著不存在分枝桿菌。在另外的方面，第一、第二、第三和/或第四rpoB探針進一步包括淬滅基團。
在另外的具體實施方式
中，這里展示了確定是否存在未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)的方法，包括
(a)將核酸樣品與含有一組探針的組合物接觸，其中有至少四個探針是在允許 rpoB探針與核心區(qū)雜交的條件下，特異性結(jié)合未突變rpoB基因核心區(qū)的rpoB探針，其中 rpoB探針包含不同的熒光基團和淬滅基團，而當rpoB探針特異性的rpoB基因核心區(qū)不存在的時候，rpoB探針形成發(fā)夾環(huán)，因此熒光基團的熒光就被淬滅，以及
(b)分析來自于突光基團的突光,其中,存在來自于突光基團的突光就表明存在未突變的rpoB基因核心區(qū)，來自于其中熒光基團之一的熒光不存在或減少就表明不存在未突變的rpoB基因核心區(qū)。
在一個方面，該方法進一步包括將核酸樣品與分枝桿菌檢測探針相接觸，分析是否存在雜交的檢測探針，其中，存在雜交的檢測探針意味著分枝桿菌存在，而不存在雜交的檢測探針意味著不存在分枝桿菌。
在另外的具體實施方式
中，這里展示了確定是否存在未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)的方法，包括
(a)將核酸樣品與含有一組探針的組合物接觸，其中有至少三個探針是在允許rpoB探針與核心區(qū)雜交的條件下，特異性結(jié)合未突變rpoB基因核心區(qū)的rpoB探針，其中第一 rpoB探針用熒光基團標記，第二 rpoB探針用熒光供體基團標記，第三rpoB探針用熒光受體基團標記；其中第二和第三rpoB探針與未突變rpoB基因核心區(qū)雜交以使得熒光受體基團能夠接受來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移；以及
(b)分析(i)當供體基團將能量轉(zhuǎn)移到受體基團時所導致的熒光發(fā)射是否存在以及(ii)來自于標記有熒光基團的雜交的rpoB探針的熒光是否存在，其中，存在當供體基團將能量轉(zhuǎn)移到受體基團時所導致的熒光發(fā)射以及存在來自于熒光基團的熒光表明存在未突變的rpoB基因核心區(qū)，當供體基團將能量轉(zhuǎn)移到受體基團時所導致的熒光發(fā)射不存在或減少，或者來自于熒光基團的熒光不存在則表明不存在未突變的rpoB基因核心區(qū)。
在一個方面，該方法進一步包括將核酸樣品與分枝桿菌檢測探針相接觸，分析是否存在雜交的檢測探針，其中，存在雜交的檢測探針意味著分枝桿菌存在，而不存在雜交的檢測探針意味著不存在分枝桿菌。在另外的方面，第一、第二和/或第三rpoB探針進一步包括淬滅基團。
在另外的具體實施方式
中，這里展示了確定是否存在未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)的方法，包括
(a)將核酸樣品與含有一組探針的組合物接觸，其中有至少三個探針是在允許 rpoB探針與核心區(qū)雜交的條件下，特異性結(jié)合未突變rpoB基因核心區(qū)的rpoB探針，其中(i)第一 rpoB探針包含熒光基團和淬滅基團，其中，當不存在第一探針特異性的未突變 rpoB基因核心區(qū)時，第一 rpoB探針形成發(fā)夾環(huán)，因此熒光基團的熒光就被淬滅，(ii)第二 rpoB探針用熒光供體基團標記，(iii)第三rpoB探針用熒光受體基團標記；其中第二和第三rpoB探針與未突變rpoB基因核心區(qū)雜交以使得熒光受體基團能夠接受來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移；以及
(b)分析(i)當供體基團將能量轉(zhuǎn)移到受體基團時所導致的熒光發(fā)射是否存在以及(ii)來自于第一 rpoB探針的熒光是否存在，其中存在當供體基團將能量轉(zhuǎn)移到受體基團時所導致的熒光發(fā)射以及存在來自于第一 rpoB探針的熒光則表明存在未突變的rpoB基因核心區(qū)，而供體基團將能量轉(zhuǎn)移到受體基團時所導致的熒光發(fā)射不存在或減少，或者來自于第一 rpo探針的熒光不存在則表明不存在未突變的rpoB基因核心區(qū)。
在一個方面，該方法進一步包括將核酸樣品與分枝桿菌檢測探針相接觸并分析是否存在雜交的檢測探針，其中，存在雜交的檢測探針則意味著分枝桿菌存在，而不存在雜交的檢測探針意味著不存在分枝桿菌。在另外的方面，第二和/或第三rpoB探針進一步包括淬滅基團。
在另外的具體實施方式
中，這里展示了確定是否存在未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)的方法，包括
(a)將核酸樣品與含有一組探針的組合物接觸，其中有至少三個探針是在允許 rpoB探針與核心區(qū)雜交的條件下，特異性結(jié)合未突變rpoB基因核心區(qū)的rpoB探針，其中 rpoB探針包含不同的熒光基團和一個淬滅基團，當rpoB探針特異性的rpoB基因核心區(qū)不存在的時候，rpoB探針形成發(fā)夾環(huán)，因此熒光基團的熒光就被淬滅，以及
(b)分析來自于突光基團的突光發(fā)射是否存在,如果存在來自于突光基團的突光發(fā)射則表明存在未突變的rpoB基因核心區(qū)，而如果來自于其中一個熒光基團的熒光發(fā)射不存在或減少表明不存在未突變的rpoB基因核心區(qū)。
在一個方面，該方法進一步包括將核酸樣品與分枝桿菌檢測探針相接觸并分析是否存在雜交的檢測探針，其中如果存在雜交的檢測探針則意味著分枝桿圃存在，而不存在雜交的檢測探針則意味著不存在分枝桿菌。
在另外的具體實施方式
中，這里展示了確定是否存在未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)的方法，包括
(a)將核酸樣品與含有一組探針的組合物接觸，其中有至少兩個探針是在允許 rpoB探針與核心區(qū)雜交的條件下，特異性結(jié)合未突變rpoB基因核心區(qū)的rpoB探針，其中 rpoB探針包含不同的熒光基團和淬滅基團，而當rpoB探針特異性的rpoB基因核心區(qū)不存在的時候，rpoB探針形成發(fā)夾環(huán)，因此熒光基團的熒光就被淬滅，以及
(b)分析來自于突光基團的突光發(fā)射是否存在,如果存在來自于突光基團的突光則表明存在未突變的rpoB基因核心區(qū)，而如果來自于其中熒光基團之一的熒光不存在或減少表明不存在未突變的rpoB基因核心區(qū)。
在一個方面，該方法進一步包括將核酸樣品與分枝桿菌檢測探針相接觸，分析是否存在雜交的檢測探針，其中如果存在雜交的檢測探針意味著分枝桿菌存在，而不存在雜交的檢測探針意味著不存在分枝桿菌。
在另外的具體實施方式
中，這里展示了確定是否存在未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)的方法，包括
(a)將核酸樣品與含有一組探針的組合物接觸，其中有至少兩個探針是在允許 rpoB探針與核心區(qū)雜交的條件下，特異性結(jié)合未突變rpoB基因核心區(qū)的rpoB探針，其中第一rpoB探針用熒光供體基團標記，第二 rpoB探針用熒光受體基團標記；其中rpoB探針與未突變rpoB基因核心區(qū)雜交以使得熒光受體基團能夠接受來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移；以及
(b)分析當供體基團將能量轉(zhuǎn)移到受體基團時所導致的熒光發(fā)射是否存在，其中存在當供體基團將能量轉(zhuǎn)移到受體基團時所導致的熒光發(fā)射時，表明存在未突變的rpoB 基因核心區(qū)，而如果當供體基團將能量轉(zhuǎn)移到受體基團時所導致的熒光發(fā)射不存在或減少時，表明不存在未突變的rpoB基因核心區(qū)。
在一個方面，該方法進一步包括將核酸樣品與分枝桿菌檢測探針相接觸，分析是否存在雜交的檢測探針，其中如果存在雜交的檢測探針則意味著分枝桿圃存在，而不存在雜交的檢測探針意味著不存在分枝桿菌。在另一個方面，第一和/或第二 rpoB探針進一步包括淬滅基團。
在另外的具體實施方式
中，這里展示了確定是否存在未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)的方法，包括
(a)將一個核酸樣品與含有一組探針的組合物接觸，其中有至少一個探針是在允許rpoB探針與核心區(qū)雜交的條件下，特異性結(jié)合未突變rpoB基因核心區(qū)的rpoB探針，其中rpoB探針包含熒光基團和淬滅基團，而當rpoB探針特異性的rpoB基因核心區(qū)不存在的時候，rpoB探針形成發(fā)夾環(huán)，因此熒光基團的熒光就被淬滅，以及
(b)分析來自于供體基團的熒光發(fā)射是否存在，如果存在來自于熒光基團的熒光則表明存在未突變的rpoB基因核心區(qū)，而如果來自于其中熒光基團之一的熒光不存在或減少表明不存在未突變的rpoB基因核心區(qū)。
在一個方面，該方法進一步包括將核酸樣品與分枝桿菌檢測探針相接觸，分析是否存在雜交的檢測探針，其中如果存在雜交的檢測探針意味著分枝桿菌存在，而不存在雜交的檢測探針意味著不存在分枝桿菌。
在特定的具體實施方式
中，這里提供的方法包括探針組的用途，其中在該組探針中的一些探針與分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)外的rpoB基因區(qū)互補，而其中該組探針中的另外一些探針則特異性結(jié)合未突變的rpoB基因核心區(qū)。舉個例子，在一個具體實施方式
中， 這里展示了確定是否存在未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)的方法，包括
(a)將核酸樣品與含有一組探針的組合物接觸，其中在允許該探針與核心區(qū)雜交的條件下，第一探針是特異性結(jié)合未突變rpoB基因核心區(qū)的rpoB探針，第二探針與分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)外的rpoB基因區(qū)互補，其中第一探針用熒光供體基團標記，第二探針用熒光受體基團標記，第一和第二探針與rpoB基因雜交，以使得熒光受體基團就能接收來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移，以及
(b)分析當供體基團將能量轉(zhuǎn)移到受體基團時所導致的熒光發(fā)射是否存在，其中存在當供體基團將能量轉(zhuǎn)移到受體基團時所導致的熒光發(fā)射時，表明存在未突變的rpoB 基因核心區(qū)，而如果當供體基團將能量轉(zhuǎn)移到受體基團時所導致的熒光發(fā)射不存在或減少時，表明不存在未突變的rpoB基因核心區(qū)。
在一個方面，該方法進一步包括將核酸樣品與分枝桿菌檢測探針相接觸，分析是否存在雜交的檢測探針，其中如果存在雜交的檢測探針意味著分枝桿菌存在，而不存在雜交的檢測探針意味著不存在分枝桿菌。在另一個方面，第一和/或第二 rpoB探針進一步包括淬滅基團。
在另外的具體實施方式
中，這里展示了確定是否存在未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)的方法，包括
(a)將核酸樣品與含有一組探針的組合物接觸，其中在允許rpoB探針與核心區(qū)雜交的條件下，第一探針與分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)外的rpoB基因區(qū)互補，而第二探針和第三探針是特異性結(jié)合未突變rpoB基因核心區(qū)的rpoB探針，其中第一探針用熒光供體基團標記，第二探針用熒光受體基團標記，第三探針用熒光基團標記，第一和第二探針與rpoB 基因雜交，以使得熒光受體基團能接收來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移，以及
(b)分析(i)當供體基團將能量轉(zhuǎn)移到受體基團時所導致的熒光發(fā)射是否存在以及(ii)來自于標記有熒光基團的第三rpoB探針的熒光是否存在，其中存在當供體基團將能量轉(zhuǎn)移到受體基團時所導致的熒光發(fā)射以及存在來自于熒光基團的熒光表明存在未突變的rpoB基因核心區(qū)，而如果當供體基團將能量轉(zhuǎn)移到受體基團時所導致的熒光發(fā)射不存在或減少，或者來自于熒光基團的熒光不存在表明不存在未突變的rpoB基因核心區(qū)。
在一個方面，該方法進一步包括將核酸樣品與分枝桿菌檢測探針相接觸，分析是否存在雜交的檢測探針，其中如果存在雜交的檢測探針意味著分枝桿菌存在，而不存在雜交的檢測探針意味著不存在分枝桿菌。在另外的方面，第一、第二和/或第三rpoB探針進一步包括淬滅基團。
在另外的具體實施方式
中，這里展示了確定是否存在未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)的方法，包括
(a)將核酸樣品與含有一組探針的組合物接觸，其中在允許rpoB探針與核心區(qū)雜交的條件下，第一探針與分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)外的rpoB基因區(qū)互補，而第二、第三和第四探針是特異性結(jié)合未突變rpoB基因核心區(qū)的rpoB探針，其中第一和第三探針用熒光供體基團標記，第二和第四探針用不同的熒光受體基團標記，而當這些探針雜交到rpoB基因時，熒光受體基團就能接收來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移，以及
(b)分析當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的熒光發(fā)射是否存在，其中存在當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的熒光發(fā)射時，表明存在未突變的rpoB基因核心區(qū)，而如果當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的熒光發(fā)射不存在或減少時，表明不存在未突變的rpoB基因核心區(qū)。
在一個方面，該方法進一步包括將核酸樣品與分枝桿菌檢測探針相接觸，分析是否存在雜交的檢測探針，其中如果存在雜交的檢測探針意味著分枝桿菌存在，而不存在雜交的檢測探針意味著不存在分枝桿菌。在另外的方面，第一、第二，第三和/或第四rpoB探針進一步包括淬滅基團。
在另外的具體實施方式
中，這里展示了確定是否存在未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)的方法，包括
(a)將核酸樣品與含有一組探針的組合物接觸，其中在允許rpoB探針與核心區(qū)雜交的條件下，第一探針與rpoB基因核心區(qū)外的rpoB基因區(qū)互補，而第二、第三、第四和第五探針是特異性結(jié)合未突變rpoB基因核心區(qū)的rpoB探針，其中第一和第三探針用熒光供體基團標記，第二和第四探針用不同的熒光受體基團標記，第五探針用熒光基團標記，而當這些探針雜交到rpoB基因時，熒光受體基團就能接收來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移，以及
(b)分析(i)當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的熒光發(fā)射是否存在以及(ii)來自于標記有熒光基團的雜交的第五rpoB探針的熒光是否存在，其中存在當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的熒光發(fā)射以及存在來自于熒光基團的熒光表明存在未突變的rpoB基因核心區(qū)，而如果當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的熒光發(fā)射不存在或減少，或者來自于熒光基團的熒光不存在表明不存在未突變的rpoB基因核心區(qū)。
在一個方面，該方法進一步包括將核酸樣品與分枝桿菌檢測探針相接觸，分析是否存在雜交的檢測探針，其中如果存在雜交的檢測探針意味著分枝桿菌存在，而不存在雜交的檢測探針意味著不存在分枝桿菌。在另外的方面，第一、第二、第三、第四和/或第五 rpoB探針進一步包括淬滅基團。
應(yīng)該可以理解，在這里所描述的每個方法中，每個與rpoB基因核心區(qū)雜交的rpoB 探針是雜交到rpoB基因核心區(qū)的不同部位的。舉個例子，當根據(jù)這里所描述的其中一個方法使用雜交到rpoB基因核心區(qū)的四個rpoB探針時,這四個rpoB探針是以雜交到rpoB基因核心區(qū)的不同部位的方式來與分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)進行結(jié)合。同樣的，當根據(jù)這里所描述的其中一個方法使用中的雜交到rpoB基因核心區(qū)的三個rpoB探針時,這三個rpoB 探針是以雜交到rpoB基因核心區(qū)的不同部位的方式來與分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)進行結(jié)合。在一些具體實施方式
中，當在rpoB基因核心區(qū)中沒有突變的時候，與rpoB基因核心區(qū)雜交的rpoB探針進行雜交以使得整個rpoB基因核心區(qū)都已經(jīng)被rpoB探針雜交。舉個例子，如果rpoB基因核心區(qū)包含81個堿基對，當rpoB基因核心區(qū)不存在突變的時候，rpoB基因核心區(qū)的全部81個堿基對都與rpoB探針進行雜交。在另外的具體實施方式
中，當在 rpoB基因核心區(qū)中沒有突變的時候，與rpoB基因核心區(qū)雜交的rpoB探針進行雜交，但并不是整個rpoB基因核心區(qū)都已經(jīng)被雜交，即，當rpoB探針進行雜交時，并沒有覆蓋全部的 rpoB基因核心區(qū)。舉個例子，如果rpoB基因核心區(qū)包含81個堿基對，而當rpoB基因核心區(qū)不存在突變的時候，與rpoB探針進行了雜交的rpoB基因核心區(qū)的堿基對數(shù)目是少于81， 例如，當rpoB基因核心區(qū)不存在突變的時候，80或更少、79或更少、78或更少、77或更少、 76或更少、75或更少、74或更少、73或更少、72或更少、71或更少、70或更少、65或更少、60 或更少、50或更少個堿基對于rpoB探針進行雜交。
在這里所描述的方法的一些具體實施方式
中，一個或多個rpoB探針以及對除 rpoB基因之外的其他分枝桿菌基因具有特異性的一個或多個探針可以包含自互補區(qū)域，因此，在不存在含有與探針雜交的核酸的核酸樣品的情況下，這些探針形成發(fā)夾環(huán)。在特定的具體實施方式
中，探針包含淬滅基團，當探針形成發(fā)夾環(huán)的時候，該淬滅基團能夠淬滅探針上的熒光基團。根據(jù)此類的具體實施方式
，來自于探針的熒光基團發(fā)射的熒光能夠根據(jù)雜交到互補核酸序列與背景區(qū)分開來，因此這能夠允許來自于探針的熒光基團發(fā)射的熒光的同源檢測，而不需要除去未雜交的探針。
在這里所描述的方法的具體實施方式
中，該系列的探針進一步包括能提高方法特異性的封閉探針。在特定的具體實施方式
中，封閉探針和與rpoB基因核心區(qū)雜交的rpoB 探針部分互補，因此在不存在含有與探針雜交的核酸的核酸樣品時，封閉探針與rpoB探針雜交。在一些具體實施方式
中，封閉探針標記有能夠淬滅rpoB探針上的熒光基團(例如， 熒光供體基團)的淬滅基團，所述rpoB探針能夠與封閉探針結(jié)合的rpoB基因核心區(qū)雜交。 在其他的具體實施方式
中，封閉探針與未突變rpoB基因核心區(qū)的核酸序列部分互補，當不存在一個或多個與rpoB基因核心區(qū)雜交的rpoB探針時，封閉探針雜交到未突變的rpoB基因核心區(qū)，而當存在未突變的rpoB基因核心區(qū)時，未突變rpoB基因核心區(qū)與rpoB探針進行雜交而不與封閉探針進行雜交。
根據(jù)這里所描述的方法，未突變rpoB基因核心區(qū)的存在意味著分枝桿菌對抗微生物制劑利福平是耐藥性的，而不存在未突變rpoB基因核心區(qū)則意味著分枝桿菌對抗微生物制劑利福平是敏感的。在特定的具體實施方式
中，鑒定出分枝桿菌對利福平具有耐藥性意味著該分枝桿菌是多重耐藥性分枝桿菌。
這里所描述的方法進一步包括檢測除rpoB基因外其他分枝桿菌基因的突變，其中所述突變與除利福平之外的其他抗微生物制劑耐藥性相關(guān)。那些能夠賦予抗微生物制劑耐藥性的分枝桿菌基因的突變在本領(lǐng)域是已知的，例如，katG, inhA, mabA, ahpC, kasA以及 oxyR基因的突變會帶來對于異煙肼的耐藥性；pncA基因的突變帶來對于吡嗪酰胺的耐藥性；rrs和rpsL基因的突變帶來鏈霉素的耐藥性；embA，embB, embC基因的突變帶來對乙胺丁醇的耐藥性；inhA基因的突變還帶來對乙硫異煙胺的耐藥性；gyrA、gyrB和nor基因的突變帶來對環(huán)丙沙星的耐藥性(見，例如Drobniewski和Wilson, 1998, J. Med. Microbiol., 47 189-196) 0本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解如何對這里提供的方法進行改進以包括檢測任何分枝桿菌基因中的突變的步驟，因此，這允許檢測分枝桿菌是否對利福平和一種或多種其他的抗微生物制劑具有耐藥性。
在一些具體實施方式
中，這里提供的方法包括檢測分枝桿菌katG、inhA、mabA、ahpC、kasA和/或oxyR基因中的一個或多個突變，其中所述突變已知或已經(jīng)被確定與分枝桿菌對異煙肼的耐藥性相關(guān)。在一個具體實施方式
中，使用一個或多個熒光標記的探針來檢測突變，所述探針是已知的異煙肼耐藥性相關(guān)的基因區(qū)特異性探針，而只有當不存在突變的時候，探針才能進行雜交。接著可以分析探針上的熒光，其中如果存在發(fā)射于探針的熒光則表明存在著未突變分枝桿菌katG、inhA、mabA、ahpC、kasA和/或oxyR基因,而如果并不存在發(fā)射于探針上的熒光則表明未突變分枝桿菌katG、inhA、mabA、ahpC、kasA和/或 oxyR基因并不存在。根據(jù)該具體實施方式
，來自于探針的熒光如果存在，則意味著分枝桿菌對異煙肼并不具有耐藥性。在另一個的具體實施方式
中，使用一個或多個熒光標記的探針來檢測突變，所述探針是已知的異煙肼耐藥性相關(guān)的基因區(qū)特異性探針，而只有當存在突變的時候，探針才能進行雜交。接著可以分析探針上的熒光，其中如果存在發(fā)射于探針的熒光則表明未突變分枝桿菌katG、inhA,mabA, ahpC、kasA和/或oxyR基因并不存在，而如果并不存在發(fā)射于探針上的熒光則表明存在未突變分枝桿菌katG、inhA、mabA、ahpC、kasA 和/或oxyR基因。根據(jù)該具體實施方式
，來自于探針的熒光如果不存在，則意味著分枝桿菌對異煙肼并不具有耐藥性。
在其他具體實施方式
中，這里提供的方法包括檢測分枝桿菌pncA基因的一個或多個突變，其中所述突變已知或者被確定為與分枝桿菌對抗微生物制劑吡嗪酰胺的耐藥性相關(guān)。在一個具體實施方式
中，使用一個或多個熒光標記的探針來檢測突變，所述探針是已知的吡嗪酰胺耐藥性相關(guān)的基因區(qū)特異性探針，而只有當不存在突變的時候，探針才能進行雜交。接著可以分析探針上的熒光，其中如果存在發(fā)射于探針的熒光則表明存在著未突變分枝桿菌pncA基因區(qū)，而如果并不存在發(fā)射于探針上的熒光則表明未突變分枝桿菌 pncA基因區(qū)并不存在。根據(jù)該具體實施方式
，來自于探針的熒光如果存在，則意味著分枝桿菌對吡嗪酰胺并不具有耐藥性。在另一個的具體實施方式
中，使用一個或多個熒光標記的探針來檢測突變，所述探針是已知的吡嗪酰胺耐藥性相關(guān)的基因區(qū)特異性探針，而只有當存在突變的時候，探針才能進行雜交。接著可以分析探針上的熒光，其中如果存在發(fā)射于探針的熒光則表明未突變分枝桿菌PncA基因區(qū)并不存在，而如果并不存在發(fā)射于探針上的熒光則表明存在未突變分枝桿菌pncA基因區(qū)。根據(jù)該具體實施方式
，來自于探針的熒光如果不存在，則意味著分枝桿菌對吡嗪酰胺并不具有耐藥性。
在其他具體實施方式
中，這里提供的方法包括檢測分枝桿菌rrs和/或rpsL基因的一個或多個突變，其中所述突變已知或者被確定為與分枝桿菌對抗微生物制劑鏈霉素的耐藥性相關(guān)。在一個具體實施方式
中，使用一個或多個熒光標記的探針來檢測突變，所述探針是已知的鏈霉素耐藥性相關(guān)的基因區(qū)特異性探針，而只有當不存在突變的時候，探針才能進行雜交。接著可以分析探針上的熒光，其中如果存在發(fā)射于探針的熒光則表明存在著未突變分枝桿菌rrs和/或rpsL基因區(qū)，而如果并不存在發(fā)射于探針上的熒光則表明未突變分枝桿菌rrs和/或rpsL基因區(qū)并不存在。根據(jù)該具體實施方式
，來自于探針的熒光如果存在，則意味著分枝桿菌對鏈霉素并不具有耐藥性。在另一個的具體實施方式
中，使用一個或多個熒光標記的探針來檢測突變，所述探針是已知的鏈霉素耐藥性相關(guān)的基因區(qū)特異性探針，而只有當存在突變的時候，探針才能進行雜交。接著可以分析探針上的熒光，其中如果存在發(fā)射于探針的熒光則表明未突變分枝桿菌rrs和/或rpsL基因區(qū)并不存在，而如果并不存在發(fā)射于探針上的熒光則表明存在未突變分枝桿菌rrs和/或rpsL基因區(qū)。據(jù)該具體實施方式
，來自于探針的熒光如果不存在，則意味著分枝桿菌對鏈霉素并不具有耐藥性。
在其他具體實施方式
中，這里提供的方法包括檢測分枝桿菌embA、embB和/或 embC基因的一個或多個突變，其中所述突變已知或者被確定為與分枝桿菌對抗微生物制劑乙胺丁醇的耐藥性相關(guān)。在一個具體實施方式
中，使用一個或多個熒光標記的探針來檢測突變，所述探針是已知的乙胺丁醇耐藥性相關(guān)的基因區(qū)特異性探針，而只有當不存在突變的時候，探針才能進行雜交。接著可以分析探針上的熒光，其中如果存在發(fā)射于探針的熒光則表明存在著未突變分枝桿菌embA、embB和/或embC基因區(qū)，而如果并不存在發(fā)射于探針上的熒光則表明未突變分枝桿菌embA、embB和/或embC基因區(qū)并不存在。根據(jù)該具體實施方式
，來自于探針的熒光如果存在，則意味著分枝桿菌對乙胺丁醇并不具有耐藥性。在另一個的具體實施方式
中，使用一個或多個熒光標記的探針來檢測突變，所述探針是已知的乙胺丁醇耐藥性相關(guān)的基因區(qū)特異性探針，而只有當存在突變的時候，探針才能進行雜交。接著可以分析探針上的熒光，其中如果存在發(fā)射于探針的熒光則表明未突變分枝桿菌 embA,embB和/或embC基因區(qū)并不存在，而如果并不存在發(fā)射于探針上的熒光則表明存在未突變分枝桿菌embA、embB和/或embC基因區(qū)。根據(jù)該具體實施方式
,來自于探針的突光如果不存在，則意味著分枝桿菌對乙胺丁醇并不具有耐藥性。
在其他具體實施方式
中，這里提供的方法包括檢測分枝桿菌inhA基因的一個或多個突變，其中所述突變已知或者被確定為與分枝桿菌對抗微生物制劑乙硫異煙胺的耐藥性相關(guān)。在一個具體實施方式
中，使用一個或多個熒光標記的探針來檢測突變，所述探針是已知的乙硫異煙胺耐藥性相關(guān)的基因區(qū)特異性探針，而只有當不存在突變的時候，探針才能進行雜交。接著可以分析探針上的熒光，其中如果存在發(fā)射于探針的熒光則表明存在著未突變分枝桿菌inhA基因區(qū)，而如果并不存在發(fā)射于探針上的熒光則表明未突變分枝桿菌inhA基因區(qū)并不存在。根據(jù)該具體實施方式
，來自于探針的熒光如果存在，則意味著分枝桿菌對乙硫異煙胺并不具有耐藥性。在另一個的具體實施方式
中，使用一個或多個熒光標記的探針來檢測突變，所述探針是已知的乙硫異煙胺耐藥性相關(guān)的基因區(qū)特異性探針， 而只有當存在突變的時候，探針才能進行雜交。接著可以分析探針上的熒光，其中如果存在發(fā)射于探針的熒光則表明未突變分枝桿菌inhA基因區(qū)并不存在，而如果并不存在發(fā)射于探針上的熒光則表明存在未突變分枝桿菌inhA基因區(qū)。根據(jù)該具體實施方式
，來自于探針的熒光如果不存在，則意味著分枝桿菌對乙硫異煙胺并不具有耐藥性。
在其他具體實施方式
中，這里提供的方法包括檢測分枝桿菌gyrA、gyrB和/或 nor基因的一個或多個突變，其中所述突變已知或者被確定為與分枝桿菌對抗微生物制劑環(huán)丙沙星的耐藥性相關(guān)。在一個具體實施方式
中，使用一個或多個熒光標記的探針來檢測突變，所述探針是已知的環(huán)丙沙星耐藥性相關(guān)的基因區(qū)特異性探針，而只有當不存在突變的時候，探針才能進行雜交。接著可以分析探針上的熒光，其中如果存在發(fā)射于探針的熒光則表明存在著未突變分枝桿菌gyrA、gyrB和/或nor基因區(qū),而如果并不存在發(fā)射于探針上的熒光則表明未突變分枝桿菌gyrA、gyrB和/或nor基因區(qū)并不存在。根據(jù)該具體實施方式
，來自于探針的熒光如果存在，則意味著分枝桿菌對環(huán)丙沙星并不具有耐藥性。在另一個的具體實施方式
中，使用一個或多個熒光標記的探針來檢測突變，所述探針是已知的環(huán)丙沙星耐藥性相關(guān)的基因區(qū)特異性探針，而只有當存在突變的時候，探針才能進行雜交。接著可以分析探針上的熒光，其中如果存在發(fā)射于探針的熒光則表明未突變分枝桿菌gyrA、 gyrB和/或nor基因區(qū)并不存在，而如果并不存在發(fā)射于探針上的熒光則表明存在未突變分枝桿菌gyrA, gyrB和/或nor基因區(qū)。根據(jù)該具體實施方式
,來自于探針的突光如果不存在，則意味著分枝桿菌對環(huán)丙沙星并不具有耐藥性。
根據(jù)這里所描述的方法，其包括檢測非rpoB基因的多個分枝桿菌基因的一個或多個突變，可以這樣理解，非rpoB基因的分枝桿菌基因特異性探針包括熒光標記，所述熒光標記遠離那些根據(jù)這里的方法用于標記一個或多個rpoB探針的熒光標記，例如，rpoB探針以及非rpoB基因的分枝桿菌基因特異性探針可以相互獨立地被檢測到。
在一些具體實施方式
中，這里所描述的方法包括檢測非rpoB基因的多個分枝桿菌基因的一個或多個突變，其中這些不同的基因上的突變與不同的抗微生物制劑耐藥性相關(guān)。舉個例子，一個方法可以包括檢測katG基因的一個或多個突變，其中所述的一個或多個突變與異煙肼耐藥性相關(guān)；該方法也可以包括檢測gyrA基因的一個或多個突變，其中所述一個或多個突變與環(huán)丙沙星耐藥性相關(guān)。根據(jù)此類的具體實施方式
，該方法允許檢測對多種抗微生物制劑具有耐藥性的分枝桿菌，例如，利福平、異煙肼和環(huán)丙沙星。根據(jù)此類具體實施方式
，非rpoB基因的分枝桿菌基因特異性探針可以包括自互補區(qū)域，因此當不存在含有與該探針雜交的核酸的核酸樣品時，探針形成發(fā)卡環(huán)。
在特定的具體實施方式
中，這里所描述的方法包括一個或多個洗滌步驟，例如，在雜交步驟之前和/或之后，該方法包括一個洗滌步驟。在其他的具體實施方式
中，這里所描述的方法不包括洗滌步驟。
在特定的具體實施方式
中，在使用這里所描述的方法前對核酸樣品進行裂解。在其他的具體實施方式
中，這里所描述的方法包括將裂解核酸樣品作為該方法的一個部分， 例如，將裂解劑包括進該方法的步驟(a)中。
在特定的具體實施方式
中，這里所描述的方法所使用的核酸樣品包括擴增的核酸。在一個特定的具體實施方式
中，擴增的核酸包括對應(yīng)于分枝桿菌rpoB基因或分枝桿菌 rpoB基因區(qū)域的核酸。在一些具體實施方式
中，擴增的核酸包括對應(yīng)于分枝桿菌非rpoB的其他基因或非rpoB的其他基因的區(qū)域，例如，擴增的核酸是分枝桿菌的inhA基因、katG基因、ahpC基因、mabA基因、oxyR基因、pncA基因、rrs基因、rpsL基因、embA基因、embB基因、embC基因、gyrA基因、gyrB基因或nor基因，或者其區(qū)域。在其他的具體實施方式
中，擴增的核酸包括分枝桿菌特異性的序列，該序列可以用于進行鑒定，例如，IS6110、16S rRNA、 gyrB、dnaj 或 85B 抗原。
在一些具體實施方式
中，核酸樣品中的核酸在使用這里所描述的方法之前就被擴增。在一些具體實施方式
中，核酸樣品中的核酸擴增是作為這里所描述的方法的一個部分， 例如，擴增步驟包括進該方法的步驟(a)中。在特定的具體實施方式
中，分枝桿菌的rpoB基因或rpoB基因的區(qū)域被擴增。在一些具體實施方式
中，被擴增的是非rpoB的分枝桿菌基因或這些基因的區(qū)域，例如，被擴增的核酸是分枝桿菌的inhA基因、katG基因、ahpC基因、 mabA基因、oxyR基因、pncA基因、rrs基因、rpsL基因、embA基因、embB基因、embC基因、 gyrA基因、gyrB基因或nor基因，或它們的區(qū)域。
在特定的具體實施方式
中，這里所展示的方法包括在核酸樣品與這里所使用的一個或多個探針(例如，rpoB探針和/或非rpoB的分枝桿菌基因特異性探針)接觸前先裂解核酸樣品，接著純化核酸樣品以及擴增核酸樣品。舉個例子，一個核酸樣品可以被裂解， 純化，然后擴增。接著，就可以將核酸樣品應(yīng)用于這里所展示的方法。
在其他的具體實施方式
中，這里所展示的方法包括裂解核酸樣品，接著在核酸樣品與這里所使用的探針(例如，rpoB探針和/或非rpoB分枝桿菌基因特異性探針)接觸的同時擴增核酸樣品。舉個例子，將核酸樣品與裂解劑、擴增制劑和一組探針組合，然后使用這里的方法，例如，這里所描述的方法可以包括在單管反應(yīng)中裂解，擴增以及檢測。
在其他的具體實施方式
中，這里所展示的方法包括在該方法前裂解核酸樣品，接著在核酸樣品與這里所使用的探針(例如，rpoB探針和/或非rpoB分枝桿菌基因特異性探針)接觸的同時擴增核酸樣品。舉個例子，核酸樣品可以被裂解，然后裂解的核酸樣品可以與擴增制劑以及一組探針組合，然后使用這里的方法，例如，這里所描述的方法可以包括在單管反應(yīng)中擴增和檢測。
Mt
探針可以指設(shè)計能與目的靶核酸序列特異性雜交的任何核酸序列。典型地，但不排除，探針與一個可檢測標記連接，因此該探針(以及它的靶核酸)能夠被檢測，顯現(xiàn)，測量和/或定量。
根據(jù)這里所描述的方法所使用的探針可以基于、衍生于或者包含本領(lǐng)域已知的任何探針，或者基于已知的或已確定的分枝桿菌的任何核酸序列或其類似物而改進。
在特定的具體實施方式
中，根據(jù)這里所描述的方法所使用的探針可以包括DNA或 RNA寡核苷酸，以及可以通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)化學合成。在特定的具體實施方式
中，根據(jù)這里所描述的方法所使用的探針是多肽-核酸探針(PNA)。PNAs是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(見，例如Egholm et al.，(1993)Nature，365 :566_568)。在其他的特定實施方式中，根據(jù)這里所描述的方法所使用的探針是鎖核酸(LNA)探針。PNAs是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。(見，例如 Koshkin et al.，(1998) J. AM. Chem. Soc.，120 :13252-13253)。
一條確定序列的探針可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所已知的技術(shù)產(chǎn)生，例如通過化學或生物化學合成，以及通過重組核酸分子的體外或體內(nèi)表達，例如細菌或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。在雜交的條件下，這里所包括的探針對它們的互補核酸序列表現(xiàn)出特異性，其設(shè)計與脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，例如核糖體RNA (rRNA)或信使RNA (mRNA)，進行雜交。
只要發(fā)生雜交，根據(jù)這里所描述的方法所使用的探針可以與任意長度的核酸序列進行雜交。舉個例子，探針可以與這些長度的核酸序列雜交5至15個堿基、5至25個堿基、5至50個堿基、5至100個堿基、5至250個堿基、5至500個堿基、5至1000個堿基、20 至25個堿基、20至50個堿基、20至100個堿基、20至250個堿基、20至500個堿基、20至 1000個堿基。在一個特定的具體實施方中，根據(jù)這里所描述的方法所使用的探針與15至 25個堿基長度的核酸序列進行雜交。在另外的特定具體實施方式
中，根據(jù)這里所描述的方法所使用的探針與18至22個堿基長度的核酸序列進行雜交。在另外的特定具體實施方式
中，根據(jù)這里所描述的方法所使用的探針與大約20個堿基長度的核酸序列進行雜交。
在特定的具體實施方式
中，根據(jù)這里所描述的方法所使用的探針長度約為5至 1000個核苷酸，約為5至750個核苷酸，約為5至500個核苷酸，約為5至250個核苷酸， 約為5至200個核苷酸，約為5至150個核苷酸，約為5至100個核苷酸，約為5至75個核苷酸，約為10至100個核苷酸，約為10至75個核苷酸，約為10至50個核苷酸，約為10至30個核苷酸，約為5至20個核苷酸，約為20至100個核苷酸，約為20至75個核苷酸，或約為30至100個核苷酸，或者它們之間的任何長度。在其他的一些具體實施方式
中，探針的長度大約 5，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31， 32，33，34，35，36，37，38，39或40個核苷酸。在特定的具體實施方式
中，根據(jù)這里所描述的方法所使用的探針長度為15至25個堿基。在其他的特定具體實施方式
中，根據(jù)這里所描述的方法所使用的探針長度為18至22個堿基。在其他的特定具體實施方式
中，根據(jù)這里所描述的方法所使用的探針長度為約20個堿基。在其他的特定具體實施方式
中，根據(jù)這里所描述的方法所使用的探針長度為約81個堿基。
在特定的具體實施方式
中，根據(jù)這里所描述的方法所使用的探針長度至多10個核苷酸，15個核苷酸，20個核苷酸，25個核苷酸，30個核苷酸，35個核苷酸，40個核苷酸， 45個核苷酸，50個核苷酸，55個核苷酸，60個核苷酸，65個核苷酸，70個核苷酸，75個核苷酸，80個核苷酸，85個核苷酸，90個核苷酸，95個核苷酸，100個核苷酸。在其他具體實施方式
中，探針長度少于 10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29， 30，31，2，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55， 56，57，58，59，60，70，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85 或 90 個核苷酸。
在特定的具體實施方式
中，根據(jù)這里所描述的方法所使用的探針與它們的互補核酸序列在高度嚴格、中等嚴格或低嚴格雜交條件下進行雜交，其中所使用的雜交條件的選擇決定了雜交的嚴格程度。最適雜交條件取決于探針以及探針雜交核酸的長度和類型(例如RNA或DNA)。本領(lǐng)域技術(shù)人員都知曉當探針變短時，為了獲得滿意的雜交結(jié)果，那么就有必要調(diào)整它們的長度以達到一個相對均一的熔解溫度。核酸嚴格雜交條件的一般性參數(shù)描述于 Sambrook et al.，MOLECULAR CLONING-A LABORATORY MANUAL (2ND ED.)，Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)以及Ausubel et al. ,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,vol. 2,Current protocols Publishing, New York(1994)中。在特定的具體實施方式
中，根據(jù)這里所描述的方法中使用的探針只有在高度嚴格的條件下才與它們的互補核酸序列進行雜交。高度嚴格條件的示例包括低鹽濃度(例如，l_250mM Na+)，相對于探針熔解溫度的高溫(例如，從比溶解溫度低5°C至比溶解溫度高5°C的范圍)，高pH值(例如，高于pHIO)，助溶劑的存在(例如1-20% DMSO或甘油)。
在一些具體實施方式
中，根據(jù)這里所描述的方法所使用的探針可以包括一個或多個額外的核酸序列，這些核酸序列不與探針的互補核酸序列雜交。如果第一序列被整合進諸如自雜交的探針(即，具有不同堿基區(qū)的探針，在沒有互補序列存在的時候，在雜交實驗情況下，這些堿基區(qū)可以相互雜交)中時，可以包括多于一個額外的核酸序列，如那些在 FRET中使用的那些。在一些具體實施方式
中，探針雜交的核酸序列包括額外的不與探針雜交的核酸。在其他的具體實施方式
中，探針雜交的核酸序列不包括額外的不與探針雜交的核酸。
這里所描述的方法所使用的探針可以以不同的特異性程度與它們的互補核酸序列進行雜交。在特定的具體實施方式
中，探針雜交的核酸序列與探針序列100%互補。在其他具體實施方式
中，探針雜交的核酸序列與探序列針超過90%互補。在其他具體實施方式
中，探針雜交的核酸序列與探針序列超過85%互補。在其他具體實施方式
中，探針雜交的核酸序列與探針序列超過80%互補。在其他具體實施方式
中，探針雜交的核酸序列與探針序列超過75 %互補。在其他具體實施方式
中，探針雜交的核酸序列與探針序列超過70 %互補。在其他具體實施方式
中，探針雜交的核酸序列與探針序列超過60%互補。
根據(jù)這里所描述的方法所使用的探針可以以任意濃度或量使用，只要所述探針的濃度或量足以達到該方法所需要的效果。在特定的具體實施方式
中，探針的使用量約為O.001 μ g，約為O. 01 μ g，約為O. I μ g，約為I. O μ g，或大于I. O μ g。為了達到所需要的探針濃度，可以將探針懸浮于適合這里描述的方法的緩沖液中。所使用的示例性的探針濃度包括 O. 0001 μ g/ml, O. 001 μ g/ml, O. 01 μ g/ml, O. I μ g/ml, I. O μ g/ml,以及 10. 0 μ g/ml 探針。在特定的具體實施方式
中，所使用的探針的量為約1.0nM，10nM，50nM，100nM，200nM， 300nM,400nM,500nM,600nM,700nM,800nM,900nM,IOOOnM,2000nM,3000nM,4000nM,5000nM, 或超過5000nM。在其他的具體實施方式
中，探針的量介于1.0恤和50001^之間，101^和 5000nM之間，IOnM和 2500nM之間，IOnM和 IOOOnM之間，50nM和 5000nM之間，50nM至 2500nM 之間，或50nM至IOOOnM之間。
在特定的具體實施方式
中，根據(jù)這里所描述的方法所使用的探針包含可檢測標記?？蓹z測標記是指基團，例如化學發(fā)光，熒光或放射性同位素基團或包含這些的基團，以及非同位素標記，例如酶或染料。在一些具體實施方式
中，可檢測標記包含熒光供體基團、 熒光受體基團或者淬滅基團。在特定的具體實施方式
中，根據(jù)這里描述的方法所使用的探針包含熒光標記。在其他的特定具體實施方式
中，根據(jù)這里所描述的方法所使用的探針包含熒光標記和淬滅基團?？梢灾苯踊蜷g接用可檢測標記來標記探針。間接標記的方法在本令頁域是已知的(見，Current Protocols in Immunology, Coligan et al. , eds. , 1997, John Wiley & Sons, Inc. U. S. A.，pp. 8. 10. 12-1. 10. 21)。直接在探針上連接可檢測標記的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。例如，由Burdick和Oakes提出的，公開于1990年5月30 日的歐洲專利公開文獻NO. EP0370694A2，標題為“使用固相捕捉方法檢測核酸的診斷試劑盒和方法”，其中披露了將標記物連接至探針的方法。舉個例子，直接標記可通過在合成探針時將熒光染料標記的亞磷酸胺直接整合到探針上來完成。熒光標記的核苷類似物可從商業(yè)獲得，或者通過本領(lǐng)域已知的合成方法產(chǎn)生(見Brumbaugh et al. , 1988,Proc. Natl. Acda. Sci(USA)，85 :5610_5614)。
在特定的具體實施方式
中，根據(jù)這里描述的方法所使用的探針包含熒光標記，當存在互補核酸序列時，發(fā)射自該探針的熒光信號比不存在互補核酸序列時發(fā)射自該探針的熒光的信號至少高 5%，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或 100%。在特定的具體實施方式
中，當存在互補核酸序列時，發(fā)射自該探針的熒光信號是不存在互補核酸序列時發(fā)射自該探針的熒光的信號至少I倍，I. 5倍，2倍，3倍，4倍，5倍，10倍，15倍，20 倍，50倍，100倍，500倍或1000倍。
在一個具體實施方式
中，探針可以包含一個或多個熒光基團。在另外的具體實施方式
中，探針可以包含一個或多個供體基團。在另外的具體實施方式
中，探針可以包含一個或多個淬滅基團。在另外的具體實施方式
中，探針可以包含一個或多個熒光受體基團。在一個具體實施方式
中，探針可以包含熒光基團和淬滅基團，它們都位于該探針中，以使得當不存在互補核酸序列時熒光基團和淬滅基團可以一起引入。在另外的具體實施方式
中，探針可以包含熒光供體基團和熒光受體基團，它們都位于該探針中，以使得當不存在互補核酸序列時熒光供體基團和熒光受體基團可以一起引入。舉個例子，熒光供體基團可以位于探針的一個末端，而淬滅基團或熒光受體基團位于探針的另外一個末端，其中當沒有與互補核酸結(jié)合或雜交時，該探針采用一種構(gòu)象或二級結(jié)構(gòu)，如莖環(huán)結(jié)構(gòu)或發(fā)夾環(huán)，而當與互補核酸結(jié)合或雜交時，該探針采用一種不同的構(gòu)象或二級結(jié)構(gòu)。當探針與互補核酸結(jié)合時，淬滅基團或熒光受體基團與熒光供體基團分離，導致熒光信號的去淬滅。在其他的具體實施方式
中，探針可以包含熒光供體基團和熒光受體基團，它們都位于該探針中，以使得當探針與核酸序列雜交時，熒光受體基團能夠接受來自于雜交到核酸序列上的附近探針的熒光供體基團的能量，以及熒光供體基團能夠?qū)⒛芰哭D(zhuǎn)移至雜交到核酸序列上的附近探針的熒光受體基團上。
在特定的具體實施方式
中，用一個單獨的熒光基團，一個單獨的熒光供體基團，一個單獨的熒光受體基團和一個單獨的淬滅基團標記探針。在其他的具體實施方式
中，用超過一個熒光基團，超過一個熒光供體基團，超過一個熒光受體基團和超過一個的淬滅基團標記探針。在特定的具體實施方式
中，用一個單獨的熒光基團和淬滅基團或熒光供體基團或熒光受體基團對來標記探針。在其他具體實施方式
中，使用不同的熒光基團和淬滅基團或熒光供體基團或熒光受體基團對來標記探針。
為了獲得發(fā)生于熒光供體基團和熒光受體基團或淬滅基團之間的FRET，兩個基團必須在空間上互相接近。因此，在特定的具體實施方式
中，探針同時含有熒光供體基團和熒光受體基團或淬滅基團，以使得熒光供體基團和熒光受體基團或淬滅基團相互之間的距離最多有O . 5nm,最多Inm,最多5nm,最多IOnm,最多15nm,或最多20nm。在其他的具體實施方式
中，在一個探針上的淬滅基團或熒光受體基團與熒光供體基團之間的距離約為10，15， 20,30,40,50,60,70,80,90,100，110，105，110，115，120，130，140 或 150A，或者它們中間的任何數(shù)值。在其他具體實施方式
中，探針同時包含熒光供體基團和熒光受體基團或淬滅基團，以使得熒光供體基團和熒光受體基團或淬滅基團相互之間的距離為至少2個，至少3 個，至少4個,至少5個,至少6個,至少7個,至少8個,至少9個,至少10個,至少15個， 至少20個，至少50個，至少100個或至少200個核苷酸。在其他的具體實施方式
中，探針同時包含熒光供體基團和熒光受體基團或淬滅基團，以使得熒光供體基團和熒光受體基團或淬滅基團相互之間的距離為2至5，2至10，2至15，2至20，3至5，3至10，3至15，3至 20，5 至 10，5 至 20，5 至 50，5 至 100，5 至 200，10 至 20，10 至 50，10 至 100，10 至 200，10 至 300，10 至 400，10 至 500，50 至 100，50 至 250，50 至 500，100 至 200，100 至 300，100 至 400， 或100至500個核苷酸。
rpoB 探針
根據(jù)這里所描述的方法中所使用的探針是分枝桿菌rpoB基因特異性的。分枝桿菌rpoB基因特異性探針可由本領(lǐng)域已知的方法或上面所描述的方法進行制備。在一個特定的具體實施方式
中，分枝桿菌rpoB基因特異性探針是與未突變的rpoB基因核心區(qū)雜交的。在其他的具體實施方式
中，分枝桿菌rpoB基因特異性探針與不包含核心區(qū)的rpoB基因區(qū)雜交。
在特定的具體實施方式
中，將對未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)特異性的探針設(shè)計為當百分之百互補時，未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)特異性探針只與它們的互補核酸序列進行雜交，即，如果與所述探針互補的rpoB基因核心區(qū)核酸序列含有突變，則探針并不會結(jié)合到該核酸上。在另外的具體實施方式
中，即便不是百分之百的互補，即，即便核酸序列包含突變，探針仍然能結(jié)合到不包含核心區(qū)的rpoB基因的核酸序列上，不包含核心區(qū)的分枝桿菌rpoB基因區(qū)特異性的探針也能與其互補的核酸序列進行雜交。
在特定的具體實施方式
中，選擇分析的條件，以使得在特定的雜交條件下(例如， 高嚴格條件下)，未突變的分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)特異性探針只會與它們的互補核酸序列進行雜交。在其他的具體實施方式
中，選擇分析的條件，以使得即便沒有完全互補，不包含核心區(qū)的rpoB基因區(qū)特異性探針也能與它們互補的核酸序列進行雜交，即，雜交條件是低至中等嚴格性。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當可以理解，低、中等和高嚴格性條件是視相互作用的多種因子而定的，同時還取決于所述探針的特殊的設(shè)計。例如，對于典型的探針，高嚴格性條件可以包括探針熔解溫度的上下5°C的溫度，低鹽濃度(例如，低于250mM)，高共溶劑濃度(例如，1-20%的共溶劑，例如DMS0)。另外一方面，低嚴格條件可以包括低于探針溶解溫度超過10°C的溫度，高鹽濃度(例如，超過IOOOmM)，以及不存在共溶劑。
這里所描述的方法使用一個，兩個，三個，四個或更多未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)特異性探針。根據(jù)這些方法，當rpoB基因核心區(qū)不包含能夠賦予其抗微生物制劑利福平耐藥性的突變時，未突變的分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)特異性探針與rpoB基因核心區(qū)進行雜交，因此整個核心區(qū)都被rpoB探針所雜交。舉個例子，如果這里所描述的方法使用了一個未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)特異性rpoB探針，則只要分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)不含有突變，這個rpoB探針將與整個分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)進行雜交；如果這里所描述的方法使用了兩個未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)特異性rpoB探針，則只要分枝桿菌 rpoB基因核心區(qū)不含有突變，這兩個rpoB探針一同將與整個分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)進行雜交；如果這里所描述的方法使用了三個未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)特異性rpoB 探針，則只要分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)不含有突變，這三個rpoB探針一同將與整個分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)進行雜交；如果這里所描述的一個方法使用了四個未突變分枝桿菌 rpoB基因核心區(qū)特異性rpoB探針，則只要分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)不含有突變，這四個 rpoB探針一同將與整個分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)進行雜交。圖I提供了當分枝桿菌rpoB 基因核心區(qū)內(nèi)存在或不存在突變時，rpoB探針如何與分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)雜交的示意圖。
分枝桿菌檢測探針
在特定的具體實施方式
中，使用了分枝桿菌檢測探針。分枝桿菌檢測探針包含可檢測標記，例如，熒光標記，所述標記能夠允許鑒定分枝桿菌是否存在在樣品中。根據(jù)這里所描述的方法所使用的分枝桿菌檢測探針包含核酸序列，該核酸序列與分枝桿菌中除rpoB 基因的核酸序列互補，例如，IS6110,16SrRNA, dnaj或85B抗原。
在特定的具體實施方式
中，分枝桿菌檢測探針是特異性針對分枝桿菌的核酸序列，該核酸序列在分枝桿菌的多個菌株或品種中是保守的。在另外一個具體實施方式
中，分枝桿菌檢測探針特異性針對特定分枝桿菌菌株或品種的核酸序列。
在一些具體實施方式
中，分枝桿菌檢測探針特異性針對分枝桿菌中大量提供的核酸序列，例如16S核糖體RNA或23S核糖體RNA。
分枝桿菌除rpoB之外的其他基因的特異性探針
在一些具體實施方式
中，根據(jù)這里所描述的方法，使用了特異性結(jié)合分枝桿菌的除rpoB基因之外的其他基因的探針。根據(jù)此類具體實施例，這些探針對分枝桿菌的除rpoB 基因之外的其他基因是特異性的，其中所述的除rpoB基因之外的其他基因可以包括能夠帶來一個或多個抗微生物制劑耐藥性的突變。示例性的探針設(shè)計所針對的分枝桿菌基因包括inhA基因、katG基因、ahpC基因、mabA基因、oxyR基因、pncA基因、rrs基因、rpsL基因、 embA基因、embB基因、embC基因、gyrA基因、gyrB基因或者nor基因(見Drobniewski and Wilson, 1998, J. Med. Microbiol. ,47 :189_196 ；Riska et al. , 2000, Int. J. Tuberc. Lung. Dis. ,4(2) :S4-S10)。在特定的具體實施方式
中，除rpoB基因之外的分枝桿菌其他基因的特異性探針包括熒光基團。在一些具體實施方式
中，除rpoB基因之外的分枝桿菌其他基因的特異性探針包含熒光基團和淬滅基團，其在探針上的位置使得在沒有互補核酸序列存在的情況下淬滅基團和熒光基團能夠靠在一起。在一些具體實施方式
中，除rpoB之外的分枝桿菌其他基因的特異性探針包含熒光供體基團和熒光受體基團，其在探針上的位置使得在沒有互補核酸序列存在的情況下熒光供體基團和熒光受體基團能夠靠在一起。在一些具體實施方式
中，除rpoB之外的分枝桿菌其他基因的特異性探針在沒有互補核酸序列的情況下能形成發(fā)夾環(huán)。
在特定的具體實施方式
中，除rpoB之外的分枝桿菌其他基因的特異性探針只有在百分之百互補的情況下才能夠與它們的互補核酸序列雜交，即，如果核酸序列含有一個突變，則該探針就不會與核酸序列結(jié)合。
封閉探針
在一些具體實施方式
中，這里所描述的方法中還使用了封閉探針。封閉探針設(shè)計為雜交到(i)這里所描述的方法中的rpoB探針；(ii)未突變rpoB基因核心區(qū)的核酸序列； 或(iii)rpoB基因核心區(qū)外的核酸序列。
在特定的具體實施方式
中，封閉探針至少部分地與rpoB探針的一部分互補，因此，在不存在含有與rpoB探針雜交的核酸的核酸樣品時，封閉探針與rpoB探針雜交。在其他的具體實施方式
中，封閉探針至少部分地與未突變rpoB基因核心區(qū)的核酸序列雜交，因此，在不存在一個或多個rpoB探針時，封閉探針能與未突變的rpoB基因核心區(qū)雜交，而如果存在未突變的rpoB基因核心區(qū)，rpoB探針則與未突變的rpoB基因核心區(qū)雜交而不與封閉探針雜交。當封閉探針與rpoB探針的一部分互補時,只有在不存在rpoB探針雜交的未突變的分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)時，封閉探針才會與rpoB探針雜交。當封閉探針至少部分與未突變的分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)的核酸序列互補的時候，只有在不存在與未突變的分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)雜交的rpoB探針時，封閉探針才會與未突變的rpoB基因核心區(qū)的核酸序列雜交。
在一些具體實施方式
中，封閉探針用淬滅基團標記，該淬滅基團能夠淬滅封閉探針結(jié)合的rpoB探針上的熒光基團(例如，熒光供體基團)。
核酸樣品
根據(jù)這里所描述的方法中所使用的核酸樣品可以分離自，獲得自，衍生自或取自任何來源,包括但不限于受試者(例如，人體或動物體)。
在特定的具體實施方式
中，所述來源被懷疑含有分枝桿菌，S卩，懷疑所述來源被分枝桿菌感染和/或污染。在其他的具體實施方式
中，來源被懷疑含有利福平耐藥性的分枝桿菌。在其他的具體實施方式
中，來源被懷疑含有多重耐藥性的分枝桿菌。
根據(jù)這里所描述的方法，核酸樣品要被裂解。在特定的具體實施方式
中，核酸樣品只含有分枝桿菌。在其他的具體實施方式
中，核酸樣品含有來自于受試者的宿主細胞。在一些具體實施方式
中，核酸樣品含有來自于受試者的宿主細胞，其中分枝桿菌定位于這些宿主細胞中。根據(jù)此類的具體實施方式
，宿主細胞同樣被裂解。在一些具體實施方式
中，一種裂解劑被用于裂解核酸樣品，例如，可以使用裂解核酸樣品中的分枝桿菌和宿主細胞的一種裂解劑。在另一些具體實施方式
中，使用多于一種的裂解劑，例如一種裂解劑可用于裂解核酸樣品中的分枝桿菌，而另一種裂解劑則用于裂解核酸樣品中的宿主細胞。在特定的具體實施方式
中，將核酸樣品裂解，并分離和/或純化核酸樣品中的分枝桿菌核酸。
在特定的具體實施方式
中，在這里所描述的一個或多個方法之前先裂解核酸樣品。在其他的具體實施方式
中，裂解核酸的步驟可作為這里所描述的一個或多個方法的一個部分。裂解核酸樣品可通過將它們與裂解劑相接觸來進行。在一些具體實施方式
中，裂解劑是生物制劑，例如，諸如裂解酶，蛋白酶K或acheromo蛋白酶(acheromopeptidase)等酶類。在其他具體實施方式
中，裂解劑是化學制劑，例如離液劑或去垢劑(例如，異硫氰胺胍和十二烷基磺酸鈉)。在進一步的具體實施方式
中，裂解劑包括一種或多種機械過程(例如，吹打，超聲，費氏細胞壓碎器)。在更進一步的具體實施方式
中，裂解劑是生物和化學制劑以及機械過程的組合。
根據(jù)這里所描述的一個或多個方法中使用的核酸樣品，在其根據(jù)這里所描述的一個或多個方法使用之前，或者其作為這里所描述的一個或多個方法的一個部分之前，可以先對其進行處理/操作。舉個例子，可以將核酸樣品儲藏(例如，在室溫下，在37°C，在4°C， 在-20°C，或者在-70°C )，可以洗滌核酸樣品(例如，移除那些不需要的組分)，和/或擴增核酸樣品。在特定的具體實施方式
中，核酸樣品被分為幾個部分，可以以相同或者不同的方式來對它們進行處理/操作。在一些具體實施方式
中，核酸樣品被分為幾個部分，至少其中一個部分是根據(jù)這里所描述的一個或多個方法來使用，而剩下的核酸樣品部分則被儲藏 (例如，在室溫下，在37°C，在4°C，在-20°C，或者在-70°C )。
在特定的具體實施方式
中，核酸樣品從來源中分離或獲得之后立刻就使用到根據(jù)這里所描述的方法中。在另外的具體實施方式
中，核酸樣品從來源中分離或獲得之后的最多30分鐘，I小時，2小時，4小時，6小時，8小時，12小時，24小時就要使用到根據(jù)這里所描述的方法中。在一些具體實施方式
中，根據(jù)這里所描述的方法使用了核酸樣品的一部分，而剩余的核酸樣品保藏以便將來使用。根據(jù)此類的具體實施方式
，樣品的剩余部分可以保藏在室溫，或4°C，在_20°C，或者在_70°C。
在特定的具體實施方式
中，核酸樣品或其部分可以通過以下處理濃縮核酸樣品的所有或部分非液體部分，例如，通過離心。在一些具體實施方式
中，處理大體積的核酸樣品來濃縮核酸樣品，在之后丟棄不含有分枝桿菌核酸的核酸樣品的的全部或部分，剩余的核酸樣品則可應(yīng)用于這里所描述的一個或多個方法中，或者在所述一個或多個方法之前進行處理/操作，例如，核酸樣品可以被裂解，洗滌，在其他培養(yǎng)基中重懸，或者擴增。在其他的具體實施方式
中，含有非分枝桿菌的非液體成分的核酸樣品，例如，血液成分，也可以被處理，以濃縮不是分枝桿菌的非液體成分。然后分離剩余的核酸樣品，丟棄那些不是分枝桿菌的非液體組分。
可以根據(jù)這里所呈現(xiàn)的方法從中獲得和使用核酸樣品的受試者的例子，例如人類，包括但不限于無臨床癥狀的受試者，清楚表現(xiàn)出或展現(xiàn)出1，2，3，4或更多個分枝桿菌感染癥狀的受試者，臨床診斷為分枝桿菌感染的受試者，分枝桿菌易感性受試者(例如，受試者的生活方式使他們傾向于分枝桿菌感染或與分枝桿菌感染者接觸的可能性增高，例如，與其他的已知患有結(jié)核的受試者接觸)，懷疑患有分枝桿菌感染的受試者，正在接受分枝桿菌感染治療的受試者，有分枝桿菌感染以及至少一種其他癥狀的受試者(例如，有2， 3，4，5或更多種癥狀的受試者)，以及已經(jīng)被確診為分枝桿菌感染的受試者。
核酸樣品可以從受試者的任意組織或器官或者任意分泌物中獲得。獲得自受試者的代表性核酸樣品包括但不限于，支氣管肺泡灌洗液、支氣管灌洗液、咽喉分泌物、氣管吸出物、血液樣品、血清樣品、血漿樣品、骨骼樣品、皮膚樣品、軟組織樣品、腸道標本、生殖道標本、母乳、淋巴樣品、腦髓液、肋膜液、痰樣品、尿液樣品、鼻腔分泌物、眼淚、膽汁樣品、腹水樣品、膿水、大便、滑膜液、玻璃體液、陰道分泌物、精液、或尿道樣品。在一些具體實施方式
中，可以從受試者中獲得兩個、三個或更多的核酸樣品。
在一個具體實施方式
中，核酸樣品包含為實施這里所描述的一個或多個方法所需要的最低量的分枝桿菌核酸。在其他的具體實施方式
中，核酸樣品中的分枝桿菌核酸被擴增直到該樣品包含為實施這里所描述的一個或多個方法所需要的最低量的分枝桿菌核酸。
在特定的具體實施方式
中，核酸樣品包括至少I個菌群形成單位(CFU)，至少 IOCFU,至少 IO2CFU,至少 IO3CFU,至少 IO4CFU,至少 IO5CFU,至少 IO6CFU,或至少 IO7CFU 的分枝桿菌。
核酸擴增
本領(lǐng)域已知的任何擴增核酸的方法都可以用于擴增分枝桿菌的核酸。舉個例子，擴增分枝桿菌核酸的方法可以是聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)(見例如Sambrook, et al,. supra)，鏈置換擴增(SDA)，轉(zhuǎn)錄介導擴增(TMA)，基于核酸序列的擴增(NASBA)，滾環(huán)擴增， 螺旋置換擴增，或環(huán)介導的等溫擴增(LAMP)。
在特定的具體實施方式
中，在實施這里所描述的一個或多個方法前擴增分枝桿菌的核酸。舉個例子，將含有分枝桿菌的樣品進行擴增反應(yīng)，例如PCR，以便在實施這里所描述的方法前能夠擴增分枝桿菌的一個或多個區(qū)域的核酸序列。在特定的具體實施方式
中， 擴增的分枝桿菌核酸序列是rpoB基因或rpoB基因的區(qū)域，例如，包含rpoB基因核心區(qū)的 rpoB基因的區(qū)域。在其他的具體實施方式
中，擴增的分枝桿菌核酸序列是非分枝桿菌rpoB 基因的其他基因或者非分枝桿菌rpoB基因的其他基因的區(qū)域，例如，inhA基因、katG基因、 ahpC基因、mabA基因、oxyR基因、pncA基因、rrs基因、rpsL基因、embA基因、embB基因、 embC基因、gyrA基因、gyrB基因或者nor基因。
在其他的具體實施方式
中，擴增分枝桿菌核酸的步驟作為這里所描述的一個或多個方法的一個部分。舉個例子，將含有分枝桿菌的樣品進行擴增反應(yīng)，例如PCR，以便作為這里所描述的方法的一個部分擴增分枝桿菌的一個或多個區(qū)域的核酸序列。在特定的具體實施方式
中，擴增的分枝桿菌核酸序列是rpoB基因或rpoB基因的區(qū)域，例如，包含rpoB基因核心區(qū)的rpoB基因的區(qū)域。在其他的具體實施方式
中，擴增的分枝桿菌核酸序列是非分枝桿菌rpoB基因的其他基因或者非分枝桿菌rpoB基因的其他基因的區(qū)域，例如，inhA基因、 katG基因、ahpC基因、mabA基因、oxyR基因、pncA基因、rrs基因、rpsL基因、embA基因、 embB基因、embC基因、gyrA基因、gyrB基因或者nor基因。
5. 3. L I 實時 PCR
實時PCR，也稱為動力學PCR，能夠同時對一個DNA樣品中的特定序列進行檢測和定量(為拷貝數(shù)的絕對數(shù)目或當以DNA載入量或者額外的標準基因進行標準化時的相對量)O
在實時PCR —種方法中，可以使用探針來檢測擴增的DNA，所述探針雜交到互補 DNA的時候可以發(fā)出熒光。根據(jù)該方法，使用熒光探針只能定量包含與所述探針互補的核酸序列的DNA ;因此，使用探針可以顯著地提高特異性，甚至可以在存在一些非特異性DNA擴增的時候都可以允許定量。序列特異性探針的使用允許利用帶有不同熒光標記的特異性探針在同一個反應(yīng)中鑒定DNA的多個區(qū)域。每個PCR循環(huán)中，探針所雜交的核酸序列的增加導致熒光信號的增加。
檢濕
根據(jù)這里所描述的方法，當供體基團將能量轉(zhuǎn)移到受體基團所導致的熒光發(fā)射或者當熒光基團或其它可檢測標記所發(fā)射的熒光的檢測可以通過使用本領(lǐng)域已知的任意測量熒光發(fā)射的方法來完成，例如熱循環(huán)儀/熒光計(實時PCR的裝置)，熒光激光掃描儀，或者熒光微孔板閱讀儀。
實時PCR裝置
所謂的“實時"PCR包括同時擴增和檢測PCR產(chǎn)物。最常見的是利用整合了熒光檢測的熱循環(huán)儀來完成該檢測。在每個循環(huán)中都要進行樣品中的熒光激發(fā)及檢測其導致的熒光發(fā)射，使得可以在整個反應(yīng)過程中累積分析熒光強度。
微孔板閱讀儀
微孔板閱讀儀是實驗室設(shè)備，設(shè)計用于檢測在微量平板中樣品的生物學、化學或生理事件?？梢栽诶?-1538孔的微量平板中分析樣品反應(yīng)。微板分析的一種常用檢測模式包括檢測熒光密度。
在用微孔板閱讀儀檢測熒光密度時，第一光學系統(tǒng)(激發(fā)系統(tǒng))用特定波長的光照射樣品。由于照射，樣品發(fā)射光(例如，熒光)，然后第二系統(tǒng)(發(fā)射系統(tǒng))收集這些發(fā)射的光，將其與激發(fā)光分離開來(使用濾鏡或單色儀系統(tǒng))，以及使用光線檢測器，例如一個光電倍增器(PMT)測量信號。
激光掃描
這里所描述的方法中使用的可檢測標記可以通過使用激光掃描進行檢測例如，使用一個熒光激光掃描儀(見，例如Schena et al.，1996，Genome Res. 6 :639_645)或者激光掃描共聚焦顯微鏡(例如，共聚焦激光掃描顯微鏡)。這里所描述的方法中使用的激光掃描方法可以是基于熒光的，例如，激光以一個特定波長激發(fā)熒光基團，然后可以檢測熒光基團所發(fā)射出的熒光。
診斷方法
在特定的具體實施方式
中，這里提供了診斷患有分枝桿菌感染的受試者的方法， 例如人類，所述方法包括用這里所描述的一個或多個方法。在特定的具體實施方式
中，這里所展示的方法可以用于診斷受試者是否患有結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌、牛型分枝桿菌、 牛型分枝桿菌卡介苗或田鼠分枝桿菌感染。在特定的具體實施方式
中，這里所展示的方法可以用于診斷受試者是否患有結(jié)核。在其他的具體實施方式
中，這里所展示的方法可以用于診斷受試者是否被利福平耐藥性的分枝桿菌感染。在其他的具體實施方式
中，這里所展示的方法可以用于診斷受試者是否被多重耐藥性的分枝桿菌感染。
這里還包括監(jiān)測受試者中分枝桿菌感染的方法，所述受試者已經(jīng)被診斷為分枝桿菌感染。根據(jù)此類方法，可以通過檢測受試者體內(nèi)的分枝桿菌感染來獲得該分枝桿菌是否已經(jīng)獲得了利福平耐藥性或者變?yōu)槎嘀啬退幮苑种U菌。可以通過對分離或獲得自受試者的核酸樣品實施這里所描述的方法來對感染進行監(jiān)測。在特定的具體實施方式
中，在感染診斷之后，以特定的間隔(例如，至少每月一次)進行感染監(jiān)測，直至不再檢測到分枝桿菌為止。在特定的具體實施方式
中，患者先施用一次或多次抗微生物制劑，例如利福平或異煙肼，之后再進行感染的監(jiān)測，例如，每周監(jiān)測一次感染，兩周一次，每月一次，兩月一次，每六個月一次或每年一次。
治療的選擇
這里所描述的方法允許確定一個分枝桿菌是否含有一個未突變的分枝桿菌rpoB 基因核心區(qū)以及因此而可能對抗微生物制劑利福平敏感。這里所展示的方法還允許鑒定一個分枝桿菌是否對其他用于治療分枝桿菌感染的抗微生物制劑敏感，例如，其他的利福平衍生物(例如，利福布汀、利福噴丁)、異煙肼、吡嗪酰胺、鏈霉素、乙胺丁醇、乙硫異煙胺、和環(huán)丙沙星。另外，這里所展示的方法可以為診斷患有分枝桿菌感染的患者選擇合適的治療方案提供信息。
舉個例子，檢測到樣品中存在未突變的分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)可以表明受試者可以用利福平進行治療，而如果在樣品中沒有檢測到未突變的分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)則表明該受試者不應(yīng)當使用利福平進行治療。此外，確定受試者的樣品中的分枝桿菌對一種或多種抗微生物制劑是否具有易感性/耐藥性能夠為治療其他受試者提供信息，即， 其他受試者表現(xiàn)出分枝桿菌感染相同的癥狀，那么可以向他們施用相同的一種或多種抗微生物制劑。
除了能夠方便為患者選擇合適的治療方案之外，確定分枝桿菌對一種或多種抗微生物制劑是否具有易感性/耐藥性還有助于減少分枝桿菌從一個受試者向其他受試者的傳播。
試劑盒
這里還展示了試劑盒，所述試劑盒在容器中包括一種或多種組分，所述組分是根據(jù)這里描述的方法，用于確定樣品中分枝桿菌對于一種或多種抗微生物制劑具有易感性/ 耐藥性所必需的。
在一個具體實施方式
中，這里所展示的試劑盒包括組合物，所述組合物含有一組探針，其中至少五個探針是未突變rpoB基因核心區(qū)特異性的rpoB探針，其中(i)第一和第三rpoB探針用熒光供體基團標記，(ii)第二和第四rpoB探針用不同的熒光受體基團標記， 以及(iii)第五探針用熒光基團標記；其中rpoB探針能與未突變的rpoB基因核心區(qū)進行雜交以使得熒光受體基團能夠接受來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移。
在另外的具體實施方式
中，這里所展示的試劑盒包括一個組合物，所述組合物含有一組探針，其中至少五個探針是未突變rpoB基因核心區(qū)特異性的rpoB探針，其中(i)第一和第三rpoB探針用熒光供體基團標記，(ii)第二和第四rpoB探針用不同的熒光受體基團標記，以及(iii)第五探針用熒光基團和淬滅基團標記，其中，當不存在第五rpoB探針特異性雜交的未突變rpoB基因核心區(qū)的時候，第五探針能形成發(fā)夾環(huán)，因此，熒光基團的熒光就被淬滅；其中rpoB探針能與未突變的rpoB基因核心區(qū)進行雜交以使得熒光受體基團能夠接受來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移。
在一個具體實施方式
中，這里所展示的試劑盒包括一個組合物，所述組合物含有一組探針，其中至少四個探針是未突變rpoB基因核心區(qū)特異性的rpoB探針，其中第一和第三rpoB探針用熒光供體基團標記，第二和第四rpoB探針用不同的熒光受體基團標記；其中 rpoB探針能與未突變的rpoB基因核心區(qū)進行雜交以使得熒光受體基團能夠接受來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移。
在一個具體實施方式
中，這里所展示的試劑盒包括一個組合物，所述組合物含有一組探針，其中至少四個探針是未突變rpoB基因核心區(qū)特異性的rpoB探針，其中第一和第二rpoB探針用不同的熒光基團標記，第三探針用熒光供體基團標記，第四探針用熒光受體基團標記；其中第三和第四rpoB探針與未突變的rpoB基因核心區(qū)進行雜交以使得熒光受體基團能夠接受來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移。
在另外的具體實施方式
中，這里所展示的試劑盒包括一個組合物，所述組合物含有一組探針，其中至少四個探針是未突變rpoB基因核心區(qū)特異性的rpoB探針，其中(i)第一和第二 rpoB探針用熒光基團和淬滅基團標記，其中，當不存在第一和第二 rpoB探針特異性雜交的未突變rpoB基因核心區(qū)時，rpoB探針會形成發(fā)夾環(huán)，則熒光基團的熒光就被淬滅，(ii)第三rpoB探針用熒光供體基團標記，以及(iii)第四探針用熒光受體基團標記； 其中第三和第四rpoB探針能與未突變的rpoB基因核心區(qū)進行雜交以使得熒光受體基團能夠接受來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移。
在另外的具體實施方式
中，這里所展示的試劑盒包括一個組合物，所述組合物含有一組探針，其中至少四個探針是未突變rpoB基因核心區(qū)特異性的rpoB探針,其中rpoB 探針包括不同的熒光基團和淬滅基團，其中，在不存在rpoB探針特異性雜交的未突變的 rpoB基因核心區(qū)的情況下，rpoB探針會形成發(fā)夾環(huán)，因此熒光基團中的熒光就會被淬滅。
在其他的具體實施方式
中，這里所展示的試劑盒包括一個組合物，所述組合物含有一組探針，其中至少三個探針是未突變rpoB基因核心區(qū)特異性的rpoB探針，其中第一 rpoB探針用熒光基團標記，第二探針用熒光供體基團標記，第三探針用熒光受體基團標記； 其中第二和第三rpoB探針與未突變的rpoB基因核心區(qū)進行雜交以使得熒光受體基團能夠接受來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移。
在另外的具體實施方式
中，這里所展示的試劑盒包括一個組合物，所述組合物含有一組探針，其中至少三個探針是未突變rpoB基因核心區(qū)特異性的rpoB探針，其中(i) 第一 rpoB探針包含熒光基團和淬滅基團，其中，當不存在第一 rpoB探針特異性雜交的未突變rpoB基因核心區(qū)時，rpoB探針會形成發(fā)夾環(huán)，則熒光基團的熒光就被淬滅，(ii)第二 rpoB探針用熒光供體基團標記，以及(iii)第三探針用熒光受體基團標記；其中第二和第三rpoB探針能與未突變的rpoB基因核心區(qū)進行雜交以使得熒光受體基團能夠接受來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移。
在另外的具體實施方式
中，這里所展示的試劑盒包括一個組合物，所述組合物含有一組探針，其中至少三個探針是未突變rpoB基因核心區(qū)特異性的rpoB探針，其中rpoB 探針包括不同的熒光基團和淬滅基團，其中，在不存在rpoB探針特異性雜交的未突變的rpoB基因核心區(qū)的情況下，rpoB探針會形成發(fā)夾環(huán)，因此熒光基團中的熒光就會被淬滅。
在另外的具體實施方式
中，這里所展示的試劑盒包括一個組合物，所述組合物含有一組探針，其中至少兩個探針是未突變rpoB基因核心區(qū)特異性的rpoB探針,其中rpoB 探針包括不同的熒光基團和淬滅基團，其中，在不存在rpoB探針特異性雜交的未突變的 rpoB基因核心區(qū)的情況下，rpoB探針會形成發(fā)夾環(huán)，因此熒光基團中的熒光就會被淬滅。
在其他的具體實施方式
中，這里所展示的試劑盒包括一個組合物，所述組合物含有一組探針，其中至少兩個探針是未突變rpoB基因核心區(qū)特異性的rpoB探針，其中第一 rpoB探針用熒光供體基團標記，第二探針用熒光受體基團標記；其中當rpoB探針與未突變的rpoB基因核心區(qū)進行雜交以使得熒光受體基團能夠接受來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移。
在另外的具體實施方式
中，這里所展示的試劑盒包括一個組合物，所述組合物含有一組探針，其中至少一個探針是未突變rpoB基因核心區(qū)特異性的rpoB探針,其中rpoB 探針包括熒光基團和淬滅基團，其中，在不存在rpoB探針特異性雜交的未突變的rpoB基因核心區(qū)的情況下，rpoB探針會形成發(fā)夾環(huán)，因此熒光基團中的熒光就會被淬滅。
在另外的具體實施方式
中，這里所展示的試劑盒包括一個組合物，所述組合物含有一組探針，其中第一探針是未突變rpoB基因核心區(qū)特異性的rpoB探針，第二探針與核心區(qū)外的rpoB基因區(qū)域互補，其中第一探針用熒光供體基團標記，第二探針用熒光受體基團標記，其中第一和第二探針都雜交到rpoB基因上以便熒光受體基團能夠接受來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移。
在另外的具體實施方式
中，這里所展示的試劑盒包括一個組合物，所述組合物含有一組探針，其中第一探針與核心區(qū)外的rpoB基因區(qū)域互補，第二探針和第三探針是未突變rpoB基因核心區(qū)特異性探針，其中第一探針用熒光供體基團標記，第二探針用熒光受體基團標記，第三探針用熒光基團標記，其中第一和第二探針都雜交到rpoB基因上以便熒光受體基團能夠接受來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移。
在另外的具體實施方式
中，這里所展示的試劑盒包括一個組合物，所述組合物含有一組探針，其中第一探針與核心區(qū)外的rpoB基因區(qū)域互補，第二、第三和第四探針是未突變rpoB基因核心區(qū)特異性探針，其中第一和第三探針用熒光供體基團標記，第二和第四探針用不同的熒光受體基團標記，其中rpoB探針雜交到rpoB基因上以便熒光受體基團能夠接受來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移。
在另外的具體實施方式
中，這里所展示的試劑盒包括一個組合物，所述組合物含有一組探針，其中第一探針與核心區(qū)外的rpoB基因區(qū)域互補，第二、第三、第四和第五探針是未突變rpoB基因核心區(qū)特異性探針，其中第一和第三探針用熒光供體基團標記，第二和第四探針用不同的熒光受體基團標記，第五探針用熒光基團標記，其中rpoB探針雜交到 rpoB基因上以便熒光受體基團能夠接受來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移。
在一些具體實施方式
中，這里所提供的試劑盒還包括分枝桿菌檢測探針。
在特定的具體實施方式
中，這里所提供的試劑盒包括一種或多種用于裂解核酸樣品、擴增核酸樣品(例如，PCR引物)、分離核酸樣品、純化核酸樣品和/或濃縮核酸樣品的試劑。
在一個特定的具體實施方式
中，這里所提供的試劑盒包括一組或多組用于擴增分枝桿菌rpoB基因或其區(qū)域(例如，分枝桿菌rpoB基因核心區(qū))的引物。在其他的具體實施方式
中，這里所提供的試劑盒包含一組或多組的用于擴增分枝桿菌除rpoB基因外其他基因或其區(qū)域的引物，例如，一組或多組的引物用于擴增分枝桿菌的inhA基因、katG基因、 ahpC基因、mabA基因、oxyR基因、pncA基因、rrs基因、rpsL基因、embA基因、embB基因、 embC基因、gyrA基因、gyrB基因或者nor基因或其區(qū)域。在另外的具體實施方式
中，這里所提供的試劑盒包括一種或多種緩沖液，例如，用于在雜交中洗滌的緩沖液。
在其他的具體實施方式
中，這里所提供的試劑盒包括一個或多個封閉探針，其中一個或多個封閉探針Q)與雜交到未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)的rpoB探針至少部分互補，因此在不存在含有rpoB探針雜交的核酸的核酸樣品時，封閉探針與rpoB探針進行雜交；或(ii)與分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)的核酸序列至少部分互補，而如果存在未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)時，rpoB探針與核心區(qū)雜交而不與封閉探針雜交。在一些具體實施方式
中，封閉探針包含一個自互補區(qū)域，因此，在不存在含有與封閉探針雜交的核酸的核酸樣品時，封閉探針形成發(fā)夾環(huán)。在一些具體實施方式
中，封閉探針用淬滅基團標記，該淬滅基團能夠淬滅封閉探針結(jié)合的rpoB探針上的熒光基團(例如，熒光供體基團)。
這里所展示的試劑盒可以包括如何利用試劑盒檢測未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)的使用說明。在一個特定的具體實施方式
中，使用說明中推薦將陽性和陰性對照與測試樣品平行檢測。在一些具體實施方式
中，這里所展示的試劑盒包含樣品，所述樣品已知并不與試劑盒中所提供的一個或多個探針雜交(即，陰性對照)。在其他具體實施方式
中，這里所展示的試劑盒還包括已知能與試劑盒中所提供的一個或多個探針雜交的樣品(即，陽性對照)。在其他的具體實施方式
中，這里所提供的試劑盒中包括已知能與試劑盒中所提供的一個或多個探針雜交的樣品(即，陽性對照)以及一個已知并不與試劑盒中所提供的一個或多個探針雜交的樣品(即，陰性對照)。
MM
這里展示系統(tǒng)，例如，自動化系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括這里所展示的試劑盒或試劑盒中的組分以及能與計算機系統(tǒng)聯(lián)合使用的計算機程序產(chǎn)品。在此類系統(tǒng)中，計算機程序產(chǎn)品可以包括計算機可讀儲藏介質(zhì)和嵌入其中的計算機程序機制。計算機程序機制可以包括指令，以評估是否存在未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)以及是否存在分枝桿菌，和/或是否在除rpoB基因之外的分枝桿菌其他基因中存在突變。
這里所展示的一些系統(tǒng)包括這里所展示的試劑盒或試劑盒中的組分、具有中央處理單元和與中央處理單元匹配的內(nèi)存的計算機。這里所展示的一些系統(tǒng)包括這里所展示的試劑盒或試劑盒中的組分、一個計算機可讀介質(zhì)、具有中央處理單元和與中央處理單元匹配的內(nèi)存的計算機。內(nèi)存儲藏有指令，該指令用于評估是否存在未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)以及是否存在分枝桿菌，和/或是否在除rpoB基因之外的分枝桿菌其他基因中存在突變。在一些具體實施方式
中，內(nèi)存包括能將這里所展示的方法得到的結(jié)果傳遞至遠程計算機的指令，以及遠程計算機包括能評估是否存在未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)以及是否存在分枝桿菌，和/或是否在除rpoB基因之外的分枝桿菌其他基因中存在一個突變的指令。
在一些具體實施方式
中，這里所展示的是一個計算機系統(tǒng)，該計算機系統(tǒng)包括一個計算機可讀介質(zhì)，所述可讀介質(zhì)包括評估是否存在未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)以及是否存在分枝桿菌，和/或是否在除rpoB基因之外的分枝桿菌其他基因中存在突變的結(jié)果。在一些具體實施方式
中，這里所展示的計算機系統(tǒng)包括
中央處理單元；
主要非易失性儲存單元，例如，硬盤，用于儲藏軟件和數(shù)據(jù)，由存儲控制器所控制的存儲單元；
系統(tǒng)內(nèi)存，例如高速隨機讀寫內(nèi)存(RAM)，用于存儲系統(tǒng)控制程序，數(shù)據(jù)和應(yīng)用程序，包括由非易失性儲存單元裝載的程序和數(shù)據(jù)，還可以包括只讀內(nèi)存(ROM)；
使用者界面，包括一個或多個輸入裝置(例如，鍵盤)以及顯示或其它輸出設(shè)備；
網(wǎng)絡(luò)接口卡，用于連接任何有線或無線交流網(wǎng)絡(luò)(例如，廣域網(wǎng)，如因特網(wǎng));
內(nèi)部總線，用于連接前面所述的系統(tǒng)中的元件；以及
電源，用于為前面所述的元件提供電源。
計算機的操作主要通過操作系統(tǒng)來控制，所述系統(tǒng)由中央處理單元執(zhí)行。操作系統(tǒng)可以存儲在系統(tǒng)儲存中。除了操作系統(tǒng)，執(zhí)行系統(tǒng)可以包括文件系統(tǒng)，用于控制這里所展示的不同文件和數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的讀取；訓練數(shù)據(jù)，用于根據(jù)這里所展示的方法建立一個或多個決定規(guī)則；數(shù)據(jù)分析算法模塊，用于處理訓練數(shù)據(jù)，構(gòu)建決策規(guī)則；一個或多個決策規(guī)則；數(shù)據(jù)評測模塊，用于評估是否存在未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)以及是否存在分枝桿菌，和/或是否在除rpoB基因之外的分枝桿菌其他基因中存在突變。
該計算機可以包括軟件程序模塊和數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)。每一個數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)可以包括任何形式的數(shù)據(jù)存儲系統(tǒng)，包括，但不限于，flat ASCII或二進制文件，Excel電子數(shù)據(jù)表格，相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(例如SQL)，或在線分析進程(OLAP)數(shù)據(jù)庫(例如MDX和/或其變體)。在一些具體實施方式
中，此類的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)每一個都是以一個或多個包括等級結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫的形式 (例如，星型架構(gòu))。在一些具體實施方式
中，此類的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)每一個都是以不包括明確的等級(例如，沒有等級安排的維度表)的數(shù)據(jù)庫形式。
在一些具體實施方式
中，每一個存儲或能夠訪問計算機系統(tǒng)的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)是單一的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)。在其他的具體實施方式
中，此類數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)實際上包括一群數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)(例如，數(shù)據(jù)庫，文件，檔案)，所述數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)可以或者不可以全部由同一臺計算機控制。舉個例子，在一些具體實施方式
中，一套訓練數(shù)據(jù)可以包括一群Excel電子數(shù)據(jù)表，所述電子數(shù)據(jù)表可以存儲在計算機中和/或在那些能通過廣域網(wǎng)被其他計算機定位找到的計算機中。在另一個的例子中，一套訓練數(shù)據(jù)可以包括一群Excel電子數(shù)據(jù)表，所述電子數(shù)據(jù)表可以存儲在計算機中和/或可以分布于一個或多個計算機，所述計算機可以通過廣域網(wǎng)被其他計算機定位找到。
上面所提到的一些模塊和數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)可以定位于一個或多個遠程控制計算機中。舉個例子，在一些具體實施方式
中，可使用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)類型的執(zhí)行方式。在此類具體實施方式
中，評估模塊可以位于一臺客戶端計算機中，該計算機能夠通過網(wǎng)絡(luò)與其他計算機進行交流。在一些具體實施方式
中，數(shù)據(jù)評估模塊可以是一個交換網(wǎng)頁。
在一些具體實施方式
中，一套訓練數(shù)據(jù)和/或決策規(guī)則是位于同一臺計算機中的，在其他的具體實施方式
中，一個或多個此類數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)和模塊可以被一臺或多臺遠程計算機控制。數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)和軟件模塊在一臺或多臺計算機中的任何安排都落在這里所展示的系統(tǒng)的范圍之內(nèi)，只要這些數(shù)據(jù)和軟件模塊對于其他計算機是通過網(wǎng)絡(luò)或其他電子手段可以通過尋址而獲得的。
在一些具體實施方式
中，裝載在一個載體波上的數(shù)字信號包括關(guān)于這里所展示的方法的數(shù)據(jù)。在一些具體實施方式
中，裝載在一個載體波上的數(shù)字信號包括對于是否存在未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)以及是否存在分枝桿菌，和/或是否在除rpoB基因之外的分枝桿菌其他基因中存在一個突變的確定。在一些具體實施方式
中，提供了一個圖形用戶界面用于確定是否存在未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)以及是否存在分枝桿菌，和/或是否在除rpoB基因之外的分枝桿菌其他基因中存在突變。該圖形用戶界面可以包括顯示域，用于顯示裝載在一個載體波上的數(shù)字信號，而該載體波是從遠程計算機接收的。
等同方式
本領(lǐng)域技術(shù)人員只需使用常規(guī)的實驗可以意識到，或者能夠確定許多對于這里所描述的發(fā)明的特定具體實施方式
的等同方式。此類的等同方式打算包括在下述的權(quán)利要求之中。
在說明書中提到的所有的公開文獻，專利和專利申請在這里通過參考文獻以相同的程度而引入本申請說明書中，如同每篇獨立的公開文獻、專利和專利申請都被特定地、單獨地作為參考文獻而被引入。
這里所引用或討論的參考文獻并不應(yīng)當被解釋為承認這些文獻是作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
權(quán)利要求
1.一種鑒定未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)存在的方法，包括(a)將核酸樣品與含有一組探針的組合物接觸，其中有至少四個探針是在允許rpoB探針與核心區(qū)雜交的條件下，特異性結(jié)合未突變rpoB基因核心區(qū)的rpoB探針，其中第一和第三rpoB探針用熒光供體基團標記，第二和第四rpoB探針用不同的熒光受體基團標記，其中 rpoB探針與未突變rpoB基因核心區(qū)雜交以使得熒光受體基團能夠接受來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移；以及(b)分析當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的熒光發(fā)射是否存在， 其中，如果存在當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的熒光發(fā)射，表明存在未突變的rpoB基因核心區(qū)；而如果當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的熒光發(fā)射不存在或減少，表明不存在未突變的rpoB基因核心區(qū)。
2.一種鑒定分枝桿菌存在以及未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)存在的方法，包括(a)將核酸樣品與含有(i)分枝桿菌檢測探針，和(ii)一組探針的組合物接觸，其中有至少四個探針是在允許rpoB探針與核心區(qū)雜交以及檢測探針與互補分枝桿菌核酸序列雜交的條件下，特異性結(jié)合未突變rpoB基因核心區(qū)的rpoB探針,其中第一和第三rpoB探針用熒光供體基團標記，第二和第四rpoB探針用不同的熒光受體基團標記；其中rpoB探針與未突變rpoB基因核心區(qū)雜交以使得熒光受體基團能夠接受來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移；以及(b)分析雜交的檢測探針和當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的熒光發(fā)射是否存在，其中，(i)存在雜交的檢測探針和存在當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的熒光發(fā)射，意味著存在分枝桿菌和存在未突變的rpoB基因核心區(qū)； ( )雜交的檢測探針不存在，以及當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的熒光發(fā)射不存在或減少，意味著不存在分枝桿菌；(iii)雜交的檢測探針存在，以及當兩個供體基團將能量轉(zhuǎn)移到兩個受體基團時所導致的熒光發(fā)射不存在或減少，意味著存在分枝桿菌，但不存在未突變的rpoB基因核心區(qū)。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中分枝桿菌是結(jié)核分枝桿菌，非洲分枝桿菌，牛型分枝桿菌，牛型分枝桿菌卡介苗或田鼠分枝桿菌。
4.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中未突變rpoB基因核心區(qū)的存在表明分枝桿菌對利福平是敏感性的，而如果未突變rpoB基因核心區(qū)不存在表明分枝桿菌對利福平是耐藥性的。
5.如權(quán)利要求I或2所述的方法,其中該組探針進一步包括至少與rpoB探針部分互補的封閉探針，以使得在不存在含有與rpoB探針雜交的核酸的核酸樣品時，封閉探針與rpoB 探針雜交。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中封閉探針含有淬滅基團,其中該淬滅基團淬滅rpoB 探針上熒光供體基團或熒光受體基團上發(fā)射出來的熒光。
7.如權(quán)利要求I或2所述的方法,其中該組探針進一步包括封閉探針,所述封閉探針與未突變rpoB基因核心區(qū)的核酸序列至少部分互補，其中當rpoB探針不存在時，封閉探針與未突變rpoB基因核心區(qū)雜交，而當未突變rpoB基因核心區(qū)存在的時候，該未突變rpoB基因核心區(qū)與rpoB探針而不與封閉探針進行雜交。
8.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中至少一個rpoB探針包含自互補區(qū)域，當含有雜交到rpoB探針的核酸的核酸樣品不存在的情況下，rpoB探針形成發(fā)夾環(huán)。
9.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中核心區(qū)包括81個核苷酸。
10.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中核酸樣品是從受試者中分離或獲得的。
11.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中核酸樣品是從受試者的生物體液或組織中分離或獲得的。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中受試者是人類。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中生物體液或組織是支氣管肺泡灌洗液、支氣管灌洗液、咽喉分泌物、氣管吸出物、血液樣品、血清樣品、血漿樣品、骨骼樣品、皮膚樣品、軟組織樣品、腸道標本、糞便樣品、生殖道樣品、母乳、淋巴樣品、腦髓液、肋膜液、痰樣品、尿樣品、鼻腔分泌物、眼淚、膽汁樣品、腹水樣品、膿水、滑膜液、玻璃體液、陰道分泌物、精液或尿道樣品。
14.如權(quán)利要求I或2的方法，其中核酸樣品包括擴增的核酸。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中擴增的核酸通過使用PCR、SDA、TMA,NASBA、滾環(huán)擴增、螺旋置換擴增或LAMP而產(chǎn)生。
16.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中步驟(a)包括在核酸樣品中擴增核酸。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的擴增使用PCR、SDA、TMA、NASBA、滾環(huán)擴增、 螺旋置換擴增或LAMP進行。
18.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中核酸樣品進一步包括裂解劑。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中裂解劑是裂解酶、加熱、超聲、壓力或離液劑。
20.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中所述的熒光受體基團或熒光供體基團選自于下述FITC、ROX、GFP、Cy5、Cy5. 5、Cy3、Cy3B、GFP、YFP、RFP、CFP、若丹明紅、德克薩斯紅、氟硼突、IDR700、LightCycler610> LightCycler640> LightCycler670> LightCycler705> 以及 TAMRA0
21.如權(quán)利要求I或2所述的方法，進一步包括檢測分支桿菌rpoB基因的非核心區(qū)中是否有突變。
22.如權(quán)利要求I或2所述的方法，進一步包括檢測分支桿菌的inhA基因、katG基因、 ahpC基因、mabA基因、oxyR基因、pncA基因、rrs基因、rpsL基因、embA基因、embB基因、 embC基因、gyrA基因、gyrB基因或nor基因中的突變。
23.如權(quán)利要求4所述的方法，其中對利福平的耐藥性意味著分支桿菌是多重耐藥性分支桿菌。
24.一種試劑盒，包括含一組探針的組合物，其中至少四種探針是特異性結(jié)合分支桿菌未突變rpoB基因核心區(qū)的rpoB探針，其中第一和第三rpoB探針用熒光供體基團標記，第二和第四rpoB探針用兩種不同的熒光受體基團標記，其中rpoB探針與未突變的rpoB基因核心區(qū)雜交以使得熒光受體基團能夠接受來自于熒光供體基團的能量轉(zhuǎn)移。
25.如權(quán)利要求24所述的試劑盒，其中分枝桿菌是結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌、牛型分枝桿菌、牛型分枝桿菌卡介苗或田鼠分枝桿菌。
26.如權(quán)利要求24所述的試劑盒，其中至少一個rpoB探針包括自互補區(qū)域，在不存在包含與rpoB探針雜交的核酸的核酸樣品時，rpoB探針形成發(fā)夾環(huán)。
27.如權(quán)利要求26所述的試劑盒,其中至少一個rpoB探針包括淬滅基團。
28.如權(quán)利要求24所述的試劑盒，其中該組探針進一步包括一個或多個封閉探針。
29.如權(quán)利要求28所述的試劑盒，其中一個或多個封閉探針(i)至少部分與rpoB探針互補，以使得不存在包含與rpoB探針雜交的核酸的核酸樣品時，封閉探針與rpoB探針進行雜交；和/或(ii)至少與所述核心區(qū)的核酸序列部分互補，其中當不存在rpoB探針時，封閉探針與未突變rpoB基因核心區(qū)雜交，而當存在分枝桿菌未突變rpoB基因核心區(qū)時，未突變rpoB基因核心區(qū)與rpoB探針雜交而不與封閉探針雜交。
30.如權(quán)利要求29所述的試劑盒，其中與rpoB探針至少部分互補的封閉探針包含淬滅基團，其中淬滅基團淬滅由rpoB探針上的熒光供體基團和/或熒光受體基團所發(fā)射的熒光。
31.一種自動化系統(tǒng)，其包含如權(quán)利要求24至30中任一項所述的試劑盒，以及與計算機系統(tǒng)聯(lián)合使用的計算機程序產(chǎn)品。
32.如權(quán)利要求31所述的系統(tǒng)，進一步包括計算機可讀存儲介質(zhì)以及嵌入其中的計算機程序機制，其中計算機程序機制包括評估是否存在未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)的指令。
33.一種自動化系統(tǒng)，其包含如權(quán)利要求24至30中任一項所述的試劑盒、以及含有中央處理單元和與中央處理單元匹配的內(nèi)存的計算機。
34.一種自動化系統(tǒng)，其包含如權(quán)利要求24至30中任一項所述的試劑盒、計算機可讀介質(zhì)、以及含有中央處理單元和與中央處理單元匹配的內(nèi)存的計算機。
35.如權(quán)利要求34所述的系統(tǒng)，其中內(nèi)存中存儲有用于評估是否存在未突變分枝桿菌 rpoB基因核心區(qū)的指令。
36.如權(quán)利要求35所述的系統(tǒng)，其中內(nèi)存包括將這里所展示的方法的結(jié)果傳遞到遠程計算機上的一個指令，遠程計算機包括評估是否存在未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)的指令。
全文摘要
這里所展示的是確定未突變分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)存在的方法。例如，這里所公開的方法通過確定分枝桿菌rpoB基因核心區(qū)是否包含突變，從而允許確定分枝桿菌是否是利福平抗性的。根據(jù)此類的方法，可以鑒定多重耐藥性的分枝桿菌菌株。
文檔編號C12Q1/68GK102947465SQ201080064378
公開日2013年2月27日 申請日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月21日
發(fā)明者托賓·J·赫利爾, 詹姆斯·G·納多 申請人:貝克頓·迪金森公司