專利名稱：排除錯誤信號的靶核酸序列的實時多路檢測的制作方法
排除錯誤信號的靶核酸序列的實時多路檢測
技術領域：
本發(fā)明涉及一種排除錯誤信號(false signals)的靶核酸序列的檢測。
背景技術：
用于檢測靶核酸的大部分技術包括靶核酸的擴增過程。核酸擴增是在分子生物學領域中所利用的必須的過程，并對此提出了多種擴增方法。例如，密勒(Miller)、H. I.等(W089/06700)公開了包括將助催化劑/引物序列與靶單鏈DNA (〃ssDNA〃)雜交之后，轉錄上述序列的許多RNA復制過程的核酸序列擴增方法。公知為聚合酶連鎖反應(以下簡稱為“PCR”)的最為廣泛利用的核酸擴增方法包括雙鏈DNA的變性、向DNA模板進行寡核苷酸引物的退火以及DNA聚合酶引起的引物延長的反復的循環(huán)過程(Mullis等，美國專利第4,683,195號，第4，683，202號以及第4,800,159 號；Saiki 等，(1985) Science 230，1350-1354)。基于聚合酶鏈式反應(PCR)的技術不僅利用在靶DNA序列的擴增，還廣泛地利用在生物學和醫(yī)學研究領域中的科學應用或方法中，例如，反轉錄酶-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、分別表示(Differential Display)-聚合酶鏈式反應(DD-PCR)、公知或未知的利用基因的PCR的克隆、CD NA末端的高速擴增(RACE)、任意的引發(fā)-聚合酶鏈式反應(AP-PCR)、多重PCR、單核苷酸多態(tài)性(SNP)基因組分型以及基于PCR的基因組分析等(McPherson and MolIer,2000) PCR. BIOS Scientific Publishers,Springer-Verlag NewYork Berlin Heidelberg, NY)。另一方面，作為基于核酸擴增檢測靶核酸的方法，正在開發(fā)出多種實時PCR方法。實時PCR方法能夠實時檢測靶的擴增產物，或者可實現(xiàn)更加正確的定量分析，在不存在污染問題的層面上備受矚目。實時PCR方法，通常在擴增反應期間，使用可產生用于表示靶核酸序列存在的信號的、標記的寡核苷酸或DNA-結合染料(dye)。作為代表性DNA-結合染料的熒光染料(SYBR Green)插入到雙鏈DNA之間呈現(xiàn)熒光。但是，由于SYBR Green以非特異性插入到DNA鏈之間的可能性高，因而不適合做特異性靶檢測。更嚴重的問題在于，當將SYBR Green技術應用于實時多重檢測時，需要通過解鏈曲線分析(melting curve analysis)來鑒定擴增產物，因此被視為在時間及效率分析層面上不適合應用。大部分的實時PCR方法使用標記寡核苷酸。以往的實時PCR方法在如下方面具有固有的特征(i)標記寡核苷酸(引物或探針)的使用，( )標記寡核苷酸的特定形態(tài)或結構的形成(例如，發(fā)夾環(huán)結構)(iii)與寡核苷酸結合的標記的數量，(iv)信號的產生原理，或者(V)所利用的核酸聚合酶的性質。作為代表性的例子包括拖慢探針(TaqManTM probe)方法(美國專利第 5，210，015 號)、分子信標(Molecular Beacon)方法(Tyagi 等，Nature Biotechnology v. 14MARCH 1996)、蝎形引物(Scorpion)方法(Whitcombe 等，Nature Biotechnology 17:804-807 (1999))、發(fā)卡式引物(Sunrise 或Amplifluor)方法(Nazarenko 等，2516-2521 Nucleic Acids Research, 25( 12): 2516-2521(1997)，及美國專利第6，117,635號)、力士(Lux)方法(美國專利第7，537，886號)、CPT (Duck P,等，Biotechniques, 9:142-148 (1990))、LNA 方法(美國專利第 6，977，295號)及叩診植(Plexor)方法(Sherrill CB,等，Journal of the American ChemicalSociety,126:4550-4556 (2004))。隨著實時PCR方法的開發(fā)，公開一種能夠同時檢測多個靶核酸序列的實時多重PCR方法。實時多重PCR方法在如下的觀點具有合理的優(yōu)點時間-有效性、比體積-有效性、方便性及高速-大量的動作性(R. N. Gunson,等，Journal of ClinicalVirology, 43:372-375 (2008))。盡管如此，以往的實時多重PCR方法的引物或探針產生非特異性雜交的可能性高(R. N. Gunson,等，Journal of Clinical Virology, 43:372-375 (2008))。就基于標記引物的實時多重PCR而言，由于標記引物形成二聚物(dimer)，導致產生假陽性信號，因而被視為主要問題。與實時多重PCR過程的動作相關而產生的假陽性信號實質性地被去除或者完全 被去除的情況下，實時多重PCR方法將會成為同時檢測多個靶核酸序列的最有發(fā)展前景的技術。在本說明書全文中，參照多篇專利及文獻，并用括號來標記其引用。這些專利及文獻作為參照整體包括在本說明書中，有助于更加明確地說明本發(fā)明所屬技術領域的水準及本發(fā)明的內容。發(fā)明概述本發(fā)明者為了開發(fā)出用于實時檢測基于以往標記的實時多重PCR (polymerasechain reaction)方法期間，徹底排除因形成標記引物的二聚物而產生的假陽性信號，由此能夠對多個靶核酸序列進行實時多重檢測的新穎的接近法而銳意研究努力。其結果，本發(fā)明者公開了通過實施對至少三種的核酸序列進行第一次多重-擴增來獲取擴增子，并借助利用標記套式引物的套式實時多重PCR來擴增上述擴增子的方式，檢測至少三種靶核酸序列的方法。本發(fā)明者確認了，上述新穎的方法徹底排除因形成標記引物的二聚物而產生的假陽性信號，并且通過更加改善的靈敏度及特異度，以實時多重方式檢測多個靶核酸序列。因此，本發(fā)明的目的在于，提供一種對于在實時多重PCR中排除錯誤信號(falsesignal s )的至少三種的靶核酸序列的實時多重檢測方法。本發(fā)明的再一目的在于，提供一種用于在實時多重PCR中排除錯誤信號(falsesignals)的至少三種祀核酸序列的實時多重PCR檢測的試劑盒。本發(fā)明的其他目的及優(yōu)點，通過所附的權利要求及附圖，以及下面的詳細說明將變得更加明確。
圖I表示關于第一次多重PCR及第二次套式實時多重PCR的本發(fā)明。圖案A表示第一次多重PCR。正向引物及反向引物與靶核酸序列雜交而延長。通過反復進行包括變性、退火及延長的PCR循環(huán)，來擴增多個靶核酸序列。第一次多重PCR用引物均可具有本技術領域中公知的任何類型或結構(例如，DPO (dual priming olgionucleotide)結構及以往結構)。圖案B表示利用標記套式引物的第二次套式實時多重PCR。具有至少一個標記的正向弓I物及反向引物中，至少一個弓I物是與通過第一次多重PCR獲得的相關擴增子的內部序列雜交的套式引物。作為在第二次套式實時多重PCR中可利用的代表性引物，包含具有單一標記或者雙重標記系統(tǒng)的TSG引物、THD引物、蝎形引物、發(fā)卡式引物、勒克司、叩診槌以及反引物。利用標記套式引物的第二次套式實時多重PCR，在產生靶信號但不產生假陽性信號的條件下實施反應循環(huán)，以排除因形成標記引物的二聚物而產生的假陽性信號，由此可提供表示靶核酸序列存在的充足的信號。并且，本發(fā)明的方法提高PCR靶特異性及靈敏度。圖2 表不利用用于檢測 C. trachomatis、N. gonorrhoeae 及 T. vaginalis 的三種一對引物來實施的以往實時多重PCR方法的結果。以往方法因形成標記引物的二聚物而產生假陽性信號。圖3 表不利用用于檢測 C. trachomatis、N. gonorrhoeae 及 T. vaginalis 的三種一對引物來實施的本發(fā)明的套式實時多重PCR方法的結果。該結果顯示，第二次套式實時多重PCR實施30循環(huán)，來獲得排除假陽性信號的、用于表示靶核酸存在的陽性信號。圖 4 表不利用用于檢測 H. ducreyi、Herpes simplex virus I 及 Herpes simplex virus 2的三種一對引物來實施以往實時多重PCR方法的結果。以往方法因形成標記引物的二聚物而產生假陽性信號。圖 5 表不利用用于檢測 H. ducreyi、Herpes simplex virus I 及 Herpes simplexvirus 2的三種一對引物來實施的套式實時多重PCR方法的結果。該結果顯示，第二次套式實時多重PCR實施30循環(huán)，來獲得排除假陽性信號的、用于表示靶核酸存在的陽性信號。圖6是表示本發(fā)明的套式實時多重PCR方法的靈敏度及特異性的結果。以30循環(huán)實施的第二次套式實時多重PCR利用用于檢測H. ducreyi、Herpes simplex virus I及Herpes simplex virus 2的三種一對引物來實施。將依次稀釋到10-倍的H. ducreyi的基因組DNA (從IOOOfg稀釋到Ifg)用作模板。圖7是表示本發(fā)明的套式實時多重PCR方法的靈敏度及特異性的結果。以30循環(huán)實施的第二次套式實時多重PCR利用用于檢測H. ducreyi、Herpes simplex virus I及Herpes simplex virus 2的三種一對引物來實施。將依次稀釋到10-倍的Herpes simplexvirus I的基因組DNA (從IOOOfg稀釋到Ifg)用作模板。圖 8表不為了檢測H. ducreyi、Herpes simplex virus I 及Herpes simplex virus
2而實施的本發(fā)明的套式實時多重PCR方法的結果。將H. ducreyi、Herpes simplex virusI及Herpes simplex virus 2的基因組DNA用作模板。發(fā)明詳述根據本發(fā)明的一實施方式，本發(fā)明提供一種在實時多重PCR (real-timemultiplex Polymerase Chain Reaction)排除錯誤信號的試樣內至少三種的祀核酸序列的實時多路檢測方法，其特征在于，包括如下步驟步驟(a)，在反應容器實施用于擴增上述靶核酸序列的第一次多重PCR，為了在上述試樣中獲取上述靶核酸序列的擴增子，在能夠擴增至少三種的靶核酸序列的條件下，利用至少三種的一對引物及模板-依賴性核酸聚合酶來實施上述第一次多重PCR ；步驟(b)，在與上述步驟(a)中所使用的反應容器不同的反應容器準備第二次套式實時多重PCR反應混合物，上述第二次套式實時多重PCR反應混合物包含(i )在上述步驟(a)中獲取的擴增子，(ii)用于上述擴增子的第二次套式實時多重PCR的至少三種的一對引物，在上述至少三種的各個一對引物中，至少一個引物是與相關擴增子的內部序列雜交的套式引物，以及(iii)模板-依賴性核酸聚合酶，上述至少三種的各個一對引物包含至少一個套式引物，上述至少一個套式引物具有在上述第二次套式實時多重PCR期間產生用于表示靶核酸序列的存在的信號的標記；步驟(C)，利用上述步驟(b)的上述反應混合物，并通過至少2循環(huán)來實施引物退火、引物延長及變性，由此實施上述第二次套式實時多重PCR，用于表示上述靶核酸序列存在的上述信號在循環(huán)期間從上述各個標記引物中產生，上述第二次套式實時多重PCR能夠以產生用于表示靶核酸序列的信號，而不產生錯誤信號的循環(huán)數來實施；以及步驟(d)，檢測用于表示靶核酸序列的存在的信號，上述檢測在步驟(C)的上述反復的各循環(huán)中，在步驟(C)的上述反復的終點或者步驟(C)的上述反復期間的各個預定時間間隔內實施，據此表示上述靶核酸序列的上述信號通過實時方式得到獲取，且不產生錯誤信號。 一般而言，當實施為了同時檢測多個靶序列而利用標記探針或引物的以往實時PCR技術時，會引發(fā)嚴重的問題。例如，利用標記探針(labeled probe)的方法，為了實現(xiàn)擴增及檢測，分別需要引物及探針等多個寡核苷酸。因此，十分難以決定作為引物及探針的寡核苷酸的合適的序列，并且，也難以實現(xiàn)實時多重PCR的反應條件的最優(yōu)化。況且，這種方法因形成寡核苷酸的二聚物或者因非特異性雜交而產生假陽性信號的可能性較高。因此，基于探針的實時PCR方法被視為不適合同時檢測多個靶序列。并且,利用標記引物(labeled primer)的以往的實時PCR接近法在祀序列的實時檢測中，出現(xiàn)與引發(fā)假陽性信號產生的標記引物的二聚物形成相關的不可避免的缺點。尤其是，這種問題在用于同時檢測多個靶序列的實時多重PCR中變得更加嚴重。由于實時多重PCR需要多個標記引物，因而因形成這種標記引物的二聚物而產生假陽性信號的可能性較聞。進而，當靶核酸序列以非常少的量存在或者不存在時，非常難以決定從基于標記引物的實時多重PCR中獲得的信號是否為因存在靶核酸序列而產生的假陽性信號或者因形成標記引物的二聚物而產生的錯誤信號。另一方面，標記引物的序列選擇通常作為用于避免二聚物形成問題的戰(zhàn)略而被利用。然而，這種戰(zhàn)略在徹底排除二聚物問題的方面上依然具有局限性。本發(fā)明者為了開發(fā)出在實施基于以往標記引物的實時多重PCR (polymerasechain reaction)方法期間，徹底排除因形成標記引物的二聚物而產生的假陽性信號，能夠對多個靶核酸序列進行實時多重檢測的新穎的接近法而銳意努力研究。其結果，本發(fā)明者公開了通過實施對至少三種的核酸序列進行第一次多重-擴增來獲取擴增子，并借助利用標記套式引物(labeled nested primer)的套式實時多重PCR來擴增上述擴增子的方式，檢測至少三種靶核酸序列的方法。本發(fā)明者確認了，新穎的方法徹底排除因形成標記引物的二聚物而產生的假陽性信號，以實時多重方式檢測多個靶核酸序列。本發(fā)明者首次公開了，可通過排除或區(qū)分因形成標記引物的二聚物而產生的假陽性信號的套式實時方式，利用至少三種標記套式引物來同時檢測至少三種靶核酸序列。排除(或者去除)因形成標記引物的二聚物而產生的假陽性信號是基于以下三種戰(zhàn)略的絕妙的組合。第一戰(zhàn)略是多個靶核酸序列的預-擴增，這應當與實時產生信號的過程分開實施。第二戰(zhàn)略利用與通過預-擴增來產生的相關擴增子的內部序列雜交的標記套式引物。第三戰(zhàn)略限制實時多重PCR反應的循環(huán)數，直至產生靶信號但不產生基于二聚物形成的假陽性信號。在本發(fā)明中，靶核酸序列首先通過第一次多重PCR來進行預-擴增，隨后，擴增子在第二次套式實時多重PCR中用作模板。由于預-擴增增加靶核酸序列的量，相對于第二次套式實時多重PCR期間的祀核酸序列的信號的循環(huán)閾值(thresho Id eye I e, Ct)比無預-擴增的條件下獲取的Ct值更低。相反，因形成標記引物的二聚物而產生的假陽性信號的Ct值與預-擴增的利用無關地不發(fā)生變化。因此，這種現(xiàn)象致使用于表示靶核酸序列的存在的信號在產生假陽性信號之前產生，結果，用于區(qū)分陽性靶信號和假陽性信號。當第一次多重PCR用引物用作第二次實時多重PCR用標記引物時，借助在第一次多重PCR期間產生的非特異產物或二聚物產物和標記引物之間的相互作用來產生假陽性信號的可能性較高。相反，當第二次實時多重PCR用標記引物為與通過第一次多重PCR產生的相關擴增子的內部序列雜交的套式引物時，避免第一次多重PCR的非特異產物或二聚物產物和標記套式引物之間的相互作用，由此從根本上防止這種假陽性信號。 最終，本發(fā)明的第二次套式實時多重PCR的循環(huán)數被限制成雖然產生多個靶信號但不產生基于二聚物形成的假陽性信號。因此，通過限制循環(huán)數，排除因形成二聚物而產生的假陽性信號，結果檢測用于表示靶核酸序列的存在的陽性信號。并且，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了，假陽性信號，例如在以往實時多重PCR中基于標記引物的二聚物形成的假陽性信號在30循環(huán)之后產生的可能性較高。因此，本發(fā)明者確認了，通過以最大30循環(huán)來實施第二次套式實時多重PCR來防止因形成二聚物而產生的假陽性信號。由于本發(fā)明的第二次套式實時多重PCR通過利用預-擴增的靶核酸序列來實施，因而，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了，用于表示靶核酸序列的存在的信號在30循環(huán)以內獲取。根據本發(fā)明，第二次套式實時多重PCR通過利用至少三種的一對引物來實施，在至少三種的各個一對引物中，至少一個引物是與通過第一次多重擴增來獲得的相關擴增子的內部序列雜交的套式引物，這將帶來提高特異性及靈敏度等套式PCR效果。第二次套式實時多重PCR產生與以往套式PCR的第二輪PCR類似的效果。即，本發(fā)明的第一次多重PCR相當于以往套式PCR的第一輪PCR，本發(fā)明的第二次套式實時多重PCR相當于以往套式PCR的第二輪PCR。尤其是，本方法的特征在于，在第二次套式實時多重PCR，將套式引物指定為標記引物。因此，本發(fā)明在實時PCR中，檢測多個靶核酸序列時，借助套式擴增效果來顯著提高靶特異性，這排除或者減少與試樣的非-靶序列的非特異雜交引起的假陽性信號。并且，本發(fā)明方法的套式效果與以往實時多重PCR方法相比時，戲劇性地提高了靈敏度。即，當多個靶序列模板以非常少的量存在時，由于以往實時多重PCR方法在檢測時受到限制，因而有可能無法檢測靶信號。相反，本發(fā)明的方法借助套式擴增效果來戲劇性地提高的靈敏度能夠正確地檢測以非常少量存在的靶序列。因此，本發(fā)明被命名為“基于第一次多重PCR及第二次套式實時多重PCR的連續(xù)組合的套式實時多重 PCR 方法(Nested real-time Multiple PCR Method by a SequentialCombination of Primary Multiplex PCR and Secondary Nested Real-time MultiplexPCR)”。
為了呈現(xiàn)本發(fā)明的特征而使用的術語“第一次多重PCR (Primary MultiplexPCR)”意味著為了從試樣中獲取靶核酸序列的擴增子而利用至少三種的一對引物來實施的多重PCR反應。為了呈現(xiàn)本發(fā)明的特征而使用的術語“第二次套式實時多重PCR (SecondaryNested Real-time Multiplex PCR)”意味著作為模板利用通過第一次多重PCR獲取的擴增子及各個一對引物中的至少一個引物為與相關擴增子的內部序列雜交的標記套式引物的至少三種的一對引物來實施，并以實時方式產生用于表示靶核酸序列的存在的信號的實時多重PCR反應。在本說明書中所使用的術語“假陽性信號的排除(eI imination )(或者去除(removal))”或者“假陽性數據的排除(elimination)(或者去除(removal))”意味著與革巴核酸序列未經過預-擴增的以往實時多重PCR反應相比時假陽性信號被減少的情況。優(yōu)選地，上述術語意味著假陽性信號的實質性排除(substantial elimination),更優(yōu)選為假陽性信號的完全排除(complete elimination)。
在本發(fā)明中使用的試樣包含任何試樣。優(yōu)選地，利用本發(fā)明的方法來分析生物試樣(biosampIe )。能夠分析來源于植物、動物、人、菌類、細菌及病毒的生物試樣。當分析來源于哺乳類或者人的試樣時，上述試樣可來源于特定組織或器官。作為組織的代表性例子，包含結合、皮膚、肌肉或神經組織。作為器官的代表性例子，包含眼睛、腦、肺、肝、脾臟、骨髓、胸腺、心臟、淋巴、血液、骨、軟骨、脾臟、腎臟、膽囊、胃、小腸、睪丸、卵巢、子宮、直腸、神經系統(tǒng)、腺及內部血管。所分析的生物試樣均能包含來自生物學根源的任何一種細胞、組織、流體(fluid),或者可通過本發(fā)明分析的任何一種介質(medium),這將包含人、動物、從人或動物所消耗的飲食中獲得的試樣。并且，所分析的生物試樣包含體液試樣，這將包含血液、血清、血漿、淋巴、母乳、小便、糞便、眼球乳液、唾液、精液、腦萃取物(例如，腦粉碎物)、脊髓液、闌尾、脾臟及扁桃腺組織萃取物。在本說明書中使用的術語“引物”意味著寡核苷酸，在誘導與核酸鏈(模板)互補的引物延長產物的合成的條件，即，如核苷酸和DNA聚合酶等聚合劑的存在以及適合的溫度與PH的條件下，可起到合成的起始點的作用。優(yōu)選地，引物在擴增中作為具有最大有效性的單鏈。優(yōu)選地，引物為寡脫氧核糖核苷酸。在本發(fā)明中利用的引物可包含自然(naturallyoccurring)脫氧單磷酸核苷(dNMP)(即，脫氧腺苷酸(dAMP)、dGMP (脫氧鳥苷酸)、dCMP (脫氧胞苷酸)及dTMP (脫氧胸苷酸))、變形的核苷酸或者非-自然核苷酸。并且，探針還可包含核糖核苷酸。就引物而言，應充分長，以便能夠在聚合劑的存在之下引發(fā)延長產物的合成。引物的適合的長度取決于多個因素，例如，溫度、應用領域及引物的根源(source)。在本說明書中使用的術語“退火”或“引發(fā)”意味著在模板核酸并置(apposition)寡脫氧核糖核苷酸或者核酸，就上述并置而言，通過聚合酶對核苷酸進行聚合而在模板核酸或者其一部分形成互補的核酸分子。在本說明書中使用的術語“雜交(hybridization)”意味著互補的單鏈核酸形成雙鏈核酸。在兩個核酸鏈之間的互補性完全匹配(perfect match)時發(fā)生雜交，或者即使存在一部分錯配(mismatch)堿基也能發(fā)生雜交。雜交時所需的互補性的程度可隨著雜交條件而不同，尤其是可通過溫度來進行調節(jié)。在本說明書中使用的術語“退火”和“雜交”沒有差異，因而在本說明書中混用。在本說明書中使用的術語“多重檢測或者多路檢測(multiplex detection ormultiplexing detection)”意味著在反應容器(例如，反應管)中同時檢測多個祀核酸序列。在本說明書中使用的術語“靶核酸”、“靶核酸序列”或者“靶序列”意味著要檢測的核酸序列，在雜交、退火或者擴增條件下，與引物或探針進行退火或者雜交。在本說明書中使用的術語“多重PCR (multiplex PCR)”意味著在反應容器中通過聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction)同時擴增多個革巴。根據本發(fā)明，在反應容器中利用可對至少三種的靶核酸序列進行擴增的至少三種的一對引物來實施多重PCR，由此從試樣中獲得靶核酸序列的擴增子。靶核酸序列的多重PCR可根據本技術領域中公知的PCR方法來實施。優(yōu)選地，多 重PCR反應根據美國專利第4，683，195號、第4，683，202號及第4，800，159號中公開的過程來實施。根據本發(fā)明的優(yōu)選實例，本發(fā)明的第一次多重PCR以最大50循環(huán)來實施，更優(yōu)選為最大40循環(huán),進而優(yōu)選為最大30循環(huán),最優(yōu)選為最大20循環(huán)。根據本發(fā)明的優(yōu)選實例，本發(fā)明的第一次多重PCR以至少2循環(huán)來實施，更優(yōu)選為至少5循環(huán)，進而優(yōu)選為至少10循環(huán)，進而優(yōu)選為至少15循環(huán)。根據本發(fā)明的優(yōu)選實例，在第二次套式實時多重PCR期間，決定第一次多重PCR的循環(huán)數，以提供產生用于表示靶核酸序列的存在的信號時所需的擴增子的量。試樣的靶核酸序列為DNA或者RNA。上述分子可以是雙鏈或者單鏈形態(tài)。當作為初期物質的核酸為雙鏈時，優(yōu)選地將雙鏈制成單鏈，或者制成一部分單鏈形態(tài)。作為用于分離鏈的公知的方法包括加熱、堿、甲酰胺、尿素及乙醇酸處理、酶方法(例，解旋酶作用)及結合蛋白質，但并不局限于此。例如，鏈的分離可以通過以80°C-105°C的溫度進行加熱而達成。用于達成這種處理的常規(guī)方法公開在Joseph Sambrook等、Molecular Cloning, ALaboratory Manual、 Cold Spring Harbor Laboratory Press、 Cold Spring Harbor、N.Y. (2001)。當mRNA用作初期物質時，在實施退火步驟之前必需要進行反轉錄步驟，以上詳細的內容公開在 Joseph Sambrook 等、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、ColdSpring Harbor Laboratory Press> Cold Spring Harbor> N. Y. (2001);以及 Noonan、K. F等,Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)。為了反轉錄反應，利用與隨機六聚體或者mRNA的聚腺苷酸尾巴(poly A tail)雜交的寡核苷酸dT引物。寡核苷酸dT引物由dTMPs構成，且在dT引物可以起到引物作用的范圍內其dTMPs的一個或者一個以上可由脫氧單磷酸核苷(dNMP)來代替。反轉錄可以由具有核糖核酸酶(RNase H Ribonuclease H)活性的反轉錄酶來實施。利用具有核糖核酸酶(RNase H Ribonuclease H)活性的酶時,慎重地選擇反應條件，從而可以省略核糖核酸酶(RNase H Ribonuclease H)切割過程。在本發(fā)明中使用的引物在靶核酸序列(模板)的一個位點(site)雜交或者退火，從而形成雙鏈結構。適合于形成這種雙鏈結構的核酸雜交或者退火的條件公開在Joseph Sambrook 等，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001) Haymes, B. D.,等，Nucleic AcidHybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D. C. (1985)。多種DNA聚合酶可利用于本發(fā)明的第一次多重PCR步驟，該多種DNA聚合酶包含E. coli DNA聚合酶I的“克列諾(Klenow)”片段、熱穩(wěn)定性DNA聚合酶及噬菌體T7DNA聚合酶。優(yōu)選地，聚合酶為可從多種細菌種獲得的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶，該聚合酶包含Thermusaquaticus (Taq)、Thermus thermophilus (Tth)>Thermus filiformiS、Thermis flavus、Thermococcus literalis 以及 Pyrococcus furiosus (Pfu)0在實施聚合反應時，優(yōu)選地向反應容器過量提供進行這種反應時所需的組成成分。所謂的延長反應所需的組成成分的過量意味著要實現(xiàn)的延長實質上未受到組成成分濃度的限制時的各組成成分的量。優(yōu)選地，在反應混合物提供充分量的如Mg2+等所需的輔因子，即為dATP、dCTP、dGTP及dTTP，以實現(xiàn)延長。利用于第一次多重PCR或者第二次套式實時多重PCR的所有酶在相同的反應條件下可處于活性狀態(tài)。實際上，緩沖液使所有酶接近于最佳的反應條件。因此，本發(fā)明的多重 PCR過程在不改變添加反應物等條件下可在單一反應物中實施。在本發(fā)明的方法中，用于多重PCR的退火或雜交在可實現(xiàn)核苷酸序列與引物之間的特異性結合的嚴格條件(stringent condition)下實施。用于退火的嚴格條件為序列-依賴性，并可隨著周圍環(huán)境變量而各不相同。優(yōu)選地，退火溫度為40°C至75°C，更優(yōu)選為45°C至68°C，最優(yōu)選為50°C至65°C。根據本發(fā)明的優(yōu)選實例，用于上述第一次多重PCR或第二次套式實時多重PCR的至少三種的一對引物中，至少一個引物具有以下通式I的雙重引發(fā)寡核苷酸(DPO)結構5’ -ΧΡ _3’ (I)在上述通式中，Xp為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的5’ -第一次引發(fā)部位(5，-first priming portion) ;Yq為包含至少三個通用堿基的分離部位(separationportion) ;Z,為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的3’ -第二次引發(fā)部位(3’ -secondpriming portion) ;p、q及r表示核苷酸的數量,X、Y及Z為脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’ -第一次引發(fā)部位的Tm高于3’ -第二次引發(fā)部位的Tm，上述分離部位在上述三個區(qū)域中具有最低的Tm;上述分離部位在針對靶核酸的退火方面，使上述5’ -第一次引發(fā)部位從上述3’ -第二次引發(fā)部位分離，由此上述寡核苷酸的上述退火特異性借助上述5’ -第一次引發(fā)部位及上述3’ -第二次引發(fā)部位來雙重性地決定，其結果，使得上述上游引物的整體退火特異性得到提高。DPO結構呈雙重特異性寡核苷酸(DS0, dual specificity oligonucleotide)的引物形態(tài)，由本發(fā)明者首次公開(W0 2006/095981; Chun 等，Dual priming oligonucleotidesystem for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotypingof CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research，35:6e40 (2007))。DPO 體現(xiàn)了借助通過分離區(qū)域相互分離雜交或退火的5’ -高Tm特異性部位(或者5’ -第一次引發(fā)部位)及3’ -低Tm特異性部位(或者3’ -第二次引發(fā)部位)來雙重性地決定的新概念，并表示顯著提高的雜交特異性(參照 W02006/095981 ;Kim 等，Direct detection of lamivudine-resistanthepatitis B virus mutants by multiplex PCR using dual-priming oligonucleotideprimers,Journal of Virological Methods，149:76-84 (2008 ) ; Kim 等,Rapiddetection and identification of 12 respiratory viruses using a dual primingoligonucleotide system-based multiplex PCR assay,Journal of VirologicalMethods,doi:10.1016/j. jviromet.2008.11.007 (2008) ;Horii 等，Use of dualpriming oligonucleotide system to detect multiplex sexualIy transmittedpathogens in clinical specimens, Letters in Applied Microbiology, doi:10. 111/j. 1472-765X2009. 02618x (2009)))。如上所述，DPO最終包含具有相互不同雜交特性的兩個引物片段導致初期穩(wěn)定雜交的5’-第一次引發(fā)部位及決定靶特異性的3’-第二次引發(fā)部位。向已排除假陽性信號的成功的多重擴增反應提供具有DPO結構的一部分引物。根據本發(fā)明的優(yōu)選實例，位于分離部位的通用堿基選自包含脫氧肌苷(deoxyinosine)、肌苷(inosine)、7_ 去氮-2，-脫氧肌苷(7-deaza_2，-deoxyinosine)、2-氮雜-2’ -脫氧肌苷(2_aza_2’ -deoxyinosine)Λ2^ -甲氧基肌苷(2’ -OMe inosine)、2’ -F 肌苷(2’ -F inosine)、脫氧 3-硝基卩比咯(deoxy 3-nitropyrrole)、3-硝基 P比咯(3-nitropyrrole)、2，-甲氧基 3_ 硝基卩比咯(2，-0Me3-nitropyrrole)、2，_F3_ 硝 基吡咯(2’ -F 3-nitropyrrole)U- (2’ -脫氧-β-D-呋喃核糖)-3-硝基吡咯(I- (2，-deoxybeta-D-ribofuranosyl)-3-nitropyrrole)、脫氧 5_ 硝基批咯(deoxy5_nitroindole)、5-硝基口引哚(5_nitroindole)、2’ -甲氧基 5-硝基口引哚(2，-OMe5_nitroindole)、2’ -F5-硝基口引哚(2，-F 5_nitroindole)、脫氧 4-硝基苯并咪唑(deoxy4-nitrobenzimidazole)λ4-硝基苯并咪唑(4_nitrobenzimidazole)、脫氧 4_ 氨基苯并咪唑(deoxy 4-aminobenzimidazole)、4_ 氨基苯并咪唑(4_aminobenzimidazole)、脫氧水粉蕈素(deoxy nebularine)、2’ -F 水粉蕈素(2’ -F nebularine)、2’ -F 4_ 硝基苯并咪唑(2’ -F4_nitrobenzimidazole)、妝核酸 _5_ 硝基卩引哚(PNA-5-nitroindole)、妝核酸-水粉蕈素(PNA-nebularine)、肽核酸-肌苷(PNA-inosine)、肽核酸_4_硝基苯并咪唑(PNA-4-nitrobenzimidazole)、妝核酸 _3_ 硝基卩比咯(PNA-3-nitropyrrole)、嗎啉基 _5硝基卩引哚(morpholino-5-nitroindole)、嗎啉基 _ 水粉蕈素(morpholino-nebularine)、嗎啉基-肌苷(morpholino-inosine)、嗎啉基-4-硝基苯并咪唑(morpholino-4-nitrobenzimidazole)λ 嗎啉基-3-硝基卩比咯(morpholino-3-nitropyrrole)、氨基磷酸酯_5_硝基卩引哚(phosphoramidate-5-nitroindole)、氨基磷酸酯-水粉蕈素(phosphoramidate-nebularine)、氨基憐酸酉旨-肌苷(phosphoramidate-inosine)、氨基憐酸酯_4_硝基苯并咪唑(phosphoramidate-4-nitrobenzimidazole)、氨基憐酸酯_3_硝基批咯(phosphoramidate-3-nitropyrrole)、2’ -O-甲氧基乙基肌苷(2’ -0-methoxyethylinosine)、2，-O-甲氧基乙基水粉蕈素(2’ 0-methoxyethyl nebularine)、2’ -O-甲氧基乙基5_硝基卩引哚(2’ -0-methoxyethyl 5_nitroindole)、2’ -O-甲氧基乙基4_硝基-苯并咪唑(2’ -0-methoxyethyl 4-nitro_benzimidazole)、2’ -O-甲氧基乙基 3_ 硝基批咯(2’ -0-methoxyethyl 3-nitropyrrole)及上述堿基的組合的群。更優(yōu)選地，通用堿基為脫氧肌苷(deoxyinosine)、肌苷(inosine)、l- (2’ -脫氧-β -D-呋喃核糖)_3_硝基批咯(I- (2，-deoxybeta-D-ribofuranosyl) -3-nitropyrrole)或者 5_ 硝基卩引哚(5-nitroindole)，最優(yōu)選為脫氧肌苷(deoxyinosine)。優(yōu)選地，上述分離部位包含具有至少三個通用堿基的連續(xù)的核苷酸，更優(yōu)選為至少四個通用堿基，最優(yōu)選為至少五個通用堿基。選擇性地，上述分離部位包含3-10、3-7或5-7個連續(xù)的核苷酸。優(yōu)選地，雙重引發(fā)寡核苷酸(DPO)的結構的5’ -第一次引發(fā)部位的長度比3’ -第二次引發(fā)部位的長度更長。上述5’ -第一次引發(fā)部位優(yōu)選地具有15-60核苷酸的長度，更優(yōu)選地具有15-40核苷酸的長度，最優(yōu)選地具有15-25核苷酸的長度。優(yōu)選地，上述3’-第二次引發(fā)部位具有3-15核苷酸的長度，更優(yōu)選地具有5-15核苷酸的長度，最優(yōu)選地具有
6-13核苷酸的長度。優(yōu)選地，上述分離部位具有3-10核苷酸的長度，更優(yōu)選地具有4-8核苷酸的長度，最優(yōu)選地具有5-7核苷酸的長度。根據本發(fā)明的優(yōu)選實例，上述5’-第一次引發(fā)部位具有40°C -80°C的Tm，更優(yōu)選地具有45°C _65°C的Tm。上述3’ -第二次引發(fā)部位優(yōu)選地具有10°C -40°C的Tm。上述分離部位優(yōu)選地具有3°C -15°C的Tm。在用于第一次多重PCR的步驟(a)中，利用至少三種的一對引物，優(yōu)選地利用至少四種的一對引物，更優(yōu)選地利用至少五種的一對引物。實施靶核酸序列的第一次多重PCR之后，接著在與第一次多重PCR的步驟(a)的 反應容器不同的反應容器中實施第二次套式實時多重PCR。利用各個一對引物中的至少一個引物為與通過步驟(a)所獲得的相關擴增子的各個內部序列雜交的套式引物的至少三種的一對引物來實施第二次套式實時多重PCR。通過第二次套式實時多重PCR，能夠以實時方式檢測至少三種的靶核酸序列。根據本發(fā)明的優(yōu)選實例，第二次套式多重PCR用正向及反向引物中的至少一個是與通過步驟(a)所獲得的相關擴增子的內部序列雜交的套式引物。在本說明書中使用的術語“套式引物(nested primer)〃意味著與通過步驟(a)所獲得的相關擴增子的內部序列雜交的引物。即，套式引物來源于經過第一次靶向的核苷酸序列內的核苷酸序列，并位于(flanking)包含在經過上述第一次靶向的核苷酸序列內的更窄的、經過第二次靶向的核苷酸序列的側面。在本說明書中使用的術語“擴增子的內部序列”意味著作為擴增子的序列使至少一個核苷酸位于內部的序列。實施用于第二次套式實時多重PCR的步驟(C)時，在第二次套式實時多重PCR期間，至少三種的一對引物中的各個一對引物包含具有產生用于表示靶核酸序列存在信號的標記的至少一個套式引物。根據本發(fā)明的優(yōu)選實例，在第二次套式實時多重PCR中所使用的引物具有產生用于表示靶核酸序列存在信號的標記時，上述引物為與相關擴增子的內部序列雜交的套式引物。在本發(fā)明中，由于第二次套式實時多重PCR利用預-擴增的產物，因而在無因形成標記套式引物的二聚物而產生的假陽性信號的狀態(tài)下產生用于表示靶核酸序列的存在的信號。根據本發(fā)明的優(yōu)選實例，在第二次套式實時多重PCR中表示靶核酸序列的存在的信號在30循環(huán)以內產生，更優(yōu)選為25循環(huán)以內，最優(yōu)選為20循環(huán)以內。在本發(fā)明中，步驟(C)的第二次套式實時多重PCR以不產生錯誤信號，而產生用于表示靶核酸序列存在信號的循環(huán)數來實施。根據本發(fā)明的優(yōu)選實例，步驟(C)的第二次套式實時多重PCR以最大30循環(huán)來實施，更優(yōu)選為最大25循環(huán)，最優(yōu)選為最大20循環(huán)。第二次套式實時多重PCR通常以至少2循環(huán)來實施，優(yōu)選為至少3循環(huán)來實施，最優(yōu)選為至少5循環(huán)。根據本發(fā)明，基于標記套式引物的二聚物形成的假陽性信號產生的循環(huán)數(或者Ct值)可在第二次套式實時多重PCR中，無模板地利用標記套式引物來決定。根據本發(fā)明的一實例，第一次多重擴增PCR的產物可分注到至少一個獨立的容器，各個容器在第二次套式多重PCR中利用于至少三種的不同靶核酸的檢測。例如，為了利用10對引物來擴增10種的不同靶核酸，實施第一次10-普思(plex)PCR，將擴增產物分注到三個不同容器之后，各個容器以實時方式利用于至少三種的靶核酸序列的子類型化(subtyping)、分組(grouping)或者鑒定(identification)。根據本發(fā)明的優(yōu)選實例，至少三種的一對引物的標記相異或者相同。根據本發(fā)明的更優(yōu)選的實例，至少三種的一對引物中的各一對引物的標記相異或者相同。
在本說明書中使用的“引物的標記相異”內容意味著(i)與引物連接的標記的數量、種類、吸收波長或釋放波長之間的差異；或者(ii)與引物連接的標記的信號產生機制的差異(例如，酶切割、具有標記的引物的三維結構變化、或者因在雙鏈PCR產物插入標記引物而引發(fā)的信號產生)。在本說明書中使用的“引物的標記相同”內容意味著(i)與引物連接的標記的數量、種類、吸收波長或者釋放波長之間的同一性；以及(ii)與引物連接的標記的信號產生機制的同一性(例如，酶切割、具有標記的引物的三維結構變化、或者因在雙鏈PCR產物插入標記引物而引發(fā)的信號產生)。根據本發(fā)明的優(yōu)選實例，術語“標記”意味著至少一個標記。根據本發(fā)明的優(yōu)選實例，標記引物包含單一標記或者相互作用性雙重標記。優(yōu)選地，標記位于與靶核酸序列互補的位置(site)。根據本發(fā)明的優(yōu)選實例，標記引物在與靶核酸序列的雜交之前具有線性(linear)結構或者分子間(intermolecular)結構。作為分子間結構的例子可舉例發(fā)夾環(huán)或者G-四聯(lián)體(quartet)結構。在本發(fā)明中有用的標記均包含本技術領域中公知的所有標記。大部分標記包含單分子或者單原子(atom);但是，部分標記(例如，相互作用性標記系統(tǒng))包含至少兩個或者其以上的標記分子或者原子。根據本發(fā)明的優(yōu)選實例，與引物連接的標記為化學標記、酶標記、放射性標記、突光標記、發(fā)光標記、化學發(fā)光標記或者金屬標記(例如，金)。根據本發(fā)明的優(yōu)選實例，標記為熒光標記，優(yōu)選為單一(mono)熒光標記，更優(yōu)選為相互作用性標記系統(tǒng)，最優(yōu)選為熒光共振能量轉移(FRET)標記系統(tǒng)。上述相互作用性標記系統(tǒng)為能量非-放射性地(non-radioacively)傳達到供體分子及受體分子之間的信號產生系統(tǒng)。作為相互作用性標記系統(tǒng)的代表性例子，熒光共振能量轉移技術(FRET, fluorescence resonance energy transfer)標記系統(tǒng)包含突光報道分子(供體分子)及猝滅分子(受體分子)。在熒光共振能量轉移技術中，能量供體為熒光性，但是，能量受體可以是熒光性或者非-熒光性。在相互作用性標記系統(tǒng)的再一形態(tài)中，能量供體為非-熒光性，例如，為發(fā)色團(chromophore),能量受體為突光性。在相互作用性標記系統(tǒng)的另一形態(tài)中，能量供體為發(fā)光性，例如，生物發(fā)光性、化學發(fā)光性或者電化學發(fā)光性，受體為熒光性。
更優(yōu)選地，用于表示靶核酸序列的信號借助相互作用性標記系統(tǒng)來產生，進而優(yōu)選為熒光共振能量轉移標記系統(tǒng)。當利用FRET標記時，在猝滅分子對報道分子的熒光進行猝滅的范圍內，熒光報道分子及猝滅分子的位置可以各不相同。例如，熒光報道分子及猝滅分子能夠隔開5-50核苷酸，優(yōu)選地隔開5-40核苷酸，最優(yōu)選地隔開5-30核苷酸。根據本發(fā)明的優(yōu)選實例，標記引物的熒光報道分子或猝滅分子位于標記引物的5’ -末端或者從5’ -末端隔開1-5核苷酸的位置。例如,突光報道 分子位于標記引物的5’ -末端，粹滅分子位于從報道分子隔開5-50核苷酸的位置。根據本發(fā)明的優(yōu)選實例，標記引物的熒光報道分子位于標記引物的5’ -末端或者從5’ -末端隔開1-5核苷酸的位置,最優(yōu)選為標記引物的5’ -末端。有利于本發(fā)明的報道分子以及猝滅分子可利用本發(fā)明所屬技術領域中公知的任何標記，例如Cy2 (506)、YOPROtm-I (509)、Υ0Υ0 -1 (509),Calcein (517),FITC (518)、FluorX (519),Alexa (520),Rhodamine I10(520)、5_FAM(522)'Oregon Green 500(522)、Oregon 25 Green 488 (524)、RiboGreen (525)、Rhodamine Green (527)>Rhodaminel23(529),Magnesium Green (531),Calcium Green (533)、TO-PROtm-I (533),TOTOl (533)、JOE (548)、B0DIPY530/550 (550),Dil (565),BODIPY TMR (568)、B0DIPY558/568 (568)、B0DIPY564/570 (570)、Cy3 (570)、Alexa 546 (570)、TRITC (572)、Magnesium Orange (575)>Phycoerythrin R&B (575)、Rhodamine Phalloidin (575)、Calcium Orange (576)、PyroninY (580)、Rhodamine B (580)、TAMRA (582)、Rhodamine Red (590)、Cy3.5 (596)、ROX (608)、Calcium Crimson (615)、Alexa 594 (615)、Texas Red (615)、Nile Red(628)、Y0-PR0 -3 (631 )、Y0Y0 -3 (631)、Rphycocyanin (642), C-Phycocyanin (648)、T0-PR0 -3 (660)、T0T03 (660)、DiD DilC (5) (665)、Cy5 (670)、Thiadicarbocyanine(671)以及Cy5. 5 (694)。括號的數字為以納米單位表示的最大發(fā)光波長。在本發(fā)明中，值得關注的是可以利用能夠對廣范圍波長或者特定波長的熒光進行猝滅的非-熒光黑猝滅分子。適合的一對報道分子-猝滅分子公開在如下的許多文獻中PeSCe等，editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY (Marcel Dekker1NewYork, 1971) ；ffhite 等，F(xiàn)LUORESCENCE ANALYSIS APRACTICAL APPROACH (MarcelDekker, NewYork, 1970)；BerIman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES，2nd EDITION(Academic Press1NewYork, 1971) Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANICMOLECULES (AcademicPress, New York, 1976) ；Bishop, editor, INDICATORS (PergamonPress, Oxford, 1972)；Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCHCHEMICALS (Molecular Probes,Eugene, 1992) ;Pringsheim，F(xiàn)LUORESCENCE ANDPHOSPHORESCENCE (Interscience Publishers, New York, 1949)；Haugland,R. P. , HANDBOOKOF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes,Eugene, Oreg.，1996 ;美國專利第 3,996,345 號以及第 4,351,760 號。在應用于標記引物的熒光共振能量轉移標記中，報道分子包含熒光共振能量轉移的供體，猝滅分子包含熒光共振能量轉移的剩余伙伴(受體)。例如，熒光素染料(fluorescein dye)被利用為報道分子,羅丹明染料(rhodamine dye)被利用為粹滅分子。
第二次套式實時多重PCR用至少三種的一對引物即使包含與靶核酸序列互補的序列，也能具有任何形態(tài)(form)或者結構。根據一實例，如上所述，第二次套式實時多重PCR用至少三種的一對引物中的各個一對引物中，至少一個引物具有DPO結構。在本發(fā)明中有用的標記引物在以往實時PCR過程中，為了產生信號，也能包含在本技術領域中公知的任何標記引物。這根據標記引物的種類包含追加的結構特征或者有可能需要特異性聚合條件。作為標記引物的例子包含以下內容，并不局限于此PlexorTM (Sherrill CB,等，Journal of the American Chemical Societyl26:4550-4556 (2004) ) , Antiprimer(Jin Li 等,Clinical Chemistry52:4 624 - 633 (2006)), Individual dye-labeledoligonucleotides (美國專利第 6, 593, 091 號)，LUXTM (I. A. Nazarenko,等,NucleicAcids Res, 30:2089-2095 (2002);美國專利第 7，537，886 號)，TSG primer (韓國專利第10-2009-0127880 號)，THD primer (國際專利第 PCT/KR2009/007064 號)，Lion (美國專利第6，248，526 號)，Self-quenching signal primer(美國專利第 5，846，726 號及第 6，054，279號)，Sunrise (I.A.Nazarenko,等,Nucleic acids Research, 125 (12) :2516-2521(1997) ;Hernandez M et, al. J. cereal Sci, 39:99-107 (2004)，美國專利第 5，866，336號，第 6，090, 552 號及第 6，117, 635 號)以及 Scorpions (David ffhitcombe,等，NatureBiotechnology, 17:804-807 (1999)以及歐美專利第 I, 088, 102 號)。作為標記引物利用PlexorTM (Sherrill CB 等，Journal of the AmericanChemical Society 126:4550-4556(2004))時，為了實現(xiàn)猝滅，優(yōu)選使用 Dabcyl-iso-dGTP。作為標記引物利用反引物(antiprimer)(Jin Li 等，Clinical Chemistry 52:4624 - 633 (2006))時，優(yōu)選地追加使用能夠對游離(free)引物進行猝滅的反引物。作為標記引物利用Individual dye-labeled oligonucleotides (美國專利第6，593，091號)時，優(yōu)選地使用具有單一標記的兩個引物。例示的標記引物中，THD引物及TSG引物是由本發(fā)明者發(fā)明的。根據本發(fā)明者所發(fā)現(xiàn)的上述引物，在實時多重PCR擴增中，THD引物或者TSG引物成功地產生用于檢測至少三種的靶核酸序列的信號。并且，本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)了如下驚奇的事實從THD引物或者TSG引物發(fā)出的信號通過引物的結構性變化或者5’ -末端的切割而產生。根據本發(fā)明的優(yōu)選實例，在步驟(C)中使用的模板-依賴性核酸聚合酶是不具有5’ 一 3’核苷酸活性的核酸聚合酶、具有5’ 一 3’核苷酸活性的核酸聚合酶、具有3’ 一 5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶或者其組合。優(yōu)選地，模板-依賴性核酸聚合酶是不具有5’ 一 3’核苷酸活性的核酸聚合酶、具有5’ 一 3’核苷酸活性的核酸聚合酶或者其組合。在引物信號化過程中，最終檢測的信號優(yōu)選地，通過向雙鏈PCR產物插入標記引物、標記引物的形態(tài)變化或者標記引物的5’ -末端的切割而產生。例如，在標記引物具有單一標記的情況下，該標記引物插入于雙鏈PCR產物時，標記借助熒光強度增加來提供信號。標記引物具有由報道分子及猝滅分子構成的相互作用性雙重標記系統(tǒng)且不與靶核酸序列雜交的情況下，粹滅分子與報道分子三維地相互相鄰而粹滅從報道分子發(fā)出的信號。相互作用性雙重標記引物與靶核酸序列雜交的情況下，猝滅分子與報道分子三維地隔開，由此不能再猝滅從報道分子發(fā)出的信號。通過相互作用性雙重標記引物的形態(tài)變化可獲得用于表不祀核酸序列的存在的信號。在這種信號產生過程中，標記引物系統(tǒng)不僅產生靶擴增而且還產生信號，這與標記探針系統(tǒng)不同。利用由于向雙鏈PCR產物插入標記引物或者基于標記引物發(fā)生形態(tài)變化而產生的信號來檢測靶核酸序列的情況下，可利用不具有5’ 一3’核苷酸活性的核酸聚合酶。作為不具有5’ 一 3’核苷酸活性的核酸聚合酶的例子包含E. coliDNA聚合酶I的克列諾(Klenow)片段、熱穩(wěn)定性DNA聚合酶及噬菌體T7 DNA聚 合酶。選擇性地，根據本發(fā)明者的以往發(fā)現(xiàn)的內容，標記引物具有由報道分子及猝滅分子組成的相互作用性標記系統(tǒng)的情況下，隨著與具有5’ 一3’核苷酸活性的核酸聚合酶接觸，其3’ -末端隨之延長，其5’ -末端被切割，隨后釋放報道分子或者猝滅分子并產生用于表示祀核酸序列存在的信號。這種標記引物被命名為“THD (Target hybridizationDetection”引物。在上述信號產生戰(zhàn)略中，THD引物具有伴隨著靶擴增及信號產生的雙重功能。利用通過標記引物(例如，THD引物)5’ -末端的切割而產生的信號來檢測用于檢測靶核酸序列的存在時，需要具有5’ 一 3’核苷酸活性的核酸聚合酶。根據本發(fā)明的優(yōu)選實例，具有5’ 一3’核苷酸活性的模板-依賴性核酸聚合酶為熱穩(wěn)定性DNA聚合酶,該聚合物可從多種細菌種種獲得，例如包含Thermus aquaticus(Taq)、Thermus thermophilus(Tth)>Thermus filiformiS、Thermis flavus>Thermococcusliteralis>Pyrococcus furiosus (Pfu)、Thermus antranikianii、Thermus caldophilus、Thermus chliarophilus、Thermus flavus、Thermus igniterrae、Thermus lacteus、Thermus oshimai、Thermus ruber、Thermus rubens、Thermus scotoductus、Thermussilvanus、Thermus species Z05、Thermus species sps 17、Thermus thermophilus、Thermotoga maritima、Thermotoga neapolitana 及 Thermosipho africanus。最優(yōu)選地，具有5’ 一 3’核苷酸活性的模板-依賴性核酸聚合酶為Taq DNA聚合酶。使用具有3’ 一 5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶時，標記引物在其3’ -末端部位包含人為的錯配核苷酸序列。多個錯配核苷酸可位于3’ -末端部位的多種位置。根據本發(fā)明的優(yōu)選實例，錯配核苷酸位于從引物的3’ -末端或者引物的3’ -末端隔開1-5核苷酸的位置，更優(yōu)選地，從引物的3’ -末端或者引物的3’ -末端隔開1-2核苷酸的位置，更優(yōu)選地，從引物的3’ -末端或者引物的3’ -末端隔開I核苷酸的位置，最優(yōu)選為引物的3’ -末端。錯配核苷酸的數為1-5個，優(yōu)選為1-4個，更優(yōu)選為1-3個，進而優(yōu)選為1_2個，最優(yōu)選為I個。引物具有至少兩個錯配核苷酸的情況下，錯配核苷酸可連續(xù)或者不連續(xù)地定位。根據本發(fā)明的優(yōu)選實例，引物的熒光報道分子或者猝滅分子位于引物的3’ -末端或者從引物的3’-末端隔開1-5核苷酸的位置，最優(yōu)選為引物的3’-末端。引物與靶核酸序列雜交的情況下，具有熒光報道分子或者猝滅分子的引物的3’ -末端由具有3’ 一 5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶所切割，釋放熒光分子或者猝滅分子，由此使從報道分子發(fā)出的熒光信號不猝滅，從而獲得用于表示靶核酸序列的熒光信號。
根據本發(fā)明的優(yōu)選實例，具有3’ 一5’外切核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶為熱穩(wěn)定性DNA聚合酶,該聚合酶可從多種細菌種獲得，并包含Thermus filiformis、Thermis flavus、 Thermococcus literalis、 Pyrococcus furiosus (Pfu)、 Thermusantranikianii、Thermus caldophiIusΛThermus chiiarophiIusΛThermus flavus、Thermusigniterrae、Thermus lacteus、Thermus oshimai、Thermus ruber、Thermus rubens、Thermus scotoductus、Thermus silvanus、Thermus species Z05、Thermus speciessps 17、Thermus thermophilus、Thermotoga maritima、Thermotoga neapolitana 以及Thermosipho africanus的DNA聚合酶。最優(yōu)選地,具有3’一 5’核苷酸活性的模板-依賴性核酸聚合酶為Pfu DNA聚合酶。最終，檢測出表示靶核酸序列存在的信號。信號檢測可在反復的各循環(huán)中，在反復的終點或者在反復過程期間的各個預定時間間隔內實施。優(yōu)選地，信號檢測在反復的各循環(huán)中實施，這能夠提高檢測的準確度。對各標記的信號可通過以往方法進行檢測或測定。例如熒光信號可通過以往方法，例如利用熒光強度測定儀進行檢測或測定。 根據本發(fā)明的另一實施方式，本發(fā)明提供一種排除假陽性信號的至少三種的靶核酸序列的實時多重PCR檢測試劑盒，包括(a)為了從試樣中獲取上述靶核酸序列的擴增子，利用于上述至少三種的靶核酸序列的第一次多重PCR的至少三種的一對引物；以及(b)用于上述擴增子的第二次套式實時多重PCR的至少三種的一對引物，上述至少三種的各個一對引物中，至少一個引物為與相關擴增子的內部序列雜交的套式引物，在上述第二次套式實時多重PCR期間，上述至少三種的各個一對引物包含具有產生用于表示靶核酸序列存在信號的標記的至少一個套式引物，上述第二次套式實時多重PCR能夠以產生用于表示靶核酸序列的信號，而不產生錯誤信號的循環(huán)數來實施。本發(fā)明的試劑盒是為了能夠實施本發(fā)明的上述套式多重實時PCR方法而構成的，為了避免本說明書的過度復雜性，故省略共同的內容。根據本發(fā)明的優(yōu)選實例，試劑盒還包含模板-依賴性核酸聚合酶。優(yōu)選地，第二次套式實時多重PCR以最大30循環(huán)來實施，更優(yōu)選為25循環(huán)，最優(yōu)選為20循環(huán)。根據本發(fā)明的優(yōu)選實例，在第二次套式實時多重PCR中使用的引物具有產生用于表示靶核酸序列存在信號的標記時，引物為與相關擴增子的內部序列雜交的套式引物。本發(fā)明的試劑盒可選擇性地包含在實施靶擴增聚合酶鏈式反應(PCR)(例如，聚合酶鏈式反應)中所需的如緩沖液、DNA聚合酶輔因子及脫氧核糖核苷酸-5-三磷酸酯等試齊U。選擇性地，本發(fā)明的試劑盒還可包含多種多聚核苷酸分子、反轉錄酶、多種緩沖液、試劑以及抑制DNA聚合酶活性的抗體。并且，試劑盒可包含實施陽性對照組及陰性對照組反應時所需的試劑。熟知本說明書的公開事項的本技術領域的普通技術人員能夠容易地決定在任意一個特定反應中使用的試劑的最適量。典型的是，本發(fā)明的試劑盒由包含在前面揭示的組成成分的額外的包裝體或者組分(compartment)所制備。對本發(fā)明的特征及優(yōu)點如下進行概括
(a)排除因形成標記引物(labeled primer)的二聚物而產生的假陽性信號以往實時多重PCR方法需要多個標記引物，形成引發(fā)假陽性信號的產生的二聚物可能性較高，這將被視為以往實時多重PCR方法的嚴重的缺點及限制。相反，本發(fā)明的方法通過利用預-擴增的產物、標記套式引物(labeled nested priemr)并通過調節(jié)循環(huán)數,從根本上排除因形成標記引物的二聚物而產生的假陽性信號。(b)在陰性對照組中的假陽性信號的排除由于以往實時多重PCR方法形成多個標記引物的二聚物，因而即使在沒有模板的陰性對照組中也出現(xiàn)假陽性信號伴隨的問題。但是，本發(fā)明通過徹底排除因形成標記引物的二聚物而產生的假陽性信號，由此防止在沒有模板的陰性對照組中出現(xiàn)的這種假陽性信號問題。(c)排除通過非-靶序列和標記引物的非特異性雜交來產生的假陽性信號 根據本技術領域中公知的常規(guī)知識，在多重靶檢測中，由于標記引物與非-靶核酸序列進行非-特異性雜交的可能性較高，因而產生假陽性信號。在本發(fā)明的方法中，由于在第二次套式實時多重PCR中利用標記引物用作套式引物，因而出現(xiàn)與以往套式PCR類似的效果，以使本發(fā)明的靶特異性顯著增加，由此防止因非特異性雜交引起的假陽性信號的產生。(d)在非常少量的靶序列檢測中的假陽性信號的排除在以往實時多重PCR方法中，可通過陰性方式分析非常少量的靶序列的存在。但是，由于本發(fā)明的第二次套式實時多重PCR利用預-擴增的產物來實施，因而通過本發(fā)明的方法可檢測出非常少量的靶序列，并且可防止假陰性信號。(e)如上所述，具有在本發(fā)明中使用的DPO結構的引物提高了結合特異性，由此去除在多重PCR反應中關于引物的非-靶結合的假陽性信號。下面，將通過實施例對本發(fā)明進行更詳細的說明。這些實施例僅用于更加具體說明本發(fā)明，根據本發(fā)明的宗旨，本發(fā)明的范圍不局限于這些實施例，這對于本發(fā)明所屬技術領域的普通技術人員來說是顯而易見的。
實施例實施例I:用于排除在針對沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)以及陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)進行實時多重 PCR期間，由于形成標記引物的二聚物而產生的假陽性信號的套式實時多重PCR的效果為了確認排除由于形成已標記的引物的二聚物而產生的假陽性信號的效果，對本發(fā)明的套式實時多重PCR方法和以往的實時多重PCR方法進行比較來做實驗。在本實驗中，為了檢測沙眼衣原體(C. trachomatis)>淋病奈瑟菌(N. gonorrhoeae)以及陰道毛滴蟲(T. vaginalis)這三種不同類型的祀核酸,對第一次多重PCR用一對引物及第二次套式實時多重PCR用標記的套式引物進行設計。第一次多重PCR用一對引物為了提高靶特異性，設計成具有雙重引發(fā)寡核苷酸(DPO)結構。為了實現(xiàn)第二次套式實時多重PCR，本實施例中利用雙重標記引物用作靶信號產生用標記引物。雙重標記引物在其5’-末端具有FAM、Alexa 532或Alexa 647等熒光報道分子，并具有黑洞粹滅劑(BHQI, Block Hole Quencher I)或 BHQ2 (Block Hole Quencher2)等猝滅分子。熒光報道分子及猝滅分子隔開18或19核苷酸。雙重標記引物為能夠與通過第一次多重PCR而產生的相關擴增子的內部序列雜交的套式引物。與雙重標記套式引物的靶核酸序列進行的退火及延長導致熒光信號的產生。為了實現(xiàn)第二次(secondary)套式實時多重PCR，一起利用第一次多重PCR中所利用的一對引物中的一個引物和雙重標記套式引物。為了對本發(fā)明的方法是否能夠排除由于形成標記套式引物的二聚物而產生的假陽性信號的情況做實驗，利用了具有以往的結構或DPO結構的已標記的套式引物的組合。在第二次套式實時多重PCR及以往的實時多重PCR中均利用相同的一對引物。為了說明實現(xiàn)假陽性信號的排除的本發(fā)明的特征，僅利用一種模板(淋病奈瑟菌的基因組DNA)。 本實施例中所利用的引物序列如下。針對沙眼衣原體(C. trachomatis)的引物對CT_F:5， -TGCAACGGGTTATTCACTCCCIIIIICATTGAAACT-3 (SEQ ID NO:I)CT_R :5’ -ACCCATACCACACCGCTTTCTIIIIIGCCTACACGT-3’ (SEQ ID N0:2)CT_DLP (18) :5，-[AminoC6+Alexa532]CACCTTCTCGTACCAAAGC[BHQl-dT]AGAA-3J(SEQ ID NO 3)針對淋病奈瑟菌(N. gonorrhoeae)的引物對NG_F :5’ -CTATTTTTATGAGCCGGAACCGIIIIIAAGCGTGGGA-3’ (SEQ ID NO:4)NG_R :5’ -TTGAAGTTGTCGGGAAAGCCIIIIITTCTTGCAAC-3’ (SEQ ID NO:5)NG_DLP(18):5，-[6-FAM]CCCCGTGCTTTTCCATCTT[BHQl-dT]111IITTGCGGGT-3，(SEQID NO 6)針對陰道毛滴蟲(T. vaginalis)的引物對TV_F :5，-CCCAAAGGCTAACCGTGAGAIIIIIATCTCCCTCA-3’ (SEQ ID NO:7)TV_R :5，-TCGGCTGTTGTGTTGAAAGCIIIIICACGCTCT-3’ (SEQ ID N0:8)TV_DLP (19):5, -[AminoC6+Alexa647]TGATCTCACAGCCTGGATGG[BHQ2_dT]CA-3’(SEQ ID NO 9)(I:脫氧肌苷)以往實時多重PCR方法以含有包含模板N. gonorrhoeae的基因組DNA IOOOfg或者不包含的2XQuantiTect多重PCR主混合液(凱杰公司Qiagen) [IlmM氯化鎂(MgC12)、QuantiTect多重PCR緩沖液、HotstarTaq DNA聚合酶以及dNTP混合液]10 μ I以及各個引物(SEQ ID :1、3、
4、6、8及9)5pmole的20 μ I的最終體積實施了以往實時多重PCR ;將含有上述反應混合物的管位于實時熱循環(huán)儀(CFX96，伯樂公司Bio-Rad);在95°C下對上述反應混合物進行15分鐘變性后，將在94°C下30秒、在55°C下60秒以及在72°C下10秒的過程實施了 40次。由此檢測了在各循環(huán)的退火步驟(55°C)中產生的信號。如圖2的畫面A所示，以往實時多重PCR方法將N. gonorrhoeae的基因組DNA用作模板，不僅產生 N. gonorrhoeae (NG)的信號(Xt 值:33· 31)還產生 C. trachomatis (CT)的信號(Ct值32. 89)，這表示CT的信號為假陽性。
如圖2的畫面B所示，在無需任何模板實施的以往實時多重PCR中，均從NG (Ct值33. 43)及CT (Ct值32. 94)產生信號。這種結果顯示，因形成標記引物的二聚物而產生假陽性信號。因此確認了，畫面A的假陽性信號(CT)是通過形成標記引物的二聚物而產生的信號。并且，雖然在畫面A及B中觀察到了信號以類似的模式生成，但是畫面A中的NG信號為陽性，畫面B中的NG信號為假陽性。這種結果顯示，陽性信號及錯誤信號不可能通過以往實時多重PCR方法來區(qū)分。用于檢測靶序列的以往實時多重PCR方法，伴隨著因形成標記引物的二聚物而產生的假陽性信號的可能性十分高，這將導致難以獲得不存在錯誤問題的靶序列的檢測結
果O本發(fā)明的套式實時多重PCR方法
第一次多重PCR以含有包含模板N. gonorrhoeae的基因組DNA IOOOfg或者不包含的2X多重主混合液(凱杰公司Qiagen)[6mM氯化鎂(MgC12)、HotstarTaq PCR緩沖液、HotstarTaq DNA聚合酶以及dNTP混合液]10 μ I以及各個引物(SEQ ID :1、2、4、5、7及8)5pmole的20 μ I的最終體積實施了第一次多重PCR ;將含有上述反應混合物的管位于實時熱循環(huán)儀(ΑΒΙ9700，美國應用生物系統(tǒng)公司Applied BioSystems);在95°C下對上述反應混合物進行15分鐘變性后，將在94°C下30秒、在55°C下60秒以及在72°C下60秒的過程實施了 35次。第二次套式實時多重PCR以含有第一次多重PCR產物I μ 1、2X QuantiTect多重PCR主混合液(凱杰公司Qiagen) [IlmM 氯化續(xù)(MgC12)、QuantiTect 多重 PCR 緩沖液、HotstarTaq DNA 聚合酶及dNTP混合物]10 μ I及各個引物(SEQ ID :1、3、4、6、8及9) 5pmole的20 μ I的最終體積實施了第二次套式實時多重PCR;將含有上述反應混合物的管位于實時熱循環(huán)儀(CFX96，伯樂公司Bio-Rad);在95°C下對上述反應混合物進行15分鐘變性后，將在94°C下30秒、在55°C下60秒以及在72°C下10秒的過程實施了 30次。由此檢測了在各循環(huán)的退火步驟(55°C)中產生的信號。如圖3的畫面A所示,將淋病奈瑟球菌(NG,N. gonorrhoeae)用作模板時,本發(fā)明的方法在沒有任何假陽性信號的狀態(tài)下，僅表示N. gonorrhoeae(NG)的祀信號(Ct值9. 14)。并且，在沒有模板的陰性對照組中，本發(fā)明的方法如圖3的畫面B所示，未表示任何假陽性信號。這種結果舉證了，本發(fā)明的方法在實時多重PCR方式中，排除因形成標記引物的二聚物而產生的假陽性信號來正確地檢測靶核酸序列。實施例2 :在實施針對Haemophilus ducreyi、Herpes simplex virusl 及Herpessimplex virus2的實時多重PCR期間，用于排除因形成標記引物的二聚物而產生的假陽性信號的套式實時多重PCR的效果作為用于確認本發(fā)明的重現(xiàn)性的實驗，利用杜克雷嗜血桿菌(Haemophilusducreyi )、單純皰疫病毒 I (Herpes simplex virus I)及單純皰疫病毒 2 (Herpes simplexvirus 2)的三種靶核酸序列。除了引物序列及標記以外，引物的設計及實驗條件是與實施例I相同。雙重標記引物在其5’ -末端具有Alexa 532、Alexa 594或Alexa 647等熒光報道分子，并具有 BHQI (Block Hole Quencher I)或 BHQ2 (Block Hole Quencher 2)等粹滅分子。突光報道分子及粹滅分子隔開18、20或21核苷酸。將Herpes simplex virusI的基因組DNA IOOOfg用作模板。在第二次套式實時多重PCR及以往實時多重PCR中均利用相同的一對引物。本實施例中所利用的引物序列如下針對杜克雷嗜血桿菌(Haemophilus ducreyi)的引物對HD_F :5，-AAAGAACGTGAAAAAGCCGACCIIIIIAAAATTACTA-3’ (SEQ ID NO:10)HD_R :5’ -ATAGCCCAGAAGGGTTAGCAATIIIIIGACAATCAAT-3’ (SEQ ID NO:11)HD_DLP (20) :5，-[AminoC6+Alexa532]CCTCGGCTGGTATTACGACTA[BHQl-dT]CIIIIIAGCCTAGG-3， (SEQ ID NO:12) 針對單純皰疫病毒I (Herpes simplex virus I)的引物對HSV1_F :5’ -GTCCTGGTGGTGCAACCGIIIIIAGTTCCGA-3’ (SEQ ID NO :13)HSV1_R :5’ -ATACGCACGGTCACCCCACIIIIITGTGAGACT-3’ (SEQ ID NO :14)HSV1_DLP (18):5_[AminoC6+Alexa594]CAGCCGATTACGACGAGGA[BHQ2_dT]IIIIITGACGAGG-3’ (SEQ ID NO :15)針對單純皰疫病毒2 (Herpes simplex virus 2)的引物對HSV2_F :5’ -GTCGTCTGCGCCAAATACGIIIIIGCAGACCC-3’ (SEQ ID NO :16)HSV2_R :5，-CAGGCGATGGTCAGGTTGTIIIIITGCTTTCG-3’ (SEQ ID NO :17)HSV2_DLP (21) :5，-[AminoC6+Alexa647]CCGATCACTGTGTACTACGCAG[BHQ2_dT]IIIIIAACGTGCC-3，(SEQ ID NO :18)(I:脫氧肌苷)以往實時多重PCR方法除了引物(SEQ ID NO :10、12、14、15、17及18)以及模板(單純皰疹病毒1，Herpessimplex virus I)以外，以與實施例I相同的方式實施了以往實時多重PCR。如圖4的畫面A所示，以往實時多重PCR方法僅將單純皰疹病毒I (HSV1，Herpessimplex virus I)的基因組DNA用作模板,不僅產生單純皰疫病毒1(HSV1,Herpes simplexvirus I)的信號(Ct 值33. 50)還產生杜克雷嗜血桿菌(HD, Haemophilus ducreyi) (Ct值38. 24)及單純皰疹病毒 2 (HSV2，Herpes simplex virus I)的信號(Ct 值32. 79)，這將表示HD及HSV2的信號為假陽性。如圖4的畫面B所示，在無任何模板的條件下實施的以往實時多重PCR，從HSVl(Ct值34. 52)及HSV2 (Ct值34. 52)均產生信號。這種結果顯示，因形成標記引物的二聚物而產生假陽性信號(HSV1及HSV2)。因此，畫面A的HSV2假陽性信號表示因形成標記引物的二聚物而產生的信號，畫面A的HD假陽性信號表示借助標記引物的非特異性雜交來產生的信號。并且，畫面A及B的HSVl及HSV2信號與靶模板的存在與否無關地產生。這種結果顯示，陽性信號及錯誤信號無法通過以往實時多重PCR方法來區(qū)別。本發(fā)明的套式實時多重PCR方法第一次多重PCR除了引物(SEQID NO :10、11、13、14、16 及 17)以及模板(Herpes simplex virus1)，與實施例I相同地實施第一次多重PCR。第二次套式實時多重PCR除了引物(SEQ ID NO :10、12、14、15、17及18)以外，以與實施例I相同的方式實
施了第二次套式實時多重PCR。如圖5的畫面A所示，當HSVl (Herpes simplex virus I)用作模板時，本發(fā)明的方法在無任何假陽性信號的狀態(tài)下僅表示HSVl (Herpes simplex virus I)的祀信號(Ct值7. 99)。并且，在無模板的陰性對照組中，本發(fā)明的方法如圖5的畫面B所示，未表示任何假陽性信號。這種結果舉證了，本發(fā)明的方法在實時多重PCR方式中，排除因形成標記引物的二聚物而產生的假陽性信號來正確地檢測靶核酸序列。
實施例3:在本發(fā)明的套式實時多重PCR方法中的靈敏度及特異性在用于檢測杜克雷嗜血桿菌(HD,Haemophilus ducreyi)、單純皰疫病毒I (HSV1,Herpes simplex virus I)及單純皰疫病毒 2 (HSV2,Herpes simplex virus 2)的三種的一對引物的存在之下，檢測杜克雷嗜血桿菌(HD, Haemophilus ducreyi)、單純皰疫病毒I(HSVl,Herpes simplex virus I)的基因組DNA,由此確認了在本發(fā)明的套式實時多重PCR方法中的靈敏度及特異性。利用與實施例2中所述的引物相同的一對引物，并將依次稀釋的杜克雷嗜血桿菌(HD, Haemophilus ducreyi)或單純皰疫病毒 I (HSVI, Herpes simplex virus I)的基因組DNA用作模板。第一次多重PCR以含有依次稀釋的杜克雷嗜血桿菌或單純皰疹病毒I的基因組DNA (IOOOfg,IOOfgUOfg或lfg)、2X多重PCR主混合液(凱杰公司Qiagen) [6mM氯化鎂(MgC12)、HotstarTaq PCR緩沖液、HotstarTaq DNA聚合酶及dNTP混合物]10 μ I及各個引物(SEQID :10、11、13、14、16及17) 5pmole的20 μ I的最終體積實施了第一次多重PCR ;將含有上述反應混合物的管位于熱循環(huán)儀(ΑΒΙ9700，Applied BioSystems);在95°C下對上述反應混合物進行15分鐘變性后，將在94°C下30秒、在55°C下60秒以及在72°C下60秒的過程實施了 35次。第二次套式實時多重PCR以含有第一次多重PCR產物I μ 1、2X QuantiTect多重PCR主混合液(凱杰公司Qiagen) [IlmM 氯化續(xù)(MgC12)、QuantiTect 多重 PCR 緩沖液、HotstarTaq DNA 聚合酶及 dNTP 混合物]10 μ I 及各個引物(SEQ ID : 10、12、14、15、17 及 18) 5pmole 的 20 μ I 的最終體積實施了第二次套式實時多重PCR ;將含有上述反應混合物的管位于實時熱循環(huán)儀(CFX96，伯樂公司Bio-Rad);在95°C下對上述反應混合物進行15分鐘變性后，將在94°C下30秒、在55°C下60秒以及在72°C下10秒的過程實施了 30次。由此檢測了在各循環(huán)的退火步驟(55°C)中產生的信號。如圖6所示，成功檢測杜克雷嗜血桿菌(H. ducreyi)的靶核酸序列來確認本方法的特異性及靈敏度。即使為了同時檢測H. ducreyi (HD)、HSVl (Herpes simplex virus I)及 HSV2(Herpes simplex virus 2)而在第二次實時多重PCR反應混合物利用三種不同標記引物，在沒有任何HSVl及HSV2的條件下僅檢測HD的靶信號，這將表示本方法的靶特異性。并且，如圖6所示，本發(fā)明的方法可檢測到IOfg的H. ducreyi基因組DNA。圖7表示通過檢測Herpes simplex virus I的祀核酸序列來確認本發(fā)明的特異性及靈敏度的其他實施例。即使為了同時檢測H. ducreyi (HD)、HSVl (Herpes simplex virusl)及 HSV2(Herpes simplex virus 2)而在第二次實時多重PCR反應混合物中利用三種不同標記引物，在無任何HD及HSV2的信號的狀態(tài)下僅檢測HSVl的靶信號，這將表示本方法的靶特異性。并且,如圖7所示,本實施例表示,本發(fā)明的方法檢測到IOfg的Herpes simplex virus I 基因組 DNA0終上所述，本發(fā)明的方法在實時多重方式中，能夠以提高的靈敏度及特異性來檢測靶序列。實施例4:利用本發(fā)明的套式實時多重PCR方法的多個靶檢測為了對是否能夠通過本發(fā)明的方法，并以實時方式同時檢測至少三種不同靶核酸序列的情況做實驗，將H. ducreyi、Herpes simplex virus I及 Herpes simplex virus 2的混合基因組DNA用作模板，并利用與實施例2中所利用的引物相同的一對引物。第一次多重PCR除了模板(H. ducreyi、Herpes simplex virus I 及 Herpes simplex virus 2 的基因組DNA分別是lOOOfg)，如同實施例2實施了第一次多重PCR。第二次套式實時多重PCR如同實施例2實施了第二次套式實時多重PCR。如圖8所示，本發(fā)明的套式實時多重PCR同時檢測了對于H. ducreyi (HD)(Ct;4. 61)>Herpes simplex virus 1(HSV1)(Ct;2·80)及 Herpes simplex virus 2(HSV2)(Ct;7. 39)的存在的三種不同靶信號。在無模板的陰性對照組中，未出現(xiàn)任何假陽性信號。因此，本發(fā)明舉證了，本發(fā)明的方法在實時多重PCR方式中，排除假陽性信號來同時檢測至少三種其他靶核酸序列。對本發(fā)明的優(yōu)選實例進行了詳細記述，可以進行根據本發(fā)明的原理的變形及修正，本發(fā)明的范圍借助所附的權利要求和與其均等的內容而定義，這對于本發(fā)明所屬的技術領域的普通技術人員來說是顯而易見的。
權利要求
1.一種在實時多重PCR排除錯誤信號的試樣內至少三種的祀核酸序列的實時多路檢測方法，其特征在于，包括如下步驟 步驟(a)，在反應容器實施用于擴增上述靶核酸序列的第一次多重PCR，為了在上述試樣中獲取上述靶核酸序列的擴增子，在能夠擴增至少三種的靶核酸序列的條件下，利用至少三種的一對引物及模板-依賴性核酸聚合酶來實施上述第一次多重PCR ； 步驟(b)，在與上述步驟(a)中所使用的反應容器不同的反應容器準備第二次套式實時多重PCR反應混合物，上述第二次套式實時多重PCR反應混合物包含(i)在上述步驟Ca)中獲取的擴增子，(ii)用于上述擴增子的第二次套式實時多重PCR的至少三種的一對引物，在上述至少三種的各個一對引物中，至少一個引物是與相關擴增子的內部序列雜交的套式引物，以及(iii)模板-依賴性核酸聚合酶，上述至少三種的各個一對引物包含至少一個套式引物，上述至少一個套式引物具有在上述第二次套式實時多重PCR期間產生用于表示靶核酸序列的存在的信號的標記； 步驟(c)，利用上述步驟(b)的上述反應混合物，并通過至少2循環(huán)來實施引物退火、弓丨物延長及變性，由此實施上述第二次套式實時多重PCR，用于表示上述靶核酸序列的存在的上述信號在循環(huán)期間從上述各個標記引物中產生，上述第二次套式實時多重PCR能夠以產生用于表示靶核酸序列的信號，而不產生錯誤信號的循環(huán)數來實施；以及 步驟(d)，檢測用于表示靶核酸序列的存在的信號，上述檢測在步驟(C)的上述反復的各循環(huán)中，在步驟(c)的上述反復的終點或者步驟(c)的上述反復期間的各個預定時間間隔內實施，據此表示上述靶核酸序列的上述信號通過實時方式得到獲取，且不產生錯誤信號。
2.根據權利要求I所述的在實時多重PCR排除錯誤信號的試樣內至少三種的靶核酸序列的實時多重檢測方法，其特征在于，上述第二次套式實時多重PCR通過最大30循環(huán)來實施。
3.根據權利要求I所述的在實時多重PCR排除錯誤信號的試樣內至少三種的靶核酸序列的實時多重檢測方法，其特征在于，上述第二次套式實時多重PCR通過最大25循環(huán)來實施。
4.根據權利要求I所述的在實時多重PCR排除錯誤信號的試樣內至少三種的靶核酸序列的實時多重檢測方法，其特征在于，上述第二次套式實時多重PCR通過最大20循環(huán)來實施。
5.根據權利要求I所述的在實時多重PCR排除錯誤信號的試樣內至少三種的靶核酸序列的實時多重檢測方法，其特征在于，用于上述第二次套式實時多重PCR的上述引物具有上述標記的情況下，上述引物為與相關擴增子的內部序列雜交的套式引物。
6.根據權利要求I所述的在實時多重PCR排除錯誤信號的試樣內至少三種的靶核酸序列的實時多重檢測方法，其特征在于，上述至少三種的一對引物的上述標記相異或者相同。
7.根據權利要求6所述的在實時多重PCR排除錯誤信號的試樣內至少三種的靶核酸序列的實時多重檢測方法，其特征在于，上述至少三種的各個一對引物的上述標記相異或者相同。
8.根據權利要求I所述的在實時多重PCR排除錯誤信號的試樣內至少三種的靶核酸序列的實時多重檢測方法，其特征在于，上述標記引物包含單一標記或者相互作用性雙重標記。
9.根據權利要求8所述的在實時多重PCR排除錯誤信號的試樣內至少三種的靶核酸序列的實時多重檢測方法，其特征在于，上述標記位于與上述靶核酸序列互補的上述引物的序列。
10.根據權利要求8所述的在實時多重PCR排除錯誤信號的試樣內至少三種的靶核酸序列的實時多重檢測方法，其特征在于，上述標記為化學標記、酶標記、放射性標記、熒光標記、發(fā)光標記、化學發(fā)光標記或金屬標記。
11.根據權利要求8所述的在實時多重PCR排除錯誤信號的試樣內至少三種的靶核酸序列的實時多重檢測方法，其特征在于，上述相互作用性雙重標記包含熒光報道分子及猝 滅分子。
12.根據權利要求I所述的在實時多重PCR排除錯誤信號的試樣內至少三種的靶核酸序列的實時多重檢測方法，其特征在于，用于上述第一次多重PCR或第二次套式實時多重PCR的上述至少三種的一對引物中，至少一個引物具有以下通式I的雙重引發(fā)寡核苷酸(DOP)結構 5，-Xp-Yq-ZrJ (I) 上述通式中，Xp為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的5’ -第一次引發(fā)部位；Yq為包含三個以上的通用堿基的分離部位；&為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的3，-第二次引發(fā)部位；P、q以及r表示核苷酸的數量，X、Y以及Z為脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’ -第一次引發(fā)部位的Tm高于3’ -第二次引發(fā)部位的Tm，上述分離部位在上述三個區(qū)域中具有最低的Tm;上述分離部位在針對靶核酸的退火方面，使上述5’ -第一次引發(fā)部位從上述3’ -第二次引發(fā)部位分離，由此上述寡核苷酸的上述退火特異性借助上述5’ -第一次引發(fā)部位以及上述3’ -第二次引發(fā)部位來雙重性地決定，其結果，使上述靶雜交及檢測引物的整體雜交特異性得到提高。
13.根據權利要求I所述的在實時多重PCR排除錯誤信號的試樣內至少三種的靶核酸序列的實時多重檢測方法，其特征在于，步驟(b)的上述模板-依賴性核酸聚合酶為不具有5’ 一 3’核苷酸活性的核酸聚合酶、具有5’ 一 3’核苷酸活性的核酸聚合酶、具有3’ 一 5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶或者均具有5’ 一 3’核苷酸活性和3’ 一 5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶。
14.一種排除假陽性信號的試樣內至少三種的靶核酸序列的實時多重PCR檢測試劑盒，其特征在于， 包括 (a)為了從試樣中獲取上述靶核酸序列的擴增子，利用于上述至少三種的靶核酸序列的第一次多重PCR的至少三種的一對引物；以及 (b)用于上述擴增子的第二次套式實時多重PCR的至少三種的一對引物，上述至少三種的各個一對引物中，至少一個引物為與相關擴增子的內部序列雜交的套式引物，在上述第二次套式實時多重PCR期間，上述至少三種的各個一對引物包含具有產生用于表示靶核酸序列的存在的信號的標記的至少一個套式引物，上述第二次套式實時多重PCR能夠以產生用于表示靶核酸序列的信號，而不產生錯誤信號的循環(huán)數來實施。
15.根據權利要求14所述的排除假陽性信號的試樣內至少三種的靶核酸序列的實時多重PCR檢測試劑盒，其特征在于，上述試劑盒還包含模板-依賴性核酸聚合酶。
16.根據權利要求14所述的排除假陽性信號的試樣內至少三種的靶核酸序列的實時多重PCR檢測試劑盒，其特征在于，上述第二次套式實時多重PCR通過最大30循環(huán)來實施。
17.根據權利要求14所述的排除假陽性信號的試樣內至少三種的靶核酸序列的實時多重PCR檢測試劑盒，其特征在于，上述第二次套式實時多重PCR通過最大25循環(huán)來實施。
18.根據權利要求14所述的排除假陽性信號的試樣內至少三種的靶核酸序列的實時多重PCR檢測試劑盒，其特征在于，上述第二次套式實時多重PCR通過最大20循環(huán)來實施。
19.根據權利要求14所述的排除假陽性信號的試樣內至少三種的靶核酸序列的實時多重PCR檢測試劑盒，其特征在于，用于上述第二次套式實時多重PCR的上述引物具有上述標記的情況下，上述引物為與相關擴增子的內部序列雜交的套式引物。
20.根據權利要求14所述的排除假陽性信號的試樣內至少三種的靶核酸序列的實時多重PCR檢測試劑盒，其特征在于，上述至少三種的一對引物的上述標記相異或者相同。
21.根據權利要求20所述的排除假陽性信號的試樣內至少三種的靶核酸序列的實時多重PCR檢測試劑盒，其特征在于，上述至少三種的各個一對引物的上述標記相異或者相同。
22.根據權利要求14所述的排除假陽性信號的試樣內至少三種的靶核酸序列的實時多重PCR檢測試劑盒，其特征在于，上述標記引物為單一標記或者相互作用性雙重標記。
23.根據權利要求22所述的排除假陽性信號的試樣內至少三種的靶核酸序列的實時多重PCR檢測試劑盒，其特征在于，上述標記位于與上述靶核酸序列互補的上述引物的序列。
24.根據權利要求22所述的排除假陽性信號的試樣內至少三種的靶核酸序列的實時多重PCR檢測試劑盒，其特征在于，上述標記為化學標記、酶標記、放射性標記、熒光標記、發(fā)光標記、化學發(fā)光標記或金屬標記。
25.根據權利要求22所述的排除假陽性信號的試樣內至少三種的靶核酸序列的實時多重PCR檢測試劑盒，其特征在于，上述相互作用性雙重標記包含光報道分子及猝滅分子。
26.根據權利要求14所述的排除假陽性信號的試樣內至少三種的靶核酸序列的實時多重PCR檢測試劑盒，其特征在于，用于上述第一次多重PCR或第二次套式實時多重PCR的上述至少三種的一對引物中，至少一個引物具有以下通式I的雙重引發(fā)寡核苷酸(DPO)結構 5，-Xp-Yq-ZrJ (I) 上述通式中，Xp為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的5’ -第一次引發(fā)部位；Yq為包含三個以上的通用堿基的分離部位；&為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的3，-第二次引發(fā)部位；P、q以及r表示核苷酸的數量，X、Y以及Z為脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’ -第一次引發(fā)部位的Tm高于3’ -第二次引發(fā)部位的Tm，上述分離部位在上述三個區(qū)域中具有最低的Tm;上述分離部位在針對靶核酸的退火方面，使上述5’ -第一次引發(fā)部位從上述3’ -第二次引發(fā)部位分離，由此上述寡核苷酸的上述退火特異性借助上述5’ -第一次引發(fā)部位以及上述3’ -第二次引發(fā)部位來雙重性地決定，其結果，使上述靶雜交及檢測引物的整體雜交特異性得到提高。
27.根據權利要求15所述的排除假陽性信號的試樣內至少三種的靶核酸序列的實時多重PCR檢測 試劑盒，其特征在于，上述模板-依賴性核酸聚合酶為不具有5’ 一 3’核苷酸活性的核酸聚合酶、具有5’ 一 3’核苷酸活性的核酸聚合酶、具有3’ 一 5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶或者均具有5’ 一 3’核苷酸活性和3’ 一 5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種排除錯誤信號的靶核酸序列的實時多路檢測。與以往實時多重PCR方法不同地，本發(fā)明在互不相同的反應容器包含兩個不同的擴增反應。即為用于獲取擴增子的第一次多重PCR及利用上述擴增子的第二次套式實時多重PCR。本發(fā)明用于排除由于形成標記引物的二聚物而產生的假陽性信號、基于非特異性雜交的假陽性信號以及假陰性信號。
文檔編號C12N15/11GK102762745SQ201080064355
公開日2012年10月31日 申請日期2010年3月15日 優(yōu)先權日2009年12月24日
發(fā)明者千鐘潤 申請人:Seegene株式會社