專利名稱：促進β細胞復制的化合物及其使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及促進β細胞復制和/或生長的組合物與方法。
背景技術：
存在以下兩種形式的糖尿病(I)胰島素依賴型糖尿病或I型糖尿病(又名，幼年型糖尿病、脆弱性糖尿病，胰島素依賴性糖尿病(IDDM))以及(2)非胰島素依賴型糖尿病或2型糖尿病(又名NIDDM)。I型糖尿病最經(jīng)常在青少年身上發(fā)病，但可在成年人中出現(xiàn)。2型糖尿病最經(jīng)常在中年或老年人身上發(fā)病，但也可在年輕人中出現(xiàn)。糖尿病是一種由多種誘發(fā)因素引發(fā)的疾病，其特征在于禁食狀態(tài)下或口服葡萄糖耐量試驗期間服用葡萄糖后血漿葡萄糖水平上升(高血糖癥)。在I型和2型糖尿病中都發(fā)生β細胞團塊(β-cell mass)的減少。I型糖尿病是一種自身免疫疾病狀況，其特征在于由完全沒有胰島素(S卩，胰腺β細胞功能和團塊的喪失)而引起的高血糖水平。當人的免疫系統(tǒng)對在胰腺中的產(chǎn)胰島素β細胞進行攻擊并將其破壞時，發(fā)生I型糖尿病。目前普遍相信，細胞因子的白細胞介素12(IL-12)家族以及信號轉導與轉錄活化因子家族中的成員、如STAT-4 (被認為是參與免疫應答的T-細胞分化調(diào)節(jié)劑)的下游活化，在導致自身免疫性的β細胞毀壞過程中起主要作用。胰腺隨后幾乎或完全不產(chǎn)生胰島素。所經(jīng)歷的最常見的I型糖尿病癥狀中包括過度口渴(煩渴)、頻繁排尿(尿頻)、極度饑餓(多食)、極度疲勞以及體重下降。這些癥狀是由高血糖癥以及身體脂肪分解造成的。被診斷患有I型糖尿病的人通常表現(xiàn)出高于300mg的血糖水平，并且在尿中出現(xiàn)酮。β細胞團塊的恢復與胰島素生產(chǎn)可以完全逆轉糖尿病的狀態(tài)。有證據(jù)表明，患有長期I型糖尿病的人持續(xù)有β細胞生成，但是被持續(xù)的自身免疫毀壞作用令人不希望地加以破壞。因此，使β細胞的復制得以增加的組合物與方法可以提供使正常的β細胞團塊水平得以恢復、并逆轉或治愈I型糖尿病的有效途徑。LADA是I型糖尿病最新認識到的一種亞型，被認為占到所有糖尿病病例的高達10%-20%。LADA也被稱作I. 5型糖尿病。LADA經(jīng)常在起初被診斷患有2型糖尿病的人之中出現(xiàn)。盡管它具有類似于成年人I型糖尿病發(fā)病的特征，但β細胞的毀壞在其進程中被認為沒有那么嚴重。2型糖尿病是由胰島素抵抗與胰島素分泌受損結合產(chǎn)生的，但是患有2型糖尿病的很多人最終都顯示出胰腺β細胞團塊與功能的明顯減少，轉而使得患有2型糖尿病的人胰島素“相對”不足，這是因為胰腺β細胞仍然產(chǎn)生部分胰島素，但是這些胰島素或者太少，或者不能合適地工作以便使葡萄糖充分進入細胞中產(chǎn)生能量。最近的尸檢研究中獲得明顯的證據(jù),顯示了在患有2型糖尿病的人體內(nèi)身體中持續(xù)的β細胞死亡(細胞凋亡)。所以，提供更多β細胞的治療途徑可以為逆轉或治愈2型糖尿病提供明顯的治療作用。不加以控制的2型糖尿病引起血液中的葡萄糖過量，導致高血糖癥?；加?型糖尿病的人會感覺到疲勞、口渴加重、尿頻、皮膚干燥發(fā)癢、視力模糊、傷口愈合慢、多于正常水平的感染以及足部的麻木刺痛感。如不進行治療，患有2型糖尿病的人會脫水，且血液總量會發(fā)展到危險的低位。如果2型糖尿病的病人在很長時間內(nèi)不加以控制，會產(chǎn)生更多嚴重的癥狀，包括重度高血糖(血糖超過600mg)、昏睡、混亂、顫抖、以及最終的“高滲透壓高血糖非酮性昏迷”。持續(xù)或不加以控制的高血糖癥還與嬰兒發(fā)病率與死亡率(prematuremorbidity and mortality)的增長相關。因此,對葡萄糖動態(tài)平衡、脂質代謝作用、肥胖和高血壓的治療控制在臨床管理和糖尿病治療方面是非常重要的。治療糖尿病的目標是通過改善高血糖狀態(tài)來避免出現(xiàn)上述所提及的慢性并發(fā)癥 (緩慢疾病進程)的出現(xiàn)，或是使其得以逆轉/治愈。治療糖尿病的傳統(tǒng)方法包括對于I型糖尿病的情況，給予流食與胰島素；對于2型糖尿病的情況，給予各種降血糖藥。諸如胰島素制劑、胰島素促分泌劑、胰島素增敏劑和α -葡萄糖苷酶抑制劑等降血糖藥被廣泛地用作臨床治療的方法。其實例包括阿卡波糖(Precose J)、glimeprimide (AmarylJ)、二甲雙胍(Glucophage V)、那格列奈(Starlix V)、卩比格列酮(ActosV)、瑞格列奈(PrandinJ)、羅格列酮(AvandiaV)、磺酰脲類、奧利司他(XenicalV)和艾塞那肽(Byetta)等。然而,很多已知的降血糖藥都表現(xiàn)出了不合人意的副作用，并且在某些情況下是有毒的。舉例而言，對于糖尿病患者患有嚴重的胰腺胰島素分泌降低的情況，胰島素促分泌劑與胰島素增敏劑的有效性降低。類似地，對于糖尿病患者的胰島素抵抗明顯很高時，胰島素制劑與胰島素促分泌劑的有效性降低。原則上，可以采用對含有分泌或產(chǎn)生胰島素的細胞組織(即胰島)進行成功移植來治療糖尿病。對產(chǎn)胰島素細胞進行移植的方法已經(jīng)被嘗試作為一種用于逆轉或治愈I型糖尿病的方法，但是存在與外科手術有關和與有毒的免疫抑制型藥物(需要服用該藥物來預防或減輕異體移植排異以及自身免疫的復發(fā))有關的顯著風險。此外，如今在美國有超過一百萬名患有I型糖尿病的人，但是由尸體的胰腺組織供應胰島卻是有限的。例如，每年僅能獲得6000個器官，需要2個或3個器官才能提供足夠的胰島來逆轉一個人的I型糖尿病。所以，急迫地需要提供具有功能(胰島素生成)的β細胞的新來源。對于可誘導β細胞增殖的化合物的高通量篩選分析，本領域中只記載了一個實例。這一篩選方法利用了生長阻滯、可逆性永生化的小鼠β細胞。這一方法的主要缺點是經(jīng)過這種篩選方法鑒定出的化合物對原代β細胞可能不具有相同的效果，也就是說，所鑒定出的化合物只是專門用于在生長阻滯、可逆性永生化的小鼠β細胞中誘導增殖。所以，需要對可誘導原代β細胞(例如，沒有發(fā)生轉化的β細胞)增殖的化合物進行篩選的方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一方面提供了使胰腺細胞群中的β細胞復制增加的方法，所述方法包括用腺苷激酶(ADK)的抑制劑、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的抑制劑或AMP活化蛋白激酶(AMPK)的活化劑與胰腺細胞群進行接觸。本發(fā)明另一方面提供了對用于增加β細胞復制的候選化合物進行篩選的方法，所述方法包括如下步驟Ca)將測試化合物與胰腺細胞群進行接觸；(b)選擇如下化合物(i)使培養(yǎng)物中的細胞總數(shù)增加；(ii)相比于未處理的對照，使培養(yǎng)物中表達至少一種β細胞標記的細胞總數(shù)增加；(iii)相比于未經(jīng)處理的對照，使表達至少一種β細胞標記的細胞相對于培養(yǎng)物中細胞總數(shù)的比例增加；(iv)相比于未經(jīng)處理的對照，使表達至少一種細胞復制標記的細胞數(shù)增加；或者(V)相比于未經(jīng)處理的對照，使表達至少一種細胞復制標記的細胞比例增加；并且其中，胰腺細胞是原代胰腺細胞。
圖I描述了示出由AlO和B8引起的、PH3相對于TOXl增加的百分比的柱狀圖。
圖2a和圖2b描述了示出化合物AlO (5-IT)的濃度對β細胞增殖(圖2a)和小鼠皮膚成纖維細胞增殖(圖2b)的影響的曲線圖。對β細胞的EC50經(jīng)測定為O. 47 μ M0圖3描述了示出化合物Β8的濃度對β細胞增殖的影響的曲線圖(EC50=9. ΙμΜ)。圖4描述了示出在處理4天后，化合物AlO和Β8對Ki-67的誘導倍數(shù)的折線圖。在第O天加入化合物，并在第2天更換介質。圖5描述了示出介質的血清濃度對Ki-67誘導作用(由ΙμΜ AlO在β細胞中引起)的影響的柱狀圖。圖6描述了示出葡萄糖對β細胞中的Ki-67誘導作用和Η)Χ+表達(由AlO引起)沒有影響的曲線圖。圖7描述了示出腺苷不以濃度依賴的方式引起對大鼠胰島中rox+和Ki-67誘導作用的曲線圖。圖8a和圖8b描述了示出腺苷受體拮抗劑對AlO誘導的Ki-67增加作用的影響的柱狀圖。圖8a :以2 μ M、I μ M、O. 2 μ M、O. 04 μ M或O. O μ M (無拮抗劑)濃度的拮抗劑進行試驗。圖8b :以O. 2 μ M濃度的拮抗劑進行試驗。圖9描述了示出腺苷激酶抑制劑AlO和腺苷單磷酸活化激酶活化劑AICAR對β細胞復制的影響的柱狀圖。圖10描述了示出AMPK-抑制作用對AlO誘導的β細胞復制的影響的柱狀圖。圖Ila和圖Ilb描述了某些示例性腺苷激酶抑制劑的結構，分別為基于核苷的腺苷激酶抑制劑(圖Ila)和基于非核苷的腺苷激酶抑制劑(圖lib)。圖12為示出體內(nèi)β細胞復制的增加作用的柱狀圖。圖13a-圖13d顯示出腺苷激酶抑制劑(ADK-Is)誘導了大鼠、小鼠和豬的β細胞的增殖。圖13a顯示出促進β細胞復制的某些示例性ADK-Is的化學結構與名稱。圖13b顯示出劑量反應曲線，示出了在對ABT-702處理的應答中，鼠β細胞增殖(上圖)和豬β細胞增殖(下圖)之間的關系。圖13c顯示出大鼠胰島培養(yǎng)物的劑量反應曲線，所述曲線示出了用化合物5-IT (左圖，EC50=4. 7μΜ)和ABT-702 (右圖，EC50=7. O μ Μ)進行處理與β細胞增殖之間的關系。圖13d顯示出用DMSO或5-ΙΤ (2μΜ)處理96h和144h后對β細胞數(shù)的定量。誤差棒表示標準差，相對于用輔料進行處理的情況*Ρ〈0. 01。圖14a和圖14b顯示出β細胞表達出核腺苷激酶(ADK)，其作為增殖作用的細胞自主負性調(diào)節(jié)劑。圖14a為示出siRNA介導的ADK下調(diào)作用(knockdown)的Western印跡，該下調(diào)作用使用來自經(jīng)穩(wěn)定轉導的細胞的H4IIE (大鼠肝細胞系)裂解物進行評價，所述轉導使用陰性對照siRNA (I道和3道)或ADK導向的siRNA (2道和4道)。用Y -微管蛋白將負載標準化。圖14b為示出在感染含有對照siRNA序列(左圖)或ADK導向的siRNA序列(右圖)的病毒后，對β細胞復制進行定量的柱狀圖。在病毒編碼的GFP表達的基礎上，分別對同一孔中的未感染細胞和感染細胞的復制速率進行分析。誤差棒表示SEM (η=8個獨立的孔);*Ρ〈0. 01。圖15a和圖15b顯示出由ADK-Is誘導的β細胞復制對葡萄糖和胰高血糖素樣肽-I受體(GLP-IR)激動劑的加合作用。圖15a為示出在多種葡萄糖濃度加上DMSO或5-ΙΤ(211|0存在的情況下，對培養(yǎng)2411、4811或9611后的β細胞復制速率進行定量的柱狀圖。將各時間點的值歸一化至5mM葡萄糖加上DMSO處理條件。各處理條件的標準差小于10%，誤差棒未示出。在相同葡萄糖濃度和時間點下，當將經(jīng)5-IT處理的孔與經(jīng)DMSO處理的孔相比時，*P < O. 01 ;當將經(jīng)DMSO或5-IT處理的孔與在相同時間點并采用相同處理(DMS0或5-IT)的5mM葡萄糖處理條件相比時，林P < 0.01。圖15b為示出在用DMS0、5_IT、GLP-1、 Ex4、5-IT加上GLP-I或5-IT加上Ex4處理24h后，對β細胞復制速率進行定量的柱狀圖。5-ΙΤ的濃度為2 μ M。GLP-I和Εχ_4的濃度為20ηΜ (左側柱)和4ηΜ (右側柱)。將各值歸一化至DMSO處理條件。誤差棒表示標準差；對于所指示出的比較，*Ρ < O. 01且林P < O. 03。圖16a-圖16e顯示了 ADK-Is在體外和體內(nèi)選擇性地促進β細胞的復制。圖16a顯示出描述在用DMS0、5-IT (2μΜ)或ABT-702 (15μΜ)處理后，對δ細胞(生長抑素+，左圖)、α細胞(胰高血糖素+，中間圖)和成纖維細胞(波形蛋白+，右圖)的體外復制速率進行定量的柱狀圖。相比于DMSO處理條件，*Ρ <0.01和#P <0.05。圖16b是顯示出對在EGF (40ng/mL)和HGF (20ng/mL)加上DMSO或ABT-702 (15 μ M)存在的情況下生長的經(jīng)分離鼠肝細胞的復制速率進行定量的柱狀圖。圖16c是顯示出在用BRDU以及輔料或ΑΒΤ-702處理24h后，對小鼠胰島β細胞的體內(nèi)復制速率進行定量的柱狀圖。圖16d是顯示出在用BRDU以及輔料或ABT-702處理24h后，對小鼠外分泌細胞的體內(nèi)復制速率進行定量的柱狀圖。圖16e是顯示出在用BRDU以及輔料或ABT-702處理24h后，對小鼠肝細胞的體內(nèi)復制速率進行定量的柱狀圖。誤差棒表示標準差，使用雙尾t檢驗得到P值。圖17a和17b是顯示出ADK-Is使得β細胞復制得以增加的柱狀圖。圖17a顯示出在用DMSO或5-ΙΤ (2μΜ)處理后，對β細胞復制進行的定量。通過I3DX-I的存在和胰島素染色對β細胞進行鑒定。*Ρ<0.001。圖1713顯示出在用01^0、7-碘-2，3-二脫氧-7-脫氮腺苷(20 μ Μ、10 μ Μ)或芒霉素(6 μ Μ、1 μ Μ)處理后，對β細胞復制進行的定量。誤差棒表不標準差。圖18a是顯示出利用PDX-1和磷酸化組蛋白_H3共表達對β細胞復制進行定量的柱狀圖。用DMS0、5-IT (2μΜ)或ABT-702 (15 μ Μ)對培養(yǎng)物進行處理。相比于DMSO處理條件，*Ρ < O. 001。圖18b是顯示出在DMS0、5-IT (2 μ Μ)或ABT-702 (15 μ Μ)存在的情況下利用兩天BRDU脈沖，隨后繼續(xù)進行兩天而無化合物處理，對β細胞復制進行定量的柱狀圖。以化合物處理的孔中BRDU+和Η)Χ-Γ細胞相比于DMSO處理的孔所增加的倍數(shù)示出數(shù)據(jù)。相比于 DMSO，*P < O. 002。
圖19是顯示出在注射對照siRNA或ADK導向的siRNA后，對ADK陽性胰島細胞百分比進行自動定量的柱狀圖。誤差棒表示標準差；*P < O. 001。圖20是顯示出用ABT-702對小鼠進行體內(nèi)處理使β細胞復制得以增加、而不使外分泌細胞的復制增加的柱狀圖。使用胰島素免疫染色來鑒定β細胞、并使用BRDU免疫染色來鑒定復制細胞(左圖)，從而對體內(nèi)的β細胞復制速率進行定量。同時，使用相同的組織切片對胰島外的外分泌細胞的復制速率進行定量(右圖)。圖21描述了用于鑒定促進β細胞復制的化合物的篩選方案的示意草圖。圖22描述了示出SAHH抑制劑阿糖腺苷對β細胞增殖的影響的柱狀圖。圖23是對ADK途徑進行總覽的示意圖。
具體實施方式
本發(fā)明一方面提供了使胰腺細胞群中的β細胞復制得以增加的方法，所述方法包括用腺苷激酶(ADK)的抑制劑、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的抑制劑或AMP活化蛋白激酶(AMPK)的活化劑與胰腺細胞群或制備品進行接觸。本文所使用的“使β細胞復制得以增加”意味著β細胞以更快的速率和/或更高的頻率進行復制。在本發(fā)明的這一方面或其它方面的一些實施方式中，相對于未經(jīng)處理的對照，β 細胞復制增加了至少 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1 倍、I. I 倍、I. 5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍以上。可通過測定與本文所述的化合物接觸時發(fā)生復制的β細胞數(shù)目(相對于β細胞不與化合物接觸的對照)，從而確定β細胞復制的增加百分比或增加倍數(shù)。復制的增加也可基于發(fā)生復制的細胞同分別處理的細胞和未經(jīng)處理的對照中的細胞總數(shù)的比值。在一些實施方式中，經(jīng)處理和未經(jīng)處理的對照中的細胞總數(shù)被用來確定復制頻率。在某些實施方式中，“使β細胞復制得以增加”也包括由于β細胞祖細胞分化成β細胞而引起的β細胞數(shù)的增加。在可選的實施方式中，“使β細胞復制得以增加”不包括由于β細胞祖細胞分化成β細胞而引起的β細胞數(shù)的增加。本文所使用的術語“ β細胞”包括原代胰腺β細胞；由去分化細胞衍生而來的胰腺β樣細胞，所述去分化細胞例如誘導的多能干細胞(iPSCs);或者直接由內(nèi)胚層起源的細胞(例如，肝細胞或外分泌的胰腺細胞)重編程而來的胰腺β樣細胞。在一個實施方式中，β細胞不是永生化細胞系(例如在培養(yǎng)物中無限增殖)。在一個實施方式中，β細胞不是經(jīng)轉化的細胞、例如顯示出轉化特性(如在軟瓊脂上生長或不存在接觸抑制)的細胞。本文所使用的術語“胰腺β樣細胞”是指如下細胞表達出內(nèi)源性胰腺β細胞所表達的胰島素量的至少15%、或至少約20%、或至少約30%、或至少約40%、或至少約50%、或至少約60%、或至少約70%、或至少約80%、或至少約90%、或至少約100%或者高于100%、例如是內(nèi)源性胰腺β細胞所分泌胰島素的量的至少約I. 5倍、或至少約2倍、或至少約2. 5倍、或至少約3倍、或至少約4倍、或至少約5倍、或者高于約5倍。在一個實施方式中，胰腺β樣細胞表現(xiàn)出內(nèi)源性胰腺β細胞的至少一種或至少兩種特性，例如但不限于作為對葡萄糖的響應而分泌出胰島素，和表達β細胞標記物(例如c-肽、Pdx-I和glut-2)。本文中胰腺β樣細胞有時是指“重編程β細胞”，本文中該術語可與術語“胰腺β樣細胞”互換使用。在一個實施方式中，胰腺β樣細胞不是永生細胞(例如在培養(yǎng)物中無限增殖)。在一個實施方式中，胰腺β樣細胞不是經(jīng)轉化的細胞、例如顯示出轉化特性(如在軟瓊脂上生長或不存在接觸抑制)的細胞。本文所使用的術語“去分化細胞(de-differentiated cell)”指的是由已分化細胞重編程的細胞。本文所使用的術語“經(jīng)重編程”或“重編程”是指改變或逆轉體細胞分化狀態(tài)的方法。在重編程前，細胞可部分分化或終末分化。重編程涵蓋了將體細胞分化狀態(tài)完全逆轉為多能細胞。分化作用的這種完全逆轉產(chǎn)生了經(jīng)誘導的多能(iPS)細胞。重編程還涵蓋了分化狀態(tài)的部分逆轉，例如逆轉至多功能狀態(tài)(multipotent state)或逆轉至既非多能也非多功能的體細胞(喪失了其所來源的已分化細胞的一種或多種特征的細胞)，例如由已分化細胞直接重編程至不同的體細胞類型。重編程通常包括改變(例如逆轉)至少一些可遺傳類型的核酸修飾(例如甲基化)、染色質凝聚、表觀遺傳變化、基因組印記等，上述作用發(fā)生在作為受精卵發(fā)育為成體的細胞分化期間。本文所述的方法可應用于由重編程(去分化)細胞衍生而來的胰腺β樣細胞。例如，通過使用本領域技術人員已知的因子和條件分化成胰腺β樣細胞的iPS細胞得到。也可通過對內(nèi)胚層體細胞/外分泌體細胞直接進行重編程而無需逆轉至多能干細胞狀態(tài)(例 如，iPS細胞)來衍生得到胰腺β樣細胞，例如在Zhou等，Nature，第455卷，2008年10月2日，第627-633頁中所述，以引用的方式將其整體并入本文。本文所使用的術語“iPS細胞”和“誘導的多能干細胞”可以互換使用，是指由非多能細胞(通常為成年體細胞)人工衍生(即，去分化、重編程)得到的多能干細胞，例如通過誘導一個或多個基因的強制表達。本文所使用的術語“內(nèi)源性胰腺β細胞”或者“原代胰腺β細胞”是指哺乳動物胰腺的產(chǎn)胰島素細胞或者哺乳動物的胰腺β細胞表型的細胞。胰腺β細胞表型是本領域普通技術人員所公知的，包括例如作為對葡萄糖水平增高的響應而分泌胰島素、表達出標記物(如C-肽、PDX-I多肽和Glut2)、以及顯著的形態(tài)特征(如排布在體內(nèi)胰腺的胰島中、通常具有直徑約9-15 μ m的小的紡錘樣細胞)。可在胰島中發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性胰腺β細胞。在本發(fā)明的方法中，作為胰島的一部分，原代胰腺β細胞可在體外被接觸。本文所使用的術語“產(chǎn)胰島素細胞”包括本文所述的術語原代β細胞以及本文所述的術語胰腺β樣細胞，所述“產(chǎn)胰島素細胞”以組成型或可誘導型方式來合成(即，轉錄胰島素基因、翻譯胰島素原mRNA、將胰島素原mRNA修飾為胰島素蛋白)、表達(即,表明由胰島素基因攜帶的表型性狀)或分泌(將胰島素釋放至胞外空間)胰島素。本文所使用的術語“內(nèi)胚層起源的細胞”是指包含由內(nèi)胚層細胞發(fā)育而來的任何細胞在內(nèi)的內(nèi)胚層起源的細胞，是來自處于極早期胚胎中的三個原胚層之一的細胞，分化形成胚胎內(nèi)臟、然后再形成呼吸道和消化道的內(nèi)層以及肝臟和胰臟。對不同模型的生物體和人進行的研究提示出，在進化上保守的誘導信號和轉錄因子網(wǎng)絡誘發(fā)了肝細胞和胰腺細胞的分化，并且對如何促進來自不同干細胞類型和祖細胞類型的肝細胞和β細胞分化提供了指導。在本發(fā)明的這一方面和其它方面的一些實施方式中，相對于未經(jīng)抑制的對照，腺苷激酶的活性被抑制或被降低至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或100% (即，完全喪失活性)。不希望受理論的束縛，可通過使用本領域已知的測定該類磷酸化反應的方法來測定腺苷的磷酸化，從而測定腺苷激酶的活性。在本發(fā)明的這一方面和其它方面的一些實施方式中，腺苷激酶抑制劑的IC50小于或等于500nM、小于或等于250nM、小于或等于ΙΟΟηΜ、小于或等于50nM、小于或等于ΙΟηΜ、小于或等于InM、小于或等于O. InM、小于或等于O. OlnM或者小于或等于O. OOlnM。在本發(fā)明的這一方面和其它方面的一些實施方式中，相對于未經(jīng)活化的對照，AMP活化激酶的活性增加至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少I倍、至少I. I倍、至少I. 5倍、至少2倍、 至少3倍、至少4倍、至少5倍以上。在本發(fā)明的這一方面和其它方面的一些實施方式中，AMP活化激酶的活化劑的EC50小于或等于500nM、小于或等于250nM、小于或等于ΙΟΟηΜ、小于或等于50nM、小于或等于ΙΟηΜ、小于或等于InM、小于或等于0. InM、小于或等于0. OlnM或者小于或等于0. OOlnM。在本發(fā)明的這一方面和其它方面的一些實施方式中，相對于未經(jīng)抑制的對照，SAHH的活性被抑制或被降低至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或者100% (即，完全喪失活性)?？墒褂美缦率鑫墨I中描述的方法測定SAHH的活性美國專利申請?zhí)?0/836,953和11/389，393，以引用的方式將二者的內(nèi)容并入本文。在本發(fā)明的這一方面和其它方面的一些實施方式中，SAHH抑制劑的IC50小于或等于500nM、小于或等于250nM、小于或等于ΙΟΟηΜ、小于或等于50ηΜ、小于或等于ΙΟηΜ、小于或等于InM、小于或等于0. InM、小于或等于0. OlnM或者小于或等于0. OOlnM。將認識到的是，本文所述的許多化合物可對細胞施加多重影響。例如，SAHH類似物和殺結核菌素在甲基化途徑中的多個點發(fā)揮作用。因此，將化合物和分子分入某些組(例如ADK抑制劑或SAHH抑制劑)并非意在進行精確的、不重疊的科學分組。對這類信息進行闡明以協(xié)助本領域技術人員理解發(fā)明人所考慮的某些科學數(shù)據(jù)。例如，本文所述的許多ADK抑制劑也可作為SAHH抑制劑適合于本發(fā)明。在本發(fā)明的這一方面和其它方面的一些實施方式中，腺苷激酶抑制劑為式(I)及其藥學上可接受的鹽和酰胺
權利要求
1.一種使胰腺細胞群中的3細胞復制得以增加的方法，所述方法包括用腺苷激酶(ADK)的抑制劑、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的抑制劑或AMP活化蛋白激酶(AMPK)的活化劑與胰腺細胞群進行接觸。
2.權利要求I中所述的方法，其中，所述腺苷激酶抑制劑為式(I)及其藥學上可以接受的鹽和酰胺
3.權利要求I中所述的方法，其中，所述腺苷激酶抑制劑為式(II)及其藥學上可以接受的鹽和酰胺
4.權利要求1-3中任一項所述的方法，其中，所述ADK抑制劑的IC50為小于或等于500nM、250nM、200nM、100nM、75nM、50nM、25nM、10nM、lnM、0. lnM、0. 01nM、0. OOlnM0
5.權利要求1-4中任一項所述的方法，其中，相對于未被抑制的對照，所述ADK的活性被抑制或降低至少 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98% 或 100% (例如完全喪失活性)。
6.權利要求1-5中任一項所述的方法，其中，所述ADK抑制劑選自于由下列化合物所組成的組芒霉素、5'-脫氧腺苷、5'-氨基腺苷、5'-脫氧-5-碘代殺結核菌素、5-碘代殺結核菌素(A10)、7-脫氮-7-碘-2'，3' - ニ脫氧腺苷、去甲芒霉素、去甲殺結核菌素、A-134974、豐加霉素、GP-515 ( (2R, 3R, 4S, 5R) -2-(4-氨基-3-溴-IH-吡唑并[3，4_d]嘧啶-I-基) -5-(氨基甲基)—四氫呋喃 _3，4- ニ醇)、GP-3269( (2R, 3R, 4S, 5R) -2- (4- (4-氟苯基氨基)-5_苯基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)-四氫-5-甲基呋喃-3，4-ニ醇)、GP-683 ( (2R, 3S, 4R, 5R)-四氫_2_甲基-5-(5-苯基-4-(苯基氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)呋喃-3，4- ニ醇)、GP-947( (2S, 3S, 4R, 5R)-四氫-2-甲基-5-(5-苯基-4-(苯基氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)呋喃-3，4- ニ醇)、ABT-702(5-(3-溴苯基)-7-(6-嗎啉代吡啶-3-基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-胺，B8)、化合物I((2R, 3R, 4S, 5R) -2- (4-氨基-5-碘-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)-5-(氨基甲基)-四氫呋喃-3，4- ニ醇)、化合物 2 ( (2R, 3R, 4S, 5R) -2- (4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)-5-(氨基甲基)-四氫呋喃-3，4- ニ醇)、化合物3 ( (1S，2R, 3S, 5R) -3-氨基-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)環(huán)戊烷-1，2-ニ醇)、化合物4 ( (1S，2R，3S，5R)-3-氨基-5-(7-氨基-3H-[1，2，3]三唑并[4，5-d]嘧啶_3_基)環(huán)戊烷_1，2-ニ醇)、化合物5((IS, 2R, 3S, 4R) -4- (4-氨基-5-碘-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶 ~7~ 基)環(huán)戊烷-I, 2，3-三醇)、化合物6( 7- (4- (ニ甲基氨基)苯基)蝶啶-4-胺)、化合物7( 5- (3-溴苯基)~7~ (4~ (ニ甲基氨基)苯基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-胺)、化合物8(5-(2-溴芐基)-7-(6-嗎啉代吡啶-3-基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-胺)、化合物9(5-環(huán)己基-7-(6-嗎啉代吡啶_3_基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-胺)、化合物10 (5-(四氫-2H-吡喃-4-基)~7~ (6-嗎啉代吡啶-3-基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-胺)、化合物11(5-(I-(2-溴苯基)こ基)-7-(6-嗎啉代吡啶-3-基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-胺)、化合物12(5-(2-甲基戊-4-烯-2-基)-7-(6-嗎啉代吡啶-3-基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-4-胺)、化合物13 (N5-((1H-吲哚_3_基)甲基)-7-(6-嗎啉代吡啶-3-基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-4，5- ニ胺)、以及上述物質的組合。
7.權利要求I中所述的方法，其中，所述AMPK的活化劑為式(III)及其藥學上可接受的鹽和酰胺
8.權利要求I或7中所述的方法，其中，相對于未被活化的對照，所述AMP活化激酶的活性增加至少 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、I 倍、I. I 倍、I. 5 倍、2 倍、3 倍、4倍、5倍以上。
9.權利要求1、7和8中任一項所述的方法，其中，所述AMPK的活化劑的EC50小于或等于 500nM、250nM、100nM、50nM、10nM、lnM、0. lnM、0. OlnM 或 0. OOlnM0
10.權利要求I和7-9中任一項所述的方法，其中，所述AMPKI活化劑是5_氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷(AICAR)。
11.權利要求I中所述的方法，其中，所述SAHH的抑制劑的IC50小于或等于500nM、250nM、200nM、100nM、75nM、50nM、25nM、10nM、lnM、0. lnM、0. 01nM、0. OOlnM。
12.權利要求I或11中所述的方法，其中，相對于未被抑制的對照，所述SAHH的活性被抑制或降低至少 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98% 或 100% (例如完全喪失活性)。
13.權利要求1、11和12中任一項所述的方法，其中，所述SAHH的抑制劑選自于由下列化合物所組成的組9(S)-(2，3-ニ羥基丙基)腺嘌呤[(S)-DHPA] ;D_香菇嘌呤；(R，S)-3-腺嘌呤-9-基-2-羥基丙酸[(R，S)-AHPA];腺苷(Ado) 二醛；3-脫氮腺苷(c3-Ado);芒霉素(Ari);瓶菌素A (NPA或NpcA) ;ニ羥基環(huán)戊烯基腺嘌呤(DHCeA) ;ニ羥基環(huán)戊烯基-3_脫氮腺嘌呤(c3-DHCeA) ; ニ羥基環(huán)戊烷基腺嘌呤(DHCaA) ; ニ羥基環(huán)戊烷基-3-脫氮腺嘌呤(c3-DHCaA) ;3_脫氮瓶菌素A (c3_NpcA) ;3_脫氮芒霉素(c3Ari);碳環(huán)-3-脫氮腺苷(C-c3Ado);6' -C甲基瓶菌素A ;2'-脫氧腺苷；殺結核菌素；利巴韋林；pyraazofurin ；2'-脫氧-2'-氯腺苷；異戍烯基腺苷；甲硫基腺苷(MTA) ；9-^ -阿拉伯呋喃糖基腺嘌呤(Ara-A，阿糖腺苷);2'-脫氧腺苷；N_甲基芒霉素、8-氮雜芒霉素和3-脫氮芒霉素，以及它們的ニ醛和ニ醇衍生物；(±) -5-去甲芒霉素及其2，6- ニ氨基類似物；2'-脫氧芒霉素；3'-脫氧芒霉素；3'-氨基-3'-脫氧芒霉素；3'-氨基-3'-脫氧阿拉伯呋喃糖基-芒霉素；6'-羥基芒霉素；6'-巰基芒霉素；8'-溴芒霉素；8-羥基芒霉素、芒霉素-3'-環(huán)磷酸酷、芒霉素-6'-環(huán)磷酸酷；2-氟-S-腺苷同型半胱氨酸(2-FSAH) ；S-腺苷-L-同型半胱氨酸亞砜；S-腺苷-L-同型半胱氨酸砜；S_芒霉素-L-同型半胱氨酸；5' -S-(3-羰基-4-硝基苯基)硫代腺苷；5' -S-(甲基)-5' -S-(丁基)硫代腺苷；以及上述物質的任意組合。
14.權利要求1-13中任一項所述的方法，其中，所述胰腺細胞來自受試者，其中所述受試者需要額外的0細胞。
15.權利要求1-14中任一項所述的方法，其中，所述胰腺細胞來自受試者，其中所述受試者不需要額外的P細胞。
16.權利要求1-15中任一項所述的方法，其中，所述受試者是哺乳動物。
17.權利要求1-16中任一項所述的方法，其中，所述受試者是人類。
18.權利要求1-16中任一項所述的方法，其中，所述受試者是小鼠。
19.權利要求1-18中任一項所述的方法，其中，所述胰腺細胞是原代胰腺細胞。
20.權利要求1-19中任一項所述的方法，其中，所述胰腺細胞由去分化細胞衍生。
21.權利要求1-20中任一項所述的方法，其中，所述接觸在體外進行。
22.權利要求1-20中任一項所述的方法，其中，所述接觸離體進行。
23.權利要求1-20中任一項所述的方法，其中，所述接觸在體內(nèi)進行。
24.權利要求23所述的方法，其中，所述體內(nèi)接觸在哺乳動物體內(nèi)進行。
25.權利要求24中所述的方法，其中，所述體內(nèi)接觸在小鼠體內(nèi)進行。
26.權利要求24中所述的方法，其中，所述體內(nèi)接觸在人類體內(nèi)進行。
27.權利要求23中所述的方法，其中，所述體內(nèi)接觸在受試者內(nèi)進行，所述受試者需要額外的P細胞。
28.權利要求27中所述的方法，其中，所述受試者患有I型糖尿病。
29.權利要求27中所述的方法，其中，所述受試者患有2型糖尿病。
30.權利要求27中所述的方法，其中，所述受試者是哺乳動物。
31.權利要求27-30中任一項所述的方法，其中，所述受試者是人類。
32.權利要求1-31中任一項所述的方法，其中，相對于對照，^細胞復制增加至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1 倍、I. I 倍、I. 5 倍、2 倍、3 倍、4 倍、5 倍以上。
33.一種用于對增加胰腺細胞群中的P細胞復制的化合物進行篩選的高通量分析方法，所述分析方法包括如下步驟 (a)用測試化合物與胰腺細胞群或胰腺細胞制劑進行接觸，其中所述胰腺細胞是原代胰腺細胞； (b)對P細胞的復制或生長進行評價；以及(C)選擇使3細胞的復制或生長得以增加或增強的化合物。
34.權利要求33中所述的分析方法，其中，所述胰腺細胞在細胞培養(yǎng)容器中進行培養(yǎng)，所述容器的表面包被有來自大鼠膀胱癌細胞系804G的條件培養(yǎng)基。
35.權利要求33-34中任一項所述的分析方法，其中，對3細胞復制進行評價的步驟包括檢測3細胞標記和細胞復制標記。
36.權利要求35中所述的分析方法，其中，所述細胞復制標記是Ki-67或PH3。
37.權利要求35-36中任一項所述的分析方法，其中，所述P細胞標記選自于由下列標記所組成的組rox-l、胰島素、C-肽、胰淀素、E-鈣粘著蛋白、Hnf3P、PCI/3、Beta2、Nkx2. 2、Nkx6. I、GLUT2、PC2、ZnT_8、MAFA、MAFB、以及上述標記的任意組合。
38.權利要求35-37中任一項所述的分析方法，其中，所述P細胞標記為H)X-1。
39.權利要求35-38中任一項所述的分析方法，其中，所述P細胞標記不是胰島素。
40.權利要求33-39中任一項所述的分析方法，其中，所述測試化合物的濃度范圍是0.InM 到 IOOOnM0
41.權利要求33-40中任一項所述的分析方法，其中，所述分析方法在約15°C到約55°C的溫度范圍下進行。
42.權利要求33-41中任一項所述的分析方法，其中所述測試化合物與所述胰腺細胞接觸至少I個小時。
43.權利要求30-42中任一項所述的分析方法，其中，相對于未被處理的對照，所述測試化合物使P細胞的復制或生長增加至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、I. I倍、I. 5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍以上。
44.權利要求33-43中任一項所述的分析方法，其中，所述胰腺細胞不是胰腺細胞系。
45.權利要求33-44中任一項所述的分析方法，其中，所述胰腺細胞群是胰島或其片段。
46.權利要求33-45中任一項所述的分析方法，其中，所述胰腺細胞是原代胰腺@細胞。
47.權利要求33-46中任一項所述的分析方法，其中，在與所述測試化合物接觸前，將所述胰腺細胞附著到所述細胞培養(yǎng)容器表面約12-48小吋。
48.權利要求33-47中任一項所述的分析方法，其中，所述胰腺細胞由去分化細胞衍生。
49.權利要求33-48中任一項所述的分析方法，其中，所述去分化細胞是誘導的多能干細胞。
50.權利要求33-49中任一項所述的分析方法，其中，所述分析方法包括如下步驟 Ca)將胰島用胰蛋白酶消化成1-3個細胞的細胞集落； (b)使細胞過夜恢復； (c)將從步驟(b)得到的細胞向96孔板的孔中點板，其中將所述孔用804G條件培養(yǎng)基包被，細胞點板密度為60k個細胞/孔； Cd)將細胞附著至所述孔的表面48小時； Ce)使測試化合物與所述P細胞接觸24小時； Cf)用PDX-I抗體與Ki-67和/或PH3抗體對細胞進行染色；(g)對0細胞的復制進行評價；以及 (h)選擇使P細胞復制得以增加或增強的化合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種通過用腺苷激酶(ADK)的抑制劑、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)的抑制劑或AMP活化蛋白激酶(AMPK)的活化劑與β細胞進行接觸，從而使β細胞的復制或生長得以刺激或增加的方法。
文檔編號C12N5/02GK102803474SQ201080064348
公開日2012年11月28日 申請日期2010年12月17日 優(yōu)先權日2009年12月18日
發(fā)明者賈斯廷·P·安斯, 道格拉斯·A·梅爾頓, 李·L·魯賓, 戈登·韋爾 申請人:哈佛大學校長及研究員協(xié)會, 布里格姆及婦女醫(yī)院股份有限公司, 喬斯林糖尿病中心有限公司