專(zhuān)利名稱(chēng)：海藻細(xì)胞核基因組的同源組合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，更具體的，涉及外源DNA元素在海藻細(xì)胞中的表達(dá)。相關(guān)技術(shù)的描述對(duì)一個(gè)細(xì)胞的DNA操作可以賦予這個(gè)細(xì)胞新的功能。比如，一個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞(也就是一個(gè)吸收了外源DNA的細(xì)胞)可以比野生型細(xì)胞更加強(qiáng)壯。對(duì)很多所謂的生物系統(tǒng)模型(即一些已被充分研究的生物體)而言，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了用于轉(zhuǎn)化它們的DNA元素。對(duì)于其他尚未充分了解的生物體，轉(zhuǎn)化是一個(gè)重要事件，是推進(jìn)基因工程的必要前提。需要對(duì)這些生物體進(jìn)行有效的、非隨機(jī)轉(zhuǎn)化使得這項(xiàng)挑戰(zhàn)變得更為復(fù)雜。因此，需要對(duì)海藻細(xì)胞核基因組進(jìn)行同源重組的方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供并例舉了將脫氧核糖核酸(DNA)導(dǎo)入海藻細(xì)胞細(xì)胞核的方法?？梢灾苽溥@樣一個(gè)轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有與相應(yīng)第一細(xì)胞核DNA序列相似的第一 DNA序列，與相應(yīng)第二細(xì)胞核DNA序列相似的第二 DNA序列，和在該轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)中第一和第二 DNA序列之間插入的感興趣的DNA序列。可對(duì)位于相應(yīng)第一和第二細(xì)胞核DNA序列之間的目標(biāo)DNA序列進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從而以感興趣的DNA序列取代目標(biāo)DNA序列。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，感興趣的DNA序列可能包括抗生素抗性標(biāo)記，啟動(dòng)子序列和抗生素抗性標(biāo)記，或者代謝物營(yíng)養(yǎng)同化或者生物合成基因。該海藻細(xì)胞的表型特征可能被改變或者獲得新的特征。本發(fā)明提供并例舉了一種轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)，該轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)具有與相應(yīng)第一海藻細(xì)胞核DNA序列相似的第一 DNA序列，與相應(yīng)第二海藻細(xì)胞核DNA序列相似的第二 DNA序列，和在該轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)中第一和第二 DNA序列之間插入的感興趣的DNA序列。根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施例，感興趣DNA序列可以包含削弱或者破壞代謝物營(yíng)養(yǎng)同化或生物合成基因的野生型功能的DNA。
圖I顯示，根據(jù)實(shí)施例之一，如何用例舉的脫氧核糖核酸(DNA)序列向海藻細(xì)胞核導(dǎo)入DNA。圖2是一個(gè)流程圖，例舉一種海藻細(xì)胞核基因組同源重組的方法。
圖3顯示一例DNA序列()，該序列包括硝酸鹽還原酶基因的至少一部分。圖4顯示一例轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)(2)，其中包含硝酸鹽還原酶DNA序列作為轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)的兩側(cè)序列。圖5是顯示幾個(gè)轉(zhuǎn)化株分子遺傳學(xué)分析結(jié)果的凝膠照片。發(fā)明的詳細(xì)描述圖I顯示，根據(jù)實(shí)施例之一，如何用例舉的脫氧核糖核酸(DNA)序列向海藻細(xì)胞核導(dǎo)入DNA。圖I中顯示了一個(gè)轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)110，海藻細(xì)胞核DNA 120，和轉(zhuǎn)化了的轉(zhuǎn)化海藻細(xì)胞核 DNA 130。轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)110包含第一 DNA序列A’，其在長(zhǎng)度和序列上與海藻細(xì)胞核 DNA 120中的第一海藻細(xì)胞核DNA序列A相似。轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)110包含第二 DNA序列C’，其在長(zhǎng)度和序列上與海藻細(xì)胞核DNA 120中的第二海藻細(xì)胞核DNA序列C相似。轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)110還包含感興趣DNA序列X，其插在轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)110的第一 DNA序列A’和第二 DNA序列C’之間。在一例將DNA導(dǎo)入海藻細(xì)胞細(xì)胞核方法中，制備諸如示例性轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)110這樣的轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)。然后，可用轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)110來(lái)轉(zhuǎn)化位于細(xì)胞核DNA 120的第一序列A和第二序列C中間的目標(biāo)DNA序列B，導(dǎo)致目標(biāo)DNA序列B被感興趣DNA序列X所取代。在各種實(shí)施例中，分別與對(duì)應(yīng)的細(xì)胞核DNA120中第一序列A和/或第二序列C相似的第一 DNA序列AIP /或第二 C’DNA序列可以是任意堿基對(duì)(bps)長(zhǎng)度的，范圍從大約Obps到大約10，000bps，或者更長(zhǎng)。另外，第一 DNA序列A’在堿基對(duì)長(zhǎng)度上與第二 DNA序列C’可以相同也可以不同。各種實(shí)施例中，在細(xì)胞核DNA 120第一序列A和第二序列C之間的目標(biāo)DNA序列B可以是任意堿基對(duì)(bps)長(zhǎng)度的，范圍從大約Obps到大約10，000bps，或者更長(zhǎng)。一些實(shí)施例中，感興趣DNA序列X可以把轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)110的第一序列A’和第二序列C’以小至約0bps、大至約10，OOObps的間距隔開(kāi)。感興趣DNA序列X可以包含各種序列，比如調(diào)控序列或者啟動(dòng)子序列(單向的或者雙向的)，抗生素抗性標(biāo)記，或者可以包含啟動(dòng)子序列和一個(gè)抗生素抗性標(biāo)記。另一些實(shí)施例中，感興趣DNA序列X可以包含代謝物營(yíng)養(yǎng)同化或生物合成基因。比如，感興趣DNA序列X可以包含編碼硝酸鹽還原酶或者亞硝酸鹽還原酶的基因。各種實(shí)施例中，感興趣DNA序列X可以而非必需編碼多肽的至少一部分。在一些例子中，感興趣DNA序列X可以只被轉(zhuǎn)錄，但是不被翻譯成多肽。在其他的實(shí)例中，感興趣DNA序列X編碼的肽添加到到第一細(xì)胞核DNA序列A或者第二細(xì)胞核DNA序列C所編碼的肽。感興趣DNA序列X也可以編碼非編碼的調(diào)控DNA序列。在各種實(shí)施例中，感興趣DNA序列X的長(zhǎng)度可以與細(xì)胞核DNA 120的目標(biāo)DNA序列B不相似。比如，感興趣DNA序列X可能長(zhǎng)約Odps，造成目標(biāo)DNA序列B的缺失或者近乎缺失，如同在轉(zhuǎn)化海藻細(xì)胞核DNA 130中那樣。一些實(shí)施例中，可用轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)110來(lái)轉(zhuǎn)化位于細(xì)胞核DNA 120的第一序列A和第二序列C之間的目標(biāo)DNA序列B，導(dǎo)致目標(biāo)DNA序列B被感興趣DNA序列X所取代。細(xì)胞核DNA 120可以是微擬球藻(Nannochloropsis)基因組的至少一部分。并且,所述微擬球藻的基因組可以是單倍體基因組。這里所述的轉(zhuǎn)化方法可以用來(lái)改變海藻細(xì)胞的表型特征來(lái)從而賦予其新的特征。比如，所述用感興趣DNA序列X取代的目標(biāo)DNA序列B可以是至少部分取代，使得目標(biāo)DNA序列的基因功能部分降低。另一些實(shí)施例中，感興趣DNA序列X包含削弱或者破壞目標(biāo)基因B的野生型功能的DNA，所述野生型功能原本代謝物生物合成或營(yíng)養(yǎng)同化作用所需。相反地，也可以用感興趣DNA序列X通過(guò)轉(zhuǎn)化把代謝物生物合成或者營(yíng)養(yǎng)同化基因削弱了或者破壞了的野生型功能還原成野生型功能。比如，可以用感興趣DNA序列X轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷型海藻細(xì)胞，導(dǎo)致代謝物的生物合成或營(yíng)養(yǎng)同化。這種轉(zhuǎn)化株可以通過(guò)在不含該代謝物的液體或者固體培養(yǎng)基中局限培養(yǎng)來(lái)挑選，即所述培養(yǎng)基不含轉(zhuǎn)化了的營(yíng)養(yǎng)缺陷型海藻細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的的該代謝物。圖2是一個(gè)流程圖，顯示一例海藻細(xì)胞核基因組同源重組的方法。在210步驟中，制備一個(gè)轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)。在實(shí)施例之一中，轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)110 (圖I)包含第一 DNA序列A’，其與海藻細(xì)胞核DNA 120(圖I)中的第一海藻細(xì)胞核DNA序列A相似。轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)110還可以包含第二 DNA序列C’，其與海藻細(xì)胞核DNA 120中的第二海藻細(xì)胞核DNA序列C相似。轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)110可以包含感興趣DNA序列X，插入在轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)110 DNA的第一序列A’和第二序列C’之間。
在220步驟中，細(xì)胞核DNA的目標(biāo)序列被轉(zhuǎn)化。各種實(shí)施方式中，可用轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)110來(lái)轉(zhuǎn)化細(xì)胞核DNA 120的第一序列A和第二序列C之間的目標(biāo)序列，導(dǎo)致目標(biāo)DNA序列B被感興趣DNA序列X所取代。在230步驟中，挑選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。比如，可用感興趣DNA序列X轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷型海藻細(xì)胞，引起某代謝物的生物合成或營(yíng)養(yǎng)同化作用。這種轉(zhuǎn)化株可以通過(guò)在不含該代謝物的液體或者固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)來(lái)挑選，即所述培養(yǎng)基不包含轉(zhuǎn)化了的營(yíng)養(yǎng)缺陷型海藻細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的該代謝物。
實(shí)施例。為了檢測(cè)微擬球藻中同源重組的機(jī)率，發(fā)明者發(fā)明了一種轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)使用了選擇標(biāo)記(博來(lái)霉素基因)，其左右兩側(cè)各有一個(gè)硝酸鹽還原酶DNA序列。圖3顯示一例DNA序列()，該序列至少包括硝酸鹽還原酶基因的一部分。圖3中，左側(cè)硝酸鹽還原酶DNA序列標(biāo)記為310，右側(cè)硝酸鹽還原酶DNA序列標(biāo)記為320。如下文所述，在310和320中間的內(nèi)源硝酸鹽還原酶基因的DNA序列315將被轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)上的DNA序列所取代。圖4顯示一例轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)(2)，包含用來(lái)制造轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)兩側(cè)序列的硝酸鹽還原酶DNA序列。圖4顯示左側(cè)硝酸鹽還原酶DNA序列310’，選擇標(biāo)記盒NT7 410，和右側(cè)硝酸鹽還原酶DNA序列320’。選擇標(biāo)記盒NT7 410包含紫黃質(zhì)一葉綠素結(jié)合蛋白(“Vcp”)3’UTR，博來(lái)霉素抗性序列，和Vcp啟動(dòng)子序列。Vcp啟動(dòng)子和Vcp 3’UTR DNA序列來(lái)自?xún)蓚€(gè)不同的Vcp基因簇，參見(jiàn)2009年6月8日提交的標(biāo)題為“海藻細(xì)胞轉(zhuǎn)化的基于VCP的載體”的第12/480，635號(hào)美國(guó)非臨時(shí)申請(qǐng)。包含Vcp啟動(dòng)子、博來(lái)霉素抗性序列和Vcp 3’ UTR的NT7盒以反平行式插入到左側(cè)硝酸鹽還原酶310’和硝酸鹽還原酶320’之間。方案使用的引物。Vcp ble UTR與NR的同源重組，反向，一個(gè)外顯子部分缺失P311 NR 左側(cè)正向引物AGTCGTAGCAGCAGGAATCGACAA。
P311 NR左側(cè)反向引物GGCACACGAGATGGACAAGATCAGTGGAATAATGAGGCGGACAGGGAA。P313 NR右側(cè)正向引物GTGCCATCTTGTTCCGTCTTGCTTGCGCAAGCCTGAGTACATCATCAA。P314 NR 右側(cè)反向引物ATGACGGACAAATCCTTACGCTGC。P215 NT7 互補(bǔ)正向引物AAGCAAGACGGAACAAGATGGCAC。P119 PL38 3UTR 折返引物CTGATCTTGTCCATCTCGTGTGCC。用Takara Taq運(yùn)行PCR來(lái)生成NR兩側(cè)序列和插入盒。用P311和P312從gNDA擴(kuò)增左側(cè)序列LF(IkB)。用P313 和 P314 從 gNDA 擴(kuò)增右側(cè)序列 RF (I. 04kB)。 (注兩側(cè)序列都包括來(lái)自312和313引物的與NT7的連接區(qū)域。)用P215 和 Pl 19 從 NT7 擴(kuò)增插入結(jié)構(gòu) IC (I. 817kB)。所有的PCR產(chǎn)物都進(jìn)行凝膠純化。LF，1C，RF片段用下面的PCR來(lái)連接。全部100 微升 PCR RXN170 納克 LF，170 納克 1C，與 P311 和 P215(2. 817kB)作融合 PCR，得 LF-IC。170 納克 RF，170 納克 1C，與 P119 和 Ρ314(2· 821kB)作融合 PCR，得 RF-IC。各片段用凝膠純化后直接用于最后的PCR。170 納克 LF-IC 與 170 納克 RF-IC，與 P311 和 P314 一起做 PCR。從凝膠中回收3. 8kB的DNA片段，直接用于轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化200納克DNA片段(見(jiàn)上文)用于此前描述的轉(zhuǎn)發(fā)方法。區(qū)別在于將細(xì)胞培養(yǎng)在包含氯化銨的F2培養(yǎng)基(用2mM氯化銨代替硝酸鹽)中。轉(zhuǎn)化后涂板前的恢復(fù)也用2mM氯化銨培養(yǎng)基進(jìn)行。細(xì)胞涂在含2mM氯化銨(而不是2mM硝酸鹽(N03_))的F2 (包括吉?dú)W霉素)的平板上。所有的培養(yǎng)基都有50%鹽度，與海水相當(dāng)。挑選。選擇200個(gè)克隆，重新懸浮在100微升缺氮F2培養(yǎng)基中，并點(diǎn)樣在含有不同氮源的方形平板(F2培養(yǎng)基)上。沒(méi)有氮2mM 的 No2_2mM 的 N03-2mM 的 NH4C1絕大多數(shù)克隆不能在含硝酸鹽的培養(yǎng)基上生成(變黃指示氮缺乏；硝酸鹽還原酶敲除突變株不能在以硝酸鹽作為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng))，但是所有克隆在亞硝酸鹽和氯化銨平板上生長(zhǎng)同樣地良好。并且，在硝酸鹽平板上生長(zhǎng)抑制的克隆在外觀(guān)上不能區(qū)別于氮缺乏(沒(méi)有氮)平板上的細(xì)胞(轉(zhuǎn)化的或者沒(méi)有轉(zhuǎn)化的)，表明轉(zhuǎn)化株在硝酸鹽平板上的生長(zhǎng)阻滯是由于不能使用硝酸鹽作為氮源。野生株和硝酸鹽還原酶無(wú)關(guān)轉(zhuǎn)化突變株都從未出現(xiàn)在含硝酸鹽作為唯一氮源的瓊脂平板上的生長(zhǎng)阻滯，表明克隆的硝酸鹽還原酶基因失活。結(jié)果。
圖5是顯示對(duì)幾個(gè)轉(zhuǎn)化株的分子遺傳學(xué)分析的凝膠照片。分析了 192個(gè)克隆。其中，目測(cè)篩出176個(gè)克隆明顯地具有硝酸鹽還原酶缺陷。還對(duì)克隆進(jìn)行了 PCR分析。圖5中的凝膠照片顯示了幾個(gè)轉(zhuǎn)化株(標(biāo)記為1，2，7，9，11和12)的分子遺傳學(xué)分析?？寺?和12已被認(rèn)定能夠在以硝酸鹽為唯一氮源上生長(zhǎng)，而克隆1，7，9和11則不能，表明硝酸鹽還原酶被破壞。用于PCR遺傳學(xué)分析的引物從野生型基因獲得一個(gè)較小的DNA片段，而從突變基因則獲得一個(gè)較大的DNA片段，所述突變基因包含插入的大挑選標(biāo)記。1，7，9和11號(hào)泳道只顯示一個(gè)條帶，該條帶對(duì)應(yīng)于與含有期望插入片段的硝酸鹽還原酶基因座。2號(hào)和12號(hào)泳道顯示兩個(gè)條帶一小條帶是內(nèi)源硝酸鹽還原酶基因，大條帶則是轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)片段，該轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)片段被插入到基因組的其它位置，不在硝酸鹽還原酶基因座內(nèi)。測(cè)序。用測(cè)序來(lái)檢驗(yàn)重組后是否引入了錯(cuò)誤。對(duì)6個(gè)克隆進(jìn)行了 PCR分析，并且對(duì)包括兩側(cè)末端(左側(cè)5’末端和右側(cè)3’末端)在內(nèi)的兩側(cè)序列進(jìn)行了測(cè)序。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤。還從轉(zhuǎn)化株(硝酸鹽還原酶內(nèi)插入了 ble基因盒)中擴(kuò)增出了整個(gè)基因座，并且成功用于對(duì)野生型進(jìn)行重復(fù)轉(zhuǎn)化。發(fā)明人還成功地使用野生型硝酸鹽還原酶片段作為選擇標(biāo)記通過(guò)同源重組修復(fù)了敲除突變野生型片段與硝酸鹽還原酶基因內(nèi)的ble基因插入部位重合并置換了該基因。只有那些硝酸鹽還原酶基因被同源重組修復(fù)的克隆能夠在以硝酸鹽為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。盡管以上描述了多個(gè)實(shí)施方式，但應(yīng)理解，它們僅是示例，并不構(gòu)成限制。因此，優(yōu)選實(shí)施方式的范圍不應(yīng)受任何以上所述示例性實(shí)施方式的限制。
權(quán)利要求
1.一種把脫氧核糖核酸(DNA)引入海藻細(xì)胞細(xì)胞核的轉(zhuǎn)化方法，該方法包括 制備轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有與相應(yīng)第一細(xì)胞核DNA序列相似的第一 DNA序列，與相應(yīng)第二細(xì)胞核DNA序列相似的第二 DNA序列，和在該轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)中第一和第二 DNA序列之間插入的感興趣的DNA序列，并且 轉(zhuǎn)化相應(yīng)第一和第二細(xì)胞核DNA之間的目標(biāo)DNA序列，使得目標(biāo)DNA序列被感興趣的DNA序列所取代。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列把分別與相應(yīng)第一和第二細(xì)胞核DNA序列相似的所述第一和第二 DNA序列隔開(kāi)大約4. 5kb。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，分別與相應(yīng)第一或第二細(xì)胞核DNA序列相似的所述第一或第二 DNA序列包含大約1000堿基對(duì)(bps)。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，分別與相應(yīng)第一或第二細(xì)胞核DNA相似的所述第一或第二 DNA序列包含少于大約1000堿基對(duì)。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，分別與相應(yīng)第一或第二細(xì)胞核DNA序列相似的所述第一或第二 DNA序列包含多于大約1000堿基對(duì)。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，分別與相應(yīng)第一或第二細(xì)胞核DNA序列相似的所述第一或第二序列DNA包含多于大約10，000堿基對(duì)。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列還包含調(diào)控序列或啟動(dòng)子序列。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述啟動(dòng)子是單向的或雙向的。
9.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列還包含抗生素抗性標(biāo)記。
10.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列還包含啟動(dòng)子序列和抗生素抗性標(biāo)記。
11.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列還代謝物生物合成或營(yíng)養(yǎng)同化基因。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述基因編碼硝酸鹽還原酶或者亞硝酸鹽還原酶。
13.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列大約0bps，使得目標(biāo)DNA的缺失或者近乎缺失。
14.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列編碼多肽。
15.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列被轉(zhuǎn)錄，但是不編碼多肽。
16.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列編碼肽，所編碼的肽添加到由第一或者第二細(xì)胞核DNA序列編碼的肽。
17.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列編碼非編碼調(diào)控DNA序列。
18.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，目標(biāo)DNA序列與感興趣DNA序列不相似。
19.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述海藻細(xì)胞是微擬球藻細(xì)胞。
20.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述海藻細(xì)胞是單倍體。
21.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法還包括改變所述海藻細(xì)胞的表型特征或者賦予所述海藻細(xì)胞新特征。
22.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，與相應(yīng)第一細(xì)胞核DNA序列相似的第一DNA序列具有第一個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度，與相應(yīng)第二細(xì)胞核DNA序列相似的第二 DNA序列具有第二個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度，兩者不相等。
23.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，目標(biāo)DNA序列少于lkb。
24.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，目標(biāo)DNA序列被感興趣DNA序列取代至少是部分取代，使得目標(biāo)DNA序列的基因功能部分降低。
25.一種轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有與相應(yīng)第一海藻細(xì)胞細(xì)胞核DNA序列相似的第一 DNA序列，與相應(yīng)第二海藻細(xì)胞細(xì)胞核DNA序列相似的第二 DNA序列，和在該轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)中第一和第二DNA序列之間插入的感興趣的DNA序列。
26.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，分別與相應(yīng)第一和第二細(xì)胞核DNA序列相似的所述第一和第二序列DNA各自包含大約1000堿基對(duì)(bps)。
27.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，分別與相應(yīng)第一和第二細(xì)胞核DNA序列相似的所述第一和第二序列DNA各自包含少于大約1000堿基對(duì)。
28.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，分別與相應(yīng)第一和第二細(xì)胞核DNA序列相似的所述第一和第二 DNA序列各自包含多于大約1000堿基對(duì)。
29.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，分別與相應(yīng)第一和第二細(xì)胞核DNA序列相似的所述第一和第二 DNA序列各自包含多于大約10，000堿基對(duì)。
30.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列還包含削弱或者破壞代謝物生物合成或營(yíng)養(yǎng)同化基因的野生型功能的DNA。
31.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷型海藻細(xì)胞，引起代謝物的生物合成或者同化作用。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，該方法還包括通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)來(lái)挑選被轉(zhuǎn)化的營(yíng)養(yǎng)缺陷型海藻細(xì)胞，所述培養(yǎng)基不包含被轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷型海藻細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的代謝物。
33.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述基因編碼硝酸鹽還原酶或者亞硝酸鹽還原酶。
34.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將所述營(yíng)養(yǎng)同化或生物合成基因被削弱或破壞的野生型功能轉(zhuǎn)化并還原成野生型功能。
35.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列把分別與相應(yīng)第一和第二細(xì)胞核DNA序列相似的所述第一和第二序列DNA隔開(kāi)大約200bps。
36.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列把分別與相應(yīng)第一和第二序列細(xì)胞核DNA相似的所述第一和第二 DNA序列隔開(kāi)大約10. Okb。
37.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，至少感興趣DNA序列的一部分編碼多肽。
38.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，分別與相應(yīng)第一或第二細(xì)胞核DNA序列相似的所述第一或第二 DNA序列的堿基對(duì)長(zhǎng)度約為I個(gè)堿基對(duì)到約10000堿基對(duì)。
39.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，感興趣DNA序列的堿基對(duì)長(zhǎng)度約為I個(gè)堿基對(duì)到約10000堿基對(duì)。
40.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基是固體或者液體。
全文摘要
本文提供對(duì)向海藻細(xì)胞細(xì)胞核轉(zhuǎn)入脫氧核糖核酸(DNA)的轉(zhuǎn)化方法?？梢灾苽溥@樣一個(gè)轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)有與相應(yīng)第一細(xì)胞核DNA序列相似的第一DNA序列，與相應(yīng)第二細(xì)胞核DNA序列相似的第二DNA序列，和在該轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)中第一和第二DNA序列之間插入的感興趣的DNA序列?？蓪?duì)相應(yīng)的第一和第二核DNA之間的目標(biāo)DNA序列進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從而使得該目標(biāo)DNA序列被感興趣的DNA序列所取代。本發(fā)明還提供一個(gè)示例性轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)，該轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)有與相應(yīng)第一海藻細(xì)胞核DNA序列相似的第一DNA序列，與相應(yīng)第二海藻細(xì)胞核DNA序列相似的第二DNA序列，和插入在該轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)中第一和第二DNA序列之間的感興趣的DNA序列。
文檔編號(hào)C12P19/34GK102858980SQ201080058106
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2010年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月19日
發(fā)明者O·基利安, B·維克 申請(qǐng)人:奧羅拉藻類(lèi)股份有限公司