對(duì)辛伐他汀合成表現(xiàn)出改善性質(zhì)的LovD突變體的制作方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：對(duì)辛伐他汀合成表現(xiàn)出改善性質(zhì)的LovD突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于生物合成化合物如辛伐他汀的方法和材料，包括利用微生物宿主的過(guò)程。
_6]
背景技術(shù)：
辛伐他汀是可分離自土曲霉(Aspergillus terreus)發(fā)酵液的天然產(chǎn)物洛伐他汀的半合成衍生物。洛伐他汀和辛伐他汀都是降膽固醇藥，能顯著降低成人的心臟病風(fēng)險(xiǎn)。洛伐他汀和辛伐他汀由默克公司(Merck Co.)分別作為美降之(Mevacor)和舒降之(Zocor)銷(xiāo)售。辛伐他汀是洛伐他汀的更強(qiáng)效衍生物，并在2005年是美國(guó)第二暢銷(xiāo)藥物，單在美國(guó)就有45億美元的預(yù)期銷(xiāo)售。土曲霉(A. terreus)中用于洛伐他汀生物合成的基因簇(參見(jiàn)例如，J. Kennedy, K.等，Science, 1999，284，1368-1372 ;和 C. R. Hutchinson, J.等，AntonieVan Leeuwenhoek 2000，78，287-295)此前已有描述(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，391，583，其內(nèi)容通過(guò)引用納入本文)。在所述基因簇中編碼的是46kD的蛋白質(zhì)LovD，該蛋白最初鑒定為酯酶同系物。洛伐他汀生物合成的直接前體紅麴素J(Monacolin J)由上游巨合酶(megasynthase)LovB 組裝(參見(jiàn)例如，L. Hendrickson, C. R.等，Chem.Biol. 1999，6，429-439)，(該酶也稱(chēng)為洛伐他汀九酮合成酶，LNKS)，烯?；€原酶LovC和CYP450氧化酶。五碳單元側(cè)鏈由LovF (洛伐他汀二酮合成酶，LDKS)通過(guò)乙酰-CoA和丙二酰-CoA之間的縮合合成?？s合的二酮由單獨(dú)LovF結(jié)構(gòu)域進(jìn)行甲基化和還原性修飾產(chǎn)生共價(jià)連接于LovF?；d體蛋白(ACP)結(jié)構(gòu)域的磷酸泛酰巰基乙胺臂上的a-S-甲基丁?；蝓?參見(jiàn)例如，J. Kennedy, K.等，Science, 1999, 284, 1368-1372 和 C. R. Hutchinson, J.等，Antonie Van Leeuwenhoek2000, 78，287-295),隨后從紅麴素J生成洛伐他汀。在土曲霉中滅活LovD或LovF導(dǎo)致前體紅麴素J的積累(參見(jiàn)例如，J. Kennedy, K.等，Science, 1999, 284, 1368-1372 和 C. R. Hutchinson, J.等，Antonie Van Leeuwenhoek2000，78，287-295)。一旦制得洛伐他汀，例如在土曲霉宿主中經(jīng)發(fā)酵制得，可從洛伐他汀生成辛伐他汀。目前，辛伐他汀是洛伐他汀的半合成衍生物。洛伐他汀經(jīng)土曲霉宿主的發(fā)酵獲得。純化該化合物后，如下進(jìn)行半合成1)2-甲基丁酯側(cè)臂可在堿的存在下水解產(chǎn)生中間體紅麴素J;2)將游離酸內(nèi)酯化；3)將C13處的醇官能團(tuán)用保護(hù)基團(tuán)(例如，叔丁基二甲基硅烷基)保護(hù)；4)將顯露的CS醇用?；孜锶?- 二甲基丁酰氯酯化產(chǎn)生C13保護(hù)形式的辛伐他??；以及5)將C13 OH去保護(hù)產(chǎn)生辛伐他汀。此前已描述辛伐他汀的各種多步合成(參見(jiàn)例如，PCT WO 2005/066150和美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0050080275與20040068123，其內(nèi)容通過(guò)引用納入本文)。例如，廣泛采用的方法始于洛伐他汀中CS酯的水解產(chǎn)生三醇紅麴素J，然后選擇性硅烷化C13醇，用二甲基丁酰氯酯化C8醇并使C13醇去保護(hù)產(chǎn)生辛伐他汀(參見(jiàn)例如，ff. F. Hoffman,等，J. Med.Chem. 1986，29，849-852)。已研究用脂肪酶和酯酶來(lái)酶促轉(zhuǎn)化作為化學(xué)衍生的替代(參見(jiàn)例如，PCT WO 2005/040107, PCT WO 94/26920 和 T. G. Schimmel 等，Appl. Environ. Microbiol. 1997,63, 1307-1311，其內(nèi)容通過(guò)引用納入本文)。但是，區(qū)域選擇性酯化的要求總是涉及其它醇基團(tuán)的保護(hù)且常引起總體得率降低。因此，能選擇性?；t麴素J的CS的特異性試劑對(duì)于辛伐他汀和其它他汀類(lèi)似物的有效合成很重要。上述方案的變形常見(jiàn)，但是大多數(shù)過(guò)程總是涉及首先分離洛伐他汀，水解甲基丁酯側(cè)鏈，保護(hù)游離醇，與?；孜锓磻?yīng)，以及去保護(hù)。盡管涉及的化學(xué)轉(zhuǎn)化相對(duì)簡(jiǎn)單，但它們低效且涉及多個(gè)步驟，并因此造成目前制備辛伐他汀的高成本(每顆藥3美元)。為此，非常需要能促進(jìn)高成本效率制備辛伐他汀和相關(guān)化合物的方法和材料。

發(fā)明內(nèi)容
如下文詳述，現(xiàn)可用LovD?；D(zhuǎn)移酶多肽的變體在體外或體內(nèi)產(chǎn)生辛伐他汀和相關(guān)化合物，所述變體經(jīng)工程改造以顯示促進(jìn)其用于生成辛伐他汀和/或胡伐他汀(huvastatin)的性能。本文所述材料和方法設(shè)計(jì)成使得能用最少改動(dòng)將現(xiàn)有洛伐他汀制備的發(fā)酵設(shè)施轉(zhuǎn)化為制備辛伐他汀和相關(guān)化合物。本發(fā)明的實(shí)施方式提供設(shè)計(jì)用于利用制備洛伐他汀的生物方法來(lái)制備洛伐他汀的衍生物辛伐他汀的方法和材料。本發(fā)明還提供設(shè)計(jì)用于利用制備洛伐他汀的生物方法來(lái)制備相關(guān)化合物如普伐他汀衍生物胡伐他汀的方法和材料。本發(fā)明的實(shí)施方式包括的材料和方法可用于產(chǎn)生辛伐他汀而無(wú)需目前用來(lái)產(chǎn)生該化合物的多個(gè)化學(xué)合成步驟。本發(fā)明的典型實(shí)施方式不需要第一步先純化洛伐他汀然后進(jìn)一步半合成過(guò)程，而是在發(fā)酵過(guò)程中聯(lián)用LovD?；D(zhuǎn)移酶多肽的變體和?；蝓セ衔飦?lái)產(chǎn)生辛伐他汀和/或胡伐他汀的制備。本文公開(kāi)的發(fā)明有多種實(shí)施方式。本發(fā)明的一種說(shuō)明性實(shí)施方式是SEQ ID NO: I所示LovD多肽的變體，所述LovD多肽變體包含至少一種特定氨基酸取代，例如AlOV ；D12G ；K26E ；C40A ；C60N ；A86V ；H161Y ；A190T ；K227R ；G275S ；V334D ;V334F 和 / 或 L361M。本發(fā)明的一種相關(guān)實(shí)施方式是SEQ ID NO: I所示LovD多肽的變體，該LovD多肽的變體包含一組氨基酸取代，例如一組至少3個(gè)氨基酸的取代在C40和C60位置氨基酸殘基處的取代，和在下組氨基酸殘基位置處的另外至少一種取代A10 ；D12 ；K26 ；A86 ；A190 ；H161 ；K227 ；G275 ;V334 ;或L361。LovD多肽的此類(lèi)取代變體中，氨基酸取代可包括在SEQ ID NO: I所示LovD多肽上氨基酸殘基位置處未見(jiàn)的19種氨基酸中任一種。通常，所述取代變體與SEQID NO: I所示LovD多肽相比呈現(xiàn)一種或多種改變的性質(zhì)，例如聚集減少；熱穩(wěn)定性改善；催化活性改善值改善；可溶表達(dá)水平改善；和/或25° C下的全細(xì)胞活性改善。如上所述，本發(fā)明的某些實(shí)施方式包括氨基酸取代的特定構(gòu)象。例如，本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，LovD多肽變體包含以下各組位置的氨基酸取代氨基酸殘基位置C40、C60和A86 ;或氨基酸殘基位置C40、C60、A86和A190 ;或氨基酸殘基位置C40、C60、D12、A86和G275 ;或氨基酸殘基位置C40、C60、D12、A86、C40、C60、A190和G275 ;或氨基酸殘基位置C40、C60、D12、K26、A86、C40、C60、H161、A190 和 G275 ;或氨基酸殘基位置 C40、C60、D12、A86、A190 和 G275 ;或氨基酸殘基位置 C40、C60、A10、D12、K26、A86、A190 和 G275 ;或氨基酸殘基位置 C40、C60、D12、K26、A86、A190 和 G275 ;或氨基酸殘基位置 C40、C60、D12、K26、A86、H161、A190、G275、V334 和 L361 ;或氨基酸殘基位置 C40、C60、D12、K26、A86、H161、A190、G275和V334。這些變體的具體說(shuō)明性實(shí)施方式包括具有下列氨基酸取代的變體D12G、C40A、C60N、A86V、A190T 和 G275S ;或 D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、A190T 和G275S ;或 D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、A190T ；G275S 和 V334F。本發(fā)明的實(shí)施方式包括編碼本文所述取代變體的多核苷酸，例如，與編碼本文所述LovD多肽變體的多核苷酸具有至少95%-100%序列相同性的已分離多核苷酸。本發(fā) 明的相關(guān)實(shí)施方式包括含這些多核苷酸的載體(例如，包括含控制序列的表達(dá)載體，所述控制序列被轉(zhuǎn)化有所述載體的宿主細(xì)胞所識(shí)別)以及含此類(lèi)載體的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可選為大腸桿菌(Escherichia coli), 土曲霉(Aspergillus terreus),紅色紅曲菌(Monascus ruber),紫紅色紅曲菌(Monascus purpureus),叢毛紅曲菌(Monascuspilosus),玻璃質(zhì)紅曲菌(Monascus vitreus),軟毛紅曲菌(Monascus pubigerus),卡氏念珠菌(Candida cariosilognicola),米曲霉(Aspergillus oryzea),斯梯蒙特皮真菌(Doratomyces stemonitis)，宛氏擬青霉(Paecilomyces virioti)，桔青霉(Penicillumcitrinum)，產(chǎn)黃青霉(Penicillin chrysogenum),短尾帚霉(Scopulariopsisbrevicaulis),粗糖鏈抱霉(Neurospora crassa)或綠色木霉(Trichoderma viride)。本發(fā)明的相關(guān)實(shí)施方式是制備LovD多肽變體的方法，包括將轉(zhuǎn)化有LovD多肽變體編碼子的宿主細(xì)胞在適于表達(dá)多肽的條件下培養(yǎng)，從而產(chǎn)生LovD多肽變體。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，LovD多肽變體可融合異源氨基酸序列，例如能促進(jìn)其處理的序列(例如，多組氨酸序列)。本發(fā)明的另一實(shí)施方式是SEQ ID NO: I所示LovD多肽變體的制備方法，其包括利用多核苷酸誘變方法產(chǎn)生LovD多核苷酸的突變體群；表達(dá)由所述LovD多核苷酸的突變體群所編碼的LovD多肽變體群；從而制備LovD多肽的變體。所述多核苷酸誘變方法可選為飽和誘變或易錯(cuò)聚合酶鏈反應(yīng)法。本發(fā)明的這些實(shí)施方式通常包括篩選所述LovD多肽變體的一個(gè)或多個(gè)成員以鑒定出與SEQ ID NO: I所示LovD多肽相比具有以下性質(zhì)的變體聚集減少；熱穩(wěn)定性改善；酰基轉(zhuǎn)移酶活性改善；kcat/Km值改善；可溶表達(dá)水平改善；和/或25° C下的全細(xì)胞活性改善。所述多核苷酸誘變過(guò)程可選為受控過(guò)程，從而在編碼以下氨基酸殘基位置的密碼子處產(chǎn)生取代突變A10 ；D12 ；K26 ；A86 ；A190 ；H161 ；K227 ；G275 ；V334 ;和/或L361。在本發(fā)明的相關(guān)實(shí)施方式中，所述多核苷酸誘變過(guò)程受控從而產(chǎn)生的變體包含C40A與C60N ;以及在編碼以下氨基酸殘基位置的密碼子處的其它取代突變A10 ；D12 ；K26 ；A86 ；A190 ；H161 ；K227 ；G275 ；V334 ;和 / 或 L361。本發(fā)明的另一實(shí)施方式是制備辛伐他汀的方法，其包括以下步驟混合紅麴素J ；在LovD酰基轉(zhuǎn)移酶存在下將?；糠痔峁┙o紅麴素J的C8羥基的酰基硫酯；和SEQ IDNO: I所示LovD酰基轉(zhuǎn)移酶多肽的某變體，所述LovD?；D(zhuǎn)移酶多肽變體包括以下殘基位置的至少一個(gè)氨基酸取代A10 ；D12 ；K26 ；A86 ；A190 ；H161 ；K227 ；G275 ；V334 或 L361 ;然后允許所述LovD多肽變體利用來(lái)自?；蝓サ孽；詤^(qū)域選擇性酰化紅麴素J的CS羥基；從而制得辛伐他汀。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，在發(fā)酵培養(yǎng)基中混合紅麴素J ;酰基硫酯和LovD多肽變體，所述培養(yǎng)基中存在產(chǎn)生所述LovD?；D(zhuǎn)移酶的分離生物體，其中所述分離生物體為以下至少一種土曲霉；不表達(dá)SEQ ID NO:3所示LovF多肽的土曲霉；大腸桿菌；或不表達(dá)SEQ ID N0:4所示bioH多肽的大腸桿菌。可選在此類(lèi)實(shí)施方式中，?；蝓ミx自丁?；蝓?，N-乙?；腚装妨蝓セ蚣谆?巰基乙酸硫酯，包含中等鏈長(zhǎng)(C3-C6)?；糠趾?或能跨越生長(zhǎng)在發(fā)酵培養(yǎng)基中的大腸桿菌或土曲霉細(xì)胞的細(xì)胞膜的?；蝓?例如，a - 二甲基丁酰基-S-甲基-巰基丙酸酯(DMB-S-MMP)，二甲基丁酰基-S-乙基巰基丙酸酯(DMB-S-EMP)和二甲基丁?；?S-甲基巰基乙酸酯(DMB-S-MTG)及二甲基丁?；?S-甲 基-巰基丁酸酯(DMB-S-MMB))。在制備辛伐他汀的方法中，所述分離的生物體可以生長(zhǎng)于至少一種以下條件溫度為25-40° C ;持續(xù)時(shí)間為至少4到至少48小時(shí)；pH為7-8 ;和/或在含LB、Fl或TB培養(yǎng)基的發(fā)酵基質(zhì)中。所述方法可選進(jìn)一步包含通過(guò)至少一個(gè)純化步驟來(lái)純化由所述方法制得的辛伐他汀，所述步驟包括裂解存在于組合物中的分離生物體的細(xì)胞；離心；沉淀辛伐他汀的游離酸形式；將辛伐他汀的游離酸形式轉(zhuǎn)化成辛伐他汀鹽；過(guò)濾；或高效液相色譜(HPLC)。在某些實(shí)施方式中，所述方法制備物質(zhì)組合物，其所含紅麴素J是最初與酰基硫酯混合的紅麴素J的0%-1%，所述?；蝓ピ贚ovD酰基轉(zhuǎn)移酶變體的存在下將?；糠痔峁┙o紅麴素J的CS羥基；和/或使得加入組合物的紅麴素J中至少95%轉(zhuǎn)化成辛伐他汀?？蛇x在這些方法中，LovD多肽變體包含氨基酸取代D12G、C40A、C60N、A86V、A190T和G275S ；D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、A190T 和 G275S ;或 D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、A190T ;G275S和V334F。本發(fā)明的相關(guān)實(shí)施方式是物質(zhì)組合物，其包含紅麴素J ;在LovD酰基轉(zhuǎn)移酶存在下將酰基部分提供給紅麴素J的C8羥基的?；蝓?；SEQ ID NO: I所示LovD?；D(zhuǎn)移酶多肽的某變體，所述LovD多肽變體包括以下氨基酸取代在氨基酸殘基位置C40和C60 ；以及以下至少一個(gè)氨基酸殘基位置A10，D12，K26，A86，A190，H161，K227，G275，V334或L361 ;以及辛伐他汀。本發(fā)明的另一實(shí)施方式是制備胡伐他汀的方法，其包括以下步驟混合經(jīng)水解的普伐他汀四醇；在LovD?；D(zhuǎn)移酶存在下將?；糠痔峁┙o經(jīng)水解普伐他汀四醇的CS羥基的?；蝓?；和SEQ ID NO: I所示LovD?；D(zhuǎn)移酶多肽的某變體，所述LovD多肽變體包括在以下氨基酸殘基位置的氨基酸取代A10 ；D12 ；K26 ；C40 ；C60 ；A86 ；A190 ；H161 ；K227 ；G275 ;V334和/或L361 ;然后允許所述LovD多肽變體利用來(lái)自?；蝓サ孽；鶃?lái)區(qū)域選擇性?；?jīng)水解普伐他汀四醇的CS羥基；從而制得胡伐他汀。本發(fā)明的相關(guān)實(shí)施方式是物質(zhì)組合物，其包含經(jīng)水解的普伐他汀四醇；在LovD?；D(zhuǎn)移酶存在下將酰基部分提供給經(jīng)水解普伐他汀四醇的C8羥基的?；蝓ィ籗EQ ID NO: I所示LovD?；D(zhuǎn)移酶多肽的某變體，所述LovD多肽變體包括在以下氨基酸殘基位置的氨基酸取代A10，D12，K26，C40，C60，A86, A190, H161, K227, G275，V334和/或L361 ;以及胡伐他汀?？蛇x該LovD多肽變體包含氨基酸取代D12G、C40A、C60N、A86V、A190T 和 G275S ;D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、A190T 和 G275S ;或 D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、A190T ；G275S 和 V334F。本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，可將其它組分和/或方法步驟與上述的一種或多種方法和材料聯(lián)用。例如，上述方法還可包含利用高細(xì)胞密度發(fā)酵來(lái)提高用于制備辛伐他汀和/或胡伐他汀的一種或多種LovD?；D(zhuǎn)移酶變體的有效濃度，以及優(yōu)化發(fā)酵條件或提高LovD酰基轉(zhuǎn)移酶催化效率等。很多其它組分或方法可用于提高辛伐他汀或能促進(jìn)辛伐他汀和/或胡伐他汀生成的中間體或相關(guān)化合物的制備。本發(fā)明的實(shí)施方式還包括設(shè)計(jì)用于促進(jìn)本發(fā)明方法的制品和/或試劑盒。此類(lèi)試劑盒通常包括根據(jù)本發(fā)明所述方法使用盒中元件的說(shuō)明。此類(lèi)試劑盒可包含經(jīng)區(qū)域化的載體用具以在封閉限制件中容納一種或多種容器用具如小瓶、管等，各容器用具包含一種待用于本方法的單獨(dú)元件。一種所述容器可包括小瓶，例如含有編碼LovD?；D(zhuǎn)移酶變體的質(zhì)粒，所述質(zhì)?？蛇x在微生物宿主如大腸桿菌或土曲霉中，而另一管瓶含有硫酯化合物或類(lèi)似物，兩者均可添加至發(fā)酵混合物中以產(chǎn)生辛伐他汀和/或胡伐他汀或類(lèi)似物。下面描述本發(fā)明的補(bǔ)充實(shí)施方式。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
圖I.過(guò)量表達(dá)酰基轉(zhuǎn)移酶LovD的大腸桿菌菌株用作生物催化劑將紅麴素J (MJ)酸和DMB-S-MMP —步轉(zhuǎn)化成辛伐他汀。辛伐他汀酸形式將在低pH下自動(dòng)轉(zhuǎn)化成內(nèi)酯形式，而該內(nèi)酯則在高PH條件下轉(zhuǎn)化成酸形式。野生型LovD的k-為0.6分鐘 ' 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示大腸桿菌YT2中表達(dá)的野生型LovD可在12小時(shí)內(nèi)將15mM MJ酸轉(zhuǎn)化成辛伐他汀。圖2. (a) SDS-PAGE 凝膠來(lái)自大腸桿菌 BL21 (DE3) /pAW31 的 LovD 蛋白(WT) ； (b)分別為L(zhǎng)ovD蛋白(WT)和A1-A8的天然凝膠，對(duì)所有樣品DTT固定為2mM。Al相比WT具有稍低的寡聚體；A3消除了大多數(shù)寡聚體；A2、A6和A8與WT非常相似；突變體A4、A5和A7因不穩(wěn)定性而顯示較少蛋白；A9因?yàn)闆](méi)有可溶性蛋白而未包括在內(nèi)。該結(jié)果表明只有Cl和C3可引起分子間二硫鍵。圖3.基于從MJ酸和DMB-S-MMP轉(zhuǎn)化的全細(xì)胞生物催化活性(灰色柱)和野生型LovD與突變體間可溶性蛋白表達(dá)水平的比較(黑色柱)。對(duì)于全細(xì)胞活性,將LB培養(yǎng)物濃縮10倍以模擬高密度發(fā)酵，用15mM MJ酸和18mM DMB-S-MMP比較轉(zhuǎn)化。采用基于8小時(shí)的轉(zhuǎn)化來(lái)比較野生型LovD和突變體間的全細(xì)胞活性。野生型LovD轉(zhuǎn)化歸一化至100%，數(shù)據(jù)點(diǎn)為兩次的均值。對(duì)于蛋白表達(dá)水平試驗(yàn)，從50ml LB培養(yǎng)物中表達(dá)蛋白并用Ni-NTA柱純化。通過(guò)Bradford法測(cè)定濃度。也將野生型LovD表達(dá)水平歸一化至100%。突變體的全細(xì)胞活性與可溶表達(dá)的蛋白質(zhì)成比例，因此溶解度可能是影響全細(xì)胞活性的唯一原因。圖4.含第一或第三半胱氨酸改變的突變體與野生型LovD之間基于8小時(shí)轉(zhuǎn)化的全細(xì)胞LovD活性。野生型LovD轉(zhuǎn)化歸一化至100%，數(shù)據(jù)點(diǎn)為兩次的均值。Al顯示轉(zhuǎn)化高于其它在第一半胱氨酸位置處的突變體，而N3則在第三半胱氨酸位置中最高。Al和N3都顯示全細(xì)胞活性比野生型高 25%。圖5.辛伐他汀轉(zhuǎn)化隨著時(shí)間變化。試驗(yàn)條件同前。YT2/A1N3( )結(jié)合了 Al和N3的益處，是最快的突變體，轉(zhuǎn)化在8小時(shí)內(nèi)完成。YT2/A1和YT2/N3在10小時(shí)內(nèi)完成反應(yīng)，YT2/A1的轉(zhuǎn)化稍高于YT2/N3。YT2/pAW31是野生型，其在12小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)化15mM MJ酸。全細(xì)胞活性更高導(dǎo)致反應(yīng)時(shí)間更短。與野生型相比，YT2/A1和YT2/N3都將時(shí)間縮短 20%，而YT2/A1N3將時(shí)間縮短 50%。圖6. YT2/pAW31和YT2/A1N的高細(xì)胞密度發(fā)酵。對(duì)這兩個(gè)菌株，先將細(xì)胞在37° C生長(zhǎng)至OD6tltl約為20，然后將溫度降至25° C并添加500iU IMIPTG以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。蛋白表達(dá) 12小時(shí)后，停止葡萄糖補(bǔ)料，pH調(diào)至7. 8，緩慢添加15g MJ酸和15ml DMB-S-MMP以開(kāi)始轉(zhuǎn)化。用HPLC檢查轉(zhuǎn)化，一旦反應(yīng)完成或恒定，即終止反應(yīng)。通過(guò)下游純化方法回收辛伐他汀。添加底物后細(xì)胞密度的極大下降可通過(guò)緩慢添加底物降至最小。轉(zhuǎn)化速率最初保持恒定，隨時(shí)間延長(zhǎng)可能LovD蛋白被滅活而緩慢下降。 圖7.由LovD催化的反應(yīng)。LovD負(fù)責(zé)將MJA經(jīng)a -S-甲基丁酸側(cè)鏈的酰化轉(zhuǎn)化成LVA，且還可用DMB-SMMP作為酰基供體合成SVA。圖8. LovD的晶體結(jié)構(gòu)及其與EstB的關(guān)系。(A) LovD與EstB之間基于結(jié)構(gòu)的序列比對(duì)。在序列上方顯示指定自L(fǎng)ovD結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件。顏色從N末端處的藍(lán)色過(guò)渡到C末端處的紅色。EstB中的活性位點(diǎn)殘基由氨基酸下方的星號(hào)標(biāo)出。⑶顯示G5’-LVA復(fù)合體的帶狀圖。(C)LovD的結(jié)構(gòu)。綠色突出顯示EstB中非保守的區(qū)段。投射在活性位點(diǎn)周?chē)?個(gè)環(huán)如同接球手手套中的手指。(D)EstB的結(jié)構(gòu)。紅紫色突出顯示LovD中非保守的區(qū)段。(E) LovD和EstB結(jié)構(gòu)的重疊圖。注意到LovD上缺失了 EstB中覆蓋活性位點(diǎn)的一 個(gè)環(huán)(殘基244_260)。圖9. LovD作為辛伐他汀合成酶的定向進(jìn)化。(A)用基于瓊脂擴(kuò)散的試驗(yàn)在全細(xì)胞活性試驗(yàn)中定量SVA的量。在點(diǎn)樣反應(yīng)混合物前將粗糙鏈孢霉(N. crassa)包埋在瓊脂中。編號(hào)(1-8)表示添加MJA和DMB-SMMP至表達(dá)野生型LovD的大腸桿菌后的不同孵育時(shí)間2. 5，4，5. 5，7，8，9，10，12小時(shí)。(B) LovD突變體向更高全細(xì)胞活性的定向進(jìn)化。共有7代LovD突變體。4代源自隨機(jī)誘變，包括Gl, G2. 1，G2. 2，G4. 1，G4. 2和G6。包括G3和G5的2代源自前代突變體的有益突變。G7通過(guò)G6在V334和L361位置的飽和誘變衍生得到。含2個(gè)氨基酸變化的所有突變體進(jìn)行定點(diǎn)突變以確定有益或有害突變(G2. I、G4. I和G4. 2)。(X)表明突變體具有比前代降低的全細(xì)胞活性。(V )表明突變體具有比前代更高的全細(xì)胞活性。

圖10. G5突變體的結(jié)構(gòu)提供對(duì)于改善催化的認(rèn)識(shí)。在有改善突變體G5中存在的氨基酸變化位置，突出了其通常離活性位點(diǎn)距離遠(yuǎn)。距離是從氨基酸a碳到LVA的親核性羥基(C8)。圖11. 5種LovD結(jié)構(gòu)重疊的側(cè)視圖。該圖表明兩個(gè)結(jié)構(gòu)域間由于G5突變和存在結(jié)合鍵而有鉸鏈旋轉(zhuǎn)。(A)可穩(wěn)定鉸鏈閉合的兩個(gè)重要?dú)埢?Val86和Leul34)顯示為球體。(B)另2個(gè)殘基(Val334和Asp320)彼此直接接觸。G6中的V334D突變可導(dǎo)致Asp334和Asp320間的靜電推斥，而G7中的V334F突變可導(dǎo)致苯基側(cè)鏈和Asp320間的空間位阻。兩者都能穩(wěn)定鉸鏈的閉合。圖12.比較結(jié)合不同配體的LovD活性位點(diǎn)。(A)G5與底物MJA復(fù)合。(B)G5’與產(chǎn)物L(fēng)VA復(fù)合。(C) G5’與產(chǎn)物SVA復(fù)合。(D) 3種結(jié)構(gòu)的重疊顯示構(gòu)型變化，特別是在親核性絲氨酸處，與結(jié)合不同配體相關(guān)聯(lián)。虛線(xiàn)代表氫鍵。活性位點(diǎn)入口在各圖的頂部。一些參與配體結(jié)合的殘基未顯示。圖13.為了仔細(xì)研究引起全細(xì)胞活性增加的原因，鑒定并列舉了所有改良突變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)(keat，Km)、可溶蛋白水平與熱穩(wěn)定性。將LovD突變體的全細(xì)胞活性與GO比較，GO的轉(zhuǎn)化速率為I. 7mM/小時(shí)，并標(biāo)準(zhǔn)化至I。tMJA的Km于25°C在DMB-SMMP固定在2mM時(shí)獲得。$ DMB-SMMP的Km在MJA固定于2mM時(shí)獲得。§可溶蛋白的量從純化的蛋白水平測(cè)定。TTm由圓二色性測(cè)量。所有結(jié)果表示三次測(cè)定的均值土SD。圖14. LovD GO和突變體的全細(xì)胞活性。在25°C下，GO以每小時(shí) I. 7mM的速率產(chǎn)生SVA。在32°C下，GO, Gl, G2. 1，G2. 2和G3未顯示任何活性。在25°C下，G7顯示活性比野生型稍高。在37°C下，只有G7保持每小時(shí) 0. 4mM SVA的殘余活性。圖15. LovD突變體的動(dòng)力學(xué)特征。LovD突變體的轉(zhuǎn)換率，針對(duì)利用DMB-SMMP為底物生物合成SVA( ，藍(lán)線(xiàn)，keat于左y軸)，利用MB-SMMP( ■，粉線(xiàn)，kcat于左y軸)或LovF( ▲，紅線(xiàn)，表觀(guān)轉(zhuǎn)換率于右Y軸)為底物生物合成LVA。圖16. LovD G5’結(jié)合于LVA和MJA0 (A) LovD的結(jié)構(gòu)，從N-末端(藍(lán)色)到C-末端(紅色)的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件，以及Lo vD 二級(jí)結(jié)構(gòu)的拓?fù)鋱D(箭頭表示￠-片層，長(zhǎng)方形表示a -螺旋)。LVA顯示為灰色棒形。(B)通向LovD活性位點(diǎn)的帶正電通道和帶正電脊(圈示區(qū)域)可與LovF的ACP結(jié)構(gòu)域和pPant臂相互作用。(C)疏水和芳族氨基酸參與MJA結(jié)合口袋。圖17.與突變相關(guān)關(guān)鍵殘基和在結(jié)合配體后的移動(dòng)(A)迭合GO-Semet、G5和G5-MJA的大結(jié)構(gòu)域(殘基14-92和204-405)以表示與MJA相互作用的一些關(guān)鍵殘基的移動(dòng)。自GO-Semet到G5的結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)動(dòng)關(guān)閉Argl73的胍基和MJA的C15羧基之間的缺口，這有利于結(jié)合MJA。在G5中Phel48和Tyrl88也更靠近MJA。(B) LovD活性位點(diǎn)中LVA和SVA結(jié)合之間的區(qū)別。在SVA中添加額外的a-甲基通過(guò)接觸Phel48產(chǎn)生結(jié)構(gòu)域間的鉸鏈開(kāi)□。圖18就G5中有益突變提出的機(jī)制。(A) K26E突變可能通過(guò)打散螺旋A表面上成片帶正電殘基(R22、K23、K26和R28)來(lái)改善酶穩(wěn)定性。該片區(qū)在GO-Semet和G5中都圈出以突出顯示。(B)G275S突變看來(lái)通過(guò)添加螺旋I上S278的氫鍵改善酶的穩(wěn)定性。圖19. LovD的催化殘基和提出的LVA生物合成機(jī)制。(A)提出的參與LovD反應(yīng)的殘基。(B)LovD(灰色)和EstB(紫紅色)之間活性位點(diǎn)殘基的迭合。(C)利用MJA和MB-LovF ACP為底物生物合成LVA。Ser76起催化親核體的作用來(lái)催化酯交換反應(yīng)。Ser76和MJA (C8)的羥基被Tyrl88脫質(zhì)子化，Tyrl88由Lys79穩(wěn)定化。圖20. X-射線(xiàn)數(shù)據(jù)采集和原子精修的統(tǒng)計(jì)(括號(hào)內(nèi)數(shù)字指數(shù)據(jù)的邊界)。
=E |I_〈I>|2/E I2，其中I是觀(guān)察的強(qiáng)度。兩項(xiàng)求和都包括所有輸入反射，對(duì)超過(guò)一種對(duì)稱(chēng)等價(jià)物取平均。Rut=E If0I-IfcI I/ E |f。!，其中F。和F。分別指觀(guān)察到和計(jì)算所得結(jié)構(gòu)因子。Riis類(lèi)似于R工#，但基于反射的子集，該子集被保留不用于精密化以供交叉驗(yàn)證(Brunger, A. T. (1992) Nature, 355，472-474)?？s寫(xiě) R. M. S.表示均方根值。
具體實(shí)施例方式本文所述或所引用的技術(shù)和過(guò)程通常已充分了解并常采用本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)方法，例如，Ausubel等在威利科學(xué)出版社(Wiley Interscience Publishers) 1995年的Current Protocols in Molecular Biology (《最新分子生物學(xué)方法》)中描述的廣泛應(yīng)用的分子克隆方法。適用時(shí)，除非另有說(shuō)明，涉及使用市售可得的試劑盒和試劑的過(guò)程通常按生產(chǎn)商給出的方案和/或參數(shù)進(jìn)行。除非另外定義，本文使用的所有術(shù)語(yǔ)、符號(hào)和其它科學(xué)術(shù)語(yǔ)旨在具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所理解的相同含義。在一些情況中，本文出于清楚和/或便于引用對(duì)具有常規(guī)理解含義的術(shù)語(yǔ)加以限定，本文中包括此類(lèi)限定不應(yīng)理解為表示與本領(lǐng)域常規(guī)理解的顯著區(qū)別。描述適用于本文所公開(kāi)發(fā)明實(shí)施方式的方法和材料的公開(kāi)內(nèi)容包括，例如，國(guó)際
發(fā)明者唐奕, 謝新開(kāi), 高雪 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)