專利名稱：脂肪酶粉末制劑及其用途的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及可適用于各種酯化反應、酯交換反應等的脂肪酶粉末制劑，以及使用這些粉末制劑的酯交換方法等。
背景技術(shù)：
脂肪酶可廣泛應用于脂肪酸等各種羧酸與一元醇或多元醇等醇類發(fā)生的酯化反應、多種羧酸酯間的酯交換反應等。其中，從動植物油脂類的改性，到作為各種脂肪酸的酯、糖酯或留醇酯的制造方法，酯交換反應均是一項重要的技術(shù)。在使用作為油脂水解酶的脂肪酶作為這些反應的催化劑時，能夠在從室溫到70°C左右的溫和條件下進行酯交換反應，與常規(guī)的化學反應相比，不僅能夠抑制副反應和降低能耗，并且由于用作催化劑的脂肪酶是天然物質(zhì)，因此安全性高。另外，根據(jù)其基質(zhì)特異性和位置特異性，能夠以良好的效率生產(chǎn)目的物。但是，即使將粉末脂肪酶直接用于酯交換反應，不僅不能充分發(fā)揮其活性，而且原本為水溶性的脂肪酶難以均勻地分散在油性原料中，也難以將其回收。因此，通常將脂肪酶固定在某些載體上之后，再用于酯化或酯交換反應等，所述載體例如陰離子交換樹脂(專利文獻1)、酚吸附樹脂(專利文獻2、、疏水性載體(專利文獻3)、陽離子交換樹脂(專利文獻4)、螯合樹脂(專利文獻幻等。并且，還提出了一種固定化的脂肪酶顆粒的制造方法，所述方法通過制造使溶解了脂肪酶和起到脂肪酶載體作用的物質(zhì)的水相分散在疏水相中的乳液，然后從該乳液中除去水，使水相變成以脂肪酶包覆的固體顆粒(專利文獻6)。由此，雖然通常將脂肪酶固定化之后用于酯交換反應，但這樣的固定化脂肪酶不僅會由于固定化處理而損失本來的脂肪酶活性，而且在使用多孔性載體的情況下原料和生成物會填進小孔中，結(jié)果導致酯交換率低。并且，在使用常規(guī)的固定化脂肪酶的酯交換反應中，載體中保留的水分會帶入反應體系中，因此難以避免發(fā)生副反應，例如在油脂類的酯交換反應中生成二酸甘油酯或單酸甘油酯。鑒于上述情況，目前正在開發(fā)使用粉末脂肪酶的各種技術(shù)。例如，提出了一種方法，在存在或不存在惰性有機溶劑的條件下，將粉末脂肪酶分散在含酯的原料中來進行酯交換反應，并且保證在進行酯交換反應時分散的脂肪酶粉末顆粒的90%以上保持1-100 μ m的范圍內(nèi)的粒徑(專利文獻7)。另外，還提出了使用將含有磷脂質(zhì)和脂溶性維生素的酶溶液干燥而得到的酶粉末(專利文獻8)。但是，目前仍希望獲得進一步提高脂肪酶活性的粉末脂肪酶?！矫?，提出了一種酶固定制劑的制造方法，其特征在于，向含酶溶液中加入谷物粉或谷物粉和糖類，然后使該含酶溶液干燥(專利文獻9)。這里，能夠使用的酶可舉出脂肪酶、纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶和果膠酶，通過這樣的制造方法得到的酶固定制劑，雖然能夠在酶活性低的物質(zhì)的存在下抑制酶的失活，但是沒有記載酶活性獲得了提高。另外，在這里，實際制造的產(chǎn)品僅有對纖維素酶或蛋白酶適用脂肪含量少的脫脂大豆粉的例子，沒有具體記載使用脂肪酶的例子。
在這樣的情況下，提出了一種脂肪酶粉末制劑和使用噴霧干燥的制造方法，其特征在于，所述脂肪酶粉末制劑為含有來自米根霉(Miizopus oryzae)和/或來自戴爾根霉(Rhizopus delemar)的脂肪酶與脂肪含量為5質(zhì)量％以上的大豆粉末的造粒物(專利文獻10)，公開了其得到了脂肪酶活性顯著提高的脂肪酶粉末制劑?，F(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻專利文獻1:專利文獻2:專利文獻3:專利文獻4:專利文獻5:專利文獻6:專利文獻7:專利文獻8:專利文獻9:專利文獻10
日本專利申請?zhí)亻_昭60-98984號公報日本專利申請?zhí)亻_昭61-2(^688號公報日本專利申請?zhí)亻_平2-138986號公報日本專利申請?zhí)亻_平3-61485號公報日本專利申請?zhí)亻_平H62795號公報日本專利特許第3403202號公報日本專利特許第沈68187號公報日本專利申請?zhí)亻_2000-106873號公報日本專利申請?zhí)亻_平1H46893號公報日本專利申請?zhí)亻_2008-54448號公報
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，提供脂肪酶活性提高的脂肪酶粉末制劑。本發(fā)明的目的還有，提供使用上述脂肪酶粉末制劑的酯交換方法和酯化方法。在努力研究了構(gòu)成脂肪酶粉末制劑的顆粒的物理特性與其脂肪酶活性的關系之后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，顆粒表面存在的小孔的數(shù)量與脂肪酶活性存在很大的關系，根據(jù)該發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明提供了一種脂肪酶粉末制劑，其特征在于，構(gòu)成脂肪酶粉末制劑的顆粒的表面上具有直徑為0. 5-6 μ m的小孔3000-40000個/mm2。本發(fā)明還提供了上述脂肪酶粉末制劑的制造方法，其特征在于，將含脂肪酶的水性液體在噴霧干燥機的送風溫度為40°C以上、且小于70°C的條件下進行噴霧干燥，由此制造所述脂肪酶粉末制劑。本發(fā)明還提供了酯合成物的制造方法，其特征在于，使用上述脂肪酶粉末制劑進行酯交換或酯化。發(fā)明的效果通過本發(fā)明，提供了一種能夠高效進行酯交換反應或酯化反應并且酶活性顯著提高的脂肪酶粉末制劑。特別地，通過本發(fā)明，由于能夠提供脂肪酶自身的酶活性顯著提高的脂肪酶粉末制劑，因此能夠減少酯交換反應或酯化反應的脂肪酶粉末制劑的用量，或者能夠大幅縮短反應時間，能夠安全且低成本地制造食品或食品添加劑。
圖1示出了構(gòu)成在送風溫度為50°C的條件下進行噴霧干燥得到的脂肪粉末制劑的脂肪酶顆粒的2000倍電子顯微鏡照片。圖2示出了構(gòu)成在送風溫度為110°C的條件下進行噴霧干燥得到的脂肪粉末制劑的脂肪酶顆粒的2000倍電子顯微鏡照片。
具體實施例方式在本發(fā)明中，可以使用各種脂肪酶，但優(yōu)選根霉屬的戴爾根霉和米根霉，特別優(yōu)選1，3_特異性脂肪酶。其中，特別優(yōu)選米根霉。作為這樣的脂肪酶，可舉出Robin ( 口匕‘ > )公司的商品=Piccantase (匕。力 > 夕一S )R8000和天野酶制品公司的商品脂肪酶F-AP15等，但最合適的脂肪酶可舉出來自米根霉的天野酶制品公司的商品脂肪酶DF “Amano”15-K(也稱為脂肪酶D)和脂肪酶D “Amano”濃縮物(U "—七D “ 7 " 7 ” ^ >夕)。這些商品為粉末脂肪酶。并且，所述脂肪酶DF "Amano" 15-K之前是來自戴爾根霉的標記。在本發(fā)明中使用的脂肪酶，可以是將含有脂肪酶培養(yǎng)基成分等的含脂肪酶的水溶液干燥得到的，但是優(yōu)選不含有脂肪酶培養(yǎng)基成分等的脂肪酶，即實質(zhì)上由脂肪酶本身構(gòu)成的脂肪酶。本發(fā)明的脂肪酶粉末制劑優(yōu)選通過將使脂肪酶與谷物粉末和/或糖類粉末一并溶解和/或分散所得的含脂肪酶的水性液體進行噴霧干燥來制得。含脂肪酶的水性液體中的水的質(zhì)量相對于脂肪酶的質(zhì)量進行調(diào)整。具體而言，相對于脂肪酶的質(zhì)量，水的質(zhì)量優(yōu)選為2. 0-1000倍，更優(yōu)選為2. 0-500倍，最優(yōu)選3. 0-100倍。這里使用的含脂肪酶的水性液體可舉出除去菌體的脂肪酶培養(yǎng)液、精制培養(yǎng)液、將由這些培養(yǎng)液得到的脂肪酶再次溶解、分散在水中得到的水性液體、市售的液狀脂肪酶等。并且，為了進一步提高脂肪酶的活性，更優(yōu)選除去了鹽類等小分子成分的水性液體，另外，為了進一步提高粉末性狀，更優(yōu)選除去了糖等小分子成分的水性液體。在脂肪酶的培養(yǎng)過程中，作為脂肪酶培養(yǎng)液，可使用含有大豆粉、蛋白胨、玉米漿、K2HPO4, (NH4)2S04、MgSO4 ·7Η20等的水溶液進行培養(yǎng)。這些成分的濃度大豆粉為0. 1-20質(zhì)量％，優(yōu)選1. 0-10質(zhì)量％ ；蛋白胨為0. 1-30質(zhì)量％，優(yōu)選0. 5-10質(zhì)量％ ；玉米漿為0. 1-30質(zhì)量％，優(yōu)選0. 5-10質(zhì)量％求2朋04為0.01-20質(zhì)量％，優(yōu)選0. 1-5質(zhì)量％ ； (NH4)2SO4為0. 01-20 質(zhì)量 ％，優(yōu)選 0. 05-5 質(zhì)量 ％ ；MgSO4 · 7Η20 為 0. 01-20 質(zhì)量 ％，優(yōu)選 0. 05-5 質(zhì)量％。培養(yǎng)條件可控制為培養(yǎng)溫度為10-40°C，優(yōu)選20-35°C，；通氣量為0. 1-2.0VVM，優(yōu)選 0. 1-1. 5VVM ；攪拌轉(zhuǎn)數(shù)為 100_800rpm，優(yōu)選 200-400rpm, pH 為 3. 0-10. 0，優(yōu)選 4. 0-9. 5。脂肪酶培養(yǎng)后的菌體分離優(yōu)選通過離心分離、膜過濾等進行。另外，鹽類和糖等小分子成分的去除可通過UF膜處理進行。具體而言，進行UF膜處理，將含脂肪酶的水溶液濃縮到1/2的體積之后，添加與濃縮液等量的磷酸緩沖液，將上述操作重復1-5次，可獲得除去了小分子成分的含脂肪酶的水溶液。離心分離優(yōu)選控制在200-20000Xg的條件下進行，膜過濾時優(yōu)選將在MF膜、壓濾器等中的壓力控制在3.0kg/m2以下。若為菌體內(nèi)酶，則優(yōu)選通過均化機、高速組織搗碎機(Waring blender)、超聲波破碎、高壓細胞破碎儀(French press)、球磨機等進行細胞破碎，然后通過離心分離、膜過濾等除去細胞殘余物。均化機的攪拌轉(zhuǎn)數(shù)為500-30000rpm，優(yōu)選1000-15000rpm ；高速組織搗碎機的轉(zhuǎn)數(shù)為500-10000rpm，優(yōu)選1000-5000rpm。攪拌時間為0. 5-10分鐘，優(yōu)選1-5分鐘。超聲波破碎可以在l_50kHz、優(yōu)選10_20kHz的條件下進行。球磨機可以使用直徑0. 1-0. 5mm左右的玻璃球。也可以在干燥步驟之前的中間步驟中濃縮含脂肪酶的水溶液。對濃縮方法沒有特別的限定，可舉出蒸發(fā)器、閃蒸器、UF膜濃縮、MF膜濃縮、使用無機鹽類的鹽析、使用溶劑的沉淀法、使用離子交換纖維等的吸附法、使用吸水性凝膠的吸水法等。優(yōu)選的是UF膜濃縮、蒸發(fā)器。UF膜濃縮用組件優(yōu)選截留分子量為3000-100000、優(yōu)選6000-50000的平板膜或中空纖維膜，材質(zhì)優(yōu)選為聚丙烯腈系、聚砜系等。本發(fā)明中使用的脂肪酶如上所述，優(yōu)選除去在菌體和脂肪酶培養(yǎng)液中包含的成分。所述脂肪酶與谷物粉末和/或糖類粉末一并在水中混合，然后通過噴霧干燥進行干燥。對混合的順序沒有特別的限定，但優(yōu)選先將脂肪酶溶解在水中，然后將谷物粉末和/或糖類粉末分散在得到的水溶液中。另外，谷物粉末、糖類粉末優(yōu)選為全脂大豆粉末、脫脂大豆粉末等大豆粉末、小麥粉、米粉、糊精等。通過噴霧干燥將含脂肪酶的水性液體干燥的方法例如有使用噴嘴對流式、圓盤對流式、噴嘴并流式、圓盤并流式等噴霧干燥機的方法。在這種情況下，優(yōu)選將含有脂肪酶和大豆粉末的含脂肪酶的水性液體的溫度調(diào)整為20-40°C，然后進行噴霧干燥處理(干燥氣氛中噴霧)。送風(干燥氣氛)的溫度為40°C以上、且小于70°C，優(yōu)選為40-65°C，更優(yōu)選在40-60°C的送風溫度下進行噴霧。另外，優(yōu)選在干燥前，預先將含脂肪酶的水性液體的PH調(diào)整為7. 5-8. 5。脂肪酶對溫度敏感，在低溫下可抑制酶活性的下降。但是，在本發(fā)明中，相較于16-30°C的低溫區(qū)的送風溫度，送風溫度在40°C以上、且小于70°C的范圍時酶活性更高，因此是優(yōu)選的。在本發(fā)明中，通過上述方法，得到了由顆粒構(gòu)成的脂肪酶粉末制劑，所述顆粒的表面上具有直徑0.5-6 μ m的小孔3000-40000個/mm2。其中，優(yōu)選在其表面上具有直徑0. 5-6 μ m的小孔3000-20000個/mm2，進一步優(yōu)選3000-10000個/mm2。顆粒表面的小孔數(shù)量可以用電子顯微鏡容易地測得。此時，優(yōu)選得到水分含量為10質(zhì)量％以下、特別優(yōu)選1-8質(zhì)量％的脂肪酶粉末制劑。本發(fā)明的脂肪酶粉末制劑的粒徑可為任意的，但優(yōu)選脂肪酶粉末制劑的90質(zhì)量％以上的粒徑為1_150μπι。平均粒徑優(yōu)選為10-80μπι。另外，脂肪酶粉末制劑的形狀優(yōu)選為球狀。脂肪酶粉末制劑的粒徑例如可使用堀場(HORIBA)公司的粒度分布測定裝置(LA-500)進行測定。接下來，對使用本發(fā)明的脂肪酶粉末制劑進行酯交換反應或酯化反應從而得到酯交換產(chǎn)物或酯化物的制造方法進行說明。使用本發(fā)明的脂肪酶粉末制劑進行的酯交換反應，為選自脂肪酸酯、脂肪酸和醇中的一種以上的物質(zhì)與脂肪酸酯之間的酯交換反應，例如可舉出通過常規(guī)方法進行的油脂與油脂之間的酯交換反應、油脂與脂肪酸酯之間的酯交換反應、醇解或酸解的酯交換反應。另外，使用本發(fā)明的脂肪酶粉末制劑進行的酯化反應，為脂肪酸的部分酯與脂肪酸之間的酯化反應，或者為一元或多元醇與脂肪酸之間的酯化反應，例如，可舉出甘油與脂肪酸之間的酯化反應等。更詳細而言，作為油脂與油脂之間的酯交換反應，例如能夠進行菜籽油(長鏈脂肪酸的三酸甘油酯)與三辛酸甘油酯(植物來源的中鏈脂肪酸的三酸甘油酯)之間的酯交換反應，能夠制造長鏈和中鏈混合的三酸甘油酯。另外，作為使用油脂與脂肪酸的酸解的酯交換反應，可大量利用脂肪酶中的1，3-特異性脂肪酶制造構(gòu)造油脂。該反應是在甘油骨架的2位上保留特定的脂肪酸，而將1、3位的脂肪酸置換成目的脂肪酸。得到的產(chǎn)物可在巧克力等使用的油脂中利用，另外也可以用作具有特定的營養(yǎng)效果的油脂。對于使用本發(fā)明的脂肪酶粉末制劑進行酯交換反應或酯化反應的條件沒有特別的限定，可使用常規(guī)方法進行。一般而言，在避免會導致加水分解的水分混入的同時，在常壓或減壓下進行。反應溫度雖然也取決于使用的油脂等原料以及原料混合物的凝固點，但優(yōu)選在20-80°C左右下進行，若不受凝固點的限制，則更優(yōu)選在40-60 V下進行。另外，脂肪酶粉末制劑的向反應原料中的添加量優(yōu)選為0.05-10質(zhì)量％，更優(yōu)選為0.05-5質(zhì)量％。最合適的量根據(jù)反應溫度、設定的反應時間、得到的脂肪酶粉末制劑的活性等進行確定。反應結(jié)束后，脂肪酶粉末制劑通過過濾、離心分離等除去，可重復使用(穩(wěn)定性的評價)直到活性下降到無法制造的程度。因此，通常希望能夠以盡可能少量的昂貴的脂肪酶對脂肪酶粉末制劑同時賦予高活性和高穩(wěn)定性，通過使用本發(fā)明的脂肪酶粉末制劑實現(xiàn)了這一點。由此得到的酯交換產(chǎn)物或酯化物沒有特別的限定，可用作食品領域使用的酯交換油脂或酯化油脂。實施例實施例1天野酶制品公司的商品將商品脂肪酶D "Amano“濃縮物，批號LDD0252201溶解到水中，以形成33600U/ml的酶溶液，邊攪拌邊向其中加入3倍量的脫臭全脂大豆粉末(脂肪含量為23質(zhì)量％，商品名AlphaPlUS HS-600，日清奧利友集團制)的10%懸濁液，并用0. 5N的NaOH溶液將pH調(diào)整至7. 8，得到含脂肪酶的水性液體。將該含脂肪酶的水性液體導入低溫噴霧干燥裝置中，在改變不同的送風溫度的條件下，進行噴霧干燥。得到的脂肪酶粉末制劑的活性用以下方法測定。脂肪酶活件的測定方法向以1 1的比例混合1，2，3_三油酸甘油酯與1，2，3_三辛酸甘油酯得到的油中添加脂肪酶粉末制劑，使其在60°C下發(fā)生反應，在一段時間后進行10 μ 1的取樣，用1. 5ml的己烷稀釋后，將濾掉脂肪酶粉末制劑的溶液作為氣相色譜(GC)樣品。用GC(柱DB-Iht)進行分析，通過下式求得反應率。GC的條件為柱溫150°C，升溫15°C /分鐘，最終溫度370 "C。反應率(％) = [C34area/ (C24area+C34area) ] X 100式中，CM表示1，2，3-三辛酸甘油酯、C34表示1，2，3_三辛酸甘油酯中的一個脂肪酸被置換成油酸之后的物質(zhì)，area為它們的區(qū)域面積。根據(jù)各個時間的反應率，通過分析軟件(origin ver. 6. 1)求得了反應速率常數(shù)k的值。脂肪酶粉末制劑的活性以送風溫度設定為110°C時制造的脂肪酶粉末制劑的活性為100，表示各個溫度的相對活性。結(jié)果總結(jié)在表1中。表1噴霧干燥時的送風溫度和脂肪酶的相對活性
權(quán)利要求
1.一種脂肪酶粉末制劑，其特征在于，構(gòu)成所述脂肪酶粉末制劑的顆粒在其表面上具有直徑 0. 5-6 μ m 的小孔 3000-40000 個 /mm2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪酶粉末制劑，其特征在于，所述顆粒在其表面上具有直徑 0. 5-6 μ m 的小孔 3000-20000 個 /mm2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的脂肪酶粉末制劑，其特征在于，脂肪酶為來自米根霉的脂肪酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的脂肪酶粉末制劑，其特征在于，90質(zhì)量％以上的所述顆粒的粒徑為1-150 μ m。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的脂肪酶粉末制劑，其特征在于，所述脂肪酶粉末制劑用于進行酯交換或酯化。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的脂肪酶粉末制劑，其特征在于，所述脂肪酶粉末制劑通過在噴霧干燥的送風溫度為40°C以上且小于70°C的條件下進行噴霧干燥來制造。
7.—種權(quán)利要求1-5中任一項所述的脂肪酶粉末制劑的制造方法，其特征在于，將含脂肪酶的水性液體在噴霧干燥的送風溫度為40°C以上且小于70°C的條件下進行噴霧干燥來制造所述的脂肪酶粉末制劑。
8.—種酯合成物的制造方法，其特征在于，使用根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的脂肪酶粉末制劑進行酯交換或酯化。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種脂肪酶粉末制劑，組成粉末脂肪酶的脂肪酶顆粒的表面上具有0.5-6μm的小孔3000-40000個/mm2。所述脂肪酶粉末制劑即使在不使用大豆粉末的情況下仍提高了脂肪酶的活性。
文檔編號C12N11/10GK102575238SQ201080040680
公開日2012年7月11日 申請日期2010年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月1日
發(fā)明者中村洋介, 外山裕子, 山內(nèi)良枝, 根岸聰 申請人:日清奧利友集團株式會社