植物或植物細(xì)胞中中斷ckx3和至少另一個(gè)ckx基因得到改良的特性的制作方法

專利名稱：植物或植物細(xì)胞中中斷ckx3和至少另一個(gè)ckx基因得到改良的特性的制作方法
植物或植物細(xì)胞中中斷CKX3和至少另一個(gè)CKX基因得到改
良的特性
背景技術(shù)：
為了能為不斷增長的人口提供食物及其他植物源產(chǎn)品，人們一直對提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)量感興趣。可以各種不同方式來影響植物產(chǎn)量，例如通過改善植物生長特性或者通過延緩葉片衰老。已知許多機(jī)制和通路與植物的生長和發(fā)育有關(guān)。細(xì)胞分裂素(cytokinin)是一種植物激素，在植物生長和發(fā)育的許多方面起著正調(diào)節(jié)和負(fù)調(diào)節(jié)的作用。細(xì)胞分裂素促進(jìn)莖尖分生組織的形成及其活力，能建立庫組織(sink tissue)，延緩葉片衰老，抑制根的生長和分支，并且在種子萌發(fā)和應(yīng)激反應(yīng)中起到作用 (Mok, D. W. S. & Mok, M. C. (2001) Ann. Rev. Plant Physiol. MoI. Bio. 52，89-118)。對缺乏細(xì)胞分裂素的植物進(jìn)行分析表明，細(xì)胞分裂素在莖尖分生組織和根部分生組織中起著相反的作用，從而暗示該激素在器官生長的定量控制中具有很重要的功能(Werner Τ, Motyka V, Laucou V, Smets R，Van Onckelen H, Schmulling Τ, Plant Cell 2003,15(11) :2532-50; Werner T,Motyka V,Strnad M,Schmulling T,Proc Natl Acad Sci U S A 2001,98(18) 10487-92)。細(xì)胞分裂素氧化/ 脫氫酶(Cytokinin oxidases/dehydrogenases, CKX)是調(diào)節(jié)植物激素細(xì)胞分裂素維持體內(nèi)平衡的重要因素。擬南芥屬(Arabidopsis)基因組編碼七個(gè) CKX基因，該七個(gè)CKX基因具有不同的表達(dá)域(Werner等，2001 ；Werner等，200 。各CKX 蛋白具有不同的亞細(xì)胞定位和生化特性(Werner等，200 。通過各單獨(dú)CKX基因的過表達(dá)建立細(xì)胞分裂素缺乏的植物，結(jié)果表明細(xì)胞分裂素是莖尖分生組織活性的正調(diào)節(jié)因子，且是根分生組織活性的負(fù)調(diào)節(jié)因子。最近證實(shí)，在水稻作物中，抑制特定CKX基因(與擬南芥CKX3同源的水稻CKX基因)功能，會(huì)導(dǎo)致所述水稻作物的載粒數(shù)增加(見US2006/0123507A1)。雖然這些結(jié)果是很有希望的，但仍然需要進(jìn)一步提高植物的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供合適的手段和方法，用于生產(chǎn)產(chǎn)量提高和/或生長特性得到改良的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明將按照下文的詳細(xì)描述來實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的。本發(fā)明提供了一種分離的植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物，其中與沒有中斷的對照植物細(xì)胞或?qū)φ罩参锵啾龋龇蛛x的植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物中至少有兩個(gè)不同的細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶基因的表達(dá)和/或活性因中斷而被抑制。其中，第一個(gè)細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶基因是編碼CKX3的內(nèi)源基因或其直系同源序列(orthologue)，第二個(gè)細(xì)胞分裂素氧化 /脫氫酶基因是不同于CKX3的、編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因或其直系同源序列。令人驚訝的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在植物中同時(shí)中斷CKX3基因和編碼CKX2、CKX4、CKX5或
5CKX6中的一個(gè)的第二細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶基因，會(huì)得到種子產(chǎn)量高于缺乏這種中斷的植物的轉(zhuǎn)基因植物，或只有一個(gè)細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶基因被中斷的轉(zhuǎn)基因植物。但是， 單一中斷CKX3僅導(dǎo)致輕微(但不顯著)的種子產(chǎn)量的增加，如US2006/0123507A1中所報(bào)道的；單一中斷CK)(5對于種子產(chǎn)量并沒有可測得的影響。令人驚訝的是，與野生型、單一中斷CKX3和單一中斷CKX5相比，同時(shí)中斷CKX3和CKX2、CKX4、CKX5或CKX6中的一個(gè)，而不是同時(shí)中斷CKX2和CKX4、或CKX2和CKX4和CKX5、或CKX4和CKX6、或CKX5和CKX6，會(huì)導(dǎo)致種子產(chǎn)量顯著增加。同時(shí)中斷CKX3和CK)(5時(shí)，會(huì)觀察到最顯著的種子產(chǎn)量的增加。更令人驚訝的是，與野生型植株和包括單一中斷CKX3或CKX5的轉(zhuǎn)基因植物相比，發(fā)現(xiàn)同時(shí)中斷CKX3和CKX2、CKX4、CKX5或CKX6中的一個(gè)，特別是同時(shí)中斷CKX3和CKX5，會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物的株高顯著增加。因此，同時(shí)中斷至少CKX3和另一個(gè)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因(優(yōu)選CKX1、CKX2、CKX4、CKX5、CKX6或CKX7)，會(huì)得到產(chǎn)量提高和/或生長特性得到改良的轉(zhuǎn)基因植物。 第一方面，本發(fā)明涉及一種分離的植物細(xì)胞，該分離的植物細(xì)胞在至少以下基因中包含中斷 i)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX3基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 1相同或有至少95%—致性的多肽序列；以及ii)與i)中定義的基因不同的、另一個(gè)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因；其中，與缺乏所述中斷的相應(yīng)對照植物細(xì)胞相比，所述中斷抑制至少兩個(gè)中斷的細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶基因的表達(dá)和/或其產(chǎn)物活性。第二方面，本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)基因植物在至少以下基因中包含中斷i)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX3基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 1相同或有至少95%—致性的多肽序列；以及ii)與i)中定義的基因不同的、另一個(gè)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因；其中，與缺乏所述中斷的相應(yīng)對照植物相比，所述中斷抑制至少兩個(gè)中斷的細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶基因的表達(dá)和/或其產(chǎn)物活性。應(yīng)理解，基于本發(fā)明的目的，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因植物”不僅包括含如本發(fā)明所述中斷的植物，而且還指其無論世代號的任何子代，即術(shù)語“轉(zhuǎn)基因植物”包括第一代子代，以及第X代子代，條件是所述子代仍然包含親本轉(zhuǎn)基因植物中所包含的本發(fā)明的中斷。第三方面，本發(fā)明涉及一種相對于相應(yīng)的對照植物、在植物中提高種子產(chǎn)量和/ 或增加株高和/或增加莖粗的方法，該方法包括在植物的至少以下基因中導(dǎo)入中斷
i)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX3基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 1相同或有至少95%—致性的多肽序列；以及ii)與i)中定義的基因不同的、另一個(gè)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因；其中，與缺乏所述中斷的相應(yīng)對照植物相比，所述中斷抑制至少兩個(gè)中斷的細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶基因的表達(dá)和/或其產(chǎn)物活性。第四方面，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)與相應(yīng)的對照植物相比，具有種子產(chǎn)量提高和/ 或株高增加的植物，其中所述植物在至少以下基因中包含中斷i)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX3基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 1相同或有至少95%—致性的多肽序列；以及ii)與i)中定義的基因不同的、另一個(gè)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因；其中，與缺乏所述中斷的相應(yīng)對照植物相比，所述中斷抑制至少兩個(gè)中斷的細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶基因的表達(dá)和/或其產(chǎn)物活性。本發(fā)明還涉及到一種分離的植物細(xì)胞，其中所述分離的植物細(xì)胞在至少以下基因中包含中斷i)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX3基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 1相同或有至少95% —致性的多肽序列；優(yōu)選地， 所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/ 脫氫酶包括與SEQ ID No. 1的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQID No. 1的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 1的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45%、至少50%、至少60%、至少80%、或至少90%—致性的多肽序列；以及ii)至少另一個(gè)內(nèi)源基因a)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKXl基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 13相同或有至少95% —致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 13的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQID No. 13的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 13的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45%、至少50%、至少60%、至少80%、或至少90%—致性的多肽序列；b)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKX2基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 2相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 2的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQID No. 2的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 2 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列；c)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKX4基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 3相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 3的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQID No. 3的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 3 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 %一致性的多肽序列；d)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CK)(5基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 4相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 4的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQID No. 4的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 4 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列；e)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CK)(6基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 5相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 5的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQID No. 5的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 5 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列；或者f)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKX7基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 6相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 6的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQID No. 6的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 6 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列；其中，與缺乏所述中斷的相應(yīng)對照植物細(xì)胞相比，所述中斷抑制至少兩個(gè)中斷的細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶基因的表達(dá)和/或其產(chǎn)物活性。本發(fā)明還涉及一種轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物在至少以下基因中包含中斷i)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX3基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 1相同或有至少95% —致性的多肽序列；優(yōu)選地， 所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/ 脫氫酶包括與SEQ ID No. 1的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQID No. 1的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 1的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45%、至少50%、至少60%、至少80%、或至少90%—致性的多肽序列；以及ii)至少另一個(gè)內(nèi)源基因a)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKXl基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 13相同或有至少95% —致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 13的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 13的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 13的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45%、至少50%、至少60%、至少80%、或至少90%—致性的多肽序列；b)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKX2基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 2相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 2的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 2的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 2 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列；
c)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKX4基因，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 3相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源多肽序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 3的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ ID No. 3的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 3的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列；
d)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CK)(5基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 4相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 4的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 4的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 4 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列；
e)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CK)(6基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 5相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 5的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 5的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 5 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列；
或者
f)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKX7基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 6相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 6的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 6的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 6 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列；
其中，與缺乏所述中斷的相應(yīng)對照植物相比，所述中斷抑制至少兩個(gè)中斷的細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶基因的表達(dá)和/或其產(chǎn)物活性。
本發(fā)明分離的植物細(xì)胞和/或本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物在至少以下基因中包含中斷
i)內(nèi)源CKX3基因或其直系同源序列，所述內(nèi)源CKX3基因包括與SEQ IDNo. 7相同或有至少95%—致性的核酸序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是如下的基因包括與SEQ ID No. 7的300個(gè)核苷酸、優(yōu)選SEQ ID No. 7的500個(gè)核苷酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 7的整個(gè)長度上的連續(xù)核酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的核酸序列；
以及
ii)至少另一個(gè)內(nèi)源基因
a) CKXl基因或其直系同源序列，所述CKXl基因包括與SEQ ID No. 14相同或有至少95%—致性的核酸序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是如下的內(nèi)源基因包括與SEQ ID No. 14的300個(gè)核苷酸、優(yōu)選SEQ ID No. 14的500個(gè)核苷酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 14的整個(gè)長度上的連續(xù)核酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的核酸序列；
b)CKX2基因或其直系同源序列，所述CKX2基因包括與SEQ ID No. 8相同或有至少95%—致性的核酸序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是如下的內(nèi)源基因包括與SEQ ID No. 8的300個(gè)核苷酸、優(yōu)選SEQ ID No. 8的500個(gè)核苷酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 8的整個(gè)長度上的連續(xù)核酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的核酸序列；
c)CKX4基因或其直系同源序列，所述CKX4基因包括與SEQ ID No. 9相同或有至少95%—致性的核酸序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是如下的內(nèi)源基因包括與SEQ ID No. 9的300個(gè)核苷酸、優(yōu)選SEQ ID No. 9的500個(gè)核苷酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 9的整個(gè)長度上的連續(xù)核酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的核酸序列；
d)CKX5基因或其直系同源序列，所述CKX5基因包括與SEQ ID No. 10相同或有至少95%—致性的核酸序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是如下的內(nèi)源基因包括與SEQ ID No. 10的300個(gè)核苷酸、優(yōu)選SEQ ID No. 10的500個(gè)核苷酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 10的整個(gè)長度上的連續(xù)核酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的核酸序列；
e)CKX6基因或其直系同源序列，所述CKX6基因包括與SEQ ID No. 11相同或有至少95%—致性的核酸序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是如下的內(nèi)源基因包括與SEQ ID No. 11的300個(gè)核苷酸、優(yōu)選SEQ ID No. 11的500個(gè)核苷酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 11的整個(gè)長度上的連續(xù)核酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的核酸序列；
或者
f)CKX7基因或其直系同源序列，所述CKX7基因包括與SEQ ID No. 12相同或有至少95%—致性的核酸序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是如下的內(nèi)源基因包括與SEQ ID No. 12的300個(gè)核苷酸、優(yōu)選SEQ ID No. 12的500個(gè)核苷酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 12的整個(gè)長度上的連續(xù)核酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的核酸序列；
其中，與缺乏所述中斷的相應(yīng)對照植物和對照植物細(xì)胞相比，所述中斷抑制至少兩個(gè)中斷的細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶基因的表達(dá)和/或其產(chǎn)物活性。
優(yōu)選地，本發(fā)明分離的植物細(xì)胞和/或本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物在以下基因中包含中斷
i)至少一種編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX3基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 1相同或有至少95% —致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 1的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ ID No. 1的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 1的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45%、至少50%、至少60%、至少80%、或至少90%—致性的多肽序列；
以及
ii)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX5基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 4相同或有至少95% —致性的多肽序列；優(yōu)選地， 所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/ 脫氫酶包括與SEQ ID No. 4的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQID No. 4的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 4的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45%、至少50%、至少60%、至少80%、或至少90%—致性的多肽序列。
優(yōu)選地，本發(fā)明分離的植物細(xì)胞和/或本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物在以下基因中包含中斷
i)內(nèi)源CKX3基因或其直系同源序列，所述內(nèi)源CKX3基因包括與SEQ IDNo. 7相同或有至少95%—致性的核酸序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是如下的基因包括與SEQ ID No. 7的300個(gè)核苷酸、優(yōu)選SEQ ID No. 7的500個(gè)核苷酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 7的整個(gè)長度上的連續(xù)核酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的核酸序列；
以及
ii)內(nèi)源CKX5基因或其直系同源序列，所述CKX5基因包括與SEQ ID No. 10相同或有至少95%—致性的核酸序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是如下的內(nèi)源基因包括與 SEQ ID No. 10的300個(gè)核苷酸、優(yōu)選SEQ ID No. 10的500個(gè)核苷酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 10 的整個(gè)長度上的連續(xù)核酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % — 致性的核酸序列。
在本發(fā)明的分離的植物細(xì)胞和/或本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物中，可通過結(jié)構(gòu)性中斷、 反義多核苷酸基因抑制、雙鏈RNA誘導(dǎo)的基因沉默、核酶技術(shù)、基因組中斷、定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)(tilling)、和/或同源重組來促使產(chǎn)生本發(fā)明的一個(gè)、多個(gè)或所有中斷。
在本發(fā)明的分離的植物細(xì)胞和/或本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物中，本發(fā)明的一個(gè)、多個(gè)或所有中斷可能是純合中斷(homozygous disruption)。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)選選自十字花科(brassicaceae)、更優(yōu)選地選自蕓苔屬 (brassica)或擬南芥屬(arabidopsis)。
本發(fā)明還涉及一種源自本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞、器官、組織或轉(zhuǎn)基因繁殖材料。 其中，轉(zhuǎn)基因繁殖材料包括本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物的組成部分，例如，來自于本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物的種子、塊莖、甜菜根/腫的主根(swollen tap root)、或果實(shí)。
本發(fā)明還涉及一種相對于相應(yīng)的對照植物，提高植物的種子產(chǎn)量和/或增加株高的方法，該方法包括在植物的至少以下基因中導(dǎo)入中斷
i)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX3基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 1相同或有至少95% —致性的多肽序列；優(yōu)選地， 所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/ 脫氫酶包括與SEQ ID No. 1的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQID No. 1的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 1的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45%、至少50%、至少60%、至少80%、或至少90%—致性的多肽序列；
以及
ii)至少另一個(gè)內(nèi)源基因
a)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKXl基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 13相同或有至少95% —致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 13的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 13的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 13的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45%、至少50%、至少60%、至少80%、或至少90%—致性的多肽序列；
b)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKX2基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 2相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 2的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 2的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 2 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列；
c)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶編碼的CKX4基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 3相同或有至少95% —致性的多肽序列；優(yōu)選地， 所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/ 脫氫酶包括與SEQ ID No. 3的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQID No. 3的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 3的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45%、至少50%、至少60%、至少80%、或至少90%—致性的多肽序列；
d)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CK)(5基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 4相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 4的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 4的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 4 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列；
e)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CK)(6基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 5相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 5的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 5的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 5 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列；
或者
f)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKX7基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 6相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 6的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 6的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 6 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列；12
其中，與缺乏所述中斷的相應(yīng)對照植物相比，所述中斷抑制至少兩個(gè)中斷的細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶基因的表達(dá)和/或其產(chǎn)物活性。
本發(fā)明的另一方面涉及一種生產(chǎn)植物、優(yōu)選轉(zhuǎn)基因植物的方法；其中相對于相應(yīng)對照植物，所述本發(fā)明的植物種子產(chǎn)量得到提高和/或株高增加。所述方法包括在植物的至少以下基因中導(dǎo)入中斷
i)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX3基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 1相同或有至少95% —致性的多肽序列；優(yōu)選地， 所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/ 脫氫酶包括與SEQ ID No. 1的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQID No. 1的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 1的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45%、至少50%、至少60%、至少80%、或至少90%—致性的多肽序列；
以及
ii)至少另一個(gè)內(nèi)源基因
a)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKXl基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 13相同或有至少95% —致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 13的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 13的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 13的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45%、至少50%、至少60%、至少80%、或至少90%—致性的多肽序列；
b)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKX2基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 2相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 2的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 2的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 2 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列；
c)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKX4基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 3相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 3的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 3的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 3 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列；
d)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CK)(5基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 4相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 4的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 4的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 4 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列；
e)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CK)(6基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 5相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 5的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 5的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 5 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列；
或者
f)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKX7基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 6相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 6的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 6的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 6 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列；
其中，與缺乏所述中斷的相應(yīng)對照植物相比，所述中斷抑制至少兩個(gè)中斷的細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶基因的表達(dá)和/或其產(chǎn)物活性。
本發(fā)明的方法中，優(yōu)選中斷以下基因
i)至少一種編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX3基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 1相同或有至少95%性一致的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 1的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ ID No. 1的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 1的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45%、至少50%、至少60%、至少 80%、或至少90%—致性的多肽序列；
以及
ii)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX5基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 4相同或有至少95% —致性的多肽序列；優(yōu)選地， 所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/ 脫氫酶包括與SEQ ID No. 4的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQID No. 4的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 4的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45%、至少50%、至少60%、至少80%、或至少90%—致性的多肽序列。
本發(fā)明的方法中，優(yōu)選中斷以下基因
i)內(nèi)源CKX3基因或其直系同源序列，所述內(nèi)源CKX3基因包括與SEQ IDNo. 7相同或有至少95%—致性的核酸序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是如下的基因包括與SEQ ID No. 7的300個(gè)核苷酸、優(yōu)選SEQ ID No. 7的500個(gè)核苷酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 7的整個(gè)長度上的連續(xù)核酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的核酸序列；
以及
ii)至少另一個(gè)內(nèi)源基因
a) CKXl基因或其直系同源序列，所述CKXl基因包括與SEQ ID No. 14相同或有至少95%—致性的核酸序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是如下的內(nèi)源基因包括與SEQ ID No. 14的300個(gè)核苷酸、優(yōu)選SEQ ID No. 14的500個(gè)核苷酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 14的整個(gè)長度上的連續(xù)核酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的CN 102549161 A核酸序列；
b)CKX2基因或其直系同源序列，所述CKX2基因包括與SEQ ID No. 8相同或有至少95%—致性的核酸序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是如下的內(nèi)源基因包括與SEQ ID No. 8的300個(gè)核苷酸、優(yōu)選SEQ ID No. 8的500個(gè)核苷酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 8的整個(gè)長度上的連續(xù)核酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的核酸序列；
c)CKX4基因或其直系同源序列，所述CKX4基因包括與SEQ ID No. 9相同或有至少95%—致性的核酸序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是如下的內(nèi)源基因包括與SEQ ID No. 9的300個(gè)核苷酸、優(yōu)選SEQ ID No. 9的500個(gè)核苷酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 9的整個(gè)長度上的連續(xù)核酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的核酸序列；
d)CKX5基因或其直系同源序列，所述CKX5基因包括與SEQ ID No. 10相同或有至少95%—致性的核酸序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是如下的內(nèi)源基因包括與SEQ ID No. 10的300個(gè)核苷酸、優(yōu)選SEQ ID No. 10的500個(gè)核苷酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 10的整個(gè)長度上的連續(xù)核酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的核酸序列；
e)CKX6基因或其直系同源序列，所述CKX6基因包括與SEQ ID No. 11相同或有至少95%—致性的核酸序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是如下的內(nèi)源基因包括與SEQ ID No. 11的300個(gè)核苷酸、優(yōu)選SEQ ID No. 11的500個(gè)核苷酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 11的整個(gè)長度上的連續(xù)核酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的核酸序列；
或者
f)CKX7基因或其直系同源序列，所述CKX7基因包括與SEQ ID No. 12相同或有至少95%—致性的核酸序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是如下的內(nèi)源基因包括與SEQ ID No. 12的300個(gè)核苷酸、優(yōu)選SEQ ID No. 12的500個(gè)核苷酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 12的整個(gè)長度上的連續(xù)核酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的核酸序列。
本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選方法中，中斷以下基因
i)內(nèi)源CKX3基因或其直系同源序列，所述內(nèi)源CKX3基因包括與SEQ IDNo. 7相同或有至少95%—致性的核酸序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是如下的基因包括與SEQ ID No. 7的300個(gè)核苷酸、優(yōu)選SEQ ID No. 7的500個(gè)核苷酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 7的整個(gè)長度上的連續(xù)核酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的核酸序列；
以及
ii)內(nèi)源CKX5基因或其直系同源序列，所述內(nèi)源CKX5基因包括與SEQ IDNo. 10 相同或有至少95%—致性的核酸序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是如下的內(nèi)源基因包括與SEQ ID No. 10的300個(gè)核苷酸、優(yōu)選SEQ ID No. 10的500個(gè)核苷酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 10的整個(gè)長度上的連續(xù)核酸序列有至少45%、至少50%、至少60%、至少80%、或至少 90%—致性的核酸序列。
在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選的一個(gè)、多個(gè)或所有中斷是純合中斷。
本發(fā)明還涉及由本發(fā)明的方法之一可獲得或獲得的分離的植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物。
在一個(gè)實(shí)施例中，通過在植物細(xì)胞中導(dǎo)入至少一種多核苷酸序列，以在本發(fā)明分離的植物細(xì)胞或本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生至少一個(gè)中斷；其中，所述導(dǎo)入的多核苷酸序列含有與 SEQ ID No. 14 (CKXl)、SEQ ID No. 7 (CKX3)、SEQ ID No. 8 (CKX2)、SEQ ID No. 9 (CKX4)、SEQ ID No. 10 (CKX5)、SEQ ID No. 11 (CKX6)、SEQ ID No. 12(CKX7)、或其子序列、或其互補(bǔ)序列有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約99%、約99. 5%或更高序列一致性的核酸序列，且使所述至少一種多核苷酸序列與啟動(dòng)子正義或反義連接。在另一個(gè)實(shí)施例中，通過導(dǎo)入至少一種用于RNA沉默或 RNA干擾的多核苷酸序列，以在本發(fā)明的植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物中導(dǎo)入中斷。
在另一個(gè)實(shí)施例中，至少一個(gè)上述內(nèi)源基因中的一個(gè)、多個(gè)或所有中斷包括一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)座子的插入。在另一個(gè)實(shí)施例中，一個(gè)、多個(gè)或所有中斷可以包括至少一個(gè)上述內(nèi)源基因中的一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變。
至少一個(gè)上述內(nèi)源基因中的一個(gè)、多個(gè)或所有中斷可以是純合中斷?？蛇x擇地，至少一個(gè)上述內(nèi)源基因中的一個(gè)、多個(gè)或所有中斷可以是雜合中斷。在某些實(shí)施例中，至少一個(gè)上述內(nèi)源基因中的中斷可以包括純合中斷、雜合中斷、或純合中斷和雜合子斷的結(jié)合。
除非另有限定，否則，本發(fā)明使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語所具有的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同。在本發(fā)明的說明書及權(quán)利要求中，下列術(shù)語與下文所記載的定義一致。
在本說明書和所附權(quán)利要求中所用的單數(shù)形式(“a”，“an”和“the”)包括單數(shù)和復(fù)數(shù)，除非文中另有規(guī)定。因此，例如“細(xì)胞(a cell)”包括一個(gè)細(xì)胞、及兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞的結(jié)合等等。
術(shù)語“植物”一般是指以下任意一種整株植物、植物的組成部分或器官(如葉、 莖、根等)、莖部營養(yǎng)器官/結(jié)構(gòu)(如葉、莖和塊莖)、根、花和花器官/結(jié)構(gòu)(如苞片、萼片、 花瓣、雄蕊、心皮、花藥和胚珠)、種子(包括胚、胚乳、種皮)、果實(shí)(成熟的子房)、植物組織 (如維管組織、基本組織等)、愈傷組織培養(yǎng)、植物細(xì)胞(如保衛(wèi)細(xì)胞、卵細(xì)胞、表皮毛等)、及相同的子代。術(shù)語“植物”一般是指所有能夠進(jìn)行光合作用的生物體。本發(fā)明范圍內(nèi)的植物，包括植物領(lǐng)域所有種屬中的高等植物和低等植物。成熟植物是指在幼苗之后任意發(fā)育階段的植物。幼苗是指在早期發(fā)育階段的幼小不成熟的植物。優(yōu)選一年生植物、多年生植物、單子葉植物、和/或雙子葉植物。優(yōu)先考慮十字花科的植物，尤其是蕓苔屬和擬南芥屬的植物。
本發(fā)明所用的植物細(xì)胞還包括，但不限于，得自或發(fā)現(xiàn)于植物或其組成部分中的細(xì)胞。如細(xì)胞可來自或發(fā)現(xiàn)于種子、培養(yǎng)物、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)域、愈傷組織、葉、 根，莖、配子體、孢子體、花粉、及小孢子中。植物細(xì)胞也可以理解為包括從上述組織中獲得的經(jīng)改變的細(xì)胞，如原生質(zhì)體。
本發(fā)明所用的術(shù)語“中斷”或“中斷的”是指基因可以被結(jié)構(gòu)性中斷，以使該基因包括至少一個(gè)突變或結(jié)構(gòu)改變，從而使中斷的基因無法引導(dǎo)全長且全功能基因產(chǎn)物的有效表達(dá)。術(shù)語“中斷”或“中斷的”還包括中斷的基因或其一種產(chǎn)物被功能性抑制或去活性化，從而使基因不表達(dá)、或者不能有效表達(dá)具有全長和/或全功能的基因產(chǎn)物?？赏ㄟ^結(jié)構(gòu)中斷、或在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平干擾表達(dá)，來獲得功能抑制或去活性化。功能抑制或去活性化也可以經(jīng)由以下方法來實(shí)現(xiàn)，例如反義多核苷酸基因抑制、雙鏈RNA誘導(dǎo)的基因沉默、核酶技術(shù)等。表達(dá)和/或活性的抑制可為以下處理的結(jié)果，例如反義結(jié)構(gòu)、正義結(jié)構(gòu)、RNA沉默結(jié)構(gòu)、RNA干擾、基因組中斷(如轉(zhuǎn)座子、定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)、同源重組等)等。由功能抑制實(shí)現(xiàn)的中斷還包括通過與化合物相互作用，來抑制基因或其產(chǎn)物之一；其中，所述化合物優(yōu)選為與所述基因或基因產(chǎn)物有特異性相互作用的化合物?？梢酝ㄟ^以下方法測量表達(dá)和/或活性的抑制情況測定轉(zhuǎn)錄物的存在和/或含量，例如，通過Northern雜交或逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)；和/或測定所述基因編碼的全長或截短的多肽的存在和 /或含量，例如，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)或免疫印跡(Western blotting)；和/或測定中斷的細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶基因產(chǎn)物——細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的活性的存在和/或含量。本發(fā)明所使用的術(shù)語“中斷”或“中斷的”可以理解為，所述中斷還包括只在植物的一個(gè)組成部分、特定細(xì)胞類型或組織(例如生殖分生組織或莖尖)中能夠有效的中斷?？梢酝ㄟ^與編碼區(qū)、非編碼區(qū)、和/或調(diào)控區(qū)(如特定基因的啟動(dòng)子區(qū)域)的相互作用或影響上述區(qū)域，來實(shí)現(xiàn)中斷。
術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”是指并入了核酸序列(包括但不限于基因、多核苷酸、脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)等)和/或變化(例如突變、點(diǎn)突變等)的植物；其中，與未導(dǎo)入的植物不同，所述植物是通過用于生產(chǎn)植物的、且不必是生物學(xué)的方法而導(dǎo)入了所述核酸序列和/或變化。因此，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因植物”不僅包括含有非內(nèi)源核酸的植物，還明確包括內(nèi)源基因發(fā)生突變(如點(diǎn)突變)的植物。其中，與非導(dǎo)入植物相比，所述轉(zhuǎn)基因植物是通過用于生產(chǎn)植物的、且不必是生物學(xué)的方法而導(dǎo)入所述突變。
術(shù)語“內(nèi)源的”涉及已經(jīng)存在于特定細(xì)胞或器官等(如植物)中的任何基因或核酸序列。術(shù)語“外源的”涉及不是內(nèi)源的任何基因或核酸序列。
術(shù)語“轉(zhuǎn)座因子” CTransposable Element, TE)或“轉(zhuǎn)座性遺傳因子”是可以在細(xì)胞內(nèi)從一個(gè)位置移動(dòng)至另一個(gè)位置的DNA序列。轉(zhuǎn)座因子的移動(dòng)可以從附加體到附加體、 從附加體到染色體、從染色體到染色體、或從染色體到附加體。轉(zhuǎn)座因子的特征是在其末端有反向重復(fù)序列。該轉(zhuǎn)移是通過“轉(zhuǎn)座酶”酶介導(dǎo)的。在結(jié)構(gòu)上，基于存在或不存在除了因子轉(zhuǎn)移所必需的那些基因序列之外的基因序列，而將轉(zhuǎn)座因子分別歸類為“轉(zhuǎn)座子”(TN)或 “插入序列因子”(IS因子)。微型轉(zhuǎn)座子或微型-IS因子通常缺乏編碼轉(zhuǎn)座酶的序列。
術(shù)語“核酸”或“多核苷酸”一般是使用其在本領(lǐng)域公認(rèn)的含義，是指RNA或DNA的聚合物、或其類似物，例如，包含核苷酸、肽核酸等的修飾的核苷酸聚合物。在某些應(yīng)用中， 核酸是包括多種單體類型的聚合物，例如同時(shí)包括RNA和DNA亞單位。核酸可以是，例如， 染色體或染色體片段、載體(如表達(dá)載體)、表達(dá)盒(expression cassette)、裸DNA或RNA 聚合物、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的產(chǎn)物、寡核苷酸、探針等。核酸可以是，例如，單鏈和/或雙鏈的。除非另有說明，本發(fā)明的特定核酸序列除了明確表示的任何序列以外，還可以選擇性包括或編碼互補(bǔ)序列。
術(shù)語“多核苷酸序列”、“核酸序列”或“核苷酸序列”是指在單個(gè)核酸中的核苷酸連續(xù)序列、或表示為例如其字串。也就是說，根據(jù)上下文，“多核苷酸序列”是核苷酸的聚合物 (寡核苷酸、DNA、核酸等)、或代表核苷酸聚合物的字串。經(jīng)由任何指定的多核苷酸序列，可確定特定的核酸或互補(bǔ)的多核苷酸序列，例如互補(bǔ)的核酸。
術(shù)語“子序列”或“片段”是整個(gè)序列的任何部分。
“表達(dá)盒”是例如載體(如質(zhì)粒、病毒載體)等核酸結(jié)構(gòu)，能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄本，且能夠潛在地產(chǎn)生多核苷酸序列所編碼的多肽。表達(dá)載體能夠在外源性細(xì)胞(如細(xì)菌細(xì)胞或植物細(xì)胞)中、在體內(nèi)(in vivo)或體外(in vitro)(例如，培養(yǎng)的植物原生質(zhì)體)中產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄本。基于例如選定的啟動(dòng)子，產(chǎn)物的表達(dá)可以是組成性表達(dá)或者誘導(dǎo)性表達(dá)。本定義明確包括沒有被翻譯或不能被翻譯的反義結(jié)構(gòu)、正義結(jié)構(gòu)、或RNA干擾或或沉默結(jié)構(gòu)。在表達(dá)載體的情況中，如果啟動(dòng)子能夠調(diào)節(jié)相關(guān)聯(lián)的多核苷酸序列的表達(dá)，則稱啟動(dòng)子被“可操作性連接”或“功能性連接”至多核苷酸序列。該術(shù)語也適用于可替代的外源性基因結(jié)構(gòu)，如表達(dá)或整合的轉(zhuǎn)基因。同樣地，術(shù)語“可操作性連接”或“功能性連接”同樣適用于替代或補(bǔ)充地與多核苷酸序列相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，如增強(qiáng)子。
如果多核苷酸序列可以被轉(zhuǎn)錄(以剪接或者非剪接形式)和/或翻譯成RNA或多肽、或其子序列，則稱多核苷酸序列、核酸序列或基因“編碼”正義或反義RNA分子、或RNA沉默或干擾分子、或多肽。為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知地，由于遺傳密碼的簡并性，使得許多不同的核酸序列編碼相同的氨基酸序列或多肽，且可無困難地確定給定的核酸序列是否編碼給定的氨基酸序列或多肽。
“基因表達(dá)”或“核酸表達(dá)”是指DNA轉(zhuǎn)錄成RNA(可選地，包括RNA的修飾，如剪接)、RNA翻譯成多肽(可能包括多肽后續(xù)的修飾，例如翻譯后修飾)、或轉(zhuǎn)錄和翻譯都發(fā)生， 根據(jù)上下文決定。
術(shù)語“基因”或“基因序列”廣泛地指與生物學(xué)功能相關(guān)的任何核酸。基因通常包括編碼序列、和/或該編碼序列表達(dá)所需的調(diào)控序列。術(shù)語“基因”適用于特定的基因組序列，同時(shí)還適用于該基因組序列編碼的cDNA或mRNA?；蜻€包括不表達(dá)的核酸片段，來自例如形成其他蛋白的識別序列。不表達(dá)的調(diào)控序列包括結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子等調(diào)控蛋白的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，以在相鄰或附近序列起始轉(zhuǎn)錄。
“多肽”是包括兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基酸殘基的聚合物，如多肽或蛋白。該聚合物還可以包括非氨基酸元素，如標(biāo)記、猝滅劑、保護(hù)基等。另外該聚合物還可以選擇性地包括修飾，如糖基化等。多肽的氨基酸殘基可以是自然的或非自然的，且可以是未被取代的、未經(jīng)修飾的、被取代的或經(jīng)修飾的。
本發(fā)明所使用的“細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶基因”是指編碼具有細(xì)胞分裂素氧化 /脫氫酶活性多肽的基因。細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶是催化如下化學(xué)反應(yīng)的酶
N6_ 二曱基烯丙基腺嘌呤+受體 +H2O ^腺嘌呤+3-曱基丁烯酸+. 還原受體
該酶的三個(gè)底物是N6- 二甲基烯丙基腺嘌呤、受體和H2O,而它的三個(gè)產(chǎn)物是腺嘌呤、3-甲基-2-丁烯醛和還原受體。優(yōu)選地，術(shù)語“細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶活性”包括如下的活性給定多肽利用至少一種細(xì)胞分裂素作為底物，以催化氧化還原反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員具有公知的手段和方法，以確定給定的多肽是否具有細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的活性，或確定特定的多肽或探針的細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶活性水平的絕對值、和/或與另一種多肽或探針相比的相對值。在文獻(xiàn)中有許多如何測試給定多肽的這種活性的指導(dǎo)，例如，18參見ECl. 5. 99. 12。更優(yōu)選地，術(shù)語“細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶活性”包括如下的活性給定多肽利用至少一種細(xì)胞分裂素作為底物，以催化氧化還原反應(yīng)；該活性優(yōu)選不低于AtCKX3 活性的30% (CKX3為SEQ ID No. 1)，優(yōu)選不低于AtCKX3活性的50%。
本發(fā)明使用的術(shù)語“直系同源序列”是指源自同一物種(優(yōu)選不同于擬南芥)的基因，顯示出與擬南芥的特定基因具有最高的相似性，優(yōu)選具有最高的序列一致性，因?yàn)檫@兩個(gè)基因均來自于共同的起源。優(yōu)選地，術(shù)語“直系同源系列”表示編碼細(xì)胞分裂素氧化 /脫氫酶的內(nèi)源基因，包括與所述同源直系序列對應(yīng)的給定序列有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%—致性的序列(多肽或核酸)，優(yōu)選是在特定序列長度上具有上述的序列一致性。更優(yōu)選地，術(shù)語“直系同源序列”表示源自與擬南芥不同種、且編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，包括與所述同源直系序列對應(yīng)的擬南芥給定序列有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%—致性的序列，優(yōu)選是在特定序列長度上具有上述的序列一致性。
術(shù)語“重組”表示通過人為干預(yù)、經(jīng)人工或合成(非天然)的方式改變的材料(如細(xì)胞、核酸或蛋白)。這種改變可以對處于(或移出)自然環(huán)境或自然狀態(tài)中的材料進(jìn)行。 例如，“重組核酸”是指例如在克隆、DNA改組(DNAshufTling)或其他過程中通過重組核酸而得到的核酸；“重組多肽”或“重組蛋白”是重組核酸表達(dá)所產(chǎn)生的多肽或蛋白。重組細(xì)胞的例子包括含有重組核酸和/或重組多肽的細(xì)胞。
術(shù)語“載體”是指可以使核酸在有機(jī)體、細(xì)胞或細(xì)胞組分之間繁殖和/或轉(zhuǎn)移的工具。載體包括可自主復(fù)制或整合到宿主細(xì)胞染色體上的質(zhì)粒、病毒、噬菌體、原病毒、噬菌粒、轉(zhuǎn)座子、及人工染色體等。載體也可以是不能自主復(fù)制的裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、在同一鏈中由DNA和RNA共同組成的多核苷酸、多聚賴氨酸結(jié)合的DNA或RNA、肽結(jié)合的DNA或RNA、脂質(zhì)體結(jié)合的DNA等。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“分離的”是指基本上與其在自然存在的環(huán)境中共存或相互作用的組分分離的生物材料，如核酸或多肽。分離的材料可選地包括沒有在其自然環(huán)境(例如細(xì)胞)中發(fā)現(xiàn)的材料。例如，如果材料仍在其自然環(huán)境，如細(xì)胞中，但被放置在細(xì)胞內(nèi)該環(huán)境中材料非自然存在的位置上，例如，基因組或遺傳因素上。例如，如果由非天然的工具(例如載體，如質(zhì)粒載體、或病毒載體、或擴(kuò)增子)將自然存在的核酸導(dǎo)入對核酸來說非天然存在的基因組的位點(diǎn)(如編碼序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等)上，則該核酸為分離的核酸。分離的植物細(xì)胞，例如，可以在如細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或從細(xì)胞培養(yǎng)純化的環(huán)境中，而不是在野生型植物細(xì)胞的天然環(huán)境(如整個(gè)植物)中。
本發(fā)明使用的“啟動(dòng)子”，包括DNA上游的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域，且參與RNA聚合酶和其他蛋白的識別和結(jié)合，以起始轉(zhuǎn)錄?！爸参飭?dòng)子”是指能夠在植物細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。 植物的啟動(dòng)子的例子包括但不僅限于從植物、植物病毒、及包含在植物細(xì)胞中表達(dá)的基因的細(xì)菌(如農(nóng)桿菌(Agrohacterium)或根瘤菌O^hizobium))中獲得的啟動(dòng)子。在發(fā)育控制下的啟動(dòng)子的例子包括在特定組織(如葉、根、種子)、或在如胚乳、胚或分生區(qū)域等空間優(yōu)先起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子被稱為“組織優(yōu)選”的或“組織特異性”的。時(shí)間調(diào)節(jié)性的啟動(dòng)子在特定時(shí)間啟動(dòng)表達(dá)，如授粉后“0-25天”之間?！凹?xì)胞類型優(yōu)選”啟動(dòng)子，主要在一種或多種器官中一定類型的細(xì)胞中啟動(dòng)表達(dá)，例如，在根或葉的維管細(xì)胞中?！翱烧T導(dǎo)的”啟動(dòng)子是在環(huán)境控制下可誘導(dǎo)或可去抑制的啟動(dòng)子?？赏ㄟ^可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子影響轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的例子，包括厭氧條件或光存在的條件。組織特異性、細(xì)胞類型特異性、和可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子構(gòu)成“非組成性”啟動(dòng)子這一類別?！敖M成性”啟動(dòng)子是指在大多數(shù)環(huán)境條件、 在所有或幾乎所有的組織、在發(fā)育過程的所有或幾乎所有的階段都有活性的啟動(dòng)子。
本發(fā)明使用的“轉(zhuǎn)化”是指如下的過程當(dāng)將外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞膜時(shí)，則稱細(xì)胞被外源DNA“轉(zhuǎn)化”。外源DNA可能整合(共價(jià)連接)或可能沒有整合至構(gòu)成細(xì)胞基因組的染色體DNA上。例如，在原核生物和酵母中，外源DNA可保持在附加因子(如質(zhì)粒)上。對于更高級的真核細(xì)胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為外源DNA整合到細(xì)胞的染色體上，從而能夠通過染色體復(fù)制遺傳給子細(xì)胞。這種穩(wěn)定性指真核細(xì)胞能夠建立含有外源DNA子細(xì)胞群的細(xì)胞系或克隆的能力。
基于本發(fā)明的目的，序列“一致性”是由許多任意方法客觀確定的。熟練的技術(shù)人員熟知這些方法，可以在沒有負(fù)擔(dān)的情況下選擇合適方法?？捎卸喾N確定兩條或兩條以上序列之間關(guān)系(如一致性、相似性和/或同源性)的方法，并且這些方法在本領(lǐng)域是公知的。這些方法包括例如人工比對、計(jì)算機(jī)輔助序列比對、及其組合。很多執(zhí)行序列比對的算法(一般是由計(jì)算機(jī)實(shí)施的)被廣泛使用，或者熟練的技術(shù)人員可以制作序列比對的算法。這些方法包括，例如局部同源性算法(Smith和Waterman(1981)Adv. Appl. Math. 2 482)；同源性比對算法(Needleman 和 Wunsch(1970) J. Mol. Biol. 48 :443)；尋找相似性的方法(Pearson 和 Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85 :2444)；和 / 或這些算法的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)(例如威斯康星遺傳學(xué)軟件包發(fā)布(Wisconsin Genetics Software Package Release) 7. O 中的 GAP、BESTFIT、FASTA、和 TFASTA，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(Genetics Computer Group), 575Science Dr.，麥迪遜，威斯康星州(WI))。
例如，使用BLAST算法執(zhí)行序列一致性(序列相似性)分析的軟件記載于 Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403-410中。這個(gè)軟件是可公開使用的，例如通過在全球性網(wǎng)站ncbi.nlm.nih.gov.的國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)上使用。該算法首先通過識別待查序列中長度為W的短字串確定高得分序列片段(High Sequence I^airs，HSP)，待查序列中長度為W的短字串當(dāng)與數(shù)據(jù)庫序列中長度相同的字串進(jìn)行比對時(shí)匹配或滿足某正閾值得分T。T是指鄰近字串得分閾值。這些初始的鄰近的命中字串作為起始搜索的種子，以尋找包含這些命中字串的更長的HSP。然后該命中字串沿著每條序列向兩側(cè)延伸，直至累計(jì)比對得分是增加的。對于核苷酸序列，使用參數(shù)M(—對匹配殘基的獎(jiǎng)分；總是> 0)和N(不匹配殘基的罰分；始終< 0) 計(jì)算累計(jì)得分。對于氨基酸序列，使用打分矩陣(scoring matrix)來計(jì)算累計(jì)得分。命中字串在每個(gè)方向上的延伸會(huì)在以下情況下停止累計(jì)比對得分自其達(dá)到的最高值下降X ； 由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)得分殘基比對的累積，累計(jì)得分為零或零以下；或者，到達(dá)任一序列的末端。BLAST算法的參數(shù)W、T和X確定比對的靈敏度和速度。對于核苷酸序列而言，BLASTN 程序默認(rèn)使用字串長度(W)為11，預(yù)期值(E)為10，截止值為100，M = 5, N = -4，對兩條鏈均進(jìn)行比對。對于氨基酸序列，BLASTP(BLAST蛋白)程序默認(rèn)使用字串長度(W)為3， 預(yù)期值(E)為 10，使用 BL0SUM62 打分矩陣(參見 Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915)。
此外，BLAST算法執(zhí)行兩個(gè)序列之間相似性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(參見例如Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873-5787)。BLAST 算法提供的相似性的測量標(biāo)準(zhǔn)是最小的總和概率(P(N))，用于指示兩條核苷酸序列或者氨基酸序列之間匹配偶然出現(xiàn)的概率。例如，如果測試核酸與對照核酸比對的最小的總和概率小于約0. 1、或小于約 0.01、甚至小于約0. 001，則認(rèn)為該測試核酸與對照序列是相似的，因此，在本文的上下文中，則認(rèn)為這兩條序列是同源的。
另一個(gè)有用的序列比對算法的例子是PILEUP。PILEUP采用累積、成對的比對方法，從一組相關(guān)序列中創(chuàng)建多序列比對。該算法也可以繪制聚類關(guān)系樹，該聚類關(guān)系用于創(chuàng)建比對。PILEUP 采用了簡化的累積比對方法(Feng & Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35 351-360)。所使用的方法與 Higgins & Sharp ((1989) CABI0S5 :151-153)的方法類似。該程序可以比對例如多達(dá)300條最大長度為5000個(gè)字母的序列。多序列比對程序始于兩條最相似序列的成對比對，產(chǎn)生兩條比對序列的集群。然后該集群與下一個(gè)最相關(guān)序列或比對序列的集群進(jìn)行比對?？梢杂蓛蓷l單獨(dú)序列成對比對的簡單延伸來進(jìn)行兩個(gè)序列集群的比對。通過一系列累積、成對的比對來獲得最終的比對結(jié)果。該程序也可用于繪制代表聚類關(guān)系的系統(tǒng)樹圖或樹。為對照序列的區(qū)域指定特定序列及其氨基酸或者核苷酸坐標(biāo)，從而以運(yùn)行該程序。
另一個(gè)適合多DNA或氨基酸序列比對的算法的例子是CLUSTALW程序(Thompson， J.D.等(1994)Nucl. Acids. Res. 22 :4673-4680)。CLUSTALW 在多組序列之間進(jìn)行多對比較，并基于同源性對這些序列進(jìn)行多重比對。缺口打開和缺口擴(kuò)展的罰分可以例如分別為 10和0.05。對于氨基酸比對，BLOSUM算法可用作蛋白分子重矩陣。參見例如Henikoff和 Henikoff(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915_10919。
本發(fā)明的分離的植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物可以通過如轉(zhuǎn)化等常規(guī)手段獲得。植物細(xì)胞和原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化可以采用對于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的各種方式進(jìn)行，包括但不限于本發(fā)明描述的方法。一般參見《酶學(xué)方法》(Methods in Enzymology), 卷 153，重組 DNA 部分 D(Recombinant DNA Part D) CWu 和 Grossman 編著 1987，科學(xué)出版社(Academic Press) )0本發(fā)明所使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”是指通過導(dǎo)入“異源性”、“外源性”或“異質(zhì)的”核酸序列來改變宿主植物或植物細(xì)胞的基因型。異源性核酸序列不一定需要源自不同的來源，但是對于要導(dǎo)入的細(xì)胞來說，在某種程度上是外來的。除Berger、 Ausubel和Sambrook之外，對于植物細(xì)胞克隆、培養(yǎng)和再生有用的參考資料一般包含 Jones (編著)(19%)的《植物基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)試驗(yàn)方案-分子生物學(xué)方法》(Plant Gene Transfer and Expression Protocols-Methods in Molecular Biology) ^ 49 (Humana Press Towata，新澤西州(NJ)) ；Payne等(1992)的《在液體系統(tǒng)中的植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)〉〉(Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems) (John Wiley & Sons，Inc. 紐約，紐約州(Payne))；以及，Gamborg和Phillips (編著)(1995)的《植物細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)》(Plant Cell, Tissue and Organ Culture)；《基本方法-施普林格實(shí)驗(yàn)手冊》 (Fundamental Methods Springer Lab Manual)(施普林格出版社(Springer-Verlag)(柏林海德堡(Berlin Heidelberg)，紐約(New York)) (Gamborg))。Atlas 和 Parks (編著) 的《微生物培養(yǎng)基手冊》(The Handbook of Microbiological Media) (1993) (CRC 出版社， 博卡拉頓(Boca Raton)，佛羅里達(dá)州(FL)(Atlas))中描述了各種各樣的細(xì)胞培養(yǎng)基。另外還可以在可得到的商業(yè)文獻(xiàn)中找到植物細(xì)胞培養(yǎng)的更多信息，例如西格瑪奧德里奇公司 (Sigma-Aldrich he)(圣路易斯(St Louis)，密蘇里州(MO))提供的《生命科學(xué)研究細(xì)胞培養(yǎng)目錄〉〉(Life Science Research Cell Culture Catalogue, Sigma-LSRCCC) (1998)禾口， 例如，同樣由Sigma-Aldrich公司(St Louis, MO)提供的《植物培養(yǎng)目錄和增刊》(Plant CultureCatalogue and supplement, Sigma—PCCS) (1997)。另夕卜，還可以從 Croy (編著) (1993)的《植物分子生物學(xué)》(Plant Molecular Biology) (Bios科學(xué)出版社，牛津，英國) 中找到關(guān)于植物細(xì)胞培養(yǎng)更多的細(xì)節(jié)。
通過將處于反義或正義結(jié)構(gòu)、或RNA沉默或干擾結(jié)構(gòu)等中的轉(zhuǎn)基因多核苷酸序列導(dǎo)入植物細(xì)胞或植物中，并在其中進(jìn)行表達(dá)，從而促使在至少上述一個(gè)內(nèi)源基因中發(fā)生一個(gè)、多個(gè)或所有中斷；其中，轉(zhuǎn)基因多核苷酸序列包括以下核酸序列或其互補(bǔ)序列
a)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX3基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 1相同或有至少95%—致性的多肽序列；
b)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKXl基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括SEQ ID No. 13的多肽序列；
c)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX2基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 2相同或有至少95%—致性的多肽序列；
d)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX4基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 3相同或有至少95%—致性的多肽序列；
e)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX5基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 4相同或有至少95%—致性的多肽序列；
f)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX6基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 5相同或有至少95%—致的多肽序列；
g)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX7基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 6相同或至少95% —致性的多肽序列；
或者
h)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因的序列或子序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 1、2、3、4、5、6或13中的一條序列上的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選100 個(gè)氨基酸、更優(yōu)選在整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45%、至少50%、至少60%、至少 80%、或至少90%—致性的多肽序列；
且所述轉(zhuǎn)基因多核苷酸序列包括啟動(dòng)子。從而與相應(yīng)的缺乏這種中斷的對照植物細(xì)胞或植物(如非轉(zhuǎn)基因親本或同一種的非轉(zhuǎn)基因植物)相比，所述轉(zhuǎn)基因多核苷酸序列至少能夠抑制中斷的細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶基因的表達(dá)和/或活性。轉(zhuǎn)基因的核苷酸序列可以采用如下方法(但不限于)導(dǎo)入，例如電穿孔、微彈轟擊、土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、 或其他可用的方法。在本發(fā)明的某些方面，核苷酸正向或反向地連接在啟動(dòng)子上，或設(shè)置為 RNA沉默或RNA干擾。
描述同源依賴性基因沉默的應(yīng)用的相關(guān)文獻(xiàn)包括Jorgensen，Trends Biotechnol. 8 (12) :340-344 (1990) ；Flavell, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 91 3490-3496(1994) ；Finnegan 等,Bio/Technology 12 :883-888(1994) ；Neuhuber 等， Mol. Gen. Genet. 244 :230-241 (1994) ；Flavell 等，(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :3490-3496 Jorgensen 等，(1996)Plant Mol. Biol. 31 :957-973 Johansen 和 Carrington (2001) Plant Physiol. 126 :930-938 ；Broin (2002) Plant Cell 14: 1417-1432 ；Stoutjesdijk 等，(2002)Plant Physiol. 129 :1723-1731 ；Yu 等，(2003) Phytochemistry 63 :753-763 ；和美國專利號 5，034，323,5, 283，184 和 5，942，657。
此外，另一種基因沉默的方法，可以利用反義技術(shù)，如Rothstein等Plant Mol. Cell. Biol. 6 :221-246(1989) ；Liu等(2002)Plant Physiol. 129 :1732-1743和美國專利號 5，759，8 和5，942，657。反義核酸的使用在本領(lǐng)域中是公知的。反義核酸具有與特定基因組基因序列、mRNA、或cDNA等目標(biāo)核酸互補(bǔ)的區(qū)域。反義核酸可以是RNA、DNA、PNA或任何其他適合的分子。反義序列與其互補(bǔ)的正義序列形成雙鏈體，從而導(dǎo)致該基因失活。反義核酸通過與基因轉(zhuǎn)錄的RNA形成雙鏈體、與雙鏈DNA形成三鏈體等來抑制該基因的表達(dá)。反義核酸可以經(jīng)由許多已得到確認(rèn)的技術(shù)來制備，例如，反義RNA或寡核苷酸的化學(xué)合成法或體外轉(zhuǎn)錄法；其中，化學(xué)合成的反義RNA或寡核苷酸可選地包括修飾的核苷酸和/或鍵，以增強(qiáng)抗降解的能力或提高被細(xì)胞吸收的能力。反義核酸及其使用描述在如下文獻(xiàn)中，例如 Haselton和Alexander的USP6, 242，258 (2001年6月5號)，題目為《由光活化選擇性調(diào)控 DNA和 RNA轉(zhuǎn)錄和翻譯的方法》(Methods for the selective regulation of DNA and RNA transcription and translation by photoactivation) ；USP6, 500, 615 ；USP6, 498, 035 ； USP6, 395，544 ;USP5, 563，050 ;Ε· khuch 等(1991) Symp Soc. Exp Biol 45:117-127; de Lange 等，(1995)Curr Top Microbiol Immunol 197:57-75 ；Hamilton ^ (1995)Curr Top Microbiol Immunol 197 :77-89 ；Finnegan φ, (1996)Proc Natl Acad Sci USA93 8449-8454 ；Uhlmann 禾口 k. Pepan (1990)，Chem. Rev. 90 :543 ；P. D. Cook (1991)，Anti-Cancer Drug Design 6 585 ；J. Goodchild,Bioconjugate Chem. 1 (1990) 165 ；以及，S. L. Beaucage 和 R. P. Iyer (1993)，Tetrahedron 49 :6123 ；以及 F. Eckstein 編著(1991)，《寡核苷酸及其 ^IMlJ - ^ )) (Oligonucleotides and Analogues-A Practical Approach), IRL [ij 版社。
催化RNA分子或核酶也可以用來抑制特定基因的表達(dá)?？梢栽O(shè)計(jì)核酶，以使該核酶在實(shí)際操作中與任何期望的目標(biāo)RNA進(jìn)行配對，并在特異位置剪切磷酸雙酯骨架，從而使目標(biāo)RNA功能性失活。在進(jìn)行這種剪切時(shí)，核酶本身并未改變，因此能夠重復(fù)使用，以剪切其他分子。如果反義RNA內(nèi)包含核酶序列，則可給予該反義RNA的RNA-切割活性，從而增加了該反義RNA結(jié)構(gòu)的活性。已經(jīng)確定了許多核酶種類，例如，一類核酶衍生自許多小的環(huán)狀RNA，該環(huán)狀RNA在植物中具有能自剪切和復(fù)制的能力。RNA可以獨(dú)自復(fù)制(類病毒RNA)， 或使用輔助病毒(衛(wèi)星RNA)進(jìn)行復(fù)制。RNA的例子包括源自鱷梨日斑類病毒(avocado sunblotch viroid)的RNA ；以及，源自煙草環(huán)斑病毒(tobacco ringspot virus)、紫花苜蓿短暫條紋病毒(lucerne transient streak virus)、M毛 草斑駁病毒(velvet tobacco mottle virus)、5H屬植物斑駁病毒(solanum nodiflorum mottle virus)和地三葉草斑駁病毒(subterranean clovermottle virus)的衛(wèi)星RNA。對目標(biāo)RNA-特異性核酶的設(shè)計(jì)和使用已有描述。參見例如，Haseloff 等(1988) Nature, 334 =585-591
通過抑制表達(dá)使特定選擇的基因失活的另一種方法是正義抑制。已證實(shí)，其中核酸相對于啟動(dòng)子是正向配置的表達(dá)盒的導(dǎo)入，是阻斷期望目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的有效手段。參見， 例如，Napoli 等(1990)，The Plant Cell 2 :279_289，和美國專利號 5，034，323、5，231，020 和 5，283，184。
也可以使用RNA沉默或RNA干擾(RNAi)技術(shù)來制造本發(fā)明的中斷。RNA沉默或RNA 干擾也可以稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)或共抑制。在本發(fā)明的上下文中，“RNA沉默”(也稱為RNAi或RNA介導(dǎo)的干擾)是指如下的機(jī)制通過該機(jī)制，存在于細(xì)胞中的單鏈RNA或典型的雙鏈RNA抑制目標(biāo)基因的表達(dá)；其中該目標(biāo)基因包含與該RNA相同或幾乎相同的序列。該機(jī)制包括，但不僅限于RNA干擾；抑制目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的目標(biāo)mRNA的翻譯，且不會(huì)改變該mRNA的穩(wěn)定性；以及，轉(zhuǎn)錄沉默，如導(dǎo)致目標(biāo)mRNA轉(zhuǎn)錄被抑制的組蛋白乙酰化和異染色質(zhì)的形成。在“RNA干擾”中，存在于細(xì)胞中的單鏈RNA或雙鏈RNA導(dǎo)致核苷酸鏈內(nèi)切，隨后使目標(biāo)mRNA發(fā)生降解。
在一個(gè)實(shí)施例中，將轉(zhuǎn)基因(例如感興趣的基因或編碼序列的序列和/或子序列) 導(dǎo)入植物細(xì)胞，通過RNA沉默或RNA干擾(RNAi)來中斷一個(gè)或多個(gè)基因。例如，序列或子序列(轉(zhuǎn)基因)包括小的子序列，例如長度約21-25個(gè)堿基；較大的子序列，例如長度約 25-100或100-2000 (或約200-1500，約250-1000等)個(gè)堿基；和/或，整個(gè)編碼序列或基因。所述序列或子序列選自以下序列或其互補(bǔ)序列
a)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX3基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 1相同或至少有95%—致性的多肽序列；
b)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKXl基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 13相同或至少有95%—致性的多肽序列；
c)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX2基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 2相同或至少有95%—致性的多肽序列；
d)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX4基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 3相同或至少有95%—致性的多肽序列；
e)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX5基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 4相同或至少有95%—致性的多肽序列；
f)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX6基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 5相同或至少有95%—致性的多肽序列；
g)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX7基因的序列或子序列或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 6相同或至少有95%—致性的多肽序列；
或者
h)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因的序列或子序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID Nos:l、2、3、4、5、6或13中的一條序列的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選100 個(gè)氨基酸、更優(yōu)選整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45%、至少50%、至少60%、至少 80 %、或至少90 % —致性的多肽序列。
優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因包括在序列或子序列中包含長度約21-25個(gè)堿基、且與SEQID No. 7、8、9、10、11、12或14有至少80%、至少90%、或至少99% —致性的區(qū)域。
例如通過發(fā)夾(莖環(huán))RNA的表達(dá)或干擾RNA雙鏈的表達(dá)，利用RNAi在許多細(xì)胞類型(包括，如植物細(xì)胞)和器官中抑制基因表達(dá)，這在很多文獻(xiàn)中有很清楚的描述。另外，確定靶向期望基因的適當(dāng)干擾RNA的方法、及產(chǎn)生該干擾RNA的方法同樣在文獻(xiàn)中有詳細(xì)的描述。例如，RNA干擾描述在以下文獻(xiàn)中，例如美國專利申請公開20020173478、 20020162126 禾口 20020182223 ;Cogoni 禾口 Macino(2000)，"Post—transcriptional gene silencing across kingdoms"Genes Dev. , 10 :638-643 ；Guru T. (2000),“A silence that speaks volumes"Nature 404:804-808 ；Hammond (2001),"Post-transcriptional Gene Silencing by Double-stranded RNA"Nature Rev. Gen. 2 :110-119) ；Napoli 等， (1990) “Introduction of a chalcone synthase gene into Petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trayas. "Plant Cell 2 :279-289 ；寸。
例如，在組成性啟動(dòng)子、可誘導(dǎo)啟動(dòng)子、或組織特異性啟動(dòng)子的控制下，表達(dá)要表達(dá)以誘導(dǎo)RNAi的多核苷酸序列或子序列。在特定實(shí)施例中，在組織特異性啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行表達(dá)是有利的。
可以經(jīng)由，例如基于轉(zhuǎn)座子的基因失活來導(dǎo)入至少一個(gè)上述內(nèi)源基因中的一個(gè)、 多個(gè)或所有的中斷。例如，失活步驟包括在以下基因中產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)突變
i)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX3基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 1相同或有至少95% —致性的多肽序列；優(yōu)選地， 其中直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/ 脫氫酶包括與SEQ ID No. 1的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQID No. 1的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 1的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45%、至少50%、至少60%、至少80%、或至少90%—致性的多肽序列；
禾口/ 或
ii)至少另一個(gè)內(nèi)源基因
a)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKXl基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 13相同或有至少95% —致性的多肽序列；優(yōu)選地，其中直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 13的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 13的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 13的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45%、至少50%、至少60%、至少80%、或至少90%—致性的多肽序列；
b)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKX2基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 2相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，其中直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 2的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 2的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 2 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列；
c)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKX4基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 3相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，其中直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 3的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 3的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 3 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列；
d)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CK)(5基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 4相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，其中直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 4的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 4的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 4 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列；
e)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CK)(6基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 5相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，其中直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 5的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 5的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 5 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列；
或者
f)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKX7基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 6相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，其中直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 6的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 6的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 6 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列；
其中，基因序列中的一個(gè)或多個(gè)突變包括一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)座子的插入。并且與缺乏這種中斷的相應(yīng)對照植物細(xì)胞或植物相比，其中所述中斷至少抑制中斷的細(xì)胞分裂素氧化 /脫氫酶基因的表達(dá)和/或活性。例如，所述一個(gè)或多個(gè)突變包括在上述一個(gè)或多個(gè)基因中的純合中斷；或所述一個(gè)或多個(gè)突變包括在上述一個(gè)或多個(gè)基因中的雜合中斷、或純合中斷和雜合中斷的結(jié)合。
在20世紀(jì)40年代后期，Barbara McClintock首次在玉米中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)座子。在植物基因誘變中通常使用轉(zhuǎn)座因子的Mutator家族，例如Robertson' s Mutator (Mu)轉(zhuǎn)座因子。因?yàn)樵摷易宕嬖诟呖截悢?shù)(10-100)，且優(yōu)選插入基因中和基因附近。
轉(zhuǎn)座因子基于其轉(zhuǎn)座模式，可以分為兩大類，且命名為類I和類II。這兩類轉(zhuǎn)座因子都可用作致變物和傳遞載體。類I轉(zhuǎn)座因子由RNA作介導(dǎo)并使用反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行轉(zhuǎn)座，也就是說，類I轉(zhuǎn)座因子是逆轉(zhuǎn)錄因子。類I轉(zhuǎn)座因子至少有三種類型，如反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子、返座元(retroposon)、短散在核重復(fù)序列類(SINE-Iike)因子。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子通常包含長末端重復(fù)序列(LTR)、編碼病毒外殼蛋白(gag)和反轉(zhuǎn)錄酶的基因、核糖核酸酶(RNase)H、整合酶基因和聚合酶(pol)基因。已描述，在植物物種中存在大量的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。在反轉(zhuǎn)錄酶和RNase H催化的反應(yīng)中，這種反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子經(jīng)由RNA中間體進(jìn)行活動(dòng)和移位；其中， 反轉(zhuǎn)錄酶和RNase H是由轉(zhuǎn)座子編碼的。歸入Tyl-copia和Ty3-gypsy組的例子也可歸入 SINE-Iike和長散在核重復(fù)序列類(LINE-Iike)的分類中。在Kumar和Bennetzen(1999) Plant Retrotransposons (Annual Review of Genetics 33 :479)中可以找至Ij更詳細(xì)的討論。
此外，還發(fā)現(xiàn)DNA轉(zhuǎn)座因子，如Ac，Taml和En/Spm，廣泛存在于種類繁多的植物種類中，且這些DNA轉(zhuǎn)座因子可以用于本發(fā)明中。
轉(zhuǎn)座子(和IS因子)是在植物細(xì)胞中導(dǎo)入突變的常用工具。例如通過有性雜交 (sexual cross)，將這些可移動(dòng)的遺傳因子傳遞到細(xì)胞中。例如，為了得到感興趣的表型， 而選擇轉(zhuǎn)座和篩選得到的插入突變體。然后可以通過分離的或轉(zhuǎn)基因植物與非中斷植物進(jìn)行雜交，如通過有性雜交，將中斷的基因?qū)肫渌参镏?。根?jù)要雜交的物種，可使用任何標(biāo)準(zhǔn)的育種技術(shù)。轉(zhuǎn)座子(TN)在分離的或轉(zhuǎn)基因植物基因組內(nèi)的位置可由已知方法確定， 例如，通過本發(fā)明描述的側(cè)翼區(qū)的測序。例如，可使用依據(jù)植物的PCR反應(yīng)，以擴(kuò)增序列，這樣可以進(jìn)行診斷性測序，以確認(rèn)該序列的來源?？蛇x擇地，篩選插入突變體，以得到具有期望表型的突變體。如相比對照植物，感興趣基因的表達(dá)或活性被抑制。
定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)也可以被用來確定本發(fā)明的中斷。定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)。參見，例如，McCallum等，(2000)， "Targeting Induced Local Lesion In Genomes(TILLING)for Plant Functional Genomics" Plant Physiology 123 :439-442 ；McCallum^, (2000), "Targeted screening for induced mutations"Nature Biotechnology 18 :455-457 ； 1 ,Colbert (2001), "High—Throughput Screening for the Induced Point Mutation" Plant Physiology 126 :480-484o
定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)結(jié)合了高密度點(diǎn)突變和突變的快速靈敏檢測。典型地，使用甲烷磺酸乙酯(EMS)誘變處理植物種子。EMS使鳥嘌呤烷基化，而這通常會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)配。例如，將種子浸泡在約10-20mM的EMS溶液中，約10-20小時(shí)；然后洗凈種子，隨后進(jìn)行播種。這一代的植物被稱為Ml。然后Ml植物進(jìn)行自花受精。存在于形成繁殖組織的細(xì)胞中的突變，會(huì)遺傳給下一代(M》。典型地，篩選M2植物，以得到在期望的基因中存在突變和 /或具有特定表型的植物。例如，將源自M2植物的DNA制成基因庫，然后通過檢測異源雙鏈的形成來檢測感興趣基因中的突變。典型地，從每株M2植物制備DNA，并將該DNA制成基因庫。通過PCR擴(kuò)增期望的基因。然后將制庫的樣品變性、退火，以形成異源雙鏈。如果突變存在于其中一株植物中，則PCR產(chǎn)物將有兩種類型野生型和突變型。通過分離PCR反應(yīng)產(chǎn)物，例如通過變性高效液相色譜法(DPHPLC)，來確認(rèn)包括異源雙鏈的基因庫。DPHPLC檢測異等位DNA在解鏈和退火過程中形成的異源雙鏈中的錯(cuò)配。在加熱DNA的同時(shí)，進(jìn)行色譜分析。異源雙鏈具有較低的熱穩(wěn)定性，且形成氣泡，從而導(dǎo)致異源雙鏈在色譜柱中運(yùn)動(dòng)更快。因此當(dāng)異源雙鏈與預(yù)期的同源雙鏈同時(shí)存在時(shí)，可以看到雙峰。從而確認(rèn)出在感興趣基因上發(fā)生了突變的基因庫。然后，可確認(rèn)組成該選出的基因庫群組的、源自植物的各DNA， 并對其進(jìn)行測序?？蛇x擇地，在感興趣的基因上具有期望突變的植物可以與其他植物雜交， 以去除背景突變。
其他誘變方法也可以用于導(dǎo)入本發(fā)明的中斷。在植物基因中導(dǎo)入突變及選擇具有理想性狀的植物的方法是公知的。例如，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，種子或其他植物材料可以用具有致突變的化學(xué)物質(zhì)處理。這些化學(xué)物質(zhì)包括，但不僅限于硫酸二乙酯、吖丙啶和N-亞硝基-N-乙基脲?？商娲?，可以使用來自例如X射線或伽瑪射線源的電離輻射進(jìn)行誘變。
可采用的檢測感興趣基因中突變的其他方法，如毛細(xì)管電泳(如固定變性劑毛細(xì) iWffe^Ic (constant denaturant capillary electrophoresis)禾口Hl構(gòu)|胃構(gòu)多 術(shù)(single-stranded conformational polymorphism))。在另一個(gè) 歹Ij子中，異源雙鏈可以用錯(cuò)配修復(fù)酶學(xué)(如源自芹菜的核酸內(nèi)切酶CEL I)進(jìn)行檢測。CEL I識別錯(cuò)配，并在錯(cuò)配的3'側(cè)進(jìn)行精確切割。因此可由錯(cuò)配修復(fù)酶進(jìn)行切割，然后進(jìn)行例如變性凝膠電泳，以確定錯(cuò)配堿基的精確位點(diǎn)。參見，例如01eykowski等，(1998)/‘Mutation detection using a novel plant endonuclease"Nucleic Acid Res. 26 :4597-4602 ；禾口，Colbert等，(2001)， "High—Throughput Screening for Induced Point Mutations", Plant Physiology 126 480-484。
本發(fā)明的包含期望中斷的植物可以與其他植物雜交，以將該中斷導(dǎo)入另一植物中。這可以通過標(biāo)準(zhǔn)的育種技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。
同源重組也可用于導(dǎo)入本發(fā)明的中斷。已證明植物中存在同源重組。參見，例如Puchta 等(1994)，Experientia 50 :277-284 ；Swoboda 等(1994)，EMB0J. 13 :484-489 ； Offringa 等(1993)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :7346-7350 ；Kemp in 等(1997)Nature 389 :802-803 ； VX R, Terada φ, (2002), "Efficient gene targeting by homologous recombination in rice" Nature Biotechnology,20 (10) :1030_1034o
同源重組經(jīng)由特異性靶向體內(nèi)感興趣的基因，可用于誘導(dǎo)目標(biāo)基因的改變。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，在選定基因序列的選定部位(包括5'上游、3'下游和內(nèi)含子(intragenic region))體外制造突變，并將該突變的基因?qū)肫谕闹参镏?；其中，該選定的基因序列例如
i)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX3基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 1相同或有至少95% —致性的多肽序列；優(yōu)選地， 所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/ 脫氫酶包括與SEQ ID No. 1的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQID No. 1的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 1的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45%、至少50%、至少60%、至少80%、或至少90%—致性的多肽序列；
和/ 或
ii)至少一個(gè)內(nèi)源基因
a)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKXl基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 13相同或有至少95% —致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 13的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 13的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ IDNo. 13的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45%、至少50%、至少60%、至少80%、或至少90%—致性的多肽序列；
b)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKX2基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 2相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 2的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 2的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 2 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列；
c)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKX4基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 3相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 3的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 3的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 3 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列；
d)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CK)(5基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 4相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 4的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 4的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 4 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列；
e)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CK)(6基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 5相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 5的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 5的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 5 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列；
或者
f)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKX7基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 6相同或有至少95%—致性的多肽序列；優(yōu)選地，所述直系同源序列是編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因，且所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 6的50個(gè)氨基酸、優(yōu)選SEQ IDNo. 6的100個(gè)氨基酸、更優(yōu)選SEQ ID No. 6 的整個(gè)長度上的連續(xù)氨基酸序列有至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少80 %、或至少90 % 一致性的多肽序列。
突變基因與目標(biāo)野生型基因相互作用，以使轉(zhuǎn)基因植物中出現(xiàn)同源重組，從而使野生型基因發(fā)生靶向置換。
本發(fā)明的分離的植物細(xì)胞和/或轉(zhuǎn)基因植物，可以由人類和動(dòng)物食用，也可例如直接或經(jīng)已知的處理之后，作為食品或飼料使用。
本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明上述分離的植物細(xì)胞和/或轉(zhuǎn)基因植物、細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)、組成部分(例如，根、葉等轉(zhuǎn)基因植物的器官)、及源自轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因繁殖材料(如種子、塊莖、甜菜根/腫的主根或果實(shí))，以制造食品或飼料、藥物或精細(xì)化學(xué)品。
下面，本發(fā)明將通過實(shí)例作進(jìn)一步地說明。


圖1為在ckx突變體中T-DNA和轉(zhuǎn)座子插入的位置；通過PCR篩選確定插入的突變體，由對邊界序列的DNA進(jìn)行測序確定插入位點(diǎn)；黑色方格代表外顯子，白色方格代表內(nèi)含子，三角形表明 T-DNA 插入；G，GABI-KAT T-DNA-組織(collection) ；S, Salk T-DNA-組織；T，托里梅薩(Torrey Mesa) T-DNA-組織；Z，ZIGIA轉(zhuǎn)座子組織；
圖2為ckx T-DNA和轉(zhuǎn)座子插入的等位基因的特性；CKX基因在插入突變體中不表達(dá)；以來自10日齡幼苗的RNA作為模板，進(jìn)行RT-PCR分析；擴(kuò)增肌動(dòng)蛋白(Actin)2作為對照；
圖3為在ckx3 ckx5突變體和野生型花序中細(xì)胞分裂素的含量；每個(gè)樣品采集0. 5 克的擬南芥花序，并制成基因庫30DAG ；每種基因型采集五個(gè)獨(dú)立的生物樣品；其中數(shù)據(jù)為細(xì)胞分裂素含量的平均值[pmol/g鮮重]士 s.d. ；η = 5 ；tZ，反式玉米素；tZR，反式玉米素核苷；tZRMP，反式玉米素核苷-5'-單磷酸；tZ9G，反式玉米素9-葡萄糖苷；tZROG，反式玉米素核苷0-葡萄糖苷；iP，N6_(A2異戊烯基)腺嘌呤；iPR，N6_(A2異戊烯基)腺苷；iPRMP， Ν6-(Δ2異戊烯基)腺嘌呤5'-單磷酸；iP9G，N6-(A2異戊烯基)腺嘌呤9-葡萄糖苷；
圖4為野生型和ckx突變體的莖形態(tài)學(xué)的比較；在一個(gè)生命周期中，野生型和ckx 突變體的主莖結(jié)出的角果數(shù)目；野生型植株結(jié)出7個(gè)角果(100%)；株高為擬南芥野生型和ckx突變體在開花結(jié)束時(shí)的株高；野生型植株的高度為39. 5厘米(100% )；數(shù)據(jù)表示平均值士 s.d. (η = 13-17) ；*，P < 0.01，與野生型相比較；· = P < 0. 01，與ckx3相比較。
圖5為ckx突變體的花表型和種子產(chǎn)量；a，b，發(fā)育階段13的花(a)及相應(yīng)的雌蕊 (b)，從左至右為野生型、ckx3、ckx5、和ckx3 ckx5 ；c, ckx突變體發(fā)育階段14的花的花瓣表面，39DAG(n = 30) ；d，每個(gè)雌蕊群的胚珠數(shù)(n = 12) ；e，野生型和ckx3 ckx5在生長箱條件下的種子產(chǎn)量(n = 30)；數(shù)據(jù)為平均值士s. d. ；*，P < 0. 01，與野生型相比較；
圖6為一個(gè)生命周期中，野生型和ckx突變體主莖結(jié)出的角果的數(shù)目(η = 15)；野生型植株結(jié)有討.7個(gè)角果(100%)；數(shù)據(jù)為平均值士 s.d. ；*，P< 0.01，與WT相比較；·， P<0. 01，與ckx3相比較;
圖7為野生型和ckX3ckX5突變體的幼胚珠；根據(jù)khneitz等描述的方法確定胚珠的發(fā)育階段；比例尺10μπι ；與野生型植株相比，ckx3 ckx5突變體的胚珠的數(shù)量增加。
具體實(shí)施方式
實(shí)例
方法
植物材料和生長條件
使用擬南芥Columbia(Col-O)的生態(tài)型作為野生型。T-DNA插入突變體 ckx2-Sl(SALK_068485)、 ckx3_Sl(SALK_050938)、 ckx4_Sl(SALK_055204)、 ckx5-Sl(SALK_064309)、及ckx6-Sl(SALK_070071)來自薩克研究所基因組分析實(shí)驗(yàn)室CN 102549161 A(Salk institute genomic analysis laboratory)(Alonso 等，(2003)Science 301， 653-657)；轉(zhuǎn)座子插入突變體ckx4-Z來自ZIGIA轉(zhuǎn)座子組織(Baumann E, Lewald J, Saedler H, Schulz B, Wisman E (1998)SuccessfulPCR-based reverse genetic screens using an En-7-mutagenised Arabidopsis thaliana population generated via single-seed descent. Theoretical and Applied Genetics 97:729-734) ；ckx5_G2(系編號 332B 10)和 ckx7-Gl (系編號 363C02)來自 GABI-KAT 組織(Rosso，Μ. G.，Li, Y.， Strizhov, N. ， Reiss, B. ， Dekker, K.，禾口 Weisshaar， B. (2003)Plant Mol.Biol.53， 247-259)；以及，ckx7-Tl (SAIL_515_A07)來自托里梅薩研究所(現(xiàn)為先正達(dá)公司 (Syngenta))。為了驗(yàn)證T-DNA插入基因組引物1和左邊緣引物，并找到純合系，而采用基因組引物1和2(表1)。通過雜交獲得雙突變體，且通過使用基因特異性和T-DNA邊緣引物(表1)的基因組PCR來證實(shí)基因中存在插入。突變系ckx4-Z沒有用于雜交。植物在 22°C、長日照(1 光照/8h黑暗)條件下，生長于溫室的土壤中。用于測量種子產(chǎn)量的植物在M°C、 ΙΟΟμ E和65%的濕度、在長日照條件下，生長在生長箱的土壤中(Percival AR-66L)。
CKX表達(dá)的分析
根據(jù)Verwoerd等(Verwoerd等，1989)的方法，從幼苗中提取總RNA。用無RNase 的脫氧核糖核酸酶(DNase) I (富酶泰斯公司(Fermentas)，圣萊昂-羅特(St. Leon-Rot)， 德國)在37°C下處理RNA30分鐘。在65°C下加入1微升25mM的乙二胺四乙酸(EDTA)，處理10分鐘。使用0. 5 μ g的RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。所有使用的引物對都跨越各自的T-DNA 插入位點(diǎn)(表幻。在所有的RT-PCR反應(yīng)中，都使用Actin2引物作為對照。使用一步法 RT-PCR試劑盒(凱杰公司(Qiagen)，希爾登(Hilden)，德國)根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行 RT-PCR0 PCR包括35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為-MV，30秒；57°C，30秒；72°C，2分鐘。
掃描電子顯微鏡
使用LEO 430顯微鏡(蔡司公司(kiss)，上科亨(Oberkochen)，德國)，且依照 Krupkova 等描述的方法(Krupkova, Ε. , Immerzeel, P. , Pauly, Μ.,禾口 Schmiiilling, T. (2007) Plant J. 50，735-750)操作掃描電子顯微鏡。
細(xì)胞分裂素的測定
植物在土壤里生長，直至主花序高約10厘米(約30DAG)。對于每個(gè)樣品，將發(fā)育階段 1 到發(fā)育階段 15 的花(Smyth，D. R. ,Bowman, J. L.，和Meyerowitz，Ε· Μ· (1990)Plant Cell 2，755-767)的 0. 5克花序制成基因庫，并且每個(gè)樣品收集5個(gè)獨(dú)立樣品并分析各自的基因類型。采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法確定細(xì)胞分裂素含量(Novdk，0.，Hauserova, E.，Amakorova, P. ,Dolezal, K.，禾口 Strnad，Μ. (2008)Phytochemistry 69,2214-2224)。
花瓣表面積
使用kion Image程序(布魯克公司(Scion Corporation)，弗雷德里克 (Frederick)，馬里蘭州，美國)，對解剖器官進(jìn)行數(shù)字成像，以測量花瓣的面積。
最終株高和產(chǎn)量參數(shù)的確定
在開花終止后，確定最終的株高和主莖上的角果數(shù)目。為了分析種子的產(chǎn)量，在開花終止后，要將植株放入紙袋。植株保持干燥，繼續(xù)放置三個(gè)星期以后，測定種子的總重量。
光學(xué)顯微鏡
為了進(jìn)行胚珠的計(jì)數(shù)和觀察，依照Malamy和Benfey (1997)描述的方法進(jìn)行雌蕊的清理和固定。所有樣品使用Axioskop 2plus顯微鏡觀察(kiss，耶拿(Jena)，德國)。
胚珠計(jì)數(shù)和確定發(fā)育階段
依照 Schneitz 等(1995)Wild-type ovule development in Arabidopsis thaliana :a light microscope study of cleared whole-mount tissue.Plant J· 7， /31-749中描述的方法，制備、分析野生型和ckx3 ckx5突變的胚珠，并確定其發(fā)育階段。
與野生型植株相比，在ckx3 ckx5突變體中的胎座組織啟動(dòng)胚珠原基的能力得到增強(qiáng)，從而能夠得到更多的胚珠，且心皮內(nèi)具有更高密度的胚珠和種子。
表1.用于驗(yàn)證圖1所示T-DNA插入的引物
權(quán)利要求
1.一種分離的植物細(xì)胞，其特征在于，所述分離的植物細(xì)胞在至少以下基因中包含中斷i)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX3基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 1相同或有至少95%—致性的多肽序列；以及 )與i)中定義的基因不同的、另一個(gè)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因；其中，與缺乏所述中斷的相應(yīng)對照植物細(xì)胞相比，所述中斷抑制至少兩個(gè)中斷的所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶基因的表達(dá)和/或其產(chǎn)物活性。
2.—種轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物在至少以下基因中包含中斷i)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX3基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 1相同或有至少95%—致性的多肽序列；以及 )與i)中定義的基因不同的、另一個(gè)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因；其中，與缺乏所述中斷的相應(yīng)對照植物相比，所述中斷抑制至少兩個(gè)中斷的所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶基因的表達(dá)和/或其產(chǎn)物活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的植物細(xì)胞或權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述分離的植物細(xì)胞或所述轉(zhuǎn)基因植物在至少以下基因中包含中斷i)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX3基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 1相同或有至少95%—致性的多肽序列；以及 )至少另一個(gè)內(nèi)源基因a)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKXl基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化 /脫氫酶包括與SEQ ID No. 13相同或有至少95%—致性的多肽序列；b)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKX2基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化 /脫氫酶包括與SEQ ID No. 2相同或有至少95%—致性的多肽序列；c)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKX4基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化 /脫氫酶包括與SEQ ID No. 3相同或有至少95%—致性的多肽序列；d)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的ci 5基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化 /脫氫酶包括與SEQ ID No. 4相同或有至少95%—致性的多肽序列；e)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKX6基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化 /脫氫酶包括與SEQ ID No. 5相同或有至少95%—致性的多肽序列；或者f)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的CKX7基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化 /脫氫酶包括與SEQ ID No. 6相同或有至少95%—致性的多肽序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和2中任一項(xiàng)所述的分離的植物細(xì)胞或權(quán)利要求2和3中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述分離的植物細(xì)胞或所述轉(zhuǎn)基因植物的至少以下基因被中斷i)內(nèi)源CKX3基因或其直系同源序列，所述內(nèi)源CKX3基因包括與SEQ IDNo. 7相同或有至少95%—致性的核酸序列；CN 102549161 A以及ii)至少另一個(gè)內(nèi)源基因a)CKXl基因或其直系同源序列，所述CKXl基因包括與SEQID No. 14相同或有至少 95%—致性的核酸序列；b)CKX2基因或其直系同源序列，所述CKX2基因包括與SEQID No. 8相同或有至少95% 一致性的核酸序列；c)CKX4基因或其直系同源序列，所述CKX4基因包括與SEQID No. 9相同或有至少95% 一致性的核酸序列；d)CKX5基因或其直系同源序列，所述CKX5基因包括與SEQID No. 10相同或有至少 95%—致性的核酸序列；e)CKX6基因或其直系同源序列，所述CKX6基因包括與SEQID No. 11相同或有至少 95%—致性的核酸序列；或者f)CKX7基因或其直系同源序列，所述CKX7基因包括與SEQID No. 12相同或有至少 95%—致性的核酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的植物細(xì)胞或權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述分離的植物細(xì)胞或所述轉(zhuǎn)基因植物的以下基因被中斷i)至少編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX3基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 1相同或有至少95%—致性的多肽序列；以及 )編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX5基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 4相同或有至少95%—致性的多肽序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分離的植物細(xì)胞或權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述分離的植物細(xì)胞或所述轉(zhuǎn)基因植物的以下基因被中斷i)內(nèi)源CKX3基因或其直系同源序列，所述內(nèi)源CKX3基因包括與SEQIDNo. 7相同或有至少95%—致性的核酸序列；以及ii)內(nèi)源CK)(5基因或其直系同源序列，所述內(nèi)源CK)(5基因包括與SEQIDNo. 10相同或有至少95%—致性的核酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、3、4、5、6中任一項(xiàng)所述的分離的植物細(xì)胞或權(quán)利要求2、3、4、5、6中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，通過結(jié)構(gòu)性中斷、反義多核苷酸基因抑制、雙鏈RNA 誘導(dǎo)的基因沉默、核酶技術(shù)、基因組中斷、定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)、和/或同源重組， 促使發(fā)生一個(gè)、多個(gè)或所有中斷。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、3、4、5、6和7中任一項(xiàng)所述的分離的植物細(xì)胞或權(quán)利要求2、3、4、 5、6和7中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述一個(gè)、多個(gè)或全部中斷是純合中斷。
9.根據(jù)權(quán)利要求2、3、4、5、6、7和8中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述植物選自十字花科、優(yōu)選選自蕓苔屬或擬南芥屬。
10.一種源于根據(jù)權(quán)利要求2、3、4、5、6、7、8和9中任一項(xiàng)所述轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞、器官、組織或轉(zhuǎn)基因繁殖材料。
11.一種相對于相應(yīng)的對照植物、提高植物的種子產(chǎn)量和/或增加株高和/或增加莖粗的方法，其特征在于，所述方法包括在植物的至少以下基因中導(dǎo)入中斷i)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX3基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 1相同或有至少95%—致性的多肽序列；以及 )與i)中定義的基因不同的、另一個(gè)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因；其中，與缺乏所述中斷的相應(yīng)對照植物相比，所述中斷抑制至少兩個(gè)中斷的所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶基因的表達(dá)和/或其產(chǎn)物活性。
12.—種相對于相應(yīng)的對照植物、制造種子產(chǎn)量提高和/或株高增加的植物的方法，其特征在于，所述方法包括在植物中中斷至少以下基因i)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX3基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 1相同或有至少95%—致性的多肽序列；以及 )與i)中定義的基因不同的、另一個(gè)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源基因；其中，與缺乏所述中斷的相應(yīng)對照植物相比，所述中斷抑制至少兩個(gè)中斷的所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶基因的表達(dá)和/或其產(chǎn)物活性。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法或權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，至少以下基因被中斷i)編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX3基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 1相同或有至少95%—致性的多肽序列；以及 )編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的內(nèi)源CKX5基因或其直系同源序列，所述細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶包括與SEQ ID No. 4相同或有至少95%—致性的多肽序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求11至13中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，一個(gè)、多個(gè)或全部中斷是純合中斷。
15.一種根據(jù)權(quán)利要求11至14中任一項(xiàng)所述的方法可獲得或獲得的轉(zhuǎn)基因植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離的植物細(xì)胞和一種轉(zhuǎn)基因植物，其中所述分離的植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物在編碼細(xì)胞分裂素氧化/脫氫酶的至少內(nèi)源CKX3基因和另一個(gè)不同于CKX3的基因上包含中斷。本發(fā)明還涉及一種制備所述轉(zhuǎn)基因植物的方法，及一種提高植物種子產(chǎn)量和/或增加株高的方法。
文檔編號C12N15/82GK102549161SQ201080040513
公開日2012年7月4日 申請日期2010年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月10日
發(fā)明者伊莎貝爾·巴特里娜·Y·曼斯, 托馬斯·斯切姆林, 托馬斯·沃納 申請人:伊莎貝爾·巴特里娜·Y·曼斯, 托馬斯·斯切姆林, 托馬斯·沃納