鑒定和使用在d-葡萄糖存在下代謝戊糖的酵母菌株的材料和方法

專利名稱：鑒定和使用在d-葡萄糖存在下代謝戊糖的酵母菌株的材料和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
各個(gè)方面總體涉及在顯著水平的D-葡萄糖存在下，可以在除D-葡萄糖以外的糖上生長(zhǎng)的酵母(Saccharomyces)菌株，以及開發(fā)和使用這些菌株的方法。
背景技術(shù)：
酵母屬的各個(gè)種是非常重要的工業(yè)培養(yǎng)的微生物。長(zhǎng)期以來，這些微生物用于發(fā)酵面包、生產(chǎn)啤酒和葡萄酒，并作為食物調(diào)味劑和微量營(yíng)養(yǎng)素來源，它們現(xiàn)在在燃料生產(chǎn)中起到核心作用，有利于將糖儲(chǔ)備轉(zhuǎn)化成乙醇。作為一種代謝復(fù)雜的生物體，酵母能夠在有氧條件下生長(zhǎng)，也能夠在無(wú)氧條件下生長(zhǎng)至少數(shù)代。商業(yè)培養(yǎng)時(shí)，例如在生產(chǎn)用于支持市售焙烤食品工業(yè)的酵母時(shí)，可以在通氣的發(fā)酵罐中培養(yǎng)酵母如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae).在這些條件下可控制酵母生長(zhǎng)，以提高酵母生物質(zhì)的生成?？蓪?shí)現(xiàn)這一目的的一種方式是安排糖如D-葡萄糖的加入，以及氧氣轉(zhuǎn)移至酵母的速率以促進(jìn)其有氧生長(zhǎng)。 也可以在設(shè)計(jì)用于最大程度提高乙醇產(chǎn)量的條件下培養(yǎng)各種酵母菌株。通常，相對(duì)于目的是最大程度提高酵母生物質(zhì)生成以利于無(wú)氧生長(zhǎng)時(shí)發(fā)酵容器中采用的氧氣水平，當(dāng)目的是最大程度提高糖向乙醇的轉(zhuǎn)化時(shí)發(fā)酵容器中的氧氣水平可降低。大部分酵母菌株優(yōu)選在D-葡萄糖上生長(zhǎng)，盡管已知許多菌株也能夠在其它天然產(chǎn)生的己醣、甚至是一些二糖上生長(zhǎng)。不同酵母屬品種在不同糖和不同氧氣水平下生長(zhǎng)的能力很大程度上代表它的商業(yè)利用價(jià)值，包括酵母在當(dāng)前的燃料工業(yè)中將植物生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成乙醇中起到的核心作用。一種最熟知的用酵母生產(chǎn)乙醇的途徑是將6碳糖(己醣)，特別是D-葡萄糖發(fā)酵成乙醇(

圖1)。乙醇生產(chǎn)中廣泛使用的一種原料是多糖淀粉。淀粉是包含D-葡萄糖的簡(jiǎn)單聚合物。目前在美國(guó)，至少來自玉米的淀粉是通過釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 生產(chǎn)乙醇的優(yōu)選原料。玉米是富含營(yíng)養(yǎng)的作物，目前只有玉米仁是適用于酵母乙醇發(fā)酵的淀粉/D-葡萄糖的合適來源?；诮湍傅囊掖忌a(chǎn)所用的另一糖源是甘蔗。天然條件下， 甘蔗的可發(fā)酵糖含量更高，可能是用酵母生產(chǎn)乙醇的優(yōu)選底物。然而，與甘蔗相比，玉米在美國(guó)的種植更廣泛。鑒于氣候原因，這種狀況很可能保持如此。無(wú)論如何，基于玉米的乙醇生產(chǎn)的可持續(xù)性已經(jīng)受到質(zhì)疑，由于甘蔗在美國(guó)并不是可行的選擇，生物燃料工業(yè)正在尋找除玉米和甘蔗外可發(fā)酵原料的其它來源。—種倍受追捧的原料是纖維素，認(rèn)為它的可持續(xù)性優(yōu)于玉米，并且比甘蔗更容易獲得。經(jīng)加工產(chǎn)生可發(fā)酵糖的纖維素完全可以作為將來乙醇生產(chǎn)的碳源選擇。培養(yǎng)酵母以提高酵母生物質(zhì)或由原料如淀粉或纖維素產(chǎn)生乙醇時(shí)，需要預(yù)先發(fā)酵加工步驟將生物聚合物纖維素降解成易由酵母發(fā)酵的糖單位，如D-葡萄糖、麥芽糖、三糖和四糖。無(wú)論來源如何，六碳糖，特別是D-葡萄糖是基于酵母的發(fā)酵過程的主要能量來源。已鑒定的酵母屬的大多數(shù)品種優(yōu)選在D-葡萄糖上生長(zhǎng)。其中許多菌株，包括許多實(shí)驗(yàn)室衍生的酵母菌株都可以在除D-葡萄糖以外的己糖以及二糖和三糖上生長(zhǎng)。然而，酵母菌對(duì)于在D-葡萄糖上生長(zhǎng)的優(yōu)選性非常強(qiáng)，以至于酵母的大部分變異體，包括幾乎所有的工業(yè)重要菌株，都表現(xiàn)出分解代謝物抑制作用，即只要原料中存在可檢測(cè)水平的D-葡萄糖， 該菌株就不會(huì)發(fā)酵除D-葡萄糖以外的糖。對(duì)于由包含含有D-葡萄糖的可發(fā)酵糖混合物的任何原料生產(chǎn)酵母生物質(zhì)和/或乙醇而言，所有檢測(cè)的酵母菌株不能在D-葡萄糖存在下借助D-葡萄糖以外的糖快速生長(zhǎng)并產(chǎn)生乙醇是非常不幸的。例如，將纖維素性生物質(zhì)降解成其可發(fā)酵組分時(shí)釋放D-葡萄糖，可發(fā)酵糖混合物中存在D-葡萄糖會(huì)顯著減緩其它糖向乙醇的轉(zhuǎn)化(圖1)。盡管目前由纖維素產(chǎn)生乙醇有技術(shù)障礙，但2007年能源獨(dú)立和安全法案(Energy Independence and Security Act, EISA 2007)要求美國(guó)要快速開發(fā)生產(chǎn)纖維素乙醇的技術(shù)，以替代進(jìn)口的石油。因此，需要即使在顯著量的D-葡萄糖存在時(shí)，也易于將糖、而不是僅將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化成生物質(zhì)或乙醇的新型工業(yè)酵母菌株，以及產(chǎn)生這些工業(yè)菌株的方法。 本發(fā)明某些方面解決了這些需求。發(fā)明概述本發(fā)明某些方面包括分離酵母的方法，包括以下步驟提供生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其中該培養(yǎng)基包含2-脫氧-葡萄糖；木糖和谷胺酰胺，木糖是唯一的碳源；用至少一種酵母菌株接種該培養(yǎng)基；從所述培養(yǎng)基中分離至少一種酵母細(xì)胞；其中所述酵母細(xì)胞能夠在約0. 1重量％ 2-脫氧-葡萄糖存在時(shí)，以D-木糖作為唯一碳源生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基包含約0.03重量％ 2-脫氧-葡萄糖。在一些實(shí)施方式中，在所述培養(yǎng)基上或之中生長(zhǎng)的菌株只有在大約14天后才在所述培養(yǎng)基上表現(xiàn)出可檢測(cè)的生長(zhǎng)。在其它實(shí)施方式中，可能在接種約21天后才表現(xiàn)出可檢測(cè)的生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，用于選擇酵母菌株的培養(yǎng)基包含約2.0重量％的木糖和約 0. 5重量％的谷胺酰胺，盡管這些試劑的任何濃度都足以支持可能加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基的特定菌株的生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，分離的酵母菌株是釀酒酵母的單倍體、二倍體或大于二倍體的多倍體菌株。在一些實(shí)施方式中，由所述培養(yǎng)基分離的酵母菌株甚至在至少0. 1重量％的2-脫氧-葡萄糖存在時(shí)，也能夠代謝至少一種戊糖。在一些實(shí)施方式中，所述原料包含至少約 0. 03重量％的2-脫氧-葡萄糖。在一些實(shí)施方式中，所述菌株在至少0. 1重量％的2-脫氧-葡萄糖存在時(shí)，能代謝至少一種除D-葡萄糖以外的己糖。在一些實(shí)施方式中，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基包含約0. 03重量％ 2-脫氧-葡萄糖。在一些實(shí)施方式中，所述菌株是自發(fā)突變體。但在其它實(shí)施方式中，所述菌株可通過特定事件產(chǎn)生，例如通過以已知引起突變的方式處理酵母來靶向破壞開放閱讀框。加速突變速率的方法和試劑包括但不限于使酵母接觸電離輻射、紫外線和影響DNA結(jié)構(gòu)的試劑，例如嵌入劑、烷化劑、DNA加合物等。本發(fā)明的其它實(shí)施方式包括酵母變異體，包括在至少0. 1重量％ 2-脫氧-葡萄糖存在時(shí)，以至少一種戊糖作為唯一碳源生長(zhǎng)的釀酒酵母菌株。在一些實(shí)施方式中，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基中包含約0.03重量％ 2-脫氧-葡萄糖。在一些實(shí)施方式中，所述變異體是單倍體、二倍體或大于二倍體的多倍體。在一些實(shí)施方式中，釀酒酵母的變異株選自JH015、⑶)(R2 以及弗門狄斯乙醇紅O^ermentis Ethanol Red)reglA和弗門狄斯乙醇紅grrl_/_(GXl)寸。其它實(shí)施方式是發(fā)酵糖源的方法，包括以下步驟提供至少一種釀酒酵母菌株，其中在至少0. 2-脫氧-葡萄糖存在時(shí)，所述至少一種釀酒酵母菌株能夠在至少一種戊糖上生長(zhǎng)；提供包含至少一種糖的原料，和在所述原料上培養(yǎng)所述酵母菌株。在一些實(shí)施方式中，所述原料包含D-葡萄糖，其含量足以支持該酵母菌株在沒有任何其它糖源的情況下生長(zhǎng)。在其它實(shí)施方式中，所述原料包含可發(fā)酵的戊糖。在其它實(shí)施方式中，所述原料包含至少約0. 2-脫氧-葡萄糖。在一些實(shí)施方式中，所述原料包含至少約0. 03重量％的 2-脫氧-葡萄糖。在其它實(shí)施方式中，所述原料包含除D-葡萄糖外的可發(fā)酵己糖，而在其它實(shí)施方式中，所述原料還包含D-葡萄糖。其它方面包括產(chǎn)生酵母突變菌株的方法，包括以下步驟提供至少一個(gè)選自Grrl 和Regl的基因有活性的酵母菌株，例如釀酒酵母的單倍體、二倍體或多倍體菌株；去除 Grrl和Regl的活性以產(chǎn)生突變菌株；和測(cè)試該菌株以確定在0. 035重量％ 2-脫氧-葡萄糖存在時(shí)該菌株能否在戊糖上生長(zhǎng)。其它實(shí)施方式包括選擇或鑒定酵母菌株的方法，包括以下步驟提供在選自下組的至少一個(gè)開放閱讀框中含有突變的釀酒酵母的單倍體或多倍體菌株ALR063W、YMR167W、 YPL176c、YPL123c、YPL121c、YBR242w、YBR422w、YHR012w、YHR103w、YHR154w、YCL048w、 YLR133w、Y0R138c、Y0R177c、YDR269c、YIL064w、YOUOIc, YML124C、YMR116C、YDR028c、 YDR074c、YDL088c和YGR271，其中所述開放閱讀框編碼功能性基因且所述開放閱讀框中的突變會(huì)破壞該開放閱讀框所編碼基因的活性；在包含作為唯一碳源的木糖和約0. 1重量％ 2-脫氧-葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述釀酒酵母菌株；和分離在所述培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的釀酒酵母菌株。在一些實(shí)施方式中，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基包含約0. 03重量％ 2-脫氧-葡萄糖。其它實(shí)施方式包括分離釀酒酵母菌株的單倍體或多倍體菌株的方法，包括以下步驟提供一種菌株，其包含選自下組的開放閱讀框編碼的至少一種基因的功能性拷貝 YLR063w、YMR167w、YPL176c、YPL123c、YPL121c、YBR242w、YBR422w、YHR012w、YHR103w、 YHR154w、YCL048w、YLR133w、Y0R138c、Y0R177c、YDR269c、YIL064w、Y0L101C、YML124C、 YMR116C、YDR028c, YDR074c、YDL088c和YGR271w ；將突變引入選自下組的至少一個(gè)開放閱讀框中YLR063w、YMR167w、YPL176c、YPL123c、YPL121c、YBR242w、YBR422w、YHR012w、 YHR103w、YHR154w、YCL048w、YLR133w、Y0R138C、Y0R177C、YDR269c、YIL064w、YOLlOlc、 YML124C、YMRl 16C、YDR028C, YDR074C、YDL088c 和 YGR271w，以產(chǎn)生釀酒酵母突變體；在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述釀酒酵母的突變體，其中所述選擇培養(yǎng)基包含作為唯一碳源的木糖和 0. 1重量％ 2-脫氧-葡萄糖；和分離在所述培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的突變體。在一些實(shí)施方式中， 所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基包含約0. 03重量％ 2-脫氧-葡萄糖。本發(fā)明的一些實(shí)施方式包括選擇酵母菌株的方法，所述酵母菌株包括例如在 2-脫氧-葡萄糖存在時(shí)和D-葡萄糖存在時(shí)，在除D-葡萄糖以外的糖上生長(zhǎng)的工業(yè)或?qū)嶒?yàn)室酵母菌株，所述除D-葡萄糖以外的糖包括例如，在纖維素生物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的一些戊糖。另外一些實(shí)施方式包括使用在2-脫氧-葡萄糖存在時(shí)能在除D-葡萄糖以外的糖上生長(zhǎng)的工業(yè)酵母菌株，以便在顯著量的D-葡萄糖存在下從除D-葡萄糖以外的糖產(chǎn)生額外的酵母生物質(zhì)和/或最終產(chǎn)物或發(fā)酵副產(chǎn)物如乙醇。生產(chǎn)纖維素乙醇的優(yōu)異性能。纖維素生物質(zhì)含有多種糖，最主要是D-葡萄糖和 D-木糖。然而，酵母代謝生理常常受到分解代謝物抑制，調(diào)控使用D-葡萄糖而排除許多其它糖。雖然這未在D-木糖或D-木酮糖中證實(shí)，但我們目前證明利用D-木糖和D-木酮糖也會(huì)受限于分解代謝物抑制。因此，在這些戊糖存在時(shí)，野生型酵母菌株優(yōu)選代謝D-葡萄糖。 而且，我們現(xiàn)在證明，工業(yè)酵母菌株受到己糖和戊糖的分解代謝物抑制。這是利用大部分酵母菌株產(chǎn)生纖維素乙醇的重要技術(shù)障礙。為了在多種糖發(fā)酵過程中克服這一障礙，需要消除D-木糖的分解代謝物抑制。一種實(shí)施方式包括通過除去至少一種下列基因來消除分解代謝物抑制GRR1、REG1和HXK2。本發(fā)明的一些實(shí)施方式包括選擇工業(yè)酵母菌株，例如，在 2-脫氧-葡萄糖存在時(shí)，在除D-葡萄糖以外的糖，特別是戊糖上生長(zhǎng)的酵母。在一些實(shí)施方式中，這是一種方法，其包括選擇在顯著水平的2-脫氧-D-葡萄糖存在時(shí)，在除D-葡萄糖以外的糖源上生長(zhǎng)的工業(yè)酵母變異體。在一些實(shí)施方式中，這些菌株缺少，或至少不表達(dá)有效水平形式的至少一種下列以下基因GRR1、REG1和HXK2。在其它實(shí)施方式中，可突變這些基因，從而不產(chǎn)生可檢測(cè)水平的活性蛋白質(zhì)。另外一些實(shí)施方式包括使用在2-脫氧-葡萄糖存在時(shí)能在除D-葡萄糖以外的糖上生長(zhǎng)的工業(yè)酵母菌株，在顯著量的D-葡萄糖存在下，從除D-葡萄糖以外的糖產(chǎn)生額外的酵母生物質(zhì)和/或最終產(chǎn)物或發(fā)酵副產(chǎn)物如乙醇。一些實(shí)施方式包括發(fā)酵包含混合糖(包括D葡萄糖)的原料的方法，該方法包括使用具有不同代謝要求的多種酵母菌株有效產(chǎn)生生物質(zhì)或代謝物如乙醇的步驟。在一些實(shí)施方式中，用至少兩種不同的酵母菌株進(jìn)行發(fā)酵，其中至少一種菌株優(yōu)先在D-葡萄糖上生長(zhǎng)，并可能在可檢測(cè)水平的D葡萄糖存在下顯示出分解代謝物抑制，而至少一種其它菌株解除抑制，并且即使在可檢測(cè)水平的D葡萄糖存在下也可以將除D-葡萄糖以外的糖發(fā)酵成乙醇和/或生物質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，此種方法可提供能有效同時(shí)發(fā)酵D-葡萄糖和戊糖如D-木糖的系統(tǒng)。釀酒酵母的分解代謝物抑制抗性菌株包括釀酒酵母菌株變異體CEN. PKgrrl Δ 或釀酒酵母菌株變異體乙醇紅(Ethanol Red)GXl，其中所述變異株的單細(xì)胞分離物在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，該培養(yǎng)基包含D_木糖和2-脫氧-D-葡萄糖，其中所述培養(yǎng)基中的主要碳源是D-木糖，所述變異體在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)兩天就能產(chǎn)生強(qiáng)大菌落。其它實(shí)施方式包括釀酒酵母的分解代謝物抑制抗性菌株，包括例如，釀酒酵母菌株變異體CEN. I3Kgrrl Δ或釀酒酵母菌株變異體乙醇紅(Ethanol Red)GXl，其中所述變異體菌株的單細(xì)胞分離物在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，該培養(yǎng)基包含麥芽糖和2-脫氧-D-葡萄糖， 其中所述培養(yǎng)基中的主要碳源可以是含D-葡萄糖的糖，包括但不限于麥芽糖，所述變異株在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)兩天就能產(chǎn)生強(qiáng)大菌落。其它實(shí)施方式包括釀酒酵母的分解代謝物抑制抗性菌株，其中所述培養(yǎng)基包含約2% D-木糖和約0. 2-脫氧-葡萄糖。其它實(shí)施方式包括在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的變異體，該培養(yǎng)基包含約2%麥芽糖或另一種含D-葡萄糖的糖，以及約0. 1 %的2-脫氧-葡萄糖。其它實(shí)施方式包括釀酒酵母的分解代謝物抑制抗性菌株，其中所述變異株選自 單倍體實(shí)驗(yàn)室菌株CEN. PK衍生物CDXK1、CEN. PK(113-7D) Xdxe2和CDXK3，以及二倍體工業(yè)酵母菌株乙醇紅GXl和RX4的衍生物。在一些實(shí)施方式中，用所述方法選擇的分解代謝物抑制抗性釀酒酵母菌株在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，所述培養(yǎng)基包含D-葡萄糖作為主要碳源。一些實(shí)施方式包括釀酒酵母的分解代謝物抑制抗性菌株，其中所述變異株在包含 2% D-半乳糖和約0. 03% 2-脫氧-葡萄糖的固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)其中所述D-半乳糖是該培養(yǎng)基中的主要碳源。其它實(shí)施方式包括產(chǎn)生在除D-葡萄糖以外的糖上生長(zhǎng)的釀酒酵母菌株，包括一些工業(yè)菌株的方法，該方法包括以下步驟提供第一種釀酒酵母變異株，其中所述變異體在 2-脫氧-D-葡萄糖存在時(shí)，能在除D-葡萄糖以外的糖，特別是戊糖上生長(zhǎng)；和在第一種變異體菌株中過度表達(dá)至少一種基因以形成第二種變異株，所述基因分離自代謝除葡萄糖以外的糖的分解代謝途徑。其它實(shí)施方式包括在D-葡萄糖存在時(shí)，能夠在戊糖上生長(zhǎng)的釀酒酵母變異株的生成方法。在一些實(shí)施方式中，第一種變異株選自，例如GX1、RX4、Cdxki、CEN. H((113-7D)、 Cdxe2和CDXK3，其中可使該菌株適應(yīng)表達(dá)分離自D-木糖分解代謝途徑的至少一種基因。其它實(shí)施方式包括在除D-葡萄糖以外的糖源上培養(yǎng)釀酒酵母菌株的方法，所述方法包括以下步驟提供第一種釀酒酵母菌株，其中所述菌株在2-脫氧-D-葡萄糖存在時(shí)， 能在除D-葡萄糖以外的糖源，特別是戊糖上生長(zhǎng)；在第一種菌株中過度表達(dá)至少一種基因以形成第二種菌株，所述基因分離自分解代謝除葡萄糖以外的糖，特別是戊糖的代謝途徑； 和在培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述第二菌株，其中所述培養(yǎng)基中的主要碳源是除葡萄糖以外的糖，特別是戊糖。在一些實(shí)施方式中，所述第一種菌株是釀酒酵母菌株CEN. 1 的變異體，其選自 CDXK1、CEN. PK(113-7D)、cDXE2和CDXK3，至少一種過度表達(dá)的基因來自D-木糖分解代謝途徑。在其它實(shí)施方式中，第一種菌株是工業(yè)釀酒酵母菌株乙醇紅的變異體，其選自 GXl和RX4，且至少一種過度表達(dá)的基因來自D-木糖分解代謝途徑。其它實(shí)施方式包括鑒定參與釀酒酵母的分解代謝物抑制的開放閱讀框的方法，該方法包括以下步驟培養(yǎng)在D-葡萄糖，或D-葡萄糖和D-木糖，或D-木糖存在時(shí)受到葡萄糖抑制的第一種釀酒酵母菌株變異體；增殖對(duì)葡萄糖抑制不敏感的第二種釀酒酵母菌株變異體，所述第二種變異體在D-葡萄糖，D-葡萄糖和D-木糖，或D-木糖存在時(shí)，能夠在除D-葡萄糖以外的主要碳源上生長(zhǎng)；和比較所述第一種變異體和所述第二種變異體的蛋白質(zhì)組以鑒定所述第一種和所述第二種變異體的蛋白質(zhì)組之間的差異。在一些實(shí)施方式中，用另外的第二種糖代替D-木糖，例如麥芽糖或麥芽三糖，但不限于麥芽糖或麥芽三糖。如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述第一種和所述第二種變異體的蛋白質(zhì)組之間的差異表明以下開放閱讀框的至少一種產(chǎn)物的差異ALR063W、YMR167W、YPL176c、 YPL123c、YPL121c、YBR242w、YBR422w、YHR012w、YHR103w、YHR154w、YCL048w、YLR133w、 Y0R138c、Y0R177c、YDR269c、YIL064w、Y0L101C、YML124C、YMRl 16C、YDR028c、YDR074c、 YDL088c 和 YGR271w。附圖簡(jiǎn)要說明圖IA是酵母將玉米淀粉和植物生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成乙醇的途徑的示意圖。圖2是將D-葡萄糖或D-木糖轉(zhuǎn)化成乙醇的途徑的示意圖。正在出芽的酵母細(xì)胞的照片。
圖3是一些酵母菌株在D-木糖上生長(zhǎng)的培養(yǎng)裝置。圖4是提出的用啤酒酵母發(fā)酵D-木糖的途徑。圖5是顯示加有2% D-木糖的YP上所培養(yǎng)CEN. PK突變酵母菌落生長(zhǎng)的平板照片。圖6是顯示CEN. PK的2_脫氧-葡萄糖抗性衍生物的補(bǔ)充分析結(jié)果的平板照片。圖7是在2-脫氧-葡萄糖存在時(shí)，在D-木酮糖、D-木糖混合物上生長(zhǎng)的酵母的平板照片。圖8是通過各種工業(yè)酵母菌株將玉米芯水解產(chǎn)物發(fā)酵成乙醇的示意圖。圖9是用于鑒定GRRl基因的缺失的PCR分析結(jié)果。圖10是用于檢測(cè)REGl基因的缺失的PCR分析的結(jié)果。圖11是由GXl同時(shí)發(fā)酵麥芽糖和D-葡萄糖的示意圖。發(fā)明詳述出于促進(jìn)對(duì)新技術(shù)原理的理解的目的，下面參考優(yōu)選實(shí)施方式并采用特定術(shù)語(yǔ)進(jìn)行描述。然而應(yīng)理解，不應(yīng)據(jù)此限制新技術(shù)的范圍，該范圍也應(yīng)包括該新技術(shù)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)該新技術(shù)的原理通常能夠想到的這些改變、修飾和其它應(yīng)用。除非另有說明，本文所用術(shù)語(yǔ)“約”指加上或減去百分之20，例如，約1.0包括 0. 8-1. 2的范圍。除非另有說明，本文所用術(shù)語(yǔ)“可檢測(cè)的生長(zhǎng)”指包括和直到人裸眼觀察可明顯看出的生長(zhǎng)跡象的生長(zhǎng)狀況。除非另有具體說明，基因的命名采用Demerec，M.，Adelberg，Ε. Α.，Clark，A. J.和 Hartman，P. Ε. “對(duì)細(xì)菌遺傳學(xué)統(tǒng)一命名的提議”(A proposal for a uniform nomenclature in bacterial genetics). J. Gen. Microbiol 50，1-14 (1968)中提議的命名法。在幾個(gè)世紀(jì)前，馴化釀酒酵母用于將糖發(fā)酵成乙醇(見圖1和2)。馴化酵母導(dǎo)致產(chǎn)生在將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化成乙醇方面很有效率的工業(yè)酵母菌株。意義深遠(yuǎn)的是，這些工業(yè)酵母菌株對(duì)乙醇的耐受性大大高于大多數(shù)微生物。當(dāng)用于酵母生長(zhǎng)和/或乙醇生產(chǎn)的糖是一些自然界中含量最豐富的己糖，特別是D-葡萄糖、D-果糖和D-甘露糖時(shí)，這一過程非常高效。為了在工業(yè)企業(yè)中將纖維素工業(yè)轉(zhuǎn)化成乙醇，在優(yōu)化將纖維素轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖如葡萄糖的過程時(shí)花費(fèi)大量精力。雖然在基于酵母的乙醇生產(chǎn)中優(yōu)化纖維素向可發(fā)酵糖的轉(zhuǎn)化很重要，但從植物材料中存在的除D-葡萄糖以外的糖，特別是D-木糖中簡(jiǎn)化產(chǎn)生乙醇同樣重要。植物材料中最豐富的化合物是葡萄糖聚合物纖維素；然而，還有大量植物生物質(zhì)以稱為木聚糖的糖聚合物形式存在(圖1 ；參見例如，Warren 1996)。實(shí)際上，在許多纖維素來源中，木聚糖可能占該聚合物中生物質(zhì)的20%以上。木聚糖本身由戊糖D-木糖鏈構(gòu)成。 為了由酵母例如釀酒酵母的大部分工業(yè)和實(shí)驗(yàn)室菌株發(fā)酵，必須先將木聚糖如纖維素轉(zhuǎn)化成其單體D-木糖。這一過程已經(jīng)相當(dāng)復(fù)雜，再加上發(fā)酵環(huán)境中存在D-葡萄糖使其更為復(fù)雜，因?yàn)榇蟛糠稚虡I(yè)生產(chǎn)的釀酒酵母菌株(特別是原料中不存在D-葡萄糖時(shí))不能有效發(fā)酵戊糖如D-木糖。通常認(rèn)為釀酒酵母(S. cerevisiae)不能發(fā)酵D-木糖，實(shí)際上上世紀(jì)七十年代就有報(bào)道稱釀酒酵母不能利用D-木糖作為碳源(Barnett 1976)。根據(jù)文獻(xiàn)，樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)能夠發(fā)酵D-木糖?；谶@一信息，若干實(shí)驗(yàn)室嘗試通過在釀酒酵母中表達(dá)D-木糖利用所需的畢赤酵母基因，產(chǎn)生能夠發(fā)酵D-木糖的酵母菌株(參見例如 Kotter和Ciriacy, 1993 ；Ho等，1998 Jin等，2003)。雖然在各個(gè)情況下都報(bào)道D-木糖的利用改進(jìn)，但在D-葡萄糖存在時(shí)D-木糖發(fā)酵效率仍然變化很大。一些因素可能可以解釋這一結(jié)果，包括實(shí)驗(yàn)性生長(zhǎng)和預(yù)生長(zhǎng)條件的差異。以及D-木糖代謝途徑的異源表達(dá)水平。Ho博士(普杜大學(xué)(Purdue U.))對(duì)釀酒酵母的研究工作以及Ingram博士(佛羅里達(dá)大學(xué)(U. of Florida))對(duì)革蘭(-)和革蘭(+)細(xì)菌的研究工作集中于重組表達(dá)用于分解代謝D-木糖(樹干畢赤酵母)和產(chǎn)生乙醇(來自各種微生物)的其它生物體的代謝途徑中的外源性基因。如果不受任何理論或假說的束縛并以解釋而非限制方式，可用若干被忽視的或至少未受充分重視的理由來解釋這些觀察結(jié)果。例如，與報(bào)道結(jié)果相一致的一種解釋是這些實(shí)驗(yàn)所用D-木糖的確切組成的易變性。實(shí)際上，從化學(xué)品供應(yīng)公司購(gòu)得的糖很少是“純” 的。實(shí)際上，標(biāo)稱為純的大部分糖的純度只有約99或98%。通常，糖中的主要污染物是豐度極高的D-葡萄糖。不幸的是，對(duì)于酵母代謝研究而言，已知低至0. 的D-葡萄糖含量都會(huì)影響除D-葡萄糖以外的糖，如D-半乳糖的利用。因此，非?？赡茉谥辽俨糠忠压_研究中所用的至少一些98-99%純的D-木糖實(shí)際上被D-葡萄糖污染。在旨在確定某給定酵母菌株可否在D-木糖上生長(zhǎng)的研究中，即使少量D-葡萄糖的污染就可能極大扭曲了這些研究中觀察到的結(jié)果。大部分糖被D-葡萄糖污染是一個(gè)歷史性的問題。例如，只有在工業(yè)上引入包含少于0.01% D-葡萄糖(西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich))的D-半乳糖后，才能可靠鑒定使用D-半乳糖的酵母。不幸的是，不被D-葡萄糖污染的D-木糖很難獲得。因此，稱某些酵母菌株無(wú)法在D-木糖上生長(zhǎng)的報(bào)道可能有誤，這可以解釋文獻(xiàn)中一些矛盾的報(bào)道。對(duì)于文獻(xiàn)報(bào)道中涉及木糖發(fā)酵的不一致內(nèi)容的另一解釋可以是這些研究中采用的各種實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)酵母菌株的基因型組成不同。雖然大部分實(shí)驗(yàn)室酵母菌株來自少數(shù)起源(Mortimer和Johnston，1986)，但隨著時(shí)間推移它們的后代可能發(fā)展出迥然不同的生長(zhǎng)特性(Winston等，1995 ;van Di jken等，2000)。事實(shí)上，近期文獻(xiàn)都提示，至少一個(gè)釀酒酵母菌株不用遺傳修飾就可以在D-木糖上生長(zhǎng)(參見kdlak和Ho，2004 ；圖3 ；標(biāo)為野生型的小圖；Toivari等，2004)。菌株MC996A似乎能夠在市售級(jí)D-木糖上生長(zhǎng)，而不需加入畢赤酵母的D-木糖利用基因。該菌株是已證明具有很強(qiáng)遺傳背景的CEN. PK菌株家族的衍生物。這些菌株明顯豐富的遺傳多樣性使得它們能夠發(fā)酵多種糖(van Dijkens等，2000)。纖維素生物質(zhì)包含多種糖，最主要是D-葡萄糖和D-木糖。然而，酵母代謝生理常常受到代謝物抑制，即調(diào)控使用D-葡萄糖而排除許多其它糖。雖然這沒有在D-木糖或 D-木酮糖中證實(shí)，但本文中證明利用D-木糖和D-木酮糖也會(huì)受到代謝物抑制。因此，野生型酵母菌株優(yōu)先代謝葡萄糖。這是利用大部分酵母產(chǎn)生纖維素乙醇的重要技術(shù)障礙。為了在多種糖發(fā)酵過程中克服這一障礙，需要消除D-木糖的代謝物抑制?？赏ㄟ^(例如)產(chǎn)生缺少己糖激酶基因HXKl和HXK2的菌株來產(chǎn)生不能利用D-葡萄糖的酵母菌株。還發(fā)現(xiàn)，攜帶HXK2和GRRl突變的酵母菌株也表現(xiàn)出類似于REGl突變體的行為(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，無(wú)論是分析強(qiáng)野生型菌株或過度表達(dá)D-木糖途徑的畢赤酵母基因的菌株，存在D-葡萄糖都可能阻止D-木糖的利用。大部分酵母菌株具有與D-木糖降解必需基因高度相關(guān)的基因。按照現(xiàn)在情況，即使是引用存在發(fā)酵D-木糖的釀酒酵母的報(bào)道，也認(rèn)為它們的效率很低。例如，Sedlak和Ho (2004)報(bào)道稱，在據(jù)信可代謝D-木糖的CEN. PK酵母菌株利用大部分(如果不是全部)D-葡萄糖之前，消耗的D-木糖非常少。文獻(xiàn)的當(dāng)前狀態(tài)明確說明， 缺少?gòu)?qiáng)大的篩選機(jī)制來鑒定可以在戊糖如D-木糖上可靠生長(zhǎng)的酵母變異體。假定釀酒酵母中存在發(fā)酵D-木糖的途徑，那么建立強(qiáng)大的篩選機(jī)制后對(duì)這些途徑的研究、改進(jìn)和增加會(huì)更為容易。參見圖3A。本文所示結(jié)果說明，可篩選和分離能在木糖上生長(zhǎng)的CEN. 1 的自發(fā)突變體。這一結(jié)果與酵母基因組全序列的分析結(jié)果相一致，該分析結(jié)果說明，酵母中存在 D-木糖發(fā)酵所需的各個(gè)酶的緊密同源物(圖4)。參見圖3。和CEN. I3K衍生物在D-木糖上生長(zhǎng)。在圖3A中，將細(xì)胞重復(fù)接種到加有2% D-木糖的YP培養(yǎng)基上，30°C孵育4天。在圖;3B中，將細(xì)胞重復(fù)接種到加有2% D-木糖/0. 1 % 2-脫氧葡萄糖的YP培養(yǎng)基上，30°C孵育10天。B圖中的箭頭指向在2-脫氧葡萄糖存在時(shí)生長(zhǎng)的CEN. 1 自發(fā)突變體產(chǎn)生的菌落。酵母細(xì)胞在發(fā)酵D-葡萄糖、D-果糖和D-甘露糖方面非常有效；而且，酵母發(fā)酵這些糖時(shí)排斥許多其它碳源，這種現(xiàn)象稱為分解代謝物抑制(參見Gancedo 1998的綜述)。 實(shí)際上，迄今為止研究的幾乎所有釀酒酵母菌株都只依賴D-葡萄糖、D-果糖和/或D-甘露糖獲取能源，直到完全或接近完全地耗盡環(huán)境中的這些糖。例如，如果僅痕量D-葡萄糖 (< 1 % )污染D-半乳糖，則酵母不發(fā)酵D-半乳糖，直到所有存在的D-葡萄糖被耗盡。文獻(xiàn)中有關(guān)釀酒酵母利用D-木糖的矛盾報(bào)道可能是由于生長(zhǎng)培養(yǎng)基被D-葡萄糖污染，其造成分解代謝物抑制。已證明，在基于麥芽糖、蔗糖和D-半乳糖的發(fā)酵中，若干基因中的突變能夠緩解實(shí)驗(yàn)室菌株的分解代謝物抑制。被認(rèn)為參與分解代謝物抑制的基因包括GRR1、REGl和 HXK2(綜述見Gancedo，1998)。在某些實(shí)驗(yàn)室菌株內(nèi)，缺少這些基因中的任何一個(gè)都可能使一些實(shí)驗(yàn)室菌株能夠同時(shí)發(fā)酵D-葡萄糖和其它己醣如D-半乳糖或蔗糖(Bailey和 Woodward,1984)。對(duì)衍生自實(shí)驗(yàn)室酵母的酵母細(xì)胞在D-葡萄糖存在時(shí)利用一些次級(jí)碳源的能力的一種測(cè)試是檢測(cè)細(xì)胞在次級(jí)碳源和少量2-脫氧-葡萄糖存在下的生長(zhǎng)能力。2-脫氧-葡萄糖是D-葡萄糖的不可代謝衍生物，據(jù)報(bào)道它在某些實(shí)驗(yàn)室菌株中能針對(duì)己糖如D-半乳糖、麥芽糖和蔗糖產(chǎn)生葡萄糖抑制作用。利用D-半乳糖時(shí)也表現(xiàn)出這一現(xiàn)象(Bailey等， 1982 ；Bailey和Woodward，1984)。據(jù)信，既具有分解代謝物抑制活性又能夠發(fā)酵D-半乳糖、 麥芽糖或蔗糖的暴露于2-脫氧-葡萄糖的酵母細(xì)胞在2-脫氧-葡萄糖存在時(shí)不能利用替代碳源，且這些菌株無(wú)法代謝2-脫氧-葡萄糖。據(jù)報(bào)道，這種狀況導(dǎo)致細(xì)胞死亡；然而，暴露于2-脫氧-葡萄糖的酵母細(xì)胞的確切死亡原因尚不明確(Raiser等，2008)。葡萄糖抑制說明了酵母中的這樣一種現(xiàn)象，即必須將培養(yǎng)基中的D-葡萄糖耗盡后，才能利用大部分其它碳源。一個(gè)經(jīng)過詳細(xì)研究的葡萄糖抑制的調(diào)節(jié)物是Migl轉(zhuǎn)錄因子，認(rèn)為它可用作參與利用替代碳源的基因的轉(zhuǎn)錄阻抑物；然而，也有報(bào)道稱缺失MIGl不會(huì)使細(xì)胞具有2-脫氧-葡萄糖抗性(khUlIer，200 。如上所述，缺少GRR1、REG1或HXK2 使細(xì)胞具有2-脫氧-葡萄糖抗性(Gancedo 1998)。雖然Regl是人們認(rèn)為通過使PPl復(fù)合物接近Migl來調(diào)節(jié)Migl的PPl蛋白磷酸酶亞基，實(shí)現(xiàn)葡萄糖抑制所需的其它蛋白質(zhì)的確切機(jī)制尚不明了。微陣列分析也表明，Migl只影響Grrl和Hxk2調(diào)控過程中的一小部分 (Westergaard等，2006)。本文進(jìn)行和報(bào)告的蛋白質(zhì)組學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，尚未認(rèn)識(shí)到分解代謝物抑制調(diào)控中的一個(gè)大轉(zhuǎn)錄后組件。從1所述篩選中分離的CEN. PK自發(fā)突變顯示REGl基因座失活(圖6)。而且，靶向破壞REGl或已知缺失時(shí)具有相似突變體表型的另外兩個(gè)基因GRRl和HXK2也能獲得在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的能力。可通過PCR介導(dǎo)的基因破壞方式靶向破壞REG1、GRRl或HXK2。 通過設(shè)計(jì)與特定基因座DNA的5'和3'區(qū)段相同的引物來進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)。采用對(duì)氨基糖苷類抗生素諾爾絲菌素產(chǎn)生抗性的來自諾爾絲鏈霉菌(Sti^ptomyces nourseothricii)的 natl基因時(shí)，可以用乙酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化酵母來去除上述基因中任何一種。在單倍體菌株中， 破壞一條等位基因就足以使其在補(bǔ)充有L-谷胺酰胺、2% D-木糖和0. 1 % 2-脫氧-葡萄糖的YP培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。然而，不同酵母菌株對(duì)不同濃度的2-脫氧-葡萄糖的敏感性不同。大部分工業(yè)菌株是二倍體。因此，在這些菌株中進(jìn)行轉(zhuǎn)化只能保證去除一條等位基因。令人驚訝的是，我們發(fā)現(xiàn)可通過將雜合菌株接種在含有2-脫氧-葡萄糖和用作主要碳源的第二種糖的培養(yǎng)基上，可重復(fù)地除去二倍體或任何更多倍體酵母的同一基因座上的其它拷貝；所述第二種糖包括但不限于糖如麥芽糖、D-半乳糖、蔗糖、D-木糖或D-木酮糖。下面參見圖3和5。在D-木糖的情況下也表現(xiàn)出這一現(xiàn)象。如圖3所示，將S288c grrl Δ菌株、野生型CEN. PK菌株和CEN. PK grrl Δ菌株接種到含有2% D-木糖的培養(yǎng)基上時(shí)，可檢測(cè)到所有三種菌株的生長(zhǎng)。然而，只有CEN. 1 grrl Δ菌株在含有2% D-木糖和 0.1% 2-脫氧-葡萄糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(圖3)。在CEN. PK菌株的細(xì)胞區(qū)域內(nèi)隨著時(shí)間推移，10-15天后開始出現(xiàn)分離的菌落。大約21天后，這些菌落長(zhǎng)得大到足以進(jìn)行物理操作。這些分離的菌落是獲得存在2-脫氧-葡萄糖時(shí)在D-木糖上生長(zhǎng)的能力的CEN. PK親本菌株的自發(fā)突變體(見下)。 采用S288c grrl Δ衍生物時(shí)沒有觀察到這一現(xiàn)象。這些結(jié)果表明，與CEN. PK細(xì)胞相反，即使在缺失GRRl基因后，S^Sc細(xì)胞也不能在2-脫氧-葡萄糖存在時(shí)在D-木糖上生長(zhǎng)。在 S288c中無(wú)法開發(fā)出2-脫氧-葡萄糖抗性/D-木糖利用突變體提示，S288c出現(xiàn)的少量生長(zhǎng)可能是由于利用了 D-木糖內(nèi)污染量的葡萄糖。在本文所述的篩選中分離且在2-脫氧-葡萄糖存在時(shí)在D-木糖上生長(zhǎng)的兩種代表性的釀酒酵母單倍體菌株⑶XR2和JH015于2009年2月25日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，登錄號(hào)分別為ΡΤΑ-9849和ΡΤΑ-9850。根據(jù)有關(guān)生物材料保藏的布達(dá)佩斯條約的條款，本發(fā)明授權(quán)后公眾可以獲得這些菌株。酵母細(xì)胞代謝從利用優(yōu)選糖轉(zhuǎn)變成非優(yōu)選糖(如D-半乳糖和D-木糖)可能需要數(shù)小時(shí)。即使在經(jīng)工程改造過度表達(dá)D-木糖降解必需酶的的酵母細(xì)胞中，也會(huì)出現(xiàn)這種時(shí)滯。在利用糖混合物的工業(yè)和實(shí)驗(yàn)室酵母菌株中，D-木糖的代謝效率似乎非常低，直到混合物中幾乎完全不含D-葡萄糖。參見圖9。用PCR分析在2-脫氧-葡萄糖存在時(shí)能夠在木糖上生長(zhǎng)的所選二倍體工業(yè)酵母菌株。如果GRRl完整，則三個(gè)Grrl Tf和Grrl TF引物對(duì)應(yīng)產(chǎn)生3810bp的PCR產(chǎn)物；如果GRRl被破壞，該P(yáng)CR產(chǎn)物應(yīng)該是1400bp。如果GRRl完整，則Grrl Tf和pAG25TRl引物對(duì)應(yīng)不產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，如果GRRl被natl基因替代，則應(yīng)產(chǎn)生 1200bp的PCR產(chǎn)物。 PCR分析證明，在弗門狄斯乙醇紅的衍生物grrl-/-2A和grrl_/_2B菌株中，兩種GRRl基因均被natl基因取代。應(yīng)注意，RC4是具有g(shù)rrl::NATl的單倍體S288C衍生物。在此PCR 反應(yīng)中，兩個(gè)先前的PCR反應(yīng)(10/18/04和12/10/09)返回與grrl-/-菌株相同的產(chǎn)物。下面參見圖10。對(duì)二倍體工業(yè)菌株進(jìn)行類似分析，以尋找Regl基因中的改變。如果REGl完整，Regl測(cè)試A和Regl測(cè)試ID引物對(duì)應(yīng)產(chǎn)生約3600bp的PCT產(chǎn)物；如果被破壞，則PCR產(chǎn)物應(yīng)為約1800bp。如果REGl完整，那么Regl測(cè)試A和pAG25TRl引物對(duì)應(yīng)不產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，如果REGl被natl基因取代，則應(yīng)產(chǎn)生約1500bp的PCR產(chǎn)物。上述PCR分析證明，在弗門狄斯乙醇紅的衍生物regl-/-lA和reg 1-/-1B菌株中，兩種REGl基因均被 natl基因取代。也證明，即使在攜帶Natl基因的菌株，如grrl_/_2A中，用REGl測(cè)試A和 PAG25T41引物也無(wú)法獲得PCR產(chǎn)物。D-葡萄糖抑制作用的強(qiáng)度見表1，該表包括D-木糖(Jin等，2004)以及不同濃度 D-葡萄糖(Yin等，2003)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄物選擇組的水平。也包括與野生型細(xì)胞相比，GRRl和 HXK2的細(xì)胞突變體在2% D-葡萄糖中生長(zhǎng)時(shí)，這些轉(zhuǎn)錄物的調(diào)控作用(Westergaard等， 2006)。如表1所示，即使是恒定水平的低D-葡萄糖(0. 01% )也會(huì)引起分解代謝物抑制。 例如，F(xiàn)BPl轉(zhuǎn)錄物的豐度在0. 01% -1% D-葡萄糖時(shí)保持相對(duì)恒定，而在2% D-木糖上或在缺少GRRl的細(xì)胞中的生長(zhǎng)被高度誘導(dǎo)。消除分解代謝物抑制應(yīng)該有用，即使可能通過加工混合的糖原料將D-葡萄糖混合的糖原料水平降低到小于誘導(dǎo)分解代謝物抑制的水平， 因?yàn)榧庸せ旌咸窃现粱竞谋M它們中的D-葡萄糖是耗時(shí)和昂貴的。
權(quán)利要求
1.一種分離酵母的方法，包括以下步驟提供生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基包含2-脫氧-葡萄糖、木糖和谷胺酰胺；木糖是唯一的碳源；用至少一種酵母菌株接種所述培養(yǎng)基；從所述培養(yǎng)基中分離至少一種酵母細(xì)胞；其中所述酵母細(xì)胞能夠在至少約0. 03重量％ 2-脫氧-葡萄糖存在時(shí)，以D-木糖作為唯一碳源生長(zhǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌株在大約14天后在所述培養(yǎng)基上表現(xiàn)出可檢測(cè)的生長(zhǎng)。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌株只有在大約21天后才在所述培養(yǎng)基上表現(xiàn)出可檢測(cè)的生長(zhǎng)。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基包含約2.0重量％的木糖和約 0.5重量％的谷氨酰胺。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母是酵母屬物種。
6.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述酵母是釀酒酵母的菌株。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述釀酒酵母菌株是單倍體。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述釀酒酵母菌株是二倍體。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述釀酒酵母菌株是大于二倍體的多倍體。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，分離自所述培養(yǎng)基的所述酵母菌株在至少 0. 03重量％的2-脫氧-葡萄糖存在時(shí)將代謝至少一種戊糖。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，分離自所述培養(yǎng)基的所述酵母菌株在至少約0. 03重量％的2-脫氧-葡萄糖存在時(shí)將代謝至少一種除D-葡萄糖以外的己糖。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，分離自所述培養(yǎng)基的所述酵母是自發(fā)突變體。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括使所述酵母接觸至少一種誘變劑的步驟。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述誘變劑選自電離輻射、紫外線和影響 DNA結(jié)構(gòu)的試劑，例如嵌入劑、烷化劑、DNA加合物等。
15.一種酵母變異體，其包括在至少0. 03重量％ 2-脫氧-葡萄糖存在時(shí)，以至少一種戊糖作為唯一碳源生長(zhǎng)的釀酒酵母菌株。
16.如權(quán)利要求15所述的酵母變異體，其特征在于，所述釀酒酵母菌株是單倍體。
17.如權(quán)利要求15所述的酵母變異體，其特征在于，所述釀酒酵母菌株是二倍體。
18.如權(quán)利要求15所述的酵母變異體，其特征在于，所述釀酒酵母菌株選自JH015、 CDXR2和弗門狄斯乙醇紅regl Δ和弗門狄斯乙醇紅grrl-/-(GXl)。
19.一種發(fā)酵糖源的方法，所述方法包括以下步驟提供至少一種釀酒酵母菌株，其中在至少0. 03重量％ 2-脫氧-葡萄糖存在時(shí)，所述至少一種釀酒酵母菌株將在至少一種戊糖上生長(zhǎng)；提供包含至少一種糖的原料；和在所述原料上培養(yǎng)所述酵母菌株。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述原料包含D-葡萄糖，其含量足以支持所述酵母菌株在不存在任何其它糖源的情況下生長(zhǎng)。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述原料包含可被所述酵母菌株發(fā)酵的戊糖。
22.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述原料包含可被所述酵母菌株發(fā)酵的戊糖和至少0. 的2-脫氧-葡萄糖。
23.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述原料包含除D-葡萄糖以外的可發(fā)酵己糖。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述原料還包含D-葡萄糖。
25.—種產(chǎn)生酵母突變菌株的方法，包括以下步驟提供選自Grrl和Regl的至少一個(gè)基因有活性的酵母菌株；去除Grrl和Regl的活性以產(chǎn)生突變菌株；和測(cè)試所述菌株以確定在至少約0. 03重量％ 2-脫氧-葡萄糖存在時(shí)該菌株能否在戊糖上生長(zhǎng)。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述突變菌株是單倍體。
27.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述突變菌株是二倍體。
28.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述突變菌株是大于二倍體的多倍體。
29.—種選擇或鑒定酵母菌株的方法，包括以下步驟提供在選自下組的至少一個(gè)開放閱讀框中含有突變的釀酒酵母的菌株ALR063W、 YMR167w、YPL176c、YPL123c、YPL121c、YBR242w、YBR422w、YHR012w、YHR103w、YHR154w、 YCL048w、YLR133w、Y0R138c、Y0R177c、YDR269c、YIL064w、YOLlOlc、YML124C、YMR116C、 YDR028c,YDR074c,YDL088c和YGR271，其中所述開放閱讀框編碼功能性基因且所述開放閱讀框中的突變會(huì)破壞該開放閱讀框編碼的基因的活性；在包含作為唯一碳源的木糖和至少約0. 03重量％ 2-脫氧-葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述釀酒酵母菌株；和分離在所述培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的釀酒酵母菌株。
30.一種分離酵母菌株的方法，其包括以下步驟提供一種菌株，其包含選自下組的開放閱讀框編碼的至少一種基因的功能性拷貝 YLR063w、YMR167w、YPL176c、YPL123c、YPL121c、YBR242w、YBR422w、YHR012w、YHR103w、 YHR154w、YCL048w、YLR133w、Y0R138c、Y0R177c、YDR269c、YIL064w、Y0L101C、YML124C、 YMR116C、YDR028c、YDR074c、YDL088c 和 YGR271w ；將突變引入選自下組的至少一個(gè)開放閱讀框中ALR063WJMR167WJPL176CJPL123C、 YPL121c、YBR242w、YBR422w、YHR012w、YHR103w、YHR154w、YCL048w、YLR133w、Y0R138c、 Y0R177c、YDR269c、YIL064w、YOLlOlc、YML124C、YMRl 16C、YDR028c、YDR074c、YDL088c 禾口 YGR271w,以產(chǎn)生釀酒酵母突變體；在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述釀酒酵母的突變體，其中所述選擇培養(yǎng)基包含作為唯一碳源的木糖和至少約0. 03重量％ 2-脫氧-葡萄糖；和分離在所述培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的突變體。
全文摘要
本文公開了產(chǎn)生和/或分離釀酒酵母變異體的材料和方法，特別是可以在含量足以抑制大部分酵母菌株在除D-葡萄糖以外的糖上生長(zhǎng)的2-脫氧-葡萄糖和/或D-葡萄糖存在時(shí)，在除D-葡萄糖以外的糖上生長(zhǎng)的釀酒酵母變異體?？捎糜诜蛛x這類變異體的選擇培養(yǎng)基包含戊糖如D-木糖、L-谷胺酰胺和2-脫氧-葡萄糖。某些菌株中Grr1和Red基因的突變也產(chǎn)生可以在2-脫氧-葡萄糖存在時(shí)，在包括戊糖D-木糖的糖上生長(zhǎng)的變異體。
文檔編號(hào)C12N1/00GK102498202SQ201080018127
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2010年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月25日
發(fā)明者C·伍茲, J·黑恩, M·戈保, R·科克林 申請(qǐng)人:印第安納大學(xué)研究和科技公司