循環(huán)中游離dna生物標(biāo)記物及其應(yīng)用的制作方法

專利名稱：循環(huán)中游離dna生物標(biāo)記物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總地涉及檢測(cè)和/或測(cè)量與細(xì)胞損傷相關(guān)的DNA標(biāo)記物，細(xì)胞損傷例如為病理生理或創(chuàng)傷損傷的結(jié)果，如由核事故、生物恐怖襲擊、腫瘤發(fā)生、輻射處理、感染或心血管疾病引起的。特別地，本發(fā)明涉及使用一種或多種遺傳(generic)生物標(biāo)記物來(lái)檢測(cè)和 /或測(cè)量受試者的細(xì)胞損傷。
背景技術(shù)：
健康細(xì)胞中的基因組DNA通常限制在細(xì)胞的核內(nèi)。然而，在細(xì)胞經(jīng)受程序性細(xì)胞死亡或凋亡的細(xì)胞老化過(guò)程中或在早期病狀過(guò)程中，基因組DNA釋放至循環(huán)系統(tǒng)中。這些循環(huán)中的DNA(circulating DNA)在健康個(gè)體中常常不可檢測(cè)到，因?yàn)閮?nèi)環(huán)境平衡能力有效地將它們從循環(huán)中清除出去。同樣，在早期病狀過(guò)程中，如在早期腫瘤發(fā)生過(guò)程中，個(gè)體的循環(huán)DNA沒(méi)有呈現(xiàn)出含量足夠高的使用目前可用的核酸檢測(cè)方法早期可檢測(cè)的腫瘤特異性標(biāo)記物。盡管來(lái)自腫瘤發(fā)展早期個(gè)體的循環(huán)DNA高于正常的健康個(gè)體，但目前不存在可以區(qū)別個(gè)體內(nèi)作為腫瘤發(fā)生和正常細(xì)胞老化的結(jié)果釋放的循環(huán)DNA的生物標(biāo)記物。此外， 使用與健康個(gè)體中相同的細(xì)胞機(jī)制，將如果不是全部就是大部分的循環(huán)中游離DNA從循環(huán)中清除出來(lái)。此外，在個(gè)體已經(jīng)暴露于高水平輻射的情況中，例如，核事故，或生物恐怖襲擊中的高水平輻射和/或傳染劑，大規(guī)模細(xì)胞損傷隨之導(dǎo)致大量基因組DNA釋放至循環(huán)中。然而，為了治療和隔離這些個(gè)體以免與未暴露于這些試劑的個(gè)體交叉感染的目的，而用于檢測(cè)這些個(gè)體的有效、可靠且廉價(jià)的方法，目前尚不存在。因此，存在著對(duì)用于檢測(cè)和/或測(cè)量受試者狀況或病癥(如受試者的細(xì)胞損傷水平)的方法和/或生物標(biāo)記物的需求。發(fā)明概述本發(fā)明部分基于以下的發(fā)現(xiàn)特定的多核苷酸，例如受試者循環(huán)中游離的基因組 DNA，可以用作表示受試者狀況(例如受試者暴露于任何病理生理?yè)p傷)的生物標(biāo)記物。因此，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)與病理生理或其他損傷相關(guān)的細(xì)胞損傷的方法、試劑盒以及相關(guān)生物標(biāo)記物和試劑。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了檢測(cè)受試者中與病理生理?yè)p傷相關(guān)的細(xì)胞損傷的方法。該方法包括檢測(cè)受試者的生物樣品中循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的存在或不存在，其中循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記的存在表示與受試者中的病理生理?yè)p傷相關(guān)的細(xì)胞損傷。病理生理?yè)p傷可以是物理?yè)p傷，如，例如，暴露于電離輻射、核事故和炸彈襲擊。 在一個(gè)實(shí)施方案中，病理生理?yè)p傷是由于傳染劑引起的，如但不限于，通過(guò)病毒、細(xì)菌和/ 或寄生物引起的傳染，這些是天然產(chǎn)生的或是生物恐怖行動(dòng)的結(jié)果。在另一個(gè)實(shí)施方案中，病理生理?yè)p傷是由于病狀的發(fā)展和進(jìn)展引起的，病狀如腫瘤發(fā)生，或心臟、肝臟、肺或腎臟疾病。在另一個(gè)實(shí)施方案中，病理生理?yè)p傷是化學(xué)損傷，如化療和/或其他血中毒 (hematotoxic)劑、四氯化碳和/或其他肝毒劑、氧化劑、酸或其他局部或攝入的引起壞死的試劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，病理生理?yè)p傷是外傷身體損傷，如由事故引起的頭部損傷或燒傷。本發(fā)明的循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物包括受試者中作為循環(huán)中游離多核苷酸或血漿多核苷酸存在的多核苷酸，并且因此與循環(huán)中的任何細(xì)胞無(wú)關(guān)或沒(méi)有位于循環(huán)中的任何細(xì)胞內(nèi)。遺傳生物標(biāo)記物的實(shí)例包括選自具有Alu序列，或端粒序列或源自端粒的序列的那些，和編碼18S/28S核糖體RNA的基因的序列。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了檢測(cè)由病理生理?yè)p傷引起的細(xì)胞損傷的方法，包括測(cè)定受試者的生物樣品中的循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的水平涉及身體損傷，如但不限于，暴露于輻射，例如，在核事故或臟彈襲擊中。在一個(gè)實(shí)施方案中，循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的水平涉及由于傳染劑引起的病理生理?yè)p傷，如但不限于，通過(guò)病毒、細(xì)菌和/或寄生物引起天然發(fā)生的或是生物恐怖行動(dòng)的結(jié)果的傳染。在另一個(gè)實(shí)施方案中，循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的水平涉及作為病狀的發(fā)展和進(jìn)展結(jié)果的病理生理?yè)p傷，病狀如腫瘤發(fā)生，或心臟、肝臟、肺或腎臟疾病。在另一個(gè)實(shí)施方案中，循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的水平涉及由化學(xué)暴露引起的病理生理?yè)p傷，化學(xué)暴露如但不限于暴露于來(lái)自化學(xué)火災(zāi)的氣溶膠和工業(yè)毒素暴露。在另一個(gè)實(shí)施方案中，循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的水平涉及由于外傷身體損傷引起的病理生理?yè)p傷，外傷身體損傷如身體傷害，例如，由事故引起的頭部損傷、運(yùn)動(dòng)相關(guān)損傷或過(guò)度鍛太東。本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)循環(huán)多核苷酸的試劑盒，多核苷酸例如為由于細(xì)胞損傷在循環(huán)中的DNA分子或片段，細(xì)胞損傷可以是病理生理?yè)p傷的結(jié)果。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包括用于檢測(cè)循環(huán)中游離多核苷酸的探針組。例如，探針組可以包括與在細(xì)胞損傷時(shí)循環(huán)、血漿或其他體液中存在的在此公開的遺傳生物標(biāo)記物雜交的核苷酸序列。在特定的實(shí)施方案中，探針組包括具有與遺傳生物標(biāo)記物雜交的核苷酸序列的捕獲延伸物，遺傳生物標(biāo)記物如但不限于獲自受試者的生物樣品中的循環(huán)中游離或血漿中存在的Alu核苷酸序列、端粒序列或18S/28S核糖體RNA編碼序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，探針組進(jìn)一步包括具有與遺傳生物標(biāo)記物雜交的核苷酸序列的標(biāo)記延伸物。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了示意圖，其中由各種病理生理過(guò)程引起的損傷后DNA釋放至循環(huán)中。圖2顯示了用于檢測(cè)多核苷酸的一個(gè)示意圖，其可以結(jié)合本發(fā)明來(lái)使用。 圖3顯示了從結(jié)合遺傳標(biāo)記物Alu序列的鏈霉抗生物素-偶聯(lián)的藻紅蛋白標(biāo)記的探針發(fā)射出的相對(duì)光單位(RLU)的關(guān)聯(lián)。圖4A顯示了在M小時(shí)時(shí)間段中IOGy全身輻射后，釋放至循環(huán)中的DNA(Alu序列)。圖4B顯示了溴乙錠染色的來(lái)自上圖4A的樣品的DNA。圖5顯示了釋放至循環(huán)中的DNA和輻射劑量之間的相關(guān)性。
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圖6顯示了在21天時(shí)間段中2Gy(6A)和5Gy(6B)的全身輻射后釋放至循環(huán)中的 DNA。圖7顯示了各種病狀的釋放至循環(huán)中的DNA水平正常(N)、白血病(LM)、糖尿病 (DM)、癌癥(CA)、心肌梗塞(MI)、急性胰腺炎(AP)、HBV相關(guān)的肝炎(HBV)和HCV相關(guān)的肝炎(HCV)。圖8顯示了心肌梗塞后患者中釋放至循環(huán)中的DNA水平和肌酸-激酶2 (CK-MB) 水平之間隨著時(shí)間的相關(guān)性。圖9顯示了用于保護(hù)/治療受試者免受輻射影響的輻射保護(hù)劑D68對(duì)IOGy輻射后9小時(shí)存在的血漿DNA水平的作用。圖10顯示了作為檢測(cè)惡性腫瘤診斷工具的釋放至循環(huán)中的DNA水平。圖11顯示了作為監(jiān)控腫瘤進(jìn)展/衰退或腫瘤體積的診斷工具的釋放至循環(huán)中的 DNA水平。圖12顯示了作為監(jiān)控放療指標(biāo)的釋放至循環(huán)中的DNA水平。圖13顯示了可以用于指導(dǎo)放療的循環(huán)DNA水平。圖14顯示了在自身免疫病(SLE)和懷孕過(guò)程中DNA釋放至循環(huán)中。圖15A和B顯示了隨著時(shí)間釋放至循環(huán)中DNA水平和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療 (PCI)后心肌梗塞的治療結(jié)果之間的相關(guān)性。還顯示了肌鈣蛋白I水平，其下降與治療結(jié)果無(wú)關(guān)。圖16顯示了釋放至循環(huán)中的DNA水平和再次梗塞之間的相關(guān)性。圖17A和B顯示了釋放至循環(huán)中的DNA水平和輻射劑量之間的相關(guān)性。圖18顯示了輻射后循環(huán)中游離DNA的持久性。圖19顯示了釋放至循環(huán)中的DNA水平受到部分身體輻射的影響。圖20顯示了釋放至循環(huán)中的DNA用于在骨髓移植前監(jiān)控接受全身輻射(TBI)的患者的用途。圖21顯示了釋放至循環(huán)中的DNA用于在骨髓移植前監(jiān)控接受全身輻射(TBI)的多個(gè)患者的用途。發(fā)明詳述本發(fā)明部分基于以下的發(fā)現(xiàn)特定的多核苷酸(例如，受試者游離在循環(huán)中的基因組DNA)可以用作生物標(biāo)記物來(lái)表示受試者狀況，例如，受試者暴露于任何病理生理?yè)p傷引起的細(xì)胞損傷的存在。因此，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)與病理生理?yè)p傷相關(guān)的細(xì)胞損傷的方法、試劑盒以及相關(guān)生物標(biāo)記物和試劑。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了通過(guò)檢測(cè)獲自目標(biāo)受試者的生物樣品中一種或多種循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的存在或不存在來(lái)檢測(cè)受試者中細(xì)胞損傷的方法，例如，細(xì)胞損傷是病理生理?yè)p傷的結(jié)果或與病理生理?yè)p傷相關(guān)。本發(fā)明的循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物可以是任何遺傳生物標(biāo)記物。例如，生物標(biāo)記物可以是DNA或RNA標(biāo)記物，其被釋放至血管系統(tǒng)中或存在于循環(huán)中(例如，血液或血漿)、存在于體液中(例如，血漿、血清、尿液或胸腔積液)，或是胞外的，即，在細(xì)胞外(不相連或不位于其中)，結(jié)合或不結(jié)合細(xì)胞表面。如在此所用的例如含有遺傳生物標(biāo)記物的循環(huán)中游離多核苷酸可以與術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞游離多核苷酸”、“細(xì)胞循環(huán)中游離多核苷酸”或“循環(huán)中游離多核苷酸”、“血漿多核苷酸”或“細(xì)胞血漿多核苷酸”互換使用。根據(jù)本發(fā)明，例如含有遺傳生物標(biāo)記物的循環(huán)中游離多核苷酸可以獲自生物樣品，如但不限于血樣、血清樣品、血漿樣品、尿樣或胸腔積液樣品或其組合。如在此所用的術(shù)語(yǔ)“遺傳生物標(biāo)記物”是多核苷酸(DNA或RNA)或其他起與遺傳內(nèi)含物的細(xì)胞釋放相關(guān)的標(biāo)記物作用的生物物質(zhì)。通常，遺傳生物標(biāo)記物是胞外存在的多核苷酸。在特定的實(shí)施方案中，生物標(biāo)記物的序列、表達(dá)(或水平)和/或活性沒(méi)有明確地與任何特定的疾病或病癥相關(guān)。特別地，本發(fā)明的遺傳生物標(biāo)記物主要依賴于它們的胞外存在或起生物標(biāo)記物作用的活性。在特定的實(shí)施方案中，遺傳生物標(biāo)記物與細(xì)胞死亡或例如遺傳內(nèi)含物如DNA的細(xì)胞釋放相關(guān)。這些內(nèi)含物的釋放可能是受試者的病理生理?yè)p傷、瘤形成如癌癥、外源損傷、 處理或外傷影響的結(jié)果。例如，生物標(biāo)記物可以是病原體侵襲、損傷暴露、物理創(chuàng)傷、內(nèi)部創(chuàng)傷、心肌梗塞、自身免疫病等的表示。在這些實(shí)施方案中，生物標(biāo)記物的存在或水平與受試者的正常生理過(guò)程例如老化無(wú)關(guān)。在這些或其他實(shí)施方案中，遺傳生物標(biāo)記物是重復(fù)序列或元件，例如，銜接重復(fù)、 管家基因或元件，或任何其他以特定的豐度存在于哺乳動(dòng)物如人基因組中的序列。例如， 遺傳生物標(biāo)記物可以是重復(fù)核苷酸序列或任何構(gòu)成至少l^d^d^d^j^j^j^、 8%、9%或10%的人基因組的核苷酸序列元件。在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，遺傳生物標(biāo)記物具有部分或完整的Alu核苷酸序列。Alu核苷酸序列是初始特征在于Alu限制性核酸內(nèi)切酶作用的短鏈DNA，其識(shí)別5’AG/ CT3’。Alu序列屬于存在于哺乳動(dòng)物基因組如人基因組中的重復(fù)元件家族。在單倍體基因組中大概存在300，000多個(gè)Alu家族成員。Alu序列大約300個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)并且超過(guò)一百萬(wàn)個(gè)的這些序列散布在整個(gè)人基因組中。估計(jì)約10%的人基因組由Alu序列組成。任何Alu序列，部分或完整的，可以用作遺傳生物標(biāo)記物。在一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳生物標(biāo)記物是人基因組中富含的一個(gè)或多個(gè)Alu序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物標(biāo)記物是一個(gè)或多個(gè)與受試者的壓力或損傷唯一相關(guān)的Alu序列。可以用作遺傳生物標(biāo)記物的Alu序列的實(shí)例包括但不限于SEQ IDNO 1或2中所示的序列或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的遺傳生物標(biāo)記物與SEQ ID NO :1或2至少約 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%相同。
在特定的實(shí)施方案中，例如，根據(jù)QuantiGene 方法，使用基于Alu序列設(shè)計(jì)的探針組來(lái)檢測(cè)Alu序列生物標(biāo)記物。在這些實(shí)施方案中，探針組包括捕獲延伸物(CE)，例如，至少兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)CE，每個(gè)含有選自SEQ ID NO :7-19的序列(參見，以下的表 1-3)，標(biāo)記衍生物(LE)，例如，至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)LE，每個(gè)含有選自SEQ ID NO 32-44的序列(參見，以下的表6-8)，和任選的阻斷標(biāo)記(BL)，例如，至少一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)BL，每個(gè)含有選自SEQ ID NO :69-71的序列(參見，以下的表11)。 CE、LE和BL的長(zhǎng)度可以為約10個(gè)核苷酸至約20個(gè)核苷酸長(zhǎng)，約20個(gè)核苷酸至約 30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，或約30個(gè)核苷酸至約50個(gè)核苷酸長(zhǎng)。在特定的實(shí)施方案中，探針組包括每個(gè)含有SEQ ID NO 7-11序列之一的CE、每個(gè)含有SEQ ID NO :32-35序列之一的LE和任選含有SEQ IDNO :69序列的BL。在其他實(shí)施方案中，探針組包括每個(gè)含有SEQ IDNI :12-15序列之一的CE、每個(gè)含有SEQ ID NO :36-38序列之一的LE。在其他實(shí)施方案中，探針組包括每個(gè)含有SEQ ID NO :16-19序列之一的CE、每個(gè)含有SEQ ID NO :39-44序列之一的LE和任選每個(gè)含有SEQ IDNO 70和71序列之一的BL。在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，遺傳生物標(biāo)記物具有部分或完整的源自編碼 18S/28S核糖體RNA的基因的序列。核糖體RNA基因在哺乳動(dòng)物基因組中組織為銜接重復(fù)。 在人類中，在五個(gè)簇中存在約300-400個(gè)這樣的組織化重復(fù)序列?？梢杂米鬟z傳生物標(biāo)記物的18S和28S序列的實(shí)例包括但不限于SEQ ID NO :3或4中所示的那些，或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳生物標(biāo)記物與SEQ ID吣3或4至少約50%、55%、60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%相同。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，例如，根據(jù)QuantiGene 方法，使用基于18S/28S rRNA序列設(shè)計(jì)的探針組來(lái)檢測(cè)18SA8S rRNA序列生物標(biāo)記物。通常，探針組包括捕獲延伸物(CE)，例如，至少兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)CE，每個(gè)含有選自SEQ ID NO :20-31的序列(參見，以下的表4和幻，標(biāo)記衍生物(LE)，例如，至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)LE，每個(gè)含有選自SEQ ID NO 45-68的序列(參見，以下的表9和10)，和任選的阻斷標(biāo)記(BL)，例如， 至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)BL，每個(gè)含有選自SEQ ID NO :72-77的序列(參見，以下的表11)。CE、LE和BL的長(zhǎng)度可以為約10個(gè)核苷酸至約20個(gè)核苷酸長(zhǎng)，約20個(gè)核苷酸至約30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，或約30個(gè)核苷酸至約50個(gè)核苷酸長(zhǎng)。在特定的實(shí)施方案中，遺傳生物標(biāo)記物具有源自一個(gè)或多個(gè)端粒的部分或完整核苷酸序列。端粒涉及染色體的復(fù)制和穩(wěn)定性。端粒包括在染色體末端的約六個(gè)核苷酸堿基的重復(fù)DNA序列的片段。端粒序列的長(zhǎng)度可以從酵母中大約300至大約600bp至人類中的上千堿基。序列通常包含一批約6至約8bp的富含G重復(fù)序列，或更少的，如TTAGGG、 TTGGG、TTTTGGGG等。用作遺傳生物標(biāo)記物的序列實(shí)例包括但不限于SEQ IDNO :5和6，及其片段。本發(fā)明的遺傳生物標(biāo)記物可以與SEQ ID而5或6至少約50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%相同。在特定的實(shí)施方案中，例如，根據(jù)QuantiGene 方法，使用基于端粒序列設(shè)計(jì)的探針組來(lái)檢測(cè)端粒序列生物標(biāo)記物。例如，探針組包括捕獲延伸物(CE)，例如，至少兩個(gè)、 三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)CE，標(biāo)記衍生物(LE)，例如，至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)LE，和任選的阻斷標(biāo)記(BL)，例如，至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)BL。CE、LE和BL的長(zhǎng)度可以為約10個(gè)核苷酸至約20個(gè)核苷酸長(zhǎng)，約20個(gè)核苷酸至約30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，或約30個(gè)核苷酸至約50個(gè)核苷酸長(zhǎng)。在此所用的術(shù)語(yǔ)“病理生理?yè)p傷”意思是導(dǎo)致細(xì)胞損傷的任何明顯的身體或病理沖擊或創(chuàng)傷，例如，與外源或內(nèi)部事件或來(lái)源相關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方案中，病理生理?yè)p傷與受試者的外源或內(nèi)部壓力、沖擊或處理相關(guān)。例如，實(shí)例可以是病原體傳染、暴露于有害物質(zhì)、 物理?yè)p傷或任何對(duì)受試者系統(tǒng)創(chuàng)傷性的外部事件。壓力可能是由于醫(yī)療介入引起的，如但不限于，醫(yī)療裝置例如支架(stent)的植入；移植準(zhǔn)備，例如，骨髓、心臟、肝臟或腎臟移植； 或外科手術(shù)。壓力也可以是如懷孕，上癮或?qū)λ幬铩⒒瘜W(xué)品或酒精的依賴這樣的病癥，或身體或精神壓力，如PTSD。在其他實(shí)施方案中，病理生理?yè)p傷與受試者的內(nèi)部壓力、沖擊或病理事件相關(guān)。例如，可以是與細(xì)胞死亡或程序性細(xì)胞死亡、壞死、細(xì)胞分解等相關(guān)的任何病理事件。
在其他實(shí)施方案中，病理生理?yè)p傷是暴露于輻射或任何其他引起DNA或細(xì)胞損傷的材料或能量源。在一個(gè)實(shí)施方案中，病理生理?yè)p傷是暴露于與核事故、核武器攻擊等相關(guān)的輻射。在其他實(shí)施方案中，病理生理?yè)p傷是化學(xué)損傷，如但不限于來(lái)自工業(yè)事故或爆炸的腐蝕性或非腐蝕性氣溶膠，如鹵代烴或酸、無(wú)臭氣體和/或化學(xué)品，或可以進(jìn)入并保留在體內(nèi)引起炎癥和損傷的微粒化學(xué)品。評(píng)價(jià)暴露于化學(xué)武器爆炸的嚴(yán)重程度是另一個(gè)實(shí)例。在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，病理生理?yè)p傷是由于傳染劑引起的，如但不限于通過(guò)病毒、細(xì)菌和或寄生物的感染，無(wú)論是通過(guò)天然暴露于傳染劑或作為生物恐怖行動(dòng)的結(jié)可以導(dǎo)致細(xì)胞中的病理生理?yè)p傷的病毒科的實(shí)例包括副粘病毒科 (Paramyxoviridae)(例如，副流感、腮腺炎、麻疹)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感)；嗜肝DNA病毒科Ofepdnaviridae)(例如，肝炎)；腺病毒科(Adenoviridae) (例如，急性呼吸道疾病)；痘病毒科(Poxviridae)(例如，天花)；皰疹病毒科 (Herpesviridae)(例如，抱疫，Karposi 肉瘤)；乳頭狀瘤病毒科(Papillomaviridae) (例如，HPV)；多瘤病毒科(Polyomaviridae)(例如，膀胱炎或輕度或急性呼吸道疾病)； 細(xì)小病毒科(Parvoviridae)；彈狀病毒科(Rhabdoviridae)(例如，狂犬病)；絲狀病毒科(Filoviridae)(例如，由埃博拉病毒和馬爾堡病毒引起的出血熱)；布尼亞病毒科 (Bunyaviridae)(例如，腦炎、漢坦病毒呼吸綜合癥、裂谷熱)；沙粒病毒科(Arenaviridae) (例如，無(wú)菌性腦膜炎、腦炎、腦膜腦炎、拉沙熱)；冠狀病毒科(CoronaViridae)HfMn, 嚴(yán)重急性呼吸綜合癥或SARS)；黃病毒科(Flaviviradae)(例如，登革出血熱)；披膜病毒科(Togaviridae)；小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如，)；杯狀病毒科 (Caliciviridae)(例如，冬季嘔吐病)；星狀病毒科(Astroviridae)(例如，腸胃炎)；逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)(例如，HIV、HTLV)和呼腸弧病毒科(Reoviridae)(例如，科羅拉多壁虱熱)?？梢砸鹗軅魅炯?xì)胞中的病理生理?yè)p傷的細(xì)菌的非限制實(shí)例為百日咳博德特氏菌(B. pertussis)；波摩那鉤端螺旋體(Leptospira Pomona)；副傷寒沙門氏菌(S. paratyphi) A 和 B ；白喉棒桿菌(C. diphtheriae)、破傷風(fēng)梭菌(C. tetani)、肉毒梭菌(C. botulinum)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(C. perfringens)、費(fèi)氏梭菌(C. feseri)和其他氣性壞疽細(xì)菌；炭疽桿菌(B. anthracis)；鼠疫巴斯德氏菌(P. pestis)；多殺巴斯德氏菌(P. multocida)；腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)；淋病奈瑟氏球菌(N. gonorrheae)；流感嗜血菌(Hemophilus influenzae)；方文線菌屬(Actinomyces) (例如，諾卡氏菌屬(Norcardia))；不動(dòng)桿菌屬(AcinetcAacter)；芽孢桿菌科 (Bacillaceae)(例如，炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthrasis))；擬桿菌屬(Bacteroides) (例如，脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)) ；Blastomycosis ；博德特氏菌屬(百日咳博德特氏菌(Bordetellapertusi))；疏螺旋體屬(Borrelia)(例如，布氏疏螺旋體 (Borreliaburgdoferi))；布魯氏菌屬(Brucella)；彎曲桿菌屬(Campylobacter)；衣原體屬(Chlamydia) ；Coccidiodes ；棒桿菌屬(Corynebacterium)(例如，白喉棒桿菌 (Corynebacterium diptheriae))；大腸桿菌(E. coli)(例如，產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌和腸出血性的大腸桿菌)；腸桿菌屬(Enterobacter)(例如，產(chǎn)氣腸桿菌(EntercAacteraerogenes))；腸桿菌禾斗(Enterobacteriaceae)(克雷伯氏菌屬(Klebsiella),沙門氏菌屬(Salmonella)(例如，傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)、沙雷氏菌屬(Serratia)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、志賀氏菌屬 (Shigella))；丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)；嗜血菌屬(Haemophilus)(例如，B 型流感嗜血菌(Haemophilus influenza))；螺桿菌屬(Helicobacter)；軍團(tuán)菌屬(Legionella) (例如，侵肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila))；鉤端螺旋體屬(Leptospira)；利斯特氏菌屬(Listeria)(例如，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes))；枝原體屬 (Mycoplasma)；分枝桿菌屬(Mycobacterium)(例如，麻風(fēng)桿菌(Mycobacterium leprae)、 結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)禾口牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis))； 弧菌屬(Vibrio)(例如，霍亂弧菌(Vibrio cholerae))；巴斯德氏菌科(Pasteurellacea) (溶血巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica))；變形菌屬(Proteus)；假單胞菌屬(Pseudomonas)(例如，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))；立克次氏體科 (Rickettsiaceae)；螺旋體目(Spirochetes)(例如，密螺旋體屬(Treponema spp.)、鉤端螺旋體屬(Leptospira spp·)、疏螺旋體(Borrel iaspp.))；志賀氏菌屬Shigella spp. ) ；Meningiococcus ；月市炎球菌屬(Pneumococcus)禾口鏈球菌屬(Streptococcus)(例如，月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)禾口 A、B禾口 C組Str印tococci)；尿枝原體屬 (Ureaplasmas)；蒼白密螺方寵體(Treponema pollidum)；禾口葡萄球菌屬(Staphylococcus) (金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)禾口表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis))?？梢砸鹗軅魅炯?xì)胞中的病理生理?yè)p傷的寄生物或原生動(dòng)物的非限制性實(shí)例包括利什曼病(墨西哥熱帶利什曼原蟲(Leishmania tropicamexicana)、熱帶利什曼原蟲(Leishmania tropica)、碩大利什曼原蟲(Leishmania major)、埃塞俄比亞利什曼原蟲 (Leishmania aethiopica) > EiH^1JffMJIiii. (Leishmania braziliensis)ΜΙ 蟲(Leishmaniadonovani)、嬰兒利什曼蟲(Leishmania infantum)、恰加斯氏利什曼原蟲 (Leishmania chagasi)；維蟲病(R 比亞布氏維蟲(Trypanosoma bruceigambiense)、羅德西亞布氏錐蟲(Trypanosoma brucei rhodesiense)；弓形體病(剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii))；血吸蟲病(埃及血吸蟲(Schistosoma haematobium)、日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)、曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni)、湄公河血吸蟲(Schistosoma mekongi)、 間插血吸蟲(Schistosoma intercalatum)；皰疾(間日皰原蟲(Plasmodiumvirax)、惡性皰原蟲(Plasmodium, falciparium)、三日瘧原蟲(Plasmodiummalariae)禾口蛋形皰原蟲 (Plasmodium ovale)；阿米巴病(痢疾阿米巴(Entamoeba histolytica))；巴貝蟲病(果氏巴貝蟲(Babesiosis microti))；似隱孢菌病(小隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum))； 雙核阿米巴病(Dientamoebiasis)(脆雙核阿米巴(Dientamoeba fragilis))；賈第鞭毛蟲病(蘭伯賈第蟲(Giardia Iamblia))；蠕蟲病和毛滴蟲屬(Trichomonas)(陰道毛滴蟲 (Trichomonas vaginalis))。以上的列表表示說(shuō)明性的，并且決不是將本發(fā)明限于那些特定的細(xì)菌、病毒或寄生生物體。在其他實(shí)施方案中，病理生理?yè)p傷可能是由于病狀的發(fā)展和進(jìn)展引起的，例如，與細(xì)胞死亡(程序性細(xì)胞死亡)、細(xì)胞損傷、壞死等相關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方案中，病理生理?yè)p傷是受試者中的腫瘤發(fā)生或瘤形成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，病理生理?yè)p傷是受試者中超過(guò)一個(gè)部位的實(shí)質(zhì)性腫瘤發(fā)生或瘤形成，例如，淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移等。由腫瘤發(fā)生或瘤形成引起的疾病實(shí)例包括白血病、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胃癌、結(jié)腸癌、黑素瘤、淋巴瘤、肺癌、胰腺癌、腦瘤、口腔癌等。在其他實(shí)施方案中，病理生理?yè)p傷是自身免疫病。自身免疫病的實(shí)例包括 vertiligo、硬皮病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、恰加斯氏病、1型糖尿病、橋本病、強(qiáng)直性脊柱炎、 Grave' s病、Guillain-Barre綜合癥、全身性紅斑狼瘡(SLE)等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，病理生理?yè)p傷并非是疾病，如懷孕、對(duì)化學(xué)物質(zhì)的上癮或依賴，化學(xué)物質(zhì)如藥物或酒精。在另一個(gè)實(shí)施方案中，病理生理?yè)p傷是心血管病。心血管病的實(shí)例包括急性血管阻塞，如肺栓塞和心肌梗塞，導(dǎo)致心臟細(xì)胞凋亡，其隨后引起游離多核苷酸例如DNA從細(xì)胞釋放至循環(huán)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，病理生理?yè)p傷可以是肺栓塞或心肌梗塞后的一個(gè)或多個(gè)隨后事件引起的。隨后的事件包括但不限于用于心血管病治療的醫(yī)療程序，如經(jīng)皮心臟介入，或血管重建術(shù)，或經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)(PTCA)或氣囊血管成形術(shù)，冠狀動(dòng)脈旁路術(shù)，或繼發(fā)性肺栓塞或心肌梗塞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，病理生理?yè)p傷是肝病、肺病或腎病等，尤其是與細(xì)胞死亡或壞死相關(guān)的病癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，病理生理?yè)p傷是外傷性身體損傷，如由事故引起的頭部損傷。例如，病理生理?yè)p傷可以來(lái)自運(yùn)動(dòng)損傷，如拳擊、足球或劇烈鍛煉等。根據(jù)本發(fā)明，用于檢測(cè)與受試者的病理生理?yè)p傷相關(guān)的細(xì)胞損傷的方法可以包括細(xì)胞損傷的定性和/或定量檢測(cè)。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括檢測(cè)獲自受試者的生物樣品中的一種或多種循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的存在或不存在，該受試者暴露或懷疑暴露于病理生理?yè)p傷。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括檢測(cè)獲自受試者的生物樣品中的一種或多種循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的水平，以監(jiān)測(cè)病理生理?yè)p傷的進(jìn)展、 程度或水平、或治療效果。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于檢測(cè)生物樣品中的一種或多種循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的方法可以用于監(jiān)控診斷為患病個(gè)體中的治療進(jìn)展或功效。例如，循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的水平可以用作檢測(cè)癌癥患者放療或化療功效或經(jīng)歷骨髓移植的患者中免疫應(yīng)答的標(biāo)記物。一種或多種循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物水平的提高或降低可以用于測(cè)定醫(yī)療介入的成功或失敗，如但不限于心肌梗塞后的經(jīng)皮心臟介入?？梢允褂没虿皇褂醚h(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的擴(kuò)增來(lái)進(jìn)行本發(fā)明的檢測(cè)方法。 檢測(cè)方法可以是實(shí)時(shí)PCR、定量PCR、熒光PCR、RT-MSP(RT甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、 DNA的PicoGreenTM(Molecularfrobes，Eugene, OR)檢測(cè)、放射性免疫測(cè)定、DNA的直接放射性標(biāo)記等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以不依賴擴(kuò)增而進(jìn)行檢測(cè)方法，例如，沒(méi)有產(chǎn)生目標(biāo)序列的任何拷貝或復(fù)制品，沒(méi)有涉及任何聚合酶或不需要任何熱循環(huán)。例如，可以使用2006 年6月19日提交的us申請(qǐng)系列No :11/471,025中所述的QuantiGene 方法中所列的原理來(lái)進(jìn)行檢測(cè)方法，在此將該申請(qǐng)引入作為參考。QuantiGene 方法在一系列雜交反應(yīng)中使用支化DNA技術(shù)，而不需要用于信號(hào)擴(kuò)增的熱循環(huán)。原則上，其使用一組主探針與目標(biāo)序列雜交并通過(guò)與這些主探針的一部分雜交的其他探針來(lái)加強(qiáng)這些雜交的存在。換句話說(shuō)，該方法通過(guò)多層探針雜交替代任何實(shí)際核苷酸序列擴(kuò)增而加強(qiáng)了雜交信號(hào)。在分支化DNA技術(shù)的一個(gè)示例性實(shí)施方案中，將約30個(gè)或更多個(gè)不同寡核苷酸探針用于特異性結(jié)合目標(biāo)DNA或RNA。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)與一組探針例如捕獲延伸物(CE)雜交， 捕獲延伸物隨后與一組探針例如連接固體支持物(例如珠子等)的捕獲探針(CP)雜交，來(lái)將核酸如循環(huán)中游離DNA(線狀或環(huán)狀)捕獲在固體支持物上。隨后，可以使用另一組探針例如標(biāo)記延伸物(LE)進(jìn)一步雜交捕獲在固體支持物上的靶核苷酸。可以通過(guò)直接檢測(cè)LE 與固體支持物上的目標(biāo)核苷酸的多重雜交，或替換地通過(guò)一組或多組探針例如擴(kuò)增子前探針、擴(kuò)增子探針等與雜交的LE進(jìn)一步雜交，或兩者，來(lái)加強(qiáng)這些雜交的信號(hào)。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，可以使用與鏈霉抗生物素綴合的可檢測(cè)實(shí)體來(lái)進(jìn)行這些雜交的檢測(cè)，同時(shí)相應(yīng)的探針是生物素化的(參見，圖2)。在一個(gè)實(shí)施方案中，探針組包括捕獲延伸物和標(biāo)記延伸物，其具有識(shí)別并結(jié)合Alu 序列的序列。在特定的實(shí)施方案中，對(duì)捕獲延伸物和標(biāo)記延伸物進(jìn)行設(shè)計(jì)，以識(shí)別并結(jié)合端粒序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)捕獲延伸物和標(biāo)記延伸物進(jìn)行設(shè)計(jì)，以識(shí)別并結(jié)合18S或 28S核糖體RNA序列。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，用于檢測(cè)由病理生理?yè)p傷引起的細(xì)胞損傷的方法包括測(cè)定受試者生物樣品中的循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的表達(dá)特征。通常，本發(fā)明的循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的表達(dá)特征包括與循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的存在或不存在相關(guān)的任何參數(shù)或數(shù)據(jù)或定性或定量描述。在一個(gè)實(shí)施方案中，循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的表達(dá)特征包括一種或多種循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的水平或濃度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的表達(dá)特征包括循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的組或組合的存在或不存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的表達(dá)特征包括與預(yù)定時(shí)間線或病理生理?yè)p傷相關(guān)的時(shí)間線相關(guān)的一種或多種循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的水平或濃度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的表達(dá)特征包括參數(shù)的組合，例如，濃度、關(guān)于預(yù)定時(shí)間線的存在或不存在、細(xì)胞損傷的程度、核酸釋放動(dòng)力學(xué)、基因產(chǎn)生/分裂(production/ fragmentation)之間的平衡和身體清除速率等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的表達(dá)特征包括一個(gè)或多個(gè)因素，如濃度、時(shí)間線、增加速率、分解至基線的速率、 峰水平、不同遺傳標(biāo)記物的差異表達(dá)和不同遺傳標(biāo)記物的差異表達(dá)的時(shí)間依賴性變化。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于檢測(cè)作為受試者病理生理?yè)p傷結(jié)果的細(xì)胞損傷引起的循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的試劑盒，在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包括用于檢測(cè)循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的探針組。在一個(gè)實(shí)施方案中，探針組包括與循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物雜交的序列。在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，探針組包括捕獲延伸物(CE)，其具有與遺傳生物標(biāo)記物雜交的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，探針組包括源自SEQID NO 1的Alu序列的探針組1 的捕獲延伸物。源自SEQ ID NO :1的捕獲延伸物的實(shí)例包括SEQ ID NO :7、8、9、10和11 (參見，表1)。表1 源自SEQ ID NO 1的Alu序列的探針組1的捕獲延伸物。
SEQ ID NO 探針組1的捕獲延伸物核苷酸序列7atttttagtagagacggggtttcaTTTTTctcttggaaagaaagt8cgcccggctaattttttgtTTTTTctcttggaaagaaagt
1權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)受試者中與病理生理?yè)p傷相關(guān)的細(xì)胞損傷的方法，包括檢測(cè)受試者的生物樣品中循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的存在或不存在，其中檢測(cè)使用或沒(méi)用核酸擴(kuò)增，并且其中循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的存在表示受試者中與病理生理?yè)p傷相關(guān)的細(xì)胞損傷。
2.權(quán)利要求1的方法，其中生物標(biāo)記物選自Alu、18S/28S和端粒。
3.權(quán)利要求ι的方法，其中使用選自QuantiGene 方法、實(shí)時(shí)pcr、定量pcr、熒光 PCR,RT-MSP (RT甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、DNA的PicoGreen 檢測(cè)、放射性免疫測(cè)定和DNA的直接放射性標(biāo)記的方法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中生物樣品是血樣、血清樣品或血漿樣品。
5.權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞損傷涉及壞死或程序化細(xì)胞死亡。
6.權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞損傷涉及癌癥、輻射、自身免疫病、傳染、心肌梗塞或骨髓移植。
7.權(quán)利要求1的方法，其中生物標(biāo)記物是Alu，其中使用根據(jù)SEQIDN0. 1或SEQ ID NO. 2中所示的Alu片段設(shè)計(jì)的探針組來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。
8.權(quán)利要求ι的方法，其中生物標(biāo)記物是Alu，其中使用用于QuantiGene 檢測(cè)的探針組來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，并且其中探針組包括至少兩個(gè)選自SEQ ID N0.7、8、9、10、ll、12、13、 14、15、16、17、18 和 19 的捕獲延伸物和至少一個(gè)選自 SEQ ID NO. 32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、43和44的標(biāo)記延伸物。
9.權(quán)利要求ι的方法，其中生物標(biāo)記物是Alu，其中使用用于QuantiGene 檢測(cè)的探針組來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，并且其中探針組包括捕獲延伸物、標(biāo)記延伸物和阻斷標(biāo)記。
10.一種用于檢測(cè)受試者中與病理生理?yè)p傷相關(guān)的細(xì)胞損傷的方法，包括檢測(cè)受試者的生物樣品中循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的存在或不存在，其中循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的存在表示受試者的與病理生理?yè)p傷相關(guān)的細(xì)胞損傷并且其中病理生理?yè)p傷不是癌癥。
11.權(quán)利要求10的方法，其中病理生理?yè)p傷選自輻射、自身免疫病、傳染、心肌梗塞、懷孕和骨髓移植。
12.權(quán)利要求10的方法，其中病理生理?yè)p傷是壞死或細(xì)胞死亡。
13.權(quán)利要求10的方法，其中生物標(biāo)記物選自Alu、18S/28S和端粒。
14.權(quán)利要求10的方法，其中檢測(cè)使用或沒(méi)用核酸擴(kuò)增。
15.權(quán)利要求10的方法，其中使用選自QuantiGene 方法、實(shí)時(shí)pcr、定量pcr、熒光 PCR、RT-MSP (RT甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、PicoGreen 檢測(cè)、放射性免疫測(cè)定和DNA 的直接放射性標(biāo)記的方法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。
16.權(quán)利要求10的方法，其中生物樣品是血樣、血清樣品或血漿樣品。
17.權(quán)利要求10的方法，其中生物標(biāo)記物是Alu，其中使用QuantiGene 進(jìn)行了檢測(cè)，并且用于QuantiGene 檢測(cè)的探針組是根據(jù)seq id no. ι和seq id no. 2中所示的 Alu片段設(shè)計(jì)的。
18.權(quán)利要求10的方法，其中生物標(biāo)記物是A1U，其中使用QuantiGene 進(jìn)行了檢測(cè)，并且用于QuantiGene 檢測(cè)的探針組包括捕獲延伸物和標(biāo)記延伸物，并且其中捕獲延伸物選自seq id no. 7、8、9、10和11，并且標(biāo)記延伸物選自seq id no. 32、33、34和35。
19.權(quán)利要求10的方法，其中生物標(biāo)記物是alu，其中使用QuantiGene 進(jìn)行了檢測(cè)，并且用于QuantiGene 檢測(cè)的探針組包括捕獲延伸物和標(biāo)記延伸物，并且其中捕獲延伸物選自seq id no. 12、13、14、15、16、17、18和19，并且標(biāo)記延伸物選自seq id no. 36、 37、38、39、40、41、42、43 和 44。
20.權(quán)利要求10的方法，其中生物標(biāo)記物是Alu，其中使用QuantiGene 進(jìn)行了檢測(cè)，并且用于QuantiGene 檢測(cè)的探針組包括捕獲延伸物和標(biāo)記延伸物，并且其中捕獲延伸物選自seq id no. 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和19，并且標(biāo)記延伸物選自 seq id n0. 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43 和 44。
21.權(quán)利要求10的方法，其中生物標(biāo)記物是Alu，其中使用QuantiGene 進(jìn)行了檢測(cè)，并且用于QuantiGene 檢測(cè)的探針組包括捕獲延伸物、標(biāo)記延伸物和阻斷標(biāo)記。
22.權(quán)利要求 ο的方法，其中生物標(biāo)記物是18s核糖體rna，其中使用QuantiGene 進(jìn)行了檢測(cè)，并且用于QuantiGene 檢測(cè)的探針組是根據(jù)如seq id而.3中所示的185 核糖體rna的探針設(shè)計(jì)片段設(shè)計(jì)的。
23.權(quán)利要求10的方法，其中生物標(biāo)記物是18s核糖體rna，其中使用QuantiGene 進(jìn)行了檢測(cè)，并且用于QuantiGene 檢測(cè)的探針組包括捕獲延伸物和標(biāo)記延伸物，并且其中捕獲延伸物選自seq id n0. 20、21、22、23、對(duì)和25，并且標(biāo)記延伸物選自seq id no. 45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55 和 56。
24.權(quán)利要求10的方法，其中生物標(biāo)記物是^s核糖體rna，其中使用QuantiGene 進(jìn)行了檢測(cè)，并且用于QuantiGene 檢測(cè)的探針組是根據(jù)如seq id no. 4中所示w^s 核糖體rna的探針設(shè)計(jì)片段設(shè)計(jì)的。
25.權(quán)利要求10的方法，其中生物標(biāo)記物是^s核糖體rna，其中使用QuantiGene 進(jìn)行了檢測(cè)，并且用于QuantiGene 檢測(cè)的探針組包括捕獲延伸物和標(biāo)記延伸物，并且其中捕獲延伸物選自seq id n0. 26、27、28、四、30和31，標(biāo)記延伸物選自seq id n0. 57、58、 59、60、61、62、63、64、65、66、67 和 68。
26.一種用于檢測(cè)受試者中與病理生理?yè)p傷相關(guān)的細(xì)胞損傷的方法，包括檢測(cè)受試者的生物樣品中循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的特征，其中特征表示受試者中與特定病理生理?yè)p傷相關(guān)的細(xì)胞損傷，特定病理生理?yè)p傷選自由癌癥、輻射、自身免疫病、傳染和心肌梗塞組成的一組可能的病理生理?yè)p傷。
27.權(quán)利要求沈的方法，其中特征包括選自濃度、時(shí)間線、增加速率、分解至基線的速率、峰水平、不同遺傳標(biāo)記物的差異表達(dá)和不同遺傳標(biāo)記物的差異表達(dá)的時(shí)間依賴性變化的至少一個(gè)特征。
28.權(quán)利要求沈的方法，其中生物標(biāo)記物選自Alu、18S/28S和端粒。
29.權(quán)利要求沈的方法，其中特征的測(cè)定沒(méi)有使用核酸擴(kuò)增。
30.權(quán)利要求沈的方法，其中使用QuantiGene 方法進(jìn)行了測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定方法可以是，但不限于實(shí)時(shí)PCR、定量PCR、熒光PCR、RT-MSP(RT甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、dna的PicoGreen (Molecular Probes, Eugene, OR)檢測(cè)、放射性免疫測(cè)定和dna的直接放射性標(biāo)記等。
31.權(quán)利要求沈的方法，其中生物樣品是血樣、血清樣品或血漿樣品。
32.權(quán)利要求沈的方法，其中生物標(biāo)記物是alu，其中使用QuantiGene 進(jìn)行了檢測(cè)，并且用于QuantiGene 檢測(cè)的探針組是根據(jù)seq id no. ι和seq id no. 2中所示的 alu探針設(shè)計(jì)片段設(shè)計(jì)的。
33.權(quán)利要求沈的方法，其中生物標(biāo)記物是alu，其中使用QuantiGene 進(jìn)行了檢測(cè)，并且用于QuantiGene 檢測(cè)的探針組包括捕獲延伸物和標(biāo)記延伸物，并且其中捕獲延伸物選自seq id no. 7、8、9、10和11，并且標(biāo)記延伸物選自seq id no. 32、33、34和35。
34.權(quán)利要求沈的方法，其中生物標(biāo)記物是alu，其中使用QuantiGene 進(jìn)行了檢測(cè)，并且用于QuantiGene 檢測(cè)的探針組包括捕獲延伸物和標(biāo)記延伸物，并且其中捕獲延伸物選自seq id no. 12、13、14、15、16、17、18和19，并且標(biāo)記延伸物選自seq id no. 36、 37、38、39、40、41、42、43 和 44。
35.權(quán)利要求沈的方法，其中生物標(biāo)記物是alu，其中使用QuantiGene 進(jìn)行了檢測(cè)，并且用于QuantiGene 檢測(cè)的探針組包括捕獲延伸物和標(biāo)記延伸物，并且其中捕獲延伸物選自seq id no. 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和19，并且標(biāo)記延伸物選自 seq id no. 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43 和 44。
36.權(quán)利要求沈的方法，其中生物標(biāo)記物是alu，其中使用QuantiGene 進(jìn)行了檢測(cè)，并且用于QuantiGene 檢測(cè)的探針組包括捕獲延伸物、標(biāo)記延伸物和阻斷標(biāo)記。
37.權(quán)利要求沈的方法，其中生物標(biāo)記物是18s核糖體rna，其中使用QuantiGene 進(jìn)行了檢測(cè)，并且用于QuantiGene 檢測(cè)的探針組是根據(jù)如seq id而.3中所示的185 核糖體rna的探針設(shè)計(jì)片段設(shè)計(jì)的。
38.權(quán)利要求沈的方法，其中生物標(biāo)記物是18s核糖體rna，其中使用QuantiGene 進(jìn)行了檢測(cè)，并且用于QuantiGene 檢測(cè)的探針組包括捕獲延伸物和標(biāo)記延伸物，并且其中捕獲延伸物選自seq id no. 20、21、22、23、24和25，標(biāo)記延伸物選自seq id no. 45、46、 47、48、49、50、51、52、53、54、55 和 56。
39.權(quán)利要求洸的方法，其中生物標(biāo)記物是^s核糖體rna，其中使用QuantiGene 進(jìn)行了檢測(cè)，并且用于QuantiGene 檢測(cè)的探針組是根據(jù)如seq id no. 4中所示w^s 核糖體rna的探針設(shè)計(jì)片段設(shè)計(jì)的。
40.權(quán)利要求沈的方法，其中生物標(biāo)記物是^s核糖體rna，其中使用QuantiGene 進(jìn)行了檢測(cè)，并且用于QuantiGene 檢測(cè)的探針組包括捕獲延伸物和標(biāo)記延伸物，并且其中捕獲延伸物選自seq id no. 26、27、28、四、30和31，標(biāo)記延伸物選自seq id no. 57、58、 59、60、61、62、63、64、65、66、67 和 68。
41.一種試劑盒，包括用于使用QuantiGene 方法檢測(cè)Alu生物標(biāo)記物的探針組， 其中探針組包括選自seq id no. 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和19的捕獲延伸物，并且標(biāo)記延伸物選自 seq id no. 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43 和 44。
42.權(quán)利要求41的試劑盒，其中探針組包括選自seqid n0.7、8、9、10和11的捕獲延伸物，和選自seq id no. 32,33,34 ^p 35的標(biāo)記延伸物。
43.權(quán)利要求41的試劑盒，其中探針組包括選自seqid no. 12、13、14、15、16、17、18和19的捕獲延伸物，和選自SEQ ID NO. 36、37、38、39、40、41、42、43和44的標(biāo)記延伸物。
44.權(quán)利要求41的試劑盒，進(jìn)一步包括具有SEQID NO. 69、70和71序列的阻斷標(biāo)記。
45.一種試劑盒，包括用于使用QuantiGene 方法檢測(cè)18S核糖體RNA生物標(biāo)記物的探針組，其中探針組包括選自SEQ ID而.20、21、22、23、對(duì)和25的捕獲延伸物，和選自 SEQ ID NO. 45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55 和 56 的標(biāo)記延伸物。
46.權(quán)利要求45的試劑盒，進(jìn)一步包括具有SEQID NO. 72和73序列的阻斷標(biāo)記。
47.一種試劑盒，包括用于使用QuantiGene 方法檢測(cè)28S核糖體RNA生物標(biāo)記物的探針組，其中探針組包括選自SEQ ID NO. 26、27、28、四、30和31的捕獲延伸物，和選自 SEQ ID NO. 57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67 和 68 的標(biāo)記延伸物。
48.權(quán)利要求47的試劑盒，進(jìn)一步包括具有SEQID NO. 74、75、76和77序列的阻斷標(biāo)記。
49.權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞損傷是改變生活的狀況。
50.權(quán)利要求49的方法，其中改變生活的狀況是懷孕。
51.一種用于檢測(cè)受試者中與病理生理?yè)p傷相關(guān)的細(xì)胞損傷的方法，包括 檢測(cè)受試者的生物樣品中的循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的水平，其中檢測(cè)使用或沒(méi)用核酸擴(kuò)增，和其中循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的水平表示與受試者中病理生理?yè)p傷相關(guān)的疾病的進(jìn)展。
52.一種監(jiān)控受試者輻射暴露的方法，包括檢測(cè)受試者的生物樣品中的循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的水平， 其中檢測(cè)使用或沒(méi)用核酸擴(kuò)增，和其中循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的水平表示經(jīng)受放療的受試者中的治療功效。
53.權(quán)利要求52的方法，其中經(jīng)受放療的受試者是癌癥患者或骨髓移植患者。
54.權(quán)利要求52的方法，其中循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的水平表示輻射暴露的量。
55.權(quán)利要求M的方法，其中循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的水平用于指導(dǎo)放射暴露后的鑒別分類和治療。
56.一種監(jiān)控受試者中急性心肌梗塞的治療結(jié)果的方法，包括 檢測(cè)受試者的生物樣品中的循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的水平， 其中檢測(cè)使用或沒(méi)用核酸擴(kuò)增，和其中循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的水平表示冠脈干預(yù)的功效。
57.權(quán)利要求M的方法，其中冠脈干預(yù)選自經(jīng)皮心臟介入(PCI)、血管重建術(shù)、經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)(PTCA)、氣囊血管成形術(shù)和冠狀動(dòng)脈旁路術(shù)。
58.一種監(jiān)控受試者中腫瘤進(jìn)展的方法，包括檢測(cè)受試者的生物樣品中的循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的水平， 其中檢測(cè)使用或沒(méi)用核酸擴(kuò)增，和其中循環(huán)中游離遺傳生物標(biāo)記物的水平表示腫瘤生長(zhǎng)的進(jìn)展。
全文摘要
本發(fā)明總地涉及檢測(cè)為病理生理或創(chuàng)傷損傷結(jié)果的細(xì)胞損傷的方法，所述損傷如由核事故、生物恐怖襲擊、腫瘤發(fā)生、感染或心血管疾病引起。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102421915SQ201080017861
公開日2012年4月18日 申請(qǐng)日期2010年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月25日
發(fā)明者P·奧庫(kù)涅夫, 張魯榕, 張鷺鷺 申請(qǐng)人:蒂雅卡特有限責(zé)任公司