一種檢測腸炎致病菌的方法

專利名稱：一種檢測腸炎致病菌的方法
技術領域：
本 發(fā)明屬于細菌分子生物學領域，具體而言涉及細菌，尤其腸炎致病菌的檢測方法。
背景技術：
在腸道疾病中，尤其是炎癥性腸病及腸炎，很多疾病的病因未明。研究表明，這些病因未明的腸道疾病大多與病原體的感染有一定關系，但是至今尚未找到特異病原體與某種腸道疾病有恒定關系。有研究者認為副結核分枝桿菌及麻疹病毒與炎癥性腸病中的克羅恩病有關，但證據(jù)缺乏說服力。近年來，關于微生物致病性的另一種觀點正日益受到重視， 這一觀點認為炎癥性腸病是針對自身正常腸道菌群叢的異常免疫反應引起的。在炎癥性腸病的動物模型中，用轉基因或敲除基因方法造成免疫缺陷的炎癥性腸病動物模型，在腸道無菌環(huán)境下不會發(fā)生腸道炎癥，但如果重新恢復腸道正常菌叢狀態(tài)，則出現(xiàn)腸道炎癥。另在臨床觀察中，細菌滯留易促發(fā)克羅恩病的發(fā)生，而糞便轉流能防止克羅恩病復發(fā)；抗生素或微生態(tài)制劑對某些炎癥性腸病患者有益。在臨床檢驗中，對于已明確致病菌的腸道疾病，一般可通過糞便常規(guī)檢查、酶聯(lián)免疫吸附試驗、核酸電泳圖譜分析(PAGE)、電鏡或免疫學方法及必要時聯(lián)合血液檢測確定感染的病原體。在目前的分子診斷中，也有研究者利用16S rDNA對臨床重要常見微生物進行物種分類。但是目前對16SrDNA研究方法，一般是基于Sanger法測序，芯片雜交等傳統(tǒng)技術。臨床上不明病因的腸道疾病多數(shù)與病原體感染有關，現(xiàn)在的病原體培養(yǎng)方法并不能將所有腸道內(nèi)的病原體全部檢測出，同時很多苛養(yǎng)細菌在體外不能培養(yǎng)。對于未知病因的腸道疾病，大多按照經(jīng)驗治療，用藥具有盲目性、試探性。很多藥物對機體的副作用無法避免。炎癥性腸病的藥物治療主要是氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑的聯(lián)合應用。癥狀完全好轉后依然需用藥一段時間，長期使用這幾種藥物會產(chǎn)生大量不良反應，例如惡心、嘔吐、可逆性男性不育、糖皮質(zhì)激素全身不良反應等。16S rDNA是細菌的系統(tǒng)分類研究中最有用和最常用的分子鐘，其種類少，含量大 (約占細菌RNA含量的80 ，分子大小適中，存在于所有的生物中，其進化具有良好的時鐘性質(zhì)，在結構與功能上具有高度的保守性，素有“細菌化石”之稱。由于具有約1.5Kb左右的大小，16S rDNA既能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，又能利用測序技術較容易地進行序列， 故容易被細菌學家和分類學家接受。利用全長16S rDNA可以對目前常見的致病菌進行分類，以達到物種水平上的區(qū)分。之前在對16S rDNA進行研究時，通常使用的是Sanger測序結合克隆的方法，或者芯片雜交方法。很多研究者已經(jīng)用16S rDNA來對環(huán)境中的微生物， 皮膚中的微生物進行分類研究。在目前也有利用16S rDNA或其上的某一片段(如V6區(qū)、 V3區(qū)等)來對臨床上重要的常見微生物進行分類研究。利用第一代測序技術Sanger法對 16S rDNA研究需要結合克隆測序，這存在耗時、耗力、成本高的缺點?；蛐酒夹g通常被應用于基因表達水平的研究中，應用于16S rDNA的研究中同樣存在成本高、無法實現(xiàn)高通量的缺點。 以Illumina Hiseq2000為代表的二代測序技術測序通量大，成本低。在目前一個實驗流程下來可以產(chǎn)生200G的堿基數(shù)據(jù)，平均每天產(chǎn)生20G的數(shù)據(jù)。高數(shù)據(jù)通量可以在測序序列數(shù)已定的情況下，使得每條序列獲得高的測序深度(即測序數(shù)據(jù)總量除以目的測序基因序列長度得到的倍數(shù))，確保測序結果的可靠性。二代測序技術已經(jīng)應用到微生物種屬分析領域，但一般是基于16SrDNA全長10個可變區(qū)中的一個或幾個(V6區(qū)、V3區(qū)等)，這樣在前期的PCR擴增時使用針對特定變異區(qū)的擴增引物，這樣通常會造成某些種屬的丟失。這種丟失一方面來自于特異變異區(qū)引物的偏好型，一方面來自于基于單一變異區(qū)進行種屬分析的局限性。利用16S rDNA全長結合以 IlluminaHiseq2000為代表的二代測序技術進行細菌種屬分析，最大的阻礙在于測長較短， 利用Pair-End測序策略也只能達到200bp的測長，由于16S rDNA在不同種屬之間保守區(qū)的相似度很大這就造成了對于混合擴增的16S rDNA產(chǎn)物在拼接上仍然是個挑戰(zhàn)。目前還沒有利用以Illumina Hiseq2000為代表的二代測序技術進行16S rDNA全長測序應用于臨床種屬分類研究方面的報道。1. Altschul, S. F.，W. Gish, W. Miller, Ε. W. Myers, and D. J. Lipman. 1990. Basic Local Alignment Search Tool. J. Mol. Biol. 215 :729-731.2. Banks, J. ， S. Poole, S. P. Nair, J. Lewthwaite, P. Tabona, R. McNab, M. Wilson, A. Paul, and B.Henderson.2002.Streptococcus sanguis secretesCD14_binding proteins that stimulate cytokine synthesis :a clue to thepathogenesis of infective(bacterial)endocarditis. Microb. Pathog. 32 :105_116.3. Bosshard, P. P.，S. Abels, R. Zbinden, E. C. Bottger, and M. Altwegg. 2003. Ribosomal DNA sequencing for identification of aerobicgram-positive rods in the clinical laboratory (an 18-month evaluation). J. Clin. Microbiol. 41 :4134-4140.4. Bottger, E. C. 1989.Rapid determination of bacterialribosomal RNA sequences by direct sequencing of enzymatically amplifiedDNA. FEMS Microbiol. Lett. 65 :171-176.5. Edwards, U. , T. Rogall, H. Blocker, M. Emde, and E. C. Bottger. 1989. Isolation and direct complete nucleotide determination of entiregenes. Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA. NucleicAcids Res. 17 :7843_7853.6.Felsenstein, J.1981. Evolutionary trees from DNA sequences :amaximum likelihood approach. Mol. Evo1. 17 :368_376.

發(fā)明內(nèi)容
傳統(tǒng)和常規(guī)的對細菌的確定是通過細菌分離培養(yǎng)、顯微鏡檢查(光學和電子顯微鏡)、抗原成分檢測(ELISA、免疫熒光等)、分子生物學基因診斷(核酸雜交、熒光定量PCR 等)四個步驟進行的。對于及時發(fā)現(xiàn)、有效鑒別、快速診斷和提出預警等方面而言，目前急需一種新的檢測細菌，尤其是腸炎致病菌的方法，該方法必須具備以下優(yōu)點1.無需分離培養(yǎng)繁復步驟，是一種檢測快速、靈敏度高、檢測特異性高、高通量的檢測手段；2.不需要對樣本分離培養(yǎng)，可以直接進行檢測；避免人工操作的主觀性帶來的誤差；3.同時不需熒光染料，排除了不同細菌之間交叉。本發(fā)明提供了滿足以上要求的細菌檢測技術。 本發(fā)明提供了一種檢測細菌的方法，包括1)提取一個或多個細菌樣本的DNA ；2)利用細菌16S rDNA的引物擴增樣本16S rDNA全長，其中所述引物優(yōu)選是16SF :AGAGTTTGATCMTGGCTCAG,16SR TACGGYTACCTTGTTACGACTT ；3)將擴增后的PCR產(chǎn)物進行打斷，打斷方法可以是物理打斷也可以選擇化學打斷，例如可以用帶AFA纖維扣蓋的Covaris微管在CovarisS2DNA打斷儀(Covaris公司) 上打斷；4)對來自每個細菌樣本的打斷后產(chǎn)物進行末端修復并在其3’端連接脫氧腺苷， 然后連接不同的PCR-free接頭；5)將以上的連接產(chǎn)物利用二代測序技術進行測序獲得其序列，所述二代測序技術例如是 Illumina GA、Illumina Hiseq 2000、ABI 公司的 SOLID 測序儀、Roche 的 GS FLX Titanium System(Roche454)，優(yōu)選 Illumina Hiseq 2000，其中測序方式可以采用 Single End或Pair-End，但不僅限于這兩種測序方式；并且6)通過與已有的所有細菌的16S rDNA參考序列比對，確定每個樣本中存在的細菌種類。在一個實施方案中，在上述方法的步驟4)之后和步驟5)之前還包括純化步驟對 4)中連接的產(chǎn)物進行純化，此處純化方式優(yōu)選膠回收純化或磁珠純化方式；并且任選對上述回收產(chǎn)物進行QPCR檢測。本發(fā)明的方法中利用了 PCR-FREE+DNA打斷策略+ 二代測序技術的組合，這能夠充分利用二代測序儀高通量、低成本特點。其中，本發(fā)明采用的二代測序技術例如是Illumina GA, Illumina Hiseq 2000、ABI 公司的 SOLID 測序儀、Roche 的 Roche GS FLX Titanium System(Roche454)，優(yōu)選 Illumina Hiseq 2000，其中測序方式可以是 Single-End 或 Pair-End，但不僅限于這兩種測序方式。本發(fā)明提供了一種通過16SrDNA全長進行細菌分類的方法，通過所述方法減少了自身測序讀長較短造成的限制，使二代DNA測序技術可以應用于細菌16S rDNA的測序。由于16S序列和細菌的新陳代謝密切相關，是十分重要基因，所以這段序列在細菌種內(nèi)是非常保守的。在測序結果中，本發(fā)明選取能唯一比對上的序列，作為判斷細菌是否存在的標準，與組裝后再比對相比，這種方法簡單，需要的測序深度較低，而且去除了那些保守區(qū)域的干擾。從而實現(xiàn)了在本發(fā)明的方法的后期的數(shù)據(jù)分析中，跳過了對序列組裝這一步，直接利用測序得到的序列與所有已知的16S rDNA參考序列進行比對得到結果。相對于傳統(tǒng)基于16S rDNA測序對細菌進行研究的方法，本發(fā)明的方法優(yōu)選以 Illumina的二代Hiseq2000測序平臺作為技術依托，采用全長16SrDNA全長分析細菌，尤其是腸炎致病菌。本發(fā)明的方法將樣本中的DNA提取經(jīng)16S rDNA全長通用引物擴增并測序， 可以測出所有細菌16S rDNA全長，在經(jīng)過與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中細菌的16S rDNA序列比對后，便可以得到病原體的類型，繼而為病原體分析和病因研究提供了準確的數(shù)據(jù)。本發(fā)明的方法可以用于分析不同樣品，包括食品、飲料、水、化妝品等非臨床樣品，以及血液、大便等臨床樣品，準確確定其中含有的細菌類別等信息。在臨床治療上，確定所感染的病原體，有針對性的用藥，減少了盲目、經(jīng)驗性用藥所帶來的對機體的損害。另外，本發(fā)明的方法不僅可以提供樣本中具體感染的致病菌類型，在一定程度上還可以得到樣本中不同病原菌的豐度信息(即不同病原體在檢測物中含量的多少)，為臨床病理解釋提供很好的參考依據(jù)，避免臨床盲目對抗生素的應用，造成抗生素耐藥的產(chǎn)生。本發(fā)明還提供了一種用于細菌檢測的試劑盒，包括1)提取細菌樣本DNA的試劑；2)擴增細菌16S rDNA的引物和試劑，所述引物序列為

16SF :AGAGTTTGATCMTGGCTCAG,16SR TACGGYTACCTTGTTACGACTT ；3)對PCR產(chǎn)物進行打斷的試劑；4)PCR-free接頭和接頭連接的試劑，以及進行末端修復的試劑和3’端加脫氧腺苷的試劑；以及5)進行二代測序技術測序的試劑，所述二代測序技術例如是IlluminaGA、 Illumina Hiseq 2000、ABI 公司的 SOLID 測序儀、Roche 的 Roche GSFLX Titanium System(Roche454)，優(yōu)選 Illumina Hiseq 2000，其中測序方式可以是 Single-End 或 Pair-End，但不僅限于這兩種測序方式。在一個實施方案中，上述的試劑盒中還包括對產(chǎn)物進行純化的試劑和/或對產(chǎn)物進行QPCR檢測的試劑，此處純化方式優(yōu)選膠回收純化，但是也可選磁珠純化方式。本發(fā)明還提供了上述方法或試劑盒用于檢測細菌或腸炎致病菌的用途。所述細菌或腸炎致病菌優(yōu)選存在于食品、飲料、水、化妝品等非臨床樣品，以及血液、大便等臨床樣品中。


圖IA顯示兩個樣品混合DNA(6-11007105 ；7-1100795)打斷后電泳情況(割膠前)，其中泳道m(xù)arker是分子量標記物(NEB_50bp DNALadder)，samples是割膠前樣品混合 DNA的電泳情況。圖IB顯示兩個樣品混合DNA(6-11007105 ；7-1100795)打斷后電泳情況 (割膠后)，割膠區(qū)域為350-500bp區(qū)域。其中泳道m(xù)arker是分子量標記物(NEB_50bpDNA Ladder)，samples是割膠后樣品混合DNA的電泳情況。圖2顯示該圖表示在結果分析中，不同9條測序序列能夠唯一比對到參考序列梭桿菌(Fusobacterium sp.)的情況。該圖僅為了說明結果，為該發(fā)明的結果進行解釋，本領域研究人員應理解這張結果分析圖不能局限該分析方法，僅是為了簡要說明該發(fā)明。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種檢測細菌的方法，包括1)提取一個或多個細菌樣本的DNA ；2)利用細菌16S rDNA的引物擴增樣本16S rDNA全長，其中所述引物優(yōu)選是16SF :AGAGTTTGATCMTGGCTCAG,16SRTACGGYTACCTTGTTACGACTT ；3)將擴增后的PCR產(chǎn)物進行打斷，打斷方法包括化學打斷方法和物理打斷方法，化學打斷包括酶切，物理打斷包括超聲波或機械打斷。4)對來自每個細菌樣本的打斷后產(chǎn)物進行末端修復并在其3’端連接脫氧腺苷， 然后連接不同的PCR-free接頭；5)將以上的連接產(chǎn)物利用二代測序技術進行測序獲得其序列，所述二代測序技術例如是 Illumina GA、Illumina Hiseq 2000、ABI 公司的 SOLID 測序儀、Roche 的 Roche GS FLX Titanium System(Roche454)，優(yōu)選 Illumina Hiseq 2000，其中測序方式可以是 Single-End或Pair-End，但不僅限于這兩種測序方式；并且6)通過與已有的所有細菌的16S rDNA參考序列比對，確定每個樣本中存在的細菌種類。在上述方法的步驟1)中，所述樣品可以來自于環(huán)境，食品，人體或動物體等，包括食品、飲料、水、化妝品等非臨床樣品以及血液、大便等臨床樣品。提取樣本DNA的方法是本領域技術人員已知的，并且容易獲得的?？梢允褂迷S多市售的試劑盒，例如TakaRa MiniBEST Bacterial GenomicDNA Extraction kit。任選地，還可以通過電泳確定所提取樣本DNA的量的多少。在上述方法的步驟2)中，本領域技術人員可以按照常規(guī)的PCR擴增方法進行PCR 擴增。對于具體的DNA擴增，本領域技術人員可以根據(jù)擴增目的核酸、引物以及其他條件選擇PCR擴增條件。在上述方法的步驟3)中，所得PCR產(chǎn)物經(jīng)過經(jīng)打斷。所述打斷方法包括但不限于化學打斷方法(例如酶切)和物理打斷方法，所述物理打斷方法包括超聲波打斷方法或機械打斷方法等。在上述方法的步驟4)中，將回收的DNA片段按照二代測序儀測序文庫構建的流程構建測序文庫，然后進行測序，優(yōu)選為采用PCR-FREE測序文庫構建的流程構建測序文庫， 測序方法優(yōu)選采用Single-End方法測序，也可選擇Pair-End測序方式，測序方式的選擇可以依據(jù)對結果的要求進行最優(yōu)選擇。PCR-Free測序文庫構建的流程按照本領域技術人員已知方法構建。PCR-FREE是指將文庫接頭直接連接至測序文庫中的DNA片段兩端，在文庫接頭的導入過程沒有PCR的參與。“PCR-Free文庫接頭(adapter) ”是指經(jīng)設計的一段堿基，其主要作用是輔助固定DNA分子在測序芯片上以及提供通用測序引物的結合位點，PCR-Free 文庫接頭可以通過DNA連接酶將其直接連接至測序文庫中的DNA片段兩端，文庫接頭的導入過程因為沒有PCR的參與，因此稱作PCR-Free文庫接頭。“接頭(adapter) ”或“文庫接頭 (library adapter) ”標簽技術是指通過對多個測序文庫添加不同文庫接頭(不同文庫接頭的組成序列不同，序列不同的部分稱為接頭標簽(adapter index))，構建標簽測序文庫，從而可實現(xiàn)多個不同標簽測序文庫混合測序，且最終各個標簽測序文庫的測序結果可相互區(qū)分的一種文庫標簽技術?？梢愿鶕?jù)常規(guī)的引物設計原則，選擇PCR-Free文庫接頭，例如本發(fā)明實施例中使用的兩條接頭序列為1:GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCCGTCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG ；2 GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTCGCCGTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG。本發(fā)明選擇的這兩條接頭，僅是說明利用這兩條接頭可以實現(xiàn)本發(fā)明，但不是局限本發(fā)明。該領域研究人員應該理解只要遵循測序接頭的設計原則的接頭序列都可以在本發(fā)明中使用。
PCR-FREE的文庫構建方法的應用，可以使得整個文庫構建過程中無PCR的參與， 避免了在高序列相似度的PCR產(chǎn)物混合(pooling)文庫的構建過程中由PCR引入錯誤而導致最后結果的準確性。在連接PCR-free接頭之前進行末端修復，然后在3’端加“A”，主要是為了實現(xiàn)DNA片段與PCR-free接頭末端的“Τ”利用“T_A”互補方式聚合到一起，將兩者進行連接。在上述方法的步驟5)中，對回收的DNA混合物利用二代測序技術進行測序， 本領域技術人員可以依照儀器的說明書進行。二代測序技術例如是Illumina GA、 Illumina Hiseq 2000、ABI 公司的 SOLID 測序儀、Roche 的 Roche GS FLX Titanium System(Roche454)，優(yōu)選 Illumina Hiseq 2000，其中測序方式可以是 Single-End 或 Pair-End，但不僅限于這兩種測序方式。在上述方法的步驟6)中，通過與現(xiàn)有細菌的16S rDNA序列進行比對，得出檢測結果。序列的比對的方法是本領域技術人員已知的，也可以使用軟件完成，例如Blast，短序列寡核苷酸分析軟件包(SOAP，ShortOligonucleotide Analysis Package)。 在一個實施方案中，在進行序列分析時可遵循例如以下兩條原則(1)unique read>= 10，unique read 在我們測序的得到序列和參考序列的比對中，由于有部分16S序列保守性比較好，序列會比對上多個細菌的16S參考序列，不能用來有效的鑒定細菌的型別，所以我們?nèi)〉膭t是只能比對一次的序列，就是唯一比對上的序列 unique read。unique read >= 10，即在一條參考序列上至少有10條只能比對到該參考序列的測序序列，我們才會判定樣品中存在該參考序列代表的細菌。(2) Coverage >= 60%, Coverage 根據(jù)比對結果，參考序列中有被測到的位點就叫做被覆蓋位點，覆蓋位點數(shù)占參考序列位點總數(shù)的百分比就是覆蓋率。Coverage > =60%，即在一條參考序列上能夠比對上的reads的總長占到參考序列長度的60%以上， 我們判定樣品中存在該參考序列代表的細菌。對與樣本中細菌豐度的統(tǒng)計原則是(1)統(tǒng)計所有和參考序列比對匹配次數(shù)小于等于5次的測序序列(reads)總數(shù)；(2)對每種細菌來說，支持的序列小于(1)中統(tǒng)計總數(shù)的0. 的就是微量，大于就是大量，在0. 和
之間的就是中量。這些參數(shù)僅僅是示例性的，本領域技術人員應該理解對于不同類型的樣本可以選擇的不同參數(shù)。在一個實施方案中，在上述方法的步驟4)之后和步驟5)之前還包括純化步驟 對4)中連接的產(chǎn)物進行純化，此處純化方式優(yōu)選膠回收純化或磁珠純化方式；并且任選對上述回收產(chǎn)物進行QPCR檢測。例如，可以將打斷的DNA經(jīng)2%瓊脂糖電泳，割膠純化回收 350-600bpDNA條帶(此范圍為打斷片段集中區(qū)域，大多數(shù)的打斷片段長度集中在該范圍)。 本領域技術人員可以理解，純化回收方法包括但不限于電泳割膠回收，也可以是磁珠回收等。優(yōu)選，對回收的產(chǎn)物進行定量PCR(QPCR)檢測，以確定回收的產(chǎn)物的量。本發(fā)明還提供了一種用于細菌檢測的試劑盒，包括1)提取細菌樣本DNA的試劑；2)擴增細菌16S rDNA的通用引物和試劑，所述引物序列為16SF :AGAGTTTGATCMTGGCTCAG,16SR TACGGYTACCTTGTTACGACTT ；3)對PCR產(chǎn)物進行打斷的試劑；
4)PCR-free接頭和接頭連接的試劑，以及末端修復的試劑和3’端加脫氧腺苷的試劑；以及 5)進行二代測序技術測序的試劑，所述二代測序技術例如是IlluminaGA、 Illumina Hiseq 2000、ABI 公司的 SOLID 測序儀、Roche 的 Roche GS FLXTitanium System(Roche454)，優(yōu)選 Illumina Hiseq 2000，其中測序方式可以是 Single-End 或 Pair-End，但不僅限于這兩種測序方式。在一個實施方案中，上述的試劑盒中還包括對產(chǎn)物進行純化的試劑和/或對產(chǎn)物進行QPCR檢測的試劑，此處純化方式優(yōu)選膠回收純化，但是也可選磁珠純化方式。對于上述試劑盒，其中的提取DNA的試劑、擴增細菌16S rDNA的試劑以及對產(chǎn)物進行純化的試劑可以選擇本領域中常用的DNA提取試劑、DNA擴增試劑和DNA純化試劑。 QPCR檢測的試劑也可以使用本領域中常用的熒光定量PCR檢測試劑。對PCR產(chǎn)物進行打斷的試劑可以根據(jù)使用的打斷方法進行選擇。例如化學打斷方法中使用的酶等。這是本領域技術人員可以完成的。PCR-Free文庫接頭的選擇可以根據(jù)常規(guī)的引物設計原則，選擇接頭序列，例如本發(fā)明實施例中使用的兩對接頭序列為1:GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCCGTCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG ；2 :GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTCGCCGTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG。本發(fā)明選擇的這兩條接頭，僅是說明利用這兩條接頭可以實現(xiàn)本發(fā)明，但不是局限本發(fā)明。該領域研究人員應該理解只要遵循測序接頭的設計原則的接頭序列都可以在本發(fā)明中使用。PCR-Free文庫接頭連接至測序文庫中的DNA片段兩端的DNA連接酶可以是本領域中通常使用的DNA連接酶。進行二代測序技術測序的試劑可以由本領域技術人員根據(jù)具體測序技術的要求選擇本領域中通常使用的試劑。實施例以下結合具體實施例對本發(fā)明進行詳細地描述。如下的實施例只是示例性地對本發(fā)明進行說明，不應以任何形式理解為對本發(fā)明的限制。1.樣本DNA提取獲得臨床腸炎病人糞便樣本2份，這兩份樣本利用臨床現(xiàn)有檢測技術未獲得陽性檢測結果。該實施例選擇腸炎病人樣本，只是為了更好的解釋該發(fā)明，而不僅僅是局限該發(fā)明。該發(fā)明提供的技術完全可以應用于環(huán)境，食品，皮膚等更廣泛來源樣品細菌的檢測中。 依照生產(chǎn)商提供的步驟，使用 TakaRaMiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction kit 對所述兩份腸炎病人糞便樣本進行DNA提取，并通過電泳確定所提取樣本DNA的量的多少。 雖然本實施例中使用了具體的樣本DNA提取方法，但本領域技術人員應理解的是，提取樣本DNA并不限于所公開的方法，本領域技術人員可以選擇使用任何本領域中已知的方法。2. PCR擴增和柱純化使用16S rDNA通用引物對上述提取的樣本DNA進行擴增，并對所擴增的兩個樣本 (6-11007105 ；7-1100795)利用 QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN 公司)進行過柱純化，以去除PCR過程中的引物二聚體、非特異的小片段產(chǎn)物、鹽離子等。純化后利用美國 Thermo公司NanoDropND-8000微量紫外分光光度計檢測0D，鑒定純化回收率。純化回收率此處判斷純化回收率的標準是純化后DNA的總量與純化前DNA總量的百分比。3.取5ug純化后產(chǎn)物加入新的1. 5ml離心管，加入QIAquick PCRPurification Kit中的Elution buffer使體積至IOOul，把該IOOul溶液加入帶AFA纖維扣蓋的Covaris 微管在Covaris S 2DNA打斷儀(Covaris公司)上打斷，打斷條件如下
一負載比(D叫強度循環(huán)/脈沖時間(秒)
權利要求
1.一種檢測細菌的方法，包括1)提取一個或多個細菌樣本DNA；2)利用細菌16SrDNA的引物擴增樣本16S rDNA全長，其中所述引物優(yōu)選是 16SF :AGAGTTTGATCMTGGCTCAG,16SR TACGGYTACCTTGTTACGACTT ；3)將擴增后的PCR產(chǎn)物進行打斷，打斷方式包括物理打斷和/或化學打斷(優(yōu)選用帶 AFA纖維扣蓋的Covaris微管在Covaris S2DNA打斷儀(Covaris公司)上打斷)；4)對來自每個細菌樣本的打斷后產(chǎn)物進行末端修復并在其3’端連接脫氧腺苷，然后連接不同的PCR-free接頭；5)將以上的連接產(chǎn)物利用二代測序技術進行測序獲得其序列，所述二代測序技術優(yōu)選Illumina GA或Roche454 ；更優(yōu)選Illumina Hiseq2000，其中測序方式可以采用Single End 或 Pair-End ；并且6)通過與已有的所有細菌的16SrDNA參考序列比對，確定每個樣本中存在的細菌種類。
2.權利要求1的方法，其中在所述步驟4)之后和所述步驟幻之前還包括純化步驟 對4)中連接的產(chǎn)物進行純化，此處純化方式優(yōu)選膠回收純化或磁珠純化方式；并且任選對上述回收產(chǎn)物進行QPCR檢測。
3.權利要求1或2的方法，其中所述細菌是腸炎致病菌。
4.一種用于細菌檢測的試劑盒，包括1)提取細菌樣本DNA的試劑；2)擴增細菌16SrDNA的通用引物和試劑，所述引物序列為 16SF :AGAGTTTGATCMTGGCTCAG,16SR TACGGYTACCTTGTTACGACTT ；3)對PCR產(chǎn)物進行打斷的試劑；4)PCR-free接頭和接頭連接的試劑，以及進行末端修復的試劑和加脫氧腺苷的試劑；以及5)進行二代測序技術測序的試劑，所述二代測序技術優(yōu)選IlluminaGA或Roche4M；更優(yōu)選Illumina Hiseq 2000，其中測序方式可以采用Single End或Pair-End。
5.權利要求4的試劑盒，還包括對產(chǎn)物進行純化的試劑和/或對產(chǎn)物進行QPCR檢測的試劑，此處純化方式優(yōu)選膠回收純化，但是也可選磁珠純化方式。
6.權利要求4或5的試劑盒，其中所述細菌是腸炎致病菌。
7.權利要求1或2的方法或權利要求4或5的試劑盒用于檢測細菌的用途。
8.權利要求7的用途，其中所述細菌是腸炎致病菌。
9.權利要求7中的用途，其中所述細菌或腸炎致病菌存在于血液、大便、水、飲料、食品或化妝品中。
10.權利要求1或2的方法、權利要求4或5的試劑盒或者權利要求7的用途，其中所述細菌選自索氏志賀氏菌(Shigella sonnei)、弗氏志賀菌(Shigellaflexneri), 鮑氏志賀菌(Shigella boydii)、伯克氏菌(Burkholderiales bacterium)、多毛擬桿菌(Bacteroides capillosus)、埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)、獎鏈球菌(Enterococcus faecalis)、癌腸桿菌(Enterobacter cancerogenus)、不動桿菌 (Acinetobacter sp·)、痢疾志賀菌(Shigella dysenteriae)、粘質(zhì)沙雷菌(Serratia marcescens)、綠月農(nóng)桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、普通擬桿菌(Bacteroidesvulgatus)、 多形擬桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、脆性擬桿菌(Bacteroides fragilis)禾口梭桿菌(Fusobacterium sp.)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測細菌的方法，特別是檢測腸炎致病菌的方法。所述方法包括1)提取一個或多個細菌樣本DNA；2)利用細菌16S rDNA的引物擴增樣本16S rDNA全長；3)將擴增后的PCR產(chǎn)物進行打斷；4)對來自每個細菌樣本的打斷后產(chǎn)物進行末端修復并在其3’端連接脫氧腺苷，然后連接不同的PCR-free接頭；5)將以上的連接產(chǎn)物利用二代測序技術進行測序獲得其序列；并且6)通過與已有的所有細菌的16S rDNA參考序列比對，確定每個樣本中存在的細菌種類。
文檔編號C12Q1/68GK102154450SQ201010610849
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權日2010年12月23日
發(fā)明者劉騰飛, 王金明, 管彥芳, 黃健 申請人:深圳華大基因科技有限公司