專利名稱：基于偕胺肟pan納米纖維膜為載體的固定過(guò)氧化氫酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以偕胺肟PAN納米纖維膜為載體的固定化酶的方法，具體涉及利 用靜電紡絲制備PAN納米纖維膜，通過(guò)胺肟化改性制備偕胺肟PAN納米纖維膜，并以其作為 新型的酶固定載體，通過(guò)金屬配位結(jié)合固定過(guò)氧化氫酶的方法。
背景技術(shù)：
酶是一種催化效率高、專一性強(qiáng)(如底物特異性，立體異構(gòu)特異性)的生物催化 劑。但由于酶的蛋白質(zhì)特征，凡是能夠引起蛋白質(zhì)變性的因素都可能會(huì)造成酶的失活，如 PH、重金屬鹽、熱、紫外線、劇烈震蕩等。即使在最適催化條件下，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶 催化反應(yīng)速度也會(huì)逐漸下降。此外，自由酶在催化后難以回收，給產(chǎn)物分離和提純都造成困 難，導(dǎo)致生產(chǎn)成本提高。這些因素都極大地限制了酶在現(xiàn)代工業(yè)中的應(yīng)用。酶的固定化技 術(shù)可有效地束縛酶的構(gòu)象，是穩(wěn)定酶活性的重要方法之一。它在節(jié)能、環(huán)保、降低成本以及 生產(chǎn)連續(xù)化等方面顯示了巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值，為酶的應(yīng)用提供了廣闊的前景。本發(fā)明中 固定的過(guò)氧化氫酶在清除超氧自由基、H2O2和過(guò)氧化物以及阻止或減少羥基自由基形成等 方面發(fā)揮重要作用，并被廣泛應(yīng)用到食品、紡織、造紙、環(huán)保和醫(yī)療等領(lǐng)域。關(guān)于過(guò)氧化氫酶的固定，國(guó)內(nèi)外也有相關(guān)的論文發(fā)表和專利公布。國(guó)際上，如 Cetinus將過(guò)氧化氫酶固定在用戊二醛預(yù)處理的殼聚糖膜上，研究了固定化酶的動(dòng)力學(xué)參 數(shù)、熱穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性。Horst分析了以磁鐵礦(Fe3O4)為載體用戊二醛 交聯(lián)固定過(guò)氧化氫酶，并研究了其分解過(guò)氧化氫的活力。Domink采用了溶膠-凝膠法固定 過(guò)氧化氫酶，并探討了固定化酶的催化活性和重復(fù)使用性。Opwis等則將過(guò)氧化氫酶固定在 紡織纖維材質(zhì)上，采用氰脲酰氯在棉織物上固定過(guò)氧化氫酶，還研究了在尼龍6織物上采 用戊二醛交聯(lián)固定過(guò)氧化氫酶。Costa等利用無(wú)機(jī)材質(zhì)氧化鋁(礬土)經(jīng)戊二醛交聯(lián)固定 過(guò)氧化氫酶，用于處理氧漂廢水，回收并用于染色。國(guó)內(nèi)，如浙江大學(xué)朱祥瑞利用家蠶絲素 固定化過(guò)氧化氫酶并研究其理化特性。江南大學(xué)陳堅(jiān)等以殼聚糖為載體，吸附交聯(lián)固定化 過(guò)氧化氫酶，并將其應(yīng)用于香煙過(guò)濾嘴中，對(duì)香煙的主流煙氣自由基的清除效果明顯(專 利號(hào):200610039838)。靜電紡絲制得的納米纖維空隙率高，比表面積大，可作為理想的酶固定化載體，相 對(duì)于傳統(tǒng)的酶固定載體，如微球、常規(guī)薄膜或普通纖維等，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。靜電紡PAN納 米纖維經(jīng)胺肟化改性制得的偕胺肟PAN納米纖維形態(tài)穩(wěn)定，孔隙率高，其良好的孔洞連通 性可有效提高其負(fù)載催化劑的能力，同時(shí)降低底物的擴(kuò)散阻力，具有很強(qiáng)的離子吸附能力 和生物親和性。經(jīng)查閱，目前尚無(wú)用胺肟化改性的偕胺肟PAN納米纖維膜作為酶固定載體 的專利公布或論文發(fā)表。將偕胺肟PAN納米纖維膜作為酶固定的載體，是本發(fā)明的重點(diǎn)創(chuàng) 新內(nèi)容。分析傳統(tǒng)的酶固定方法，雖具有各自的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)，但同時(shí)也具有一定的缺陷。例 如吸附法操作容易，對(duì)酶活力影響較小，但酶與載體之間的結(jié)合力較低，難以重復(fù)使用；而通過(guò)共價(jià)鍵固定，雖然結(jié)合力較強(qiáng)，但對(duì)酶的構(gòu)象有嚴(yán)重影響，使酶的活性大幅降低。本發(fā) 明中，利用載體上的功能基團(tuán)使之與金屬離子間形成絡(luò)合物，再通過(guò)配位鍵與酶端的功能 基團(tuán)結(jié)合固定酶，較好的克服傳統(tǒng)固定方法的不足，具有結(jié)合力較強(qiáng)，酶活力回收率高的特 點(diǎn)。本發(fā)明中將配位結(jié)合應(yīng)用于過(guò)氧化氫酶固定化，是對(duì)過(guò)氧化氫酶固定化方法的進(jìn)一步 拓展。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以偕胺肟PAN納米纖維膜為載體的固定化酶的方法，經(jīng) 過(guò)對(duì)靜電紡PAN納米纖維進(jìn)行胺肟化改性，制得新型的酶固定載體——偕胺肟PAN納米纖 維膜，以二價(jià)銅離子為中心體，通過(guò)配位結(jié)合在偕胺肟PAN納米纖維上固定化過(guò)氧化氫酶。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的的技術(shù)方案為偕胺肟PAN納米纖維固定過(guò)氧化氫 酶方法，步驟為1、將重均分子量為79100的PAN溶于N，N-二甲基甲酰胺中，制得質(zhì)量百分比為 10-12%的紡絲溶液，用于靜電紡絲；靜電紡絲工藝參數(shù)為噴絲頭與接收板距離15-17cm， 紡絲液流速0. 4-0. 6mL/min,噴絲頭直徑0. 7mm,施加18-20KV的靜電壓，通過(guò)鋁箔接收，接 收時(shí)間為20-25小時(shí)。2、將靜電紡PAN納米纖維在濃度為0. 5mol/L、pH為5. 5-6. 5的鹽酸羥胺溶液中浸 泡120-150分鐘，用蒸餾水清洗3-5次，制得偕胺肟PAN納米纖維膜。3、將制得的偕胺肟PAN納米纖維在20-30°C條件下浸泡于0. 05mol/L的二氯化銅 溶液中，時(shí)間為15-20小時(shí)，用蒸餾水洗去表面團(tuán)聚的銅離子。4、配置PH為7. 0、濃度為50mmol/L的磷酸鹽緩沖液，將過(guò)氧化氫酶溶解于pH為 7. 0的磷酸鹽緩沖液中，過(guò)氧化氫酶溶液濃度為0. 3-0. 5mg/mL。5、將經(jīng)過(guò)銅離子配合后的偕胺肟PAN納米纖維膜在濃度為0. 3-0. 5mg/mL的酶溶 液中振蕩浸泡4小時(shí)，于20°C固定，再用pH為7. 0的磷酸鹽緩沖液沖洗3-5遍，制得偕胺肟 PAN納米纖維膜固定化過(guò)氧化氫酶。由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果1、本發(fā)明采用靜電紡PAN納米纖維經(jīng)胺肟化改性制得的偕胺肟PAN納米纖維膜作 為固定化酶的載體，形態(tài)穩(wěn)定、孔隙率高，負(fù)載能力強(qiáng)，降低底物的擴(kuò)散阻力，并具有良好的 生物親和性。2、本發(fā)明所得的偕胺肟PAN納米纖維固定過(guò)氧化氫酶活力回收率高，最適pH范圍 擴(kuò)大，熱穩(wěn)定性和存儲(chǔ)穩(wěn)定性好。
圖1制備偕胺肟PAN納米纖維膜并固定化過(guò)氧化氫酶工藝流程。圖2偕胺肟PAN納米纖維膜(掃描電子顯微鏡)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例將2克重均分子量為79100的PAN溶于N，N-二甲基甲酰胺中，制得20mL質(zhì)量百分比為10%的紡絲溶液，置于自制的靜電紡絲設(shè)備。靜電紡絲工藝參數(shù)為噴絲頭與接收 板距離17cm，紡絲液流速0. 5mL/min,噴絲頭直徑0. 7mm,施加18KV的靜電壓，通過(guò)鋁箔接 收，接收時(shí)間為22小時(shí)。隨后在真空干燥箱中干燥2小時(shí)，去除剩余溶劑，得到PAN納米纖
維膜。 配置0. 5mol/L的鹽酸羥胺溶液，用碳酸鈉調(diào)節(jié)pH值為6. 0 ；將0. 2克靜電紡PAN 納米纖維在50mLpH值為6. 0、濃度為0. 5mol/L的鹽酸羥胺溶液中浸泡120分鐘，用蒸餾水 清洗4次，制得偕胺肟PAN納米纖維膜。將制得的偕胺肟PAN納米纖維在20°C條件下浸泡于0. 05mol/L的二氯化銅溶液 中，時(shí)間為20小時(shí)，用蒸餾水沖洗5次，去除表面團(tuán)聚的銅離子，制得配合了銅離子的偕胺 肟PAN納米纖維膜。配置pH為7. 0、濃度為50mmol/L的磷酸鹽緩沖液，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH為7. 0，將15mg 的過(guò)氧化氫酶溶解于50mLpH為7. 0的磷酸鹽緩沖液中，制得濃度為0. 3mg/mL的過(guò)氧化氫 酶溶液。將制得的配合有銅離子的偕胺肟PAN納米纖維膜在50mL酶溶液中振蕩浸泡4小 時(shí)，于20°C固定，再用pH為7.0的磷酸鹽緩沖液沖洗3遍，將游離的過(guò)氧化氫酶洗去，制得 基于偕胺肟PAN納米纖維膜為載體的固定化過(guò)氧化氫酶。
權(quán)利要求
1.基于偕胺肟PAN納米纖維膜為載體的固定過(guò)氧化氫酶的方法，其特征是利用靜電紡 絲獲取PAN納米纖維，并對(duì)其進(jìn)行胺肟化改性制得偕胺肟PAN納米纖維膜，再以二價(jià)銅離子 為中心體，通過(guò)配位結(jié)合在偕胺肟PAN納米纖維膜上固定化過(guò)氧化氫酶。
2.如權(quán)利1所述的基于偕胺肟PAN納米纖維膜為載體的固定過(guò)氧化氫酶的方法，其 特征在于過(guò)氧化氫酶的固定化載體是將靜電紡PAN納米纖維在濃度為0. 5mol/L、pH為 5. 5-6. 5的鹽酸羥胺溶液中浸泡120-150分鐘，用蒸餾水清洗3_5次，制得形態(tài)穩(wěn)定、孔隙率 高，負(fù)載能力強(qiáng)并具有良好的生物親和性的偕胺肟PAN納米纖維膜。
3.如權(quán)利1所述的基于偕胺肟PAN納米纖維膜為載體的固定過(guò)氧化氫酶的方法，其特 征在于將制得的偕胺肟PAN納米纖維膜在20-30°C條件下浸泡于0. 05mol/L的二氯化銅 溶液中，時(shí)間為15-20小時(shí)，用蒸餾水洗去表面團(tuán)聚的銅離子。
4.如權(quán)利1所述的基于偕胺肟PAN納米纖維膜為載體的固定過(guò)氧化氫酶的方法，其特 征在于配置PH為7. 0濃度為50mmol/L的磷酸鹽緩沖液，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH為7. 0，將過(guò)氧 化氫酶溶解于pH為7. 0的磷酸鹽緩沖液中，酶溶液濃度為0. 3-0. 5mg/mL。
5.如權(quán)利1所述的基于偕胺肟PAN納米纖維膜為載體的固定過(guò)氧化氫酶的方法，其特 征在于將經(jīng)過(guò)銅離子配合后的偕胺肟納米纖維膜在酶溶液中振蕩浸泡4小時(shí)，于20°C固 定，再用PH為7. 0的磷酸鹽緩沖液沖洗3-5遍，制得偕胺肟PAN納米纖維膜固定化過(guò)氧化 氫酶。
全文摘要
基于偕胺肟PAN納米纖維膜為載體的固定過(guò)氧化氫酶的方法，涉及利用靜電紡絲制備納米纖維膜、PAN功能化改性和酶固定技術(shù)領(lǐng)域。利用靜電紡絲獲取PAN納米纖維膜，對(duì)其進(jìn)行胺肟化改性制得形態(tài)穩(wěn)定，孔隙率高，具有很強(qiáng)負(fù)載能力和生物親和性的偕胺肟PAN納米纖維膜，再以二價(jià)銅離子為中心體，通過(guò)配位結(jié)合在偕胺肟PAN納米纖維膜上固定化過(guò)氧化氫酶。與常規(guī)的過(guò)氧化氫酶固定化方法相比，本發(fā)明解決了固定化過(guò)氧化氫酶酶活力回收率低，存儲(chǔ)穩(wěn)定性不搞，重復(fù)使用性能不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。發(fā)明制備的基于偕胺肟PAN納米纖維膜為載體的固定化過(guò)氧化氫酶可用于制備生物傳感器、膜生物反應(yīng)器、環(huán)保材料等多個(gè)領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N11/08GK102102097SQ20101058181
公開(kāi)日2011年6月22日 申請(qǐng)日期2010年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月10日
發(fā)明者喬輝, 鳳權(quán), 王清清, 魏取福, 黃鋒林 申請(qǐng)人:江南大學(xué)