專利名稱：一種快速建立轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
隨著生物技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因動物的研究及基因的功能研究成為目前的熱點(diǎn)，核移植是獲得轉(zhuǎn)基因動物普遍采用的技術(shù)，基因功能的研究在陽性細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因動物上進(jìn)行更具有說服力，因此獲得轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞系是核移植及基因功能研究的基礎(chǔ)，快速、簡便獲得活性好的陽性細(xì)胞系勢在必行。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞系一般需要二個步驟，首先將目的基因插入細(xì)胞的染色體上，采用的方法主要有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電轉(zhuǎn)染法，然后通過篩選去除陰性細(xì)胞，富集陽性細(xì)胞，所采用的方法主要是抗性基因篩選，目前所用的抗藥基因主要有G418、卡那霉素，稻瘟菌素等。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法或電轉(zhuǎn)染面臨的問題主要是對細(xì)胞損傷大，所獲得轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞較少，部分未插入到染色體上的基因在胞質(zhì)內(nèi)也可長期表達(dá)，造成假陽性。通過G418 篩選獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞時，由于不同得細(xì)胞及目的基因?qū)418的濃度要求不一樣，G418的濃度需要篩選，通過長期篩選獲得的陽性單克隆細(xì)胞，還需經(jīng)較長時間的培養(yǎng)才能獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，同時抗性篩選獲得的陽性細(xì)胞系攜帶有抗性基因， 具有一定的潛在的生物安全問題。慢病毒載體有3質(zhì)?；?質(zhì)粒系統(tǒng)組成，大體可分為包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒及穿梭質(zhì)粒，通過包裝獲得的高滴度慢病毒顆粒不僅能感染分裂的細(xì)胞，對不分裂細(xì)胞也具有較高感染性。根據(jù)RNA病毒感染細(xì)胞的原理，只要有標(biāo)記基因(如綠色熒光蛋白)的表達(dá)，說明目的基因插入染色體，所獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞即為陽性細(xì)胞。流式細(xì)胞分選術(shù)以其分選速度快， 靈敏度高，對細(xì)胞損傷小等優(yōu)點(diǎn)，已在科研領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，根據(jù)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中的綠色熒光蛋白可以高效分選轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞。結(jié)合慢病毒及流式細(xì)胞分選技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)可建立一種快速獲得轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞系的方法。
發(fā)明內(nèi)容
建立的轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞系方法具有快速、高效、省時、省力等優(yōu)點(diǎn)，同時該方法獲得的轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞具有較高的活性且傳代次數(shù)少，尤其對于體外培養(yǎng)傳代次數(shù)較少的細(xì)胞，如乳腺上皮細(xì)胞，采用該方法可較快獲得轉(zhuǎn)基因乳腺上皮細(xì)胞。以實(shí)驗(yàn)中獲得的肌肉生長抑制素基因沉默成纖維細(xì)胞系為例構(gòu)建攜帶有肌肉生長抑制素基因干擾片段的慢病毒穿梭質(zhì)粒載體，包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒及穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞，獲得病毒滴度為IO8的病毒顆粒，將病毒顆粒感染密度約40 %的成纖維細(xì)胞， 48h觀察綠色熒光，待細(xì)胞擴(kuò)大到3-4個25cm2的培養(yǎng)瓶后，進(jìn)行第一次流式細(xì)胞儀分選，分選后陽性率到達(dá)95%左右，分選后細(xì)胞傳2代后再次進(jìn)行流式細(xì)胞儀分選，即可得到純度達(dá)99%的轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞(見圖3)。
具體實(shí)施例方式
1、構(gòu)建慢病毒穿梭質(zhì)粒載體，將目的基因插入慢病毒穿梭質(zhì)粒載體。3、包裝病毒，將包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒及穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集上清液，濃縮病毒顆粒并進(jìn)行滴度檢測。4、感染成纖維細(xì)胞。將50 μ L濃縮病毒液與500 μ L完全培養(yǎng)基混勻，緩慢滴加到細(xì)胞密度約40%成纖維細(xì)胞中，混勻。5、3天后觀察熒光，感染4天后進(jìn)行傳代，待細(xì)胞擴(kuò)大到3-4個25cm2的培養(yǎng)瓶后， 進(jìn)行第一次流式細(xì)胞儀分選。6、分選后的細(xì)胞傳2代后，進(jìn)行第二次分選。分選后的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，所得細(xì)胞即為穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明主要是發(fā)明了一種快速獲得的轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞的技術(shù)，這種方法是采用慢病毒載體并結(jié)合流式細(xì)胞儀分選。
2.權(quán)利1中所指的慢病毒所采用的慢病毒載體須帶有熒光標(biāo)記，可不帶抗藥基因標(biāo)記。
3.根據(jù)權(quán)利1，這種方法的核心是將慢病毒感染與流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)合。
全文摘要
一種快速建立轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞系的方法。本發(fā)明公布了一種快速建立轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞系的方法。該方法將慢病毒與流式細(xì)胞儀的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來，首先將目的基因插入帶EGFP基因的慢病毒穿梭質(zhì)粒中，包裝病毒，濃縮病毒顆粒，將病毒顆粒感染細(xì)胞，經(jīng)2次流式細(xì)胞儀分選，即可得到穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞系，陽性率達(dá)99％。該方法不僅縮短建立陽性細(xì)胞系的時間，而且可避免抗性基因帶來的潛在危害，解決了目前建轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系難的問題。該發(fā)明尤其對建立體外培養(yǎng)代數(shù)較少，活性差或不適合抗性篩選的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系具有重要的實(shí)用價值，可加快轉(zhuǎn)基因動物及基因功能研究。
文檔編號C12N15/86GK102485886SQ20101058090
公開日2012年6月6日 申請日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者唐大運(yùn), 朱化彬, 林秀坤, 陳曉亮 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所