專(zhuān)利名稱(chēng)：一種產(chǎn)d-檸檬烯的酵母工程菌及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高產(chǎn) /-檸檬烯的酵母工程菌及其構(gòu)建方法，尤其是一種分子手 段改造萜類(lèi)生產(chǎn)(MVA)途徑并異源引入 /-檸檬烯合成酶，從而調(diào)控代謝流實(shí)現(xiàn) /-檸檬烯 過(guò)量積累的方法，屬于遺傳工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
檸檬烯(limonene)，又名寧烯。檸檬烯屬鏈狀萜烯醇類(lèi)，有α-和β _兩種異構(gòu) 體，還有左旋(必、右旋(乃兩種光異構(gòu)體。在不同的來(lái)源中，多為異構(gòu)體的混合物。消旋體 存在于香紫蘇油、茉莉油中，或是化學(xué)合成的檸檬烯中；左旋體檸檬烯存在于芳樟油、黃 樟油、香檸檬油、薰衣草油、玫瑰木油等精油中。檸檬烯是重要的香料，用于花香型香精、香水、香皂和芳香工業(yè)等，是香水香精、家 化產(chǎn)品香精及皂用香精配方中使用頻率最高的香料品種。檸檬烯也是重要的化工原料，如 用作維生素E和異植醇的合成前體。目前以松節(jié)油合成d-檸檬烯是最主要的生產(chǎn)方式，但 存在很多問(wèn)題，如合成線路長(zhǎng)、副產(chǎn)物多且無(wú)法控制、有害中間產(chǎn)物殘留等，嚴(yán)重影響了其 使用的安全性。利用發(fā)酵法生產(chǎn)d-檸檬烯和其它單萜類(lèi)化合物及其衍生物是一種可行的 技術(shù)思路。萜類(lèi)化合物的生物合成均來(lái)源于共同的前體——異戊二烯焦磷酸(Isopentenyl pyrophosphate, IPP)。在釀酒酵母中，IPP是由乙酰輔酶A經(jīng)過(guò)甲羥戊酸(MVA)途徑生成 的。IPP可以進(jìn)一步生成香葉基焦磷酸(Geranyl pyrophosphate，GPP)和法尼基焦磷酸 (Farnesyl pyrophosphate,FPP)等異戊二烯二磷酸同系物，在特定的萜類(lèi)合成酶和修飾酶 作用下，最終形成種類(lèi)繁多的萜類(lèi)化合物。代謝工程改造釀酒酵母生產(chǎn)d_檸檬烯國(guó)內(nèi)未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)d_檸檬烯的酵母工程菌。所述工程菌含有外源d_檸檬烯合成酶基因。所述d-檸檬烯合成酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。所述d-檸檬烯合成酶基因克隆于ras304整合表達(dá)質(zhì)粒上。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種產(chǎn)檸檬烯的酵母工程菌基因工程 菌的構(gòu)建方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的具體方案為
1)優(yōu)化GenebankΑΒ110637序列合成檸檬烯合成酶基因；
2)將檸檬烯合成酶基因與載體連接得到重組表達(dá)載體；
3)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母kSaccharomycescerevisiae)后得到酵母工程菌。下面是本發(fā)明技術(shù)方案的具體描述 質(zhì)粒及酵母工程菌的構(gòu)建
根據(jù)NCBI公布的d-檸檬烯合成酶序列，經(jīng)密碼子優(yōu)化后，進(jìn)行全基因合成；將人工合成的檸檬烯合成酶克隆到整合質(zhì)粒raS304(購(gòu)自德而寶生物技術(shù)有限公司，貨 號(hào)YV8002)中上構(gòu)建整合表達(dá)載體；將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母CEN. H(2-1C iMATa·, ura3~^2 ； trpl~2m\ leu2~3, 112; his,3d 1; MAL2~^ \ 5Z/C20，所述菌株購(gòu)買(mǎi)于德 國(guó)EUR0SCARF菌種保藏中心。PCR(引物為 Fl:5，CGGGATCCGCGGCCGCAATGTCTTCTT3，； R15，CGGAATTCAGATCTTTA ACCCTTCGTTCCAG3’ )，驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子(含有1. 8kbp條帶)，對(duì)照未PCR出同樣條帶，證明該 d-檸檬烯合成酶已經(jīng)被整合到染色體上，提取cDNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證，也能PCR出同樣大小條 帶，證明有表達(dá)檸檬烯能力。酵母工程菌CEN. PK2 Limonene的種子培養(yǎng)及發(fā)酵
種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20 g，1.7 g YNB和5 g硫酸銨g，亮氨酸0. 2 g，組氨酸0.2 g，尿嘧啶0.2 g，pH5.6。在制作斜面和平板時(shí)加入20 g瓊脂，115 ° C滅菌20 min。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20 g，1.7 g YNB和5 g硫酸銨g，亮氨酸0. 4 g，組氨酸 0.4 g，尿嘧啶0.4 g，pH5.6。在制作斜面和平板時(shí)加入20 g瓊脂，115 ° C滅菌20 min。培養(yǎng)條件從斜面中接種工程菌于20 mL的種子培養(yǎng)基中，放置于30° C轉(zhuǎn)速為 200 rpm的搖床上，培養(yǎng)20-24 h至對(duì)數(shù)中期，以10%的轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培 養(yǎng) 40-46 h0d~檸檬烯含量測(cè)定氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS) 樣品處理頂空微固相萃取
儀器裝置VARIAN 1200LGC/MS-MS氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀； 儀器分析條件
氣相色譜柱VF17，30 m,0. 32 mmXO. 25 μπι ；
進(jìn)樣口溫度250° C;不分流進(jìn)樣；
載氣Ae (氦氣)，載氣流速1. 3 mL/min ；恒流方式；
色譜分離條件程序升溫40° C維持3min;5° C /min升溫至120° C (第一階段)； 10° C /min 升溫至 250° C (第二階段)；250° C 維持 5 min; 采集方式全掃描，掃描范圍33— 450 Amu ；
電離方式電子轟擊(EI)；燈絲發(fā)射電流50 μ A ；檢測(cè)器電壓1000V; 離子源溫度200° C，接口溫度250°C。本發(fā)明通過(guò)代謝工程改造，將來(lái)源于CYir狀unshiu的檸檬烯合成酶異源表達(dá)于 釀酒酵母i^ccharomycGS cerevisiae)中，增加萜類(lèi)合成途徑——甲羥戊酸(MVA)途徑 碳代謝流，獲得了一株高產(chǎn)d-檸檬烯的酵母工程菌CEN. PK2 Limonene。與出發(fā)菌株CEN. PK2-1C相比，改造后酵母工程菌能夠代謝生產(chǎn)d-檸檬烯，且d-檸檬烯反饋抑制明顯降低，
檸檬烯的產(chǎn)量可達(dá)Hmg/L，具有很好的應(yīng)用前景。本發(fā)明提供的構(gòu)建方法簡(jiǎn)單，適于標(biāo) 準(zhǔn)化。
具體實(shí)施例方式實(shí)例1表達(dá)載體的構(gòu)建
根據(jù)NCBI公布的檸檬烯合成酶序列，經(jīng)密碼子優(yōu)化后，進(jìn)行全基因合成；將人工合 成的檸檬烯合成酶基因到整合質(zhì)粒PRS304中，構(gòu)建整合表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dffia后，挑選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒并經(jīng)及SpeI酶切后，出現(xiàn)1. Skb條帶，證明已經(jīng)構(gòu)建成功 整合表達(dá)載體。實(shí)施例2酵母工程菌的構(gòu)建
將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母CEN. H(2-1C iMATa- ura3~52 ； trplH leu2~ >, 112; his3d 1; MUSc- SUC2)。由于重組質(zhì)粒上帶有ir/77基因，轉(zhuǎn)化釀酒酵母 CEN. H(2-1C感受態(tài)，涂布到含有組氨酸、亮氨酸、尿嘧啶的YNB (葡萄糖20 g/L,YNB 6.7 g /L，固體培養(yǎng)基加20 g/L瓊脂，調(diào)節(jié)pH5.6，115° C滅菌20 min)，挑取轉(zhuǎn)化后平板上正常 生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子，提取基因組PCR驗(yàn)證，出現(xiàn)1. Skb條帶，對(duì)照未能PCR同樣條帶，證明成功整 合到基因組上。實(shí)例3發(fā)酵生產(chǎn)檸檬烯
種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20 g，1.7 g YNB和5 g硫酸銨g，亮氨酸0. 2g，組氨酸0. 2g， 尿嘧啶0. 2g，pH5. 6。在制作斜面和平板時(shí)加入20瓊脂，115 ° C滅菌20 min。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20 g，1.7 g YNB和5 g硫酸銨，亮氨酸0. 4g，組氨酸 0. 4g，尿嘧啶0. 4g，pH5. 6。在制作斜面和平板時(shí)加入20瓊脂，115 ° C滅菌20 min。從斜面中接種酵母工程菌于20 mL的種子培養(yǎng)基中，放置于30° C轉(zhuǎn)速為200 rpm 的搖床上，培養(yǎng)20-24 h至對(duì)數(shù)中期，以10%的轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)48-56 h，搖瓶發(fā)酵30° C，200rpm，d~檸檬烯產(chǎn)量為6mg/L。實(shí)施例4發(fā)酵生產(chǎn)檸檬烯
發(fā)酵參數(shù)轉(zhuǎn)速400rpm，pH4. 5，通氣量1. 5vvm, 3L罐上發(fā)酵添加碳酸鈣后流加碳源， 流加量為2. 5g/L. h，發(fā)酵結(jié)束后d-檸檬烯產(chǎn)量達(dá)到13mg/L。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。序列表 <110>江南大學(xué)
<120> 一種產(chǎn)d-檸檬烯的酵母工程菌及其構(gòu)建方法 <160> 3
<170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1827 <212> DNA <213>人工合成序列 <220>
<223>根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)，用于基因表達(dá)。 <400> 1
atgtcttctt gcattaatcc ctcaaccttg gctacctctg cctcttgcaa caaatagagc agccatcaga atcatggcaa cttgtcagca ccaaatatga taatttgaca gttgatagga
taaatggttt caaatgtctt 60 aaaataagcc agtccaatgc 120 gatcagcaaa ctaccaacct 180
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)d-檸檬烯的酵母工程菌，其特征在于含有外源d-檸檬烯合成酶基因。
2.權(quán)利要求1所述的酵母工程菌，其特征在于所述檸檬烯合成酶基因核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
3.權(quán)利要求1所述的酵母工程菌，其特征在于所述檸檬烯合成酶基因克隆于 PRS304 質(zhì)粒。
4.權(quán)利要求1所述酵母工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟 優(yōu)化Genebank ABl 10637序列合成檸檬烯合成酶基因；將檸檬烯合成酶基因與載體連接得到重組表達(dá)載體；將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母、Saccharomyces cerevisiae CEN. PK2-1C)后得到酵母 工程菌。
5.權(quán)利要求1所述酵母工程菌應(yīng)用于檸檬烯生產(chǎn)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種產(chǎn)d-檸檬烯的酵母工程菌及其構(gòu)建方法，屬于遺傳工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)代謝工程改造，將來(lái)源于溫州蜜柑(Citrusunshiu)的檸檬烯合成酶異源表達(dá)于釀酒酵母(SaccharomycescerevisiaeCEN.PK2-1C)中，增加萜類(lèi)合成途徑——甲羥戊酸(MVA)途徑碳代謝流，獲得了一株高產(chǎn)d-檸檬烯的酵母工程菌CEN.PK2Limonene。與出發(fā)菌株CEN.PK2-1C相比，改造后酵母工程菌能夠代謝生產(chǎn)d-檸檬烯，且d-檸檬烯反饋抑制明顯降低，d-檸檬烯的產(chǎn)量可達(dá)13mg/L，具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/19GK102071153SQ20101057842
公開(kāi)日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月8日
發(fā)明者劉繼棟, 周景文, 堵國(guó)成, 孫明雪, 陳堅(jiān) 申請(qǐng)人:江南大學(xué)