專利名稱：一種snp復(fù)合檢測體系和檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于基因分型的個體檢測體系和方法，尤其涉及一種用于基于 SNP位點分型的SNP復(fù)合檢測體系和檢測方法。
背景技術(shù)：
隨著各方面對司法訴訟活動的科學(xué)性、客觀性以及準(zhǔn)確性要求的不斷提高，物證 鑒定領(lǐng)域不斷發(fā)展，要求更為精確的分析手段來對案件中檢材的個體來源進(jìn)行確定，DNA分 析由于其檢驗結(jié)果精確，成為物證鑒定領(lǐng)域的重要技術(shù)手段。目前法醫(yī)DNA實驗室常采用復(fù)合PCR-STR分型技術(shù)對未知個體來源的檢材進(jìn)行基 于STR位點的分型以達(dá)到確定檢材個體來源的目的，該復(fù)合PCR-STR分型技術(shù)可檢測的DNA 片段主要分布在300-400bp之間，但在實際案件中常會遇到因各種因素(包括高溫、潮濕、 暴曬、微生物等)發(fā)生降解的檢材，主要表現(xiàn)為，檢材中的DNA分子受損，片段斷裂、丟失，分 子變小等，使用復(fù)合PCR-STR分型技術(shù)對這些檢材進(jìn)行檢測時，經(jīng)常出現(xiàn)“優(yōu)勢擴(kuò)增”或“無 效擴(kuò)增”，導(dǎo)致片段較大的STR基因座無法有效分型。雖然通過改進(jìn)DNA提取方法，提高模 板DNA的濃度和純度，優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件等在一定程度上提高降解檢材的擴(kuò)增效率，但仍不 能獲得良好的確定檢材個體來源的分型結(jié)果，難以滿足案件分析的需要。SNP是目前為止人類基因組中分布最廣泛、存在數(shù)量最多的DNA多態(tài)型，每300個 堿基對出現(xiàn)一次，NCBI數(shù)據(jù)庫中dbSNP Build 131版中人類SNP的數(shù)目為23，652，081，SNP 廣泛存在于非編碼區(qū)和編碼區(qū)，比STR要高出幾個數(shù)量級，大約90%的人類遺傳變異是單 核苷酸多態(tài)性。SNP突變率低，相比STR更加穩(wěn)定可靠，另外SNP片段短，更易進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，并且產(chǎn)物的長度不到lOObp，這與300-400bp的STR相比能夠更好的適用于降解的DNA 樣本，而且SNP引物結(jié)合位點間的距離較近，在法醫(yī)鑒定中有利于對高度降解的DNA進(jìn)行分 析。如何從上述眾多SNP位點中選擇出一組SNP位點構(gòu)建一種檢測體系可對痕量、降 解檢材的DNA同時進(jìn)行個體識別、ABO基因分型以及性別鑒定，以達(dá)到確定檢材個體來源的 目的，擴(kuò)大犯罪現(xiàn)場的檢材范圍，為公安機(jī)關(guān)刑事執(zhí)法和行政執(zhí)法、保障社會公共安全提供 有力的技術(shù)支撐，成為有待解決的問題。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種SNP復(fù)合檢測體系，通過確定48個SNP位點，擴(kuò)增引物組以及微 測序引物組，可對未知個體來源的，痕量、降解檢材的DNA同時進(jìn)行個體識別、ABO基因分型 以及性別鑒定，以確定所述痕量、降解檢材的個體來源。本發(fā)明還提供了一種利用所述SNP復(fù)合檢測體系進(jìn)行個體識別、ABO基因分型和 性別鑒定的SNP復(fù)合檢測的方法，通過該方法可對痕量、降解檢材DNA進(jìn)行準(zhǔn)確的個體識 別、ABO基因分型和性別鑒定。本發(fā)明提供SNP復(fù)合檢測體系，包括48個SNP位點，擴(kuò)增引物組、微測序引物組以及通用芯片；所述擴(kuò)增引物組中包括與所述48個SNP位點一一對應(yīng)的48對擴(kuò)增引物，每對擴(kuò) 增引物能擴(kuò)增待檢測DNA上包括其相應(yīng)的SNP位點的突變型或野生型堿基在內(nèi)的核苷酸序 列；所述微測序引物組中包括與所述48個SNP位點一一對應(yīng)的48條微測序引物，每 條微測序引物的5’端連有標(biāo)簽序列能與通用芯片上的標(biāo)簽序列互補(bǔ)，3’端包括與待檢測 DNA上其相應(yīng)的SNP位點之前的核苷酸序列互補(bǔ)的序列；所述48 個 SNP 位點為:rs8176747、rsl0488710、rs2272998、rs689512、rs445251、 rs5746846、rs9606186、rs3744163、rs722290、rs521861、rsl821380、rs2269355、 rs7520386、rsl0773760、rsl3218440、rs560681、rs221956、rs4530059、rs338882、 rs430046、rsl3182883、rs9951171、rsll09037、rsl736442、rsl59606、rs321198、 rs4606077、rsl336071、rsl294331、rs3780962、rs9905977、rsl058083、rs740598、 rs8176720、 rs8176719、 amelogenin、 rs8078417、 rs2342747、 rsl0092491、 rs6444724、 rsl498553、rsl2997453、rs7041158、rs214955、rs6955448、rs993934、rsl523537、 rsl053878o在本發(fā)明的一個實施例中，在所述SNP復(fù)合檢測體系中，所述擴(kuò)增引物組優(yōu)選為 序列表中SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 96的核苷酸序列；所述微測序引物組優(yōu)選為序列表 中SEQ ID No. 97至SEQ ID No. 144的核苷酸序列；所述微測序引物5，端連有的標(biāo)簽序列 分別為序列表中SEQ ID No. 97至SEQ IDNo. 144的各條核苷酸序列的自5’末端的第1至 20位的脫氧核苷酸；所述通用芯片為微測序反應(yīng)通用芯片、固相微測序反應(yīng)芯片或連接 酶反應(yīng)通用芯片。本發(fā)明所選擇的48個SNP位點，在不同人群間等位基因頻率差別小(Fst平均值 <0.06)；位點雜合度高(>0.4)；且遺傳標(biāo)記處于連鎖平衡狀態(tài)。HapMap數(shù)據(jù)庫中，詳細(xì) 描述了這些包括突變形式、在DNA上存在的位置，以及在同一群體內(nèi)部和不同群體間的分 布狀況。試驗證明，利用所篩選的48個SNP位點，可以實現(xiàn)同時進(jìn)行個體識別、ABO 基因分型以及性別鑒定，具體地，針對ABO基因分型，其中的rs8176719 (261delG)、 rs8176720(297A > G)、rsl053878 (467C > Τ)、rs8176747 (803G > C) 4 個 SNP 位點，可以對 Al、A2、B、01和02等位基因進(jìn)行分型檢測，進(jìn)而完成A1A1、A1A2、A101、A102、A2A2、A201、 A202、A1B、A2B、BB、B01、B02、0101、0102和0202等15種ABO基因型組合的分型工作，性別 鑒定位點選自amelogenin基因；利用本發(fā)明提出的48個SNP位點實施對未知來源檢材的 檢測，可一次完成對未知來源檢材的個體識別、ABO基因分型以及性別鑒定，提高了檢測的 效率。本發(fā)明提供的48個SNP位點信息如表1所示表 1序號SNP基因座染色體堿基變化作用1rs8176747(803G>C)9C/GABO基因分型2rsl048871011C/G個體識別3rs22729986C/G個體識別4rs68951217C/G個體識別5rs44525120C/G個體識別6rs574684622C/G個體識別7rs960618622C/G個體識別8rs374416317C/G個體識別9rs72229014C/G個體識別10rs52186118C/G個體識別11rsl82138015C/G個體識別12rs226935512C/G個體識別13rs75203861G/A個體識別14rsl077376012G/A個體識別15rsl32184406G/A個體識別16rs5606811G/A個體識別17rs22195621G/A個體識別18rs453005914G/A個體識別19rs3388825G/A個體識別20rs43004616G/A個體識別21rsl 31828835G/A個體識別22rs995117118G/A個體識別23rsl 1090372G/A個體識別24rsl73644218G/A個體識別25rsl 596065G/A個體識別26rs3211987G/A個體識別27rs46060778G/A個體識別28rsl3360716G/A個體識別29rsl 2943311G/A個體識別30rs378096210G/A個體識別31rs990597717G/A個體識別32rsl05808313G/A個體識別33rs74059810G/A個體識別34rs8176720 (297A>G)9G/AABO基因分型35rs8176719 (261delG)9G/AABO基因分型36amelogeninXYG/A性別鑒定37rs807841717G/A個體識別38rs234274716G/A個體識別39rs 100924918G/A個體識別40rs64447243G/A個體識別41rsl49855311G/A個體識別42rsl29974532G/A個體識別43rs70411589G/A個體識別44rs2149556G/A個體識別45rs69554487G/A個體識別46rs9939342G/A個體識別47rsl52353720G/A個體識別48rs 1053878 (467C>T)9G/AABO基因分型本發(fā)明提供的優(yōu)選的擴(kuò)增引物組序列和延伸引物組序列，通過Autoprimer在線 軟件進(jìn)行設(shè)計。所述48對擴(kuò)增引物及其相對應(yīng)的SNP位點如表2所示，PCRU代表上游引 物，PCRL代表下游引物；表2
序號SNP位點 名稱 長度 引物序列SEQ
IDNO.
1rs8176747PCRU109AGGCCTACATCCCCAAGG1(803G>C)PCRLATCATGGCCTGGTGGCAG22rsl0488710PCRU140AAAATTAAATAAGGGTACTCATTAACCA3PCRLTAAAAGACTTTCAATTTATGTCAGCA43rs2272998PCRlJ93TGCCTTTTTTTTTTAAGTGACAC5PCRLCGACTCCTACGAGAGAAGATTC64rs689512PCRU100AACATGACTCTGACATCTGGTG7PCRLCAGGAACCCAAGACCTCC85rs445251PCRU103ATCACACTATCCTGACATGAACAA9
權(quán)利要求
1.一種SNP復(fù)合檢測體系，其特征在于，包括48個SNP位點，擴(kuò)增引物組、微測序引物 組以及通用芯片；所述擴(kuò)增引物組中包括與所述48個SNP位點一一對應(yīng)的48對擴(kuò)增引物，每對擴(kuò)增引 物能擴(kuò)增待檢測DNA上包括其相應(yīng)的SNP位點的突變型或野生型堿基在內(nèi)的核苷酸序列；所述微測序引物組中包括與所述48個SNP位點一一對應(yīng)的48條微測序引物，每條微 測序引物的5’端連有標(biāo)簽序列能與所述通用芯片的標(biāo)簽序列互補(bǔ)，3’端包括與待檢測DNA 上其相應(yīng)的SNP位點之前的核苷酸序列互補(bǔ)的序列；所述 48 個 SNP 位點為rs8176747、rsl0488710、rs2272998、rs689512、rs445251、 rs5746846、rs9606186、rs3744163、rs722290、rs521861、rsl821380、rs2269355、 rs7520386、rsl0773760、rsl3218440、rs560681、rs221956、rs4530059、rs338882、 rs430046、rsl3182883、rs9951171、rsll09037、rsl736442、rsl59606、rs321198、 rs4606077、rsl336071、rsl294331、rs3780962、rs9905977、rsl058083、rs740598、 rs8176720、rs8176719、amelogenin、rs8078417、rs2342747、rsl0092491、rs6444724、 rsl498553、rsl2997453、rs7041158、rs214955、rs6955448、rs993934、rsl523537、 rsl053878o
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SNP復(fù)合檢測體系，其特征在于，所述擴(kuò)增引物組為序列表中 SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 96的核苷酸序列；所述微測序引物組為序列表中SEQ ID No. 97 至SEQ ID No. 144的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的SNP復(fù)合檢測體系，其特征在于，所述微測序引物5’端連有 的標(biāo)簽序列分別為序列表中SEQ ID No. 97至SEQ ID No. 144的各條核苷酸序列的自5，末 端的第1至20位的脫氧核苷酸；
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SNP復(fù)合檢測體系，其特征在于，所述通用芯片為微測序反 應(yīng)通用芯片、固相微測序反應(yīng)芯片或連接酶反應(yīng)通用芯片。
5.一種利用權(quán)利要求1-4任一項所述SNP復(fù)合檢測體系進(jìn)行個體識別、ABO基因分型 和性別鑒定的SNP復(fù)合檢測方法，包括1)提取待檢測樣本的DNA作為模板；2)使用所述擴(kuò)增引物組對步驟1提取的DNA模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)；3)然后將步驟2得到的產(chǎn)物使用所述微測序引物組進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，所述引物延伸 反應(yīng)中ddNTP為熒光標(biāo)記的ddNTP ；4)將步驟3的產(chǎn)物和通用芯片進(jìn)行雜交，根據(jù)芯片雜交結(jié)果進(jìn)行個體識別、ABO基因分 型和性別鑒定；
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)在一管中進(jìn)行或分多管進(jìn)行。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板為提取自全 血、組織等檢材的DNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為 95°C, 15min ；94°C，30sec ；55°C，30sec ；72°C, Imin sec ；40 個循環(huán)；4°C保存。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述引物延伸反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為96°C， 3min ；94°C,20sec ；40°C, Ilsec ；46 個循環(huán)；4°C保存。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述雜交的條件為在密封的盒子中，溫 箱內(nèi)42V雜交，時間為2 2. 5小時。
全文摘要
本發(fā)明提供一種SNP復(fù)合檢測體系和檢測方法，該SNP復(fù)合檢測體系包括一組適合法醫(yī)學(xué)應(yīng)用的48個SNP位點，擴(kuò)增引物組、微測序引物組以及通用芯片，可用于進(jìn)行個體識別、ABO基因分型和性別判定。本發(fā)明還提供了一種利用所述SNP復(fù)合檢測體系進(jìn)行個體識別、ABO基因分型和性別鑒定的SNP復(fù)合檢測方法，通過對待檢測樣本的DNA進(jìn)行包含48個SNP位點的核苷酸片段的擴(kuò)增，通過微測序引物進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，再使用通用芯片對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基于SNP位點的分型，提高了對于痕量、降解檢材DNA的分析能力，擴(kuò)大了犯罪現(xiàn)場的檢材范圍，為公安機(jī)關(guān)刑事執(zhí)法和行政執(zhí)法提供有力的技術(shù)支撐。
文檔編號C12Q1/68GK102115788SQ201010577908
公開日2011年7月6日 申請日期2010年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月2日
發(fā)明者李彩霞, 胡蘭, 葛蕓英 申請人:公安部物證鑒定中心