專利名稱：枯草芽孢桿菌ls02漆酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細菌漆酶，具體涉及一株枯草芽孢桿菌LS02的芽孢漆酶的制備 方法和催化性質(zhì)，以及編碼該芽孢漆酶的核酸片段。此外，本發(fā)明還涉及到該芽孢漆酶使合 成染料脫色的方法，屬于應(yīng)用微生物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
漆酶(EC 1. 10. 3. 2)是一種含銅的多酚氧化酶，它可利用活性中心的銅離子催化 氧化多種結(jié)構(gòu)的芳香化合物，同時將分子氧還原成水。由于漆酶催化的底物范圍十分廣泛， 因此漆酶酶已被廣泛應(yīng)用于造紙工業(yè)、紡織工業(yè)、食品工業(yè)以及土壤的生物修復(fù)等領(lǐng)域。漆酶催化氧化底物一般包括兩種作用方式，第一種是底物分子直接與漆酶銅簇反 應(yīng)氧化成相應(yīng)的激發(fā)態(tài)分子。然而有些底物不能由漆酶直接氧化，原因在于它們分子太大 而不能滲透進入酶的活性部位，或者由于其氧化還原電位較高而不能被漆酶直接氧化。漆 酶氧化底物的第二種方式是通過一些小分子的介體物質(zhì)為媒介，漆酶先將小分子介體氧化 成激發(fā)態(tài)，然后這些激發(fā)態(tài)的介體再與大分子的或氧化還原電位較高的底物反應(yīng)，該方式 也被稱為漆酶-介體系統(tǒng)(LMS)。漆酶-介體系統(tǒng)的應(yīng)用有助于進一步擴大漆酶的底物范 圍，提高漆酶的工業(yè)應(yīng)用范圍。在自然界中，漆酶廣泛分布于植物、真菌和細菌中，特別是真菌，是目前漆酶的主 要生產(chǎn)者。雖然目前對細菌漆酶的理論研究不如真菌漆酶深入，但細菌具有生長快、易于培 養(yǎng)的特點，細菌漆酶較真菌漆酶在堿性環(huán)境和高溫下具有更好的穩(wěn)定性。由于工業(yè)造紙廢 水等一般溫度較高，堿性較強，真菌漆酶在實際應(yīng)用中受到穩(wěn)定性差的限制，因此細菌漆酶 在工業(yè)上具有更好的應(yīng)用前景。漆酶在細菌中的存在主要有三種形式，即細胞外漆酶、細胞內(nèi)漆酶和細胞組成漆 酶。得到的這三種形式的酶，酶的活性及穩(wěn)定性不同。由于胞內(nèi)酶需破壁獲得，此形式的 漆酶在破胞過程中酶活性降低較明顯，且隨著細胞的破碎各種細胞組份與漆酶混合，對酶 的純化也會帶來困難；與之相比，另外的兩種形式漆酶則優(yōu)勢顯而易見，尤其是細胞組成漆 酶，通常是芽孢菌屬的細菌，由于細菌芽孢對高溫、高壓、極端PH以及高鹽等多種不利因素 具有較強的抗逆性，該種類漆酶會因芽孢這一特殊構(gòu)造的特性而表現(xiàn)出更好的溫度穩(wěn)定性 和PH穩(wěn)定性。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，眾多的漆酶基因已經(jīng)得到了克隆和深入分析。 研究漆酶編碼基因的表達調(diào)控機制，有助于闡明不同基因在發(fā)育進程中所起的作用，此外， 還可以通過定點誘變等技術(shù)對漆酶基因進行改造，提高漆酶工業(yè)應(yīng)用性能。染料被廣泛應(yīng)用于紡織、印染、皮革等行業(yè)，全球每年生產(chǎn)染料萬種之余，至少有 10-15%的染料通過廢水排放到自然環(huán)境中，對水體的生態(tài)環(huán)境造成嚴重破壞。工業(yè)使用的 合成染料多是芳香族化合物，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難降解。目前染料廢水的處理方法主要有物理化學(xué) 法和生物處理法，物化處理技術(shù)費用高，存在二次污染，生物法因其經(jīng)濟環(huán)保而成為較好的 治理方法。其中漆酶由于具有廣泛的底物作用范圍，可催化降解多種結(jié)構(gòu)的染料，在工業(yè)染料廢水處理上具有較好的應(yīng)用前景。已有很多關(guān)于應(yīng)用白腐菌或其它真菌來源的漆酶脫色 染料的研究，但關(guān)于細菌漆酶以及細菌漆酶-介體系統(tǒng)在染料脫色方面的研究報道較少。 通過研究細菌漆酶對不同合成染料的脫色效果，可以進一步推動細菌漆酶的工業(yè)應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種枯草芽孢桿菌(Baciilus subtilis)LS02，同時本發(fā)明的 目的還在于提供一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)LS02產(chǎn)芽孢漆酶的制備方法，以 及提供一種利用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)LS02產(chǎn)的芽孢漆酶脫色合成染料的方法。本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)LS02已于2010年10月22日 保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3 號，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏編號為CGMCC No. 4261。上述枯草芽孢桿菌菌株是從中國黑龍江省伊春市涼水國家自然保護區(qū)森林表 層土壤分離獲得?？莶菅挎邨U菌LS02菌株革蘭氏染色陽性，芽孢中生，有鞭毛。在固體 Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)Mh，菌落微黃色、扁平呈圓形，菌落表面濕潤、光 滑，菌落邊緣呈葉狀，菌落半透明且正反顏色一致。菌株的最適生長溫度為37°C，最適生長 PH 為 7.0，可耐受 -13% 的 NaCl。本發(fā)明提供了枯草芽孢桿菌LS02產(chǎn)芽孢漆酶的產(chǎn)孢培養(yǎng)培養(yǎng)基配方及芽孢漆酶 的制備方法。上述產(chǎn)孢培養(yǎng)基配方(g/L)為營養(yǎng)肉湯8 ；KCll ；MgSO4 · 7H20 0. 25 ；MnCl2 · 4H20 0. 002 ；瓊脂17 ；調(diào)pH7. 0后高溫高壓滅菌，加入過濾除菌的0. 5mmol/LCaCl2及0. OOlmmol/ L FeSO40上述芽孢漆酶的制備方法為1)枯草芽孢桿菌LS02劃線接種于固體產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，37°C倒置培養(yǎng)5d后。2)用無菌去離子水將固體培養(yǎng)基上的芽孢沖洗下來。3)加入終濃度0. lmg/mL的溶菌酶，37°C水浴lOmin。4)依次用含有 10mmol/L EDTAiPO. 3mg/mL PMSF 的 lmol/L NaCl，0. 14mol/L NaCl 和 0. (w/v)SDS 清洗一遍。5)用無菌去離子水清洗一遍。6)80°C水浴熱擊IOmin后用無菌去離子水清洗三遍。7)取一定量懸液后，將其余懸液裝入滅菌后的三角瓶中，4°C避光保存。8)將取出的懸液置于80°C烘箱內(nèi)烘至恒重，計算出芽孢懸液濃度(mg/ml)，并記 錄。本發(fā)明枯草芽孢桿菌LS02產(chǎn)生的芽孢漆酶可在pH值2. 2-10.0范圍內(nèi)發(fā)揮作用， 催化不同底物的最適PH值有所不同以ABTS為底物時，在pH 3.0時酶活最高；以丁香醛連 氮為底物時，在PH6. 8時酶活最高；以2，6- 二甲氧基苯酚為底物時，在pH7. 8時酶活最高。 本發(fā)明枯草芽孢桿菌LS02產(chǎn)生的芽孢漆酶在堿性條件下具有極強的穩(wěn)定性，在ρΗΙΟ. 0的 條件下30°C保溫10天活性不僅沒有下降反而有所增加，10天后酶活為初始酶活的3. 8倍 左右。這一特點是絕大多數(shù)真菌漆酶所不具備的，由于造紙工業(yè)很多采用堿法制漿，使造紙廢水堿性較高，該芽孢漆酶在堿性條件下極好的穩(wěn)定性有利于其在造紙廢水等處理中發(fā)揮 有效作用。本發(fā)明枯草芽孢桿菌LS02產(chǎn)生的芽孢漆酶的酶促反應(yīng)溫度范圍較廣，其最適溫 度為60°C，在50-80°C間可保持較高的活性，80°C時為最高酶活的71 %，即使在90°C的高溫 下仍可保持最高酶活的50. 8%，真菌漆酶在此溫度下基本完全喪失活性。同時，這種芽孢漆 酶具有較好的熱穩(wěn)定性，在50°C、60°C和70°C下保溫IOh后，其酶活分別為初始活性的1. 1、 1. 58和1. 75倍，在80°C保溫IOh后殘余酶活為初始酶活的86%。這種芽孢漆酶在高溫下 極好的穩(wěn)定性在工業(yè)上具有很大的實際應(yīng)用價值。金屬陽離子對所述漆酶的活性有較大的 影響，如 Na+、Li+、K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+ 和 Co2+ 對其活性有激活作用，而 Ag+、Mn2+、Al3+ 和 Hg2+對酶活有抑制作用，其中Hg2+可使本發(fā)明所述的芽孢漆酶完全失活。本發(fā)明枯草芽孢 桿菌LS02產(chǎn)生的芽孢漆酶在不同濃度的NaCl下活性變化較大，0. 01mol/L的NaCl對所述 芽孢漆酶的活性有促進作用，0. lmol/L以上濃度的NaCl對活性有抑制作用，在lmol/L的 NaCl存在時可保持原始活性的24. 22%。本發(fā)明枯草芽孢桿菌LS02所產(chǎn)的芽孢漆酶對不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的工業(yè)合成染料具有 較好的脫色作用。在介體乙酰丁香酮的參與下，在PH6. 8時對RBBR、活性黑KN-B、靛紅和 結(jié)晶紫6h后的脫色率分別為85. 2%、87. 84%,96. 18%和92. 57%，靛紅和結(jié)晶紫幾乎完 全脫色。在PH9. 0時對RBBR、活性黑KN-B、靛紅和結(jié)晶紫Mi后的脫色率分別為92. 22%, 96. 09%,97. 12%和97. 43%，說明該芽孢漆酶在堿性環(huán)境下對各種染料仍保持了較高的脫 色能力。本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌漆酶基因，來自于枯草芽孢桿菌LS02， CGMCCNo. 4261，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID No 1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID No 2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表SEQ ID No 1限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且編碼相同功 能蛋白質(zhì)的DNA序列。本發(fā)明也涉及多肽，其具有漆酶活性并被上述定義的核酸分子所編碼。本發(fā)明進 一步涉及多肽，其氨基酸序列以上述方式與SEQ ID No :2的氨基酸序列是相同的或同源的。本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)LS02經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，可制備具 有漆酶活性的芽孢懸液，該制備方法操作簡單，成本較低。所制備的芽孢漆酶具有廣泛的PH 和溫度催化范圍，在堿性和高溫條件下具有較好的穩(wěn)定性，比真菌來源的漆酶具有更優(yōu)越 的適用性。在介體物質(zhì)乙酰丁香酮的參與下，該芽孢漆酶能對不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的合成染料有 效脫色，在堿性條件下仍保持了較好的脫色效果，因此本發(fā)明提供的芽孢漆酶在工業(yè)染料 廢水的處理上具有較好的應(yīng)用前景。
圖1是以ABTS為底物時pH對枯草芽孢桿菌LS02芽孢漆酶活性的影響；圖2是以丁香醛連氮為底物時pH對枯草芽孢桿菌LS02芽孢漆酶活性的影響；圖3是以2，6- 二甲氧基苯酚為底物時pH對枯草芽孢桿菌LS02芽孢漆酶活性的 影響；
圖4是枯草芽孢桿菌LS02芽孢漆酶在pH10. 0時酶活隨時間變化的曲線圖；圖5是不同溫度對枯草芽孢桿菌LS02芽孢漆酶活性的影響；圖6是枯草芽孢桿菌LS02芽孢漆酶在50_80°C時活性的穩(wěn)定性；圖7是不同濃度的NaCl對枯草芽孢桿菌LS02芽孢漆酶活性的影響；圖8是pH6. 6時枯草芽孢桿菌LS02芽孢漆酶以乙酰丁香酮為介體對RBBR、活性黑 KN-B、靛紅和結(jié)晶紫的脫色結(jié)果圖9是pH9. 0時枯草芽孢桿菌LS02芽孢漆酶以乙酰丁香酮為介體對RBBR、活性黑 KN-B、靛紅和結(jié)晶紫的脫色結(jié)果
具體實施例方式以下的實施方式是為了更好地理解本發(fā)明。以下實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為可購買到的生化試劑。其中 細菌基因組提取試劑盒和膠回收試劑盒是Omega公司產(chǎn)品，T載體和其他工具酶等均為 TaKaRa公司產(chǎn)品。以下實施方式中所說的酶液，均是按照芽孢漆酶制備方法制備出的枯草芽孢桿菌 LS02芽孢漆酶。酶活測定方法是指用分光光度計檢測漆酶與底物反應(yīng)后吸光度，計算漆酶活性。 所述的底物為丁香醛連氮，2，2-連氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTQ或2，6-二甲
氧基苯酚。酶的活性定義為每分鐘氧化1 μ mol底物為產(chǎn)物所需的酶量為一個酶活力單位。 反應(yīng)體系如下(I)ABTS 反應(yīng)體系含有l(wèi)mmol/L ABTS, 100 μ L芽孢懸液，及檸檬酸-磷酸鹽緩沖 液(0. lmol/L, pH 3. 0)，總體積3mL, 30°C反應(yīng)3min后在420nm處測定吸光值。(2) 丁香醛連氮反應(yīng)體系含有0. lmmol/L 丁香醛連氮，100 μ L芽孢懸液，及檸檬 酸-磷酸鹽緩沖液(0. Imo 1/L，pH 7. 0)，總體積3mL, 30°C反應(yīng)3min后在525nm處測定吸光值。(3)2，6-二甲氧基苯酚應(yīng)體系含有211111101/1 2，6_ 二甲氧基苯酚，100 μ L芽孢懸 液，及檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(0. lmol/L, pH 7. 0)，總體積3mL, 30°C反應(yīng)5min后在468nm 處測定吸光值。實施例1枯草芽孢桿菌LS02芽孢漆酶的性質(zhì)1. pH值對芽孢漆酶活性和穩(wěn)定性的影響pH對漆酶活性的影響采用pH2. 2-7. 8檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(0. lmol/L)、 ρΗ7· 4-9. OTris-HCl (0. 05mol/L)緩沖液及ρΗ8· 6-10. 0甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液 (0. 05mol/L)測定，pH對漆酶穩(wěn)定性的影響通過在30°C時將漆酶與pH3.0、8.0的檸檬 酸-磷酸鹽緩沖液，PH9. 0的Tris-HCl緩沖液及pH10. 0甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中混 合放置I-IOd后測定剩余活性。圖1-3表明，本發(fā)明提供的芽孢漆酶催化范圍廣泛，在 pH2. 2-10. 0的范圍內(nèi)均可催化底物反應(yīng)，以ABTS，丁香醛連氮和2，6-二甲氧基苯酚為底物 時測得的最適PH分別為3. 0、6. 8和7. 8。圖4表明，枯草芽孢桿菌LS02芽孢漆酶在pH10. 0 的環(huán)境中具有較好穩(wěn)定性，IOd后仍可保持較高的活性。
權(quán)利要求
1.枯草芽孢桿菌LS02，在中國普通微生物菌種保藏管理中心的保藏編號為CGMCC No.似61。
2.一種芽孢漆酶，該漆酶由權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌LS02 (Bacillussubtilis)產(chǎn)生的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的芽孢漆酶的制備方法，其特征在于按下列步驟進行a.枯草芽孢桿菌LS02劃線接種于固體產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，37°C倒置培養(yǎng)5d后，所述的產(chǎn)孢 培養(yǎng)基組份為(g/L)營養(yǎng)肉湯 8 ；KCl 1 ；MgSO4 · 7H20 0. 25 ；MnCl2 · 4H20 0. 002 ；瓊脂 17 ； 調(diào)pH7. 0后高溫高壓滅菌，加入過濾除菌的0. 5mmol/LCaCl2及0. 001mmol/L FeSO4 ；b.用無菌去離子水將固體培養(yǎng)基上的芽孢沖洗下來；c.加入終濃度0.lmg/mL的溶菌酶，37°C水浴IOmin ；d.依次用含有10mmol/L EDTA 禾口 0. 3mg/mL PMSF 的 Imol/L NaCl、0. 14mol/L NaCl, 0. 1% (w/v) SDS和無菌去離子水清洗一遍；e.80°C熱擊IOmin后用無菌去離子水清洗三遍后，裝入滅菌后的三角瓶中4°C避光保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求2和3所述的芽孢漆酶，可在pH2. 2-10.0發(fā)揮作用，在30°C時催化 底物ABTS的最適pH值為3. 0，催化底物丁香醛連氮的最適pH值為6. 8，催化底物2，6- 二 甲氧基苯酚的最適pH值為7.8。
5.根據(jù)權(quán)利要求2至4所述的芽孢漆酶，可在20-100°C發(fā)揮功能，在pH6. 8以丁香醛 連氮為底物時最適反應(yīng)溫度為60°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求2至5所述的芽孢漆酶，可對不同結(jié)構(gòu)的合成染料包括RBBR(RemaZ0l Brilliant Blue R, CAS No :2580-78-1)，活性黑 KN-B (CAS No 17095-24-8)，結(jié)晶紫(CAS No =548-62-9)和靛紅(CAS No :860-22-0)進行脫色，脫色條件為:40°C, pH 6. 8 或 9. 0，芽 孢漆酶懸液的終濃度是lmg/ml，染料終濃度分別為RBBR 100mg/L，活性黑KN-B 40mg/L，靛 紅25mg/L，結(jié)晶紫5mg/L，加入終濃度是0. lmmol/L的漆酶介體乙酰丁香酮。
7.枯草芽孢桿菌具有漆酶活性的基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQID No 1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQID No 2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表SEQID No :1限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且編碼相同功能蛋 白質(zhì)的DNA序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基因，其特征在于所述枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) 漆酶基因是序列表中SEQ ID No :1。
9.枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)漆酶，是具有序列表中SEQ ID No :2氨基酸殘 基序列的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種枯草芽孢桿菌LS02(CGMCC No.4261)芽孢漆酶的制備方法，催化性質(zhì)和在染料脫色中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及編碼該芽孢漆酶的核苷酸序列?？莶菅挎邨U菌LS02在固態(tài)產(chǎn)孢培養(yǎng)基上37℃發(fā)酵5天后，用去離子水將芽孢沖洗下來，再通過溶菌酶處理等一系列措施獲得具有漆酶活性的芽孢懸液。該芽孢漆酶在堿性和高溫條件下具有較好的催化活性，在介體作用下對不同結(jié)構(gòu)的合成染料具有較好的脫色效果，可用于工業(yè)染料廢水的處理。
文檔編號C12N15/53GK102115722SQ201010568908
公開日2011年7月6日 申請日期2010年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月2日
發(fā)明者盧磊, 李德斌, 李泰侖, 杜美惠, 王天女, 趙麗艷, 趙敏 申請人:東北林業(yè)大學(xué)