專利名稱：與植物耐逆性相關蛋白ZmSAPK8及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種與植物耐逆性相關蛋白ZmSAPKS及其編碼基因與應用。
背景技術：
全世界有3. 8億公頃鹽堿土地。在我國耕地中有10%為鹽漬化土壤，嚴重影響著現(xiàn)代農業(yè)的發(fā)展。在人口不斷增長的今天，擴大可耕種土地面積，提高耕地單位面積產量以解決糧食問題已經(jīng)成為亟待解決的問題。與利用工程手段改變環(huán)境以適應植物的需要相比，運用生物手段改變植物本身，使之適應環(huán)境是更為積極主動且長期有效的措施。因此， 植物基因工程研究已經(jīng)成為改良作物、提高產量的重要手段，因而克隆獲得抗逆性較好的基因已經(jīng)成為植物基因工程研究的重心。
發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種與植物耐逆性相關蛋白ZmSAPKS及其編碼基因。本發(fā)明所提供的蛋白質，名稱為ZmSAPKS，人工合成，是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由1)衍生的蛋白質。上述序列表中序列2由366個氨基酸殘基組成。所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述與植物耐逆性相關的蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述編碼基因為如下1)或2)或3)或4)所示的基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)序列表中序列1自5’末端第60-1160位核苷酸所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA分子雜交且編碼所述與植物耐逆性相關蛋白質的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98% 或至少具有99%同源性且編碼與所述植物耐逆性相關蛋白質的DNA分子。其中，序列表中序列1由1386位脫氧核糖核苷酸組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5'末端第60-1160位堿基。所述嚴格條件也可為在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65 °C下雜交，然后用 2 XSSC,0. 1% SDS 和 1XSSC，0. 1% SDS 各洗膜一次。含有上述蛋白編碼基因的重組表達載體、重組菌、轉基因細胞系或表達盒也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組表達載體具體可為在pCAMBIA3301的BglII和BstEII位點間插入序列表中序列1的核苷酸得到的pCAMBIA3301-ZmSAPK8。
擴增上述任一所述編碼基因全長或其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。引物對中的一條引物為序列表中序列3所示的DNA分子，另一條引物為序列表中序列 4所示的DNA分子。本發(fā)明的另一個目的是提供培育耐逆性提高的轉基因植物的方法。本發(fā)明所提供的方法，是將所述的編碼基因導入目的植物得到的轉基因植物，所述轉基因植物的耐逆性高于所述目的植物。所述耐逆性為耐鹽性。所述編碼基因是通過所述重組表達載體導入所述目的植物中。所述植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物優(yōu)選為擬南芥。本發(fā)明的實驗證明，用克隆的方法得到ZmSAPKS基因，將其導入擬南芥中得到的轉基因擬南芥，與野生型擬南芥相比，轉基因擬南芥的耐逆性高于野生型擬南芥，耐逆性表現(xiàn)在耐鹽性的。本實驗得到的ZmSAPKS基因和轉基因擬南芥在植物遺傳育種方面有重要的
眉、ο
圖1為菌液PCR鑒定轉化pCAMBIA3301-ZmSAPK8的陽性克隆圖2為轉基因擬南芥植株的分子檢測圖3為RT-PCR方法檢測轉基因純和株系中ZmSAPK8的表達情況圖4為野生型擬南芥與T3代轉基因株系在NaCl處理下的存活率圖5為野生型擬南芥與T3代轉基因株系在NaCl處理下的持綠性圖6為鹽脅迫對野生型擬南芥及轉基因株系的脯氨酸含量的影響
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、ZmSAPK8的獲得提取玉米(CN165，Zea mays L.)的DNA， 用正向引物 CCTTCTCACGGAATCCTACCATTA,反向引物TCCAAAGCCCAGTAACCAGGAAG，進行 PCR 擴增，得至Ij 1386bp的片段。也可人工合成序列1，用正向引物CCTTCTCACGGAATCCTACCATTA，反向引物 TCCAAAGCCCAGTAACCAGGAAG 進行 PCR 擴增，同樣得到 PCR 產物。將該PCR產物送去測序，結果為該PCR產物具有序列表中序列1自5 ‘末端第 1-1386位核苷酸，該PCR產物的基因命名為ZmSAPKS，該基因的編碼區(qū)為序列表中序列1的自5 ‘末端第60-1160位核苷酸，該基因編碼的蛋白命名為ZmSAPKS，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。序列1由1386個核苷酸組成，序列2由366個氨基酸組成。實施例2、轉ZmSAPKS擬南芥的獲得及功能研究一、轉ZmSAPK8擬南芥的獲得1、表達載體構建及PCR分子檢測將實施例1得到的PCR產物用如下引物進行再次PCR
正向引物(BglII) TAGATCTATGGCAGGGCCGGCGCCGGA (序列 3，下劃線為酶切位
占). /、、、 / 反向引物(BstEII)TTGGTAACCTCACATTGCGTACACAATCTCA(序列 4,下劃線為酶切位點)將得到的PCR產物經(jīng)BglII和BstEII雙酶切得到的小片段與經(jīng)過同樣酶切得到的 pCAMBIA3301 (以下簡稱 p3301，Canberra，Australia，Wang MY, Gu D，Liu TS, Wang ZQ, Guo XY, Hou W, Bai YF, Chen XP, Wang GY. 2007. Overexpression of a putative maize calcineurin B-Iike protein in Arabidopsis confers salt tolerance. Plant Mol Biol. 65:733-746.，公眾可從中國農業(yè)科學院作物科學研究所獲得。)載體大片段連接， 得到的連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)ToplO，得到轉化子，提取轉化子的質粒經(jīng)過PCR鑒定，正向引物(Bgl II) :TTAGATCTATGGCAGGGCCGGCGCCGGA(序列 3)；反向引物(BstEII) TTGGTAACCTCACATTGCGTACACAATCTCA(序列4)，得到IlOlbp片段的質粒為陽性，經(jīng)陽性質粒送去測序，結果為該質粒為將序列表中序列1自5 ‘末端第60-1160位核苷酸插入到 PCAMBIA3301載體(以下簡稱p3301)的Bgl II和BstEII酶切位點得到的載體，命名為 pCAMBIA3301-ZmSAPK8，且 pCAMBIA3301-ZmSAPK8 中 ZmSAPK8 的編碼區(qū)位于啟動子 CaMV35S 下游，為植物超表達載體。2、GV3101/pCAMBIA3301-ZmSAPK8 的獲得將上述pCAMBIA3301-ZmSAPK8 轉入根癌農桿菌 GV3101(Wang MY, Gu D，Liu TS, Wang ZQ,Guo XY,Hou W,Bai YF,Chen XP,Wang GY. 2007. Overexpression of a putative maize calcineurin B-Iike protein in Arabidopsis confers salt tolerance. Plant Mol Biol. 65 :733-746.，公眾可從中國農業(yè)科學院作物科學研究所獲得。)中，在含有 100 μ g/ml Kan和125 μ g/ml Rif的YEB平板篩選，得到的轉化子，進行菌液PCR鑒定，正向引物ATGGCAGGGCCGGCGCCGGA ；反向引物TCACATTGCGTACACAATCTCA，結果見圖 1 所示， M表示DNA marker，左側箭頭指向IOOObp的條帶；泳道1表示以卡那霉素抗性的YEB液體培養(yǎng)基為模板的負對照；泳道2-6表示5個陽性克隆，目的產物如圖中右側箭頭所示，得到 IlOlbp的片段為PCR陽性克隆，將PCR鑒定陽性克隆提取質粒，送去測序，結果為該質粒為 pCAMBIA3301-ZmSAPK8，含有該質粒的陽性克隆命名為 GV3101/pCAMBIA3301_ZmSAPK8。常用培養(yǎng)基和溶液的配制YEB液體培養(yǎng)基(IL)酵母提取物Ig牛肉膏5g蛋白胨5g蔗糖5gMgSO4. 7H200. 5g加蒸餾水定容至1L，調PH至7. 0，高壓滅菌。YEB固體培養(yǎng)基每升液體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂粉，高壓滅菌。含有抗生素的YEB培養(yǎng)基在高壓滅菌后的YEB培養(yǎng)基中，當溫度降至50°C左右時加入所需抗生素(100mg/L 的 Rif，100mg/L 的 Kan)，搖勻。
3、轉ZmSAPK8擬南芥的獲得及分子檢測(1)轉化擬南芥將GV3101/pCAMBIA3301-ZmSAPK8菌株擴大培養(yǎng)，用蘸花法轉化野生型擬南芥 Columbia(Arabidopsis thaliana,ecotype Columbia)(Zhang X,Henriques R,Lin SS,Niu Qff, Chua NH(2006)Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols 1 :641_646.，公眾可從中國農業(yè)科學院作物科學研究所獲得。)，得到TO代轉ZmSAPKS擬南芥。收獲TO代轉ZmSAPK8擬南芥的種子，播種得到Tl代轉ZmSAPK8擬南芥。采用相同的方法將空載體PCAMBIA3301導入野生型擬南芥Columbia中，得到轉空載體擬南芥。(2)分子鑒定提取Tl代轉ZmSAPKS擬南芥葉片的基因組DNA作為模板，分別以特異引物和bar 基因引物進行PCR，特異引物正向引物5'ATGGCAGGGCCGGCGCCGGA-3‘，反向引物5 ‘ TCACATTGCGTACACAATCTCA-3 ‘bar 基因引物Barp-F -GCGGTCTGCACCATCGTC-3 ‘Barp-R 5' -GTACCG GCAGGCTGAAGTCCA-3‘。以野生型擬南芥(W)、水為對照，以質粒pCAMBIA3301-ZmSAPK8為陽性對照。結果見圖2A和2B所示，圖2A為基因特異引物擴增結果；圖2B為bar基因 (PCAMBIA3301上有bar基因)擴增結果；其中，M表示DNA marker，左側箭頭分別指向 IOOObp的條帶；泳道1表示陽性對照；泳道2表示野生型WT對照；泳道3表示以H2O為模板的負對照；泳道4-15表示12個T1代轉基因株系，從2A看出得到大小為IlOlbp的片段為陽性Tl代轉ZmSAPKS擬南芥；負對照和野生型WT均無片段。從圖2B中看出，能夠擴增出約為500bp的bar基因為陽性Tl代轉ZmSAPK8擬南芥，既得到IlOlbp的片段又得到bar 基因的為陽性Tl代轉ZmSAPKS擬南芥，共得到15株陽性Tl代轉ZmSAPKS擬南芥。野生型擬南芥與轉空載體擬南芥結果無顯著差異。收獲Tl代轉ZmSAPKS擬南芥的種子，播種得到T2代轉ZmSAPKS擬南芥，收獲T2 代轉ZmSAPKS擬南芥的種子，播種得到T3代轉ZmSAPKS擬南芥。將編號為9-5、8-7、5-1、12-4的T3代轉ZmSAPK8擬南芥進行ZmSAPK8表達分析，以野生型擬南芥與轉空載體擬南芥為對照，具體為提取編號為9-5、8-7、5-1、 12-4的T3代轉ZmSAPKS擬南芥葉片RNA，反轉錄出cDNA作為模板，以特異引物正向引物ATGCACGACAGCGACCGGTA 和反向引物TGGAAGAAGTAGCGAGCC，進行 RT-PCR，以 Actin基因作為對照，Actin引物為正向引物GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG和反向引物 AACGACCTTAATCTTCATGCTGC,結果見圖3所示，圖3為野生型和轉基因純合株系中ZmSAPK8 的表達分析，其中WT為野生型擬南芥，可以看出，在編號為9-5、8-7、5-1、12-4的T3代轉 ZmSAPKS擬南芥中，ZmSAPKS均得到表達。野生型擬南芥與轉空載體擬南芥結果無顯著差已升。4、轉ZmSAPK8擬南芥表型分析1)耐鹽性
將上述獲得的編號為8-7 (TL7)、9_5 (TL5)的T3代轉ZmSAPKS擬南芥、野生型擬南芥、轉空載體擬南芥分別進行如下處理在含有150mM NaCl的MS培養(yǎng)基上，分三個區(qū)域點播各株系擬南芥種子(圖5B)， 每個株系30粒。在22°C、16小時光照/8小時黑暗條件下，生長10天統(tǒng)計存活率，實驗重復三次，結果取平均值。結果如下表1所示
權利要求
1.一種蛋白質，是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由1)衍生的蛋白質。
2.權利要求1所述蛋白質的編碼基因。
3.根據(jù)權利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因為如下1)或2)或3) 或4)所示的基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)序列表中序列1自5’末端第60-1160位核苷酸所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA分子雜交且編碼所述與植物耐逆性相關蛋白質的DNA分子；4與1)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與所述植物耐逆性相關蛋白質的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述編碼基因的重組表達載體、重組菌、轉基因細胞系或表達品.ο
5.根據(jù)權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體為將權利要求2或3所述的編碼基因插入載體PCAMBIA3301的多克隆位點得到的重組表達載體。
6.擴增權利要求2或3所述的編碼基因全長或其任意片段的引物對，引物對中的一條引物為序列表中序列3所示的DNA分子，另一條引物為序列表中序列4所示的DNA分子。
7.一種培育耐逆性提高的轉基因植物的方法，是將權利要求2或3所述的編碼基因導入目的植物得到轉基因植物，所述轉基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于 所述耐逆性為耐鹽性。
9.根據(jù)權利要求7或8所述的方法，其特征在于權利要求2或3所述編碼基因是通過權利要求4或5所述重組表達載體導入所述目的植物中。
10.根據(jù)權利要求7-9任一所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物優(yōu)選為擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與植物耐逆性相關蛋白ZmSAPK8及其編碼基因與應用。本發(fā)明提供了的蛋白質，名稱為ZmSAPK8，來源于玉米，是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由1)衍生的蛋白質。本發(fā)明的實驗證明，用克隆的方法得到ZmSAPK8基因，將其導入擬南芥中得到的轉基因擬南芥，與野生型擬南芥相比，轉基因擬南芥的耐逆性高于野生型擬南芥，耐逆性表現(xiàn)在耐鹽性。本實驗得到的ZmSAPK8基因和轉基因擬南芥在植物遺傳育種方面有重要的意義。
文檔編號C12N15/11GK102453085SQ20101052618
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月29日 優(yōu)先權日2010年10月29日
發(fā)明者劉穎慧, 宋燕春, 張登峰, 李會勇, 王天宇, 石云素, 英生, 黎裕 申請人:中國農業(yè)科學院作物科學研究所