專利名稱：一種將單核細(xì)胞分化培養(yǎng)為成熟的樹突狀細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種將CD 14+單核細(xì)胞分化培養(yǎng)為成熟的樹突狀細(xì)胞的方法，屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell, DC)于1973年由Meinman和Cohn首次從小鼠淋巴器官分離獲得。是目前所知功能最強(qiáng)的、也是唯一能激活初始性T細(xì)胞(NT cell)的專職抗原提呈細(xì)胞(Antigen-presenting cell，APC)，在免疫應(yīng)答中處于中心地位。近年來(lái)基于DC的免疫治療已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)，尤其是體外大量擴(kuò)增培養(yǎng)DC用于病毒感染和腫瘤治療已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段。DC起源于骨髓CD34+細(xì)胞，除大腦以外廣泛分布于全身各臟器，但數(shù)量極微，僅占外周斑單核細(xì)胞的0. 5-1%以下。目前研究表明，經(jīng)細(xì)胞因子作用可在體外誘導(dǎo)分化獲得大量DC。具體方法包括有(1)用細(xì)胞因子混合劑如干細(xì)胞因子(SCF)、IL-3、IL-4、IL-6等培養(yǎng)⑶34+干細(xì)胞來(lái)源J2)IL-4、GM-CSF培養(yǎng)單核細(xì)胞來(lái)源；(3)從外周血中分離獲得DC。近年來(lái)的一個(gè)重要進(jìn)展就是把骨髓和血中的CD34+前體細(xì)胞誘導(dǎo)成有免疫刺激活性的DC。具體來(lái)源和方法為①臍帶血臍帶血中含有豐富的細(xì)胞因子，具有組織相容性好等特點(diǎn)，用臍帶血體外誘導(dǎo)擴(kuò)增DC成為目前研究的熱點(diǎn)。但是從臍帶血中純化出CD34+干細(xì)胞費(fèi)用昂貴。②骨髓骨髓中含有大量的CD34+造血干細(xì)胞，在合適的細(xì)胞因子刺激下可以誘導(dǎo)高質(zhì)大量的DC。其主要缺點(diǎn)是骨髓采集不易，而且容易污染，患者比較痛苦，擴(kuò)增費(fèi)用昂貴。③ 脾臟脾臟是免疫器官和造血器官，從脾臟分離出來(lái)的貼壁單核細(xì)胞可以誘導(dǎo)分化為典型 DC ；但脾臟來(lái)源受限。由于DC存在異質(zhì)性，不同組織來(lái)源，不同的培養(yǎng)擴(kuò)增條件可以得到不同分化成熟階段的DC。由于外周血采集方法簡(jiǎn)單易行，并且較骨髓而言不易污染。目前很多人主張用外周血來(lái)源的DC做免疫治療。常用的方法是從正常人外周血分離獲得單核細(xì)胞，加入GM-CSF、IL-4，進(jìn)一步地成熟需要腫瘤壞死因子-α (TNF- α )、⑶40或其他試劑如細(xì)菌脂多糖(LPQ的刺激。體外培養(yǎng)1周后，可獲得大量高純度的DC。但是此種方法細(xì)胞誘導(dǎo)周期較長(zhǎng)，細(xì)胞因子價(jià)格昂貴。2008年Brian C. Schanen利用transwell技術(shù)(一類有通透性的杯狀的裝置，常用于腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)，共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)等)將外周血單核細(xì)胞(PBMC)和人臍靜脈血內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)進(jìn)行共培養(yǎng)，在PBMC通過(guò)上層的HUVEC后，在下層分化為未成熟的DC，整個(gè)分化過(guò)程不需要外源細(xì)胞因子，并且更接近體內(nèi)DC分化的過(guò)程，但是這種培養(yǎng)方法transwell價(jià)格比較昂貴并且只適用于小量培養(yǎng)(Brian C. Schanen and Donald R.Drake III. A novel approach for the generation of human dendritic cells from blood. Journal of Immunological Methods2008,335,53-64)?；诂F(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明欲使用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株作為飼養(yǎng)層細(xì)胞， 并提供相應(yīng)的細(xì)胞因子，以誘導(dǎo)單核細(xì)胞的成熟和分化，旨在提供一種經(jīng)濟(jì)、方便、高效的 DC培養(yǎng)分化技術(shù)，解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種將CD 14+單核細(xì)胞分化培養(yǎng)為成熟的樹突狀細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟(1)以能分泌促進(jìn)細(xì)胞成熟的細(xì)胞因子的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，培
養(yǎng)至貼壁；(2)接種CD 14+細(xì)胞，與(1)所述飼養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)36_60小時(shí)；(3)收集步驟(2)獲得的懸浮細(xì)胞；(4)將步驟( 獲得的細(xì)胞與能分泌促進(jìn)細(xì)胞分化的細(xì)胞因子且已經(jīng)貼壁生長(zhǎng)的飼養(yǎng)層細(xì)胞人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)12-36小時(shí)；(5)收集步驟(4)獲得的懸浮細(xì)胞，即為成熟的樹突狀細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，所述人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為Ea. hy926細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，所述步驟O)中所述的能分泌促進(jìn)細(xì)胞成熟的細(xì)胞因子為GM-CSF和/或IL-4。在又一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，所述GM-CSF和IL-4為融合表達(dá)蛋白。為獲得更好的技術(shù)效果，所述步驟O)中所述的培養(yǎng)時(shí)間可以為48小時(shí)。在一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，所述步驟中所述的能分泌促進(jìn)細(xì)胞分化的細(xì)胞因子為 TNF- α。為獲得更好的技術(shù)效果，所述步驟⑷中所述的培養(yǎng)時(shí)間為M小時(shí)。在另一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，所述⑶14+單核細(xì)胞分離于人外周血。在另一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，所述細(xì)胞因子的表達(dá)載體為慢病毒載體pBPLV。為獲得更好的技術(shù)效果，所述Ea. hy926細(xì)胞在共培養(yǎng)之前需要經(jīng)過(guò)的劑量為 40Gy的γ射線照射。本發(fā)明利用能分泌促進(jìn)細(xì)胞成熟和分化的細(xì)胞因子的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株用作 DC培養(yǎng)的飼養(yǎng)層細(xì)胞，不僅模擬了體內(nèi)DC分化時(shí)在體內(nèi)的微環(huán)境和細(xì)胞因子催化的過(guò)程， 避免了用人臍靜脈血內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC作為飼養(yǎng)層時(shí)，原代細(xì)胞來(lái)源受限，每次提取都必須從臍帶中分離得到，而且培養(yǎng)時(shí)需要加入細(xì)胞因子的問(wèn)題。本發(fā)明所具體使用的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株Ea. hy^6細(xì)胞，是HUVEC和肺癌細(xì)胞A549的融合細(xì)胞，可以增殖100代以上， 并且培養(yǎng)時(shí)不需要加入細(xì)胞因子，克服了培養(yǎng)復(fù)雜以及不穩(wěn)定等因素，優(yōu)化了 DC的培養(yǎng)系統(tǒng)。與傳統(tǒng)方法相比具有經(jīng)濟(jì)、快速、可以大量培養(yǎng)的特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)。
圖IGM-CSF和IL-4、以及TNF- α PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定圖；圖2重組慢病毒載體pBPLV (GFP)構(gòu)建示意圖；圖3重組質(zhì)粒pBPLV-GMCSF-2A-IL4酶切圖譜；圖4重組質(zhì)粒PBPLV-IL2信號(hào)肽-STNF- α酶切圖譜；圖5慢病毒載體包裝電鏡圖；圖6Ea. hy926細(xì)胞感染電鏡圖；圖7DC體外培養(yǎng)倒置顯微鏡觀察形態(tài)圖；圖8DC的表型變化的流式細(xì)胞分析圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更為詳細(xì)的說(shuō)明，但是這些實(shí)施例用于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)，在本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思范圍內(nèi)，以本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的技術(shù)水平和本領(lǐng)域公知常識(shí)水平作出的任何改變均處于本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1分泌GM-CSF和IL-4、以及TNF- α的Ea. hy926細(xì)胞的構(gòu)建1.慢病毒多基因共表達(dá)載體的建立1)分別擴(kuò)增 GM-CSF-2A，以及 2A-IL4 序列。2A序列正向引物5，-3，GAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCT2A序列反向引物5，-3，AGGGCCGGGATTCTCCTCCACGTCACCGCATGTTAGAAGACTTCCTCTGCC CTC2)擴(kuò)增融合基因 GM-CSF-2A-IL4。3)擴(kuò)增 IL2 信號(hào)肽-sTNF- α。2)與3)的PCR擴(kuò)增的結(jié)果見圖1，在圖1中，各泳道依次為(1). GM-CSF_2A_IL4 重疊PCR結(jié)果；(2) IL2信號(hào)肽-sTNF- α ； (3)分子量標(biāo)記DL. marker2000。通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分別獲得了 GM-CSF、IL4共表達(dá)基因948bp，以及目的基因IL2信號(hào)肽-sTNF-α 530bp左右。測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)序列比對(duì)與Genebank公布序列一致(IL4Gene ID 3565，GM-CSF Gene ID 1437，TNF-α Gene ID 7124，IL2 信號(hào)肽序列參考文獻(xiàn)單純分泌性TNF-α真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)細(xì)胞株的建立，細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志(J Cell Mol Imumuno 1)2000 ； 16(1))。4)目的基因連接pEASY-Tl載體(購(gòu)自"TransGen Biotech公司)測(cè)序(按產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行操作)。 5)慢病毒載體pBPLV (pBPLV是通過(guò)將pMAl載體(該載體是將原始質(zhì)粒pRRLSIN. cPPT. PGK-GFP. WPRE (購(gòu)自 ADDGENE 公司)參考 Amedola M, et al. Coordinate dual-gene transgenesis by lentiviral vectors carrying synthetic bidirectional promoters. Nat Biotechol, 2005, 23(1) :108-116文獻(xiàn)進(jìn)行改造而得)用限制性內(nèi)切酶PstI、Mil進(jìn)行雙酶切后與正義鏈為5，-ggctagcatgctctagagcgctg-3，，反義鏈為 3，-acgtccgatcgtac gagatctcgcgacagct-5’多克隆位點(diǎn)序列鏈接得到的)與目的基因37°C分別雙酶切汕后，T4 連接酶的作用下16°C過(guò)夜(所用的酶均來(lái)自TaKaRa公司，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作)。載體構(gòu)建示意圖見圖2，在圖2中，通過(guò)雙酶切、連接過(guò)程獲得重組質(zhì)粒 PBPLV-GM-CSF-2A-IL4 (xba I，sail)、pBPLV_IL2 信號(hào)肽-TNF-α (pst I，sall)。6)構(gòu)建后的質(zhì)粒鑒定圖3為重組質(zhì)粒pBPLV-GMCSF-2A-IL4酶切圖譜。其中(1) sail單酶切；(2)xbal 單酶切；(3)雙酶切；(4)分子量標(biāo)記maker 15000。圖4為重組質(zhì)粒PBPLV-IL2信號(hào)肽-STNF- α酶切圖譜。其中(1) DLmarker2000 ； (2)pst I 單酶切；(3)sal I 單酶切 J4)pst I、sail 雙酶切；(5)DLmarker 15000。通過(guò)雙酶切鑒定，兩個(gè)重組質(zhì)粒都可以切除目的基因的條帶，該結(jié)果表明構(gòu)建質(zhì)粒成功。
2.慢病毒載體的包裝以293FT細(xì)胞系(是經(jīng)人工改造過(guò)的人胚腎細(xì)胞系，購(gòu)自invitrogen公司cat no :R700-07)為包裝細(xì)胞，利用invitrogen慢病毒三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)(pLPl、pLP2、pLP/VSVG 均購(gòu)自invitrogen公司)，包裝慢病毒。步驟1)準(zhǔn)備質(zhì)粒。第三代慢病毒包裝系統(tǒng)，包含慢病毒載體、包裝質(zhì)粒pLPl和pLP2、 包膜質(zhì)粒pLP/VSVG四個(gè)質(zhì)粒，要求質(zhì)粒DNA的0擬60Λ80的比值為1. 80左右，濃度在 0.l_3ug/ul02)培養(yǎng)細(xì)胞，注意不要讓其生長(zhǎng)過(guò)度，長(zhǎng)至90 %匯合即傳代，傳代超過(guò)20 代則不應(yīng)使用。3)制備DNA-Lipofectamin2000復(fù)合物。在一個(gè)無(wú)菌的5ml管中，加入1. 5ml無(wú)血 ^raOpti-MEM 1 (invitrogen cat no :31985-062),依次加入4. 2ug pLPl、2ug pLP2、2. 8ug pLP/VSVG和5ug慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，輕輕混勻。在另一個(gè)無(wú)菌的 5ml 管中，將 42ulLipofectamine (invitrogen，cat no :11668-027)稀釋于1. 5ml無(wú)血清Opti-MEM I無(wú)血清培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫放置5min，混合以上兩管液體，輕輕混勻，室溫孵育20min，形成DNA-Lipofectamin2000復(fù)合物。4)在DNA-Iipid復(fù)合物形成過(guò)程中，胰蛋白酶消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞重懸于含血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，使其密度達(dá)到1. MlO6個(gè)/ml。注意培養(yǎng)基中不能含抗生素。5)將DNA-Lipofectamin2000復(fù)合物加入到含有5ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基的IOcm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)基中不含抗生素。6)將5ml 293FT細(xì)胞細(xì)胞懸液加入到含有DNA-Lipofectamin2000復(fù)合物和生長(zhǎng)培養(yǎng)基的IOcm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕輕前后搖晃移動(dòng)培養(yǎng)皿混勻。將細(xì)胞置于37°C、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。7)次日，用IOml包含丙酮酸鈉的的完全培養(yǎng)基(高糖DMEM，10 %胎牛血清，0. ImM非必需氨基酸，2mM-L-谷氨酰胺，青-鏈霉素，ImM丙酮酸鈉)更換含有 DNA-Lipofectamin2000復(fù)合物的培養(yǎng)基。8)轉(zhuǎn)染48_72h后收集上清于15ml無(wú)菌離心管中。9)4°C，3000rpm離心15min去除細(xì)胞碎片，或用0. 45um濾膜過(guò)濾。如果需要濃縮，則需要50000g超速離心池收集病毒沉淀。293FT細(xì)胞包裝慢病毒，在慢病毒載體構(gòu)建成功后，利用invitrigen慢病毒三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)在細(xì)胞中進(jìn)行慢病毒的包裝。包裝細(xì)胞24h后，通過(guò)電鏡觀察，既可以看到細(xì)胞內(nèi)有GFP表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞比列超過(guò)95% (圖幻，包裝效率很高。包裝7 后，培養(yǎng)上清為淡黃色，收集毒液， 用0. 45um濾膜過(guò)濾除去細(xì)胞碎片，置于-70°C備用。3.慢病毒感染EA.hy^6細(xì)胞(購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞資源中心，中科院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù))去除EA. hy926細(xì)胞培養(yǎng)基，加入慢病毒毒液及中濃度 8ug/ml 的 polybrene(sigama cat no :h9268)，置于 37°C>5% CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。次日，去除毒液，添加完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80% -90%匯合時(shí)，按1 3傳代。圖6為電鏡觀察的Ea. hy926細(xì)胞感染結(jié)果，可見利用上述慢病毒感染內(nèi)皮細(xì)胞株 EA. hy926,感染效率達(dá)90%。獲得GM-CSF、IL4共表達(dá)株，以及TNF- α表達(dá)株。實(shí)施例2制備飼養(yǎng)層細(xì)胞1)上述慢病毒感染Ea. hy926細(xì)胞，獲得IL4、GM-CSF-Ea. hy926飼養(yǎng)層細(xì)胞和 TNF- α -Ea. hy926飼養(yǎng)層細(xì)胞；感染步驟同實(shí)施例1中慢病毒感染EA. hy926細(xì)胞；2)利用熒光細(xì)胞分選技術(shù)，根據(jù)GFP熒光強(qiáng)弱分選出GFP強(qiáng)表達(dá)株和弱表達(dá)株；3) IL4、GM-CSF-Ea. hy926 和 TNF- α -Ea. hy926 細(xì)胞以劑量 40Gy 的 γ 射線照射抑制其增殖，照射后的細(xì)胞更換培養(yǎng)基，于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2-3h，PBS液沖洗，制備成飼養(yǎng)層細(xì)胞。實(shí)施例3PBMC和飼養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)1)正常人外周血PBMC的制備(按照淋巴細(xì)胞分離液試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，人淋巴細(xì)胞分離液ftOduct Number =LTS 1077，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所灝洋生物公司)；幻免疫磁珠法分選外周血⑶14+單核細(xì)胞(使用德國(guó)美天旎公司Monocyte Isolation Kit II Order no. 130-091-153，按說(shuō)明書進(jìn)行分離)；3)待GM-CSF、IL4_Ea. hy926飼養(yǎng)層細(xì)胞貼壁后，接種PBMC細(xì)胞，48h收集懸浮的細(xì)胞接種于TNF- α -Ea. hy926飼養(yǎng)層細(xì)胞，24h后收集懸浮細(xì)胞即為成熟的DC。圖7為DC體外培養(yǎng)倒置顯微鏡觀察形態(tài)學(xué)，通過(guò)圖7可見誘導(dǎo)成熟后，顯微鏡下 DC的表形，加入TNF- α后，細(xì)胞大部分懸浮，胞漿透明，胞體大，細(xì)胞膜伸出的樹突更加明顯，細(xì)胞分布于培養(yǎng)板中，數(shù)量明顯增加，呈典型的DC形態(tài)。圖8是DC的表型變化的流式細(xì)胞分析圖，DC細(xì)胞與熒光標(biāo)記的單克隆抗體孵育后，流式分析其表面標(biāo)志的表達(dá)，其中虛線代表同型對(duì)照組，細(xì)實(shí)線代表為刺激成熟的樹突狀細(xì)胞，粗實(shí)線表示刺激成熟的樹突狀細(xì)胞。刺激成熟后，DC表面CD32的表達(dá)減少，而 ⑶80、⑶86、⑶40這些在適應(yīng)性免疫中起到共刺激作用的分子表達(dá)增加。HLA-DR表達(dá)稍有增加，⑶14的表達(dá)變化不大。
權(quán)利要求
1.一種將CD 14+單核細(xì)胞分化培養(yǎng)為成熟的樹突狀細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟(1)以能分泌促進(jìn)細(xì)胞成熟的細(xì)胞因子的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，培養(yǎng)至貼壁；(2)接種CD14+細(xì)胞，與(1)所述飼養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)36-60小時(shí)；(3)收集步驟( 獲得的懸浮細(xì)胞；(4)將步驟C3)獲得的細(xì)胞與能分泌促進(jìn)細(xì)胞分化的細(xì)胞因子并已經(jīng)貼壁生長(zhǎng)的飼養(yǎng)層細(xì)胞人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)12-36小時(shí)；(5)收集步驟(4)獲得的懸浮細(xì)胞，即為成熟的樹突狀細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為Ea.hy926細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟( 中所述的能分泌促進(jìn)細(xì)胞成熟的細(xì)胞因子為GM-CSF和/或IL-4。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述GM-CSF和IL-4為融合表達(dá)蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中所述的培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中所述的能分泌促進(jìn)細(xì)胞分化的細(xì)胞因子為TNF-α。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中所述的培養(yǎng)時(shí)間為24小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述CD14+單核細(xì)胞分離于人外周血。
9.根據(jù)權(quán)利要求4或6所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞因子的表達(dá)載體為慢病毒載體pBPLV。
10.根據(jù)權(quán)利要求4或6所述的方法，其特征在于，所述Ea.hy926細(xì)胞在共培養(yǎng)之前需要經(jīng)過(guò)劑量為40Gy的γ射線照射。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種將CD 14+單核細(xì)胞分化培養(yǎng)為成熟的樹突狀細(xì)胞的方法，所述方法將CD 14+細(xì)胞分別與能分泌促進(jìn)細(xì)胞成熟和分化的細(xì)胞因子的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，使CD 14+細(xì)胞成為成熟的樹突狀細(xì)胞，與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明具有經(jīng)濟(jì)、快速、可以大量培養(yǎng)的特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)C12N5/0786GK102443568SQ20101050831
公開日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2010年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月15日
發(fā)明者喬志新, 于群, 馮秋月, 張公慶, 李偉靜, 楊曉琮, 王婧, 王璇琳, 石曉月, 程宏, 賀敏 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所